JP2020533299A - キャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための肺炎球菌多糖の製剤方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの莢膜多糖のキャリアタンパク質へのコンジュゲーションに関係する多くのプロセス改善を提供する。これらのプロセスは血清型固有のものであり、酸加水分解、塩化ナトリウムの還元的アミノ化反応への添加、及びショ糖の添加による多糖溶解を含むものである。本発明のプロセスを用いて製造される多糖−タンパク質コンジュゲートは、多価肺炎球菌ワクチンに含ませることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの莢膜多糖のキャリアタンパク質へのコンジュゲーションに関連する多くのプロセス改善を提供する。本発明の方法を用いて製造される多糖−タンパク質コンジュゲートは、多価肺炎球菌ワクチンに含ませることができる。

肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、被包性細菌の１例であり、世界的に重篤な疾患の重要な原因である。１９９７年に、疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ＣＤＣ）は、米国において年間で、肺炎球菌性髄膜炎３，０００例、肺炎球菌性菌血症５０，０００例、肺炎球菌性中耳炎７，０００，０００例、及び肺炎球菌性肺炎５００，０００例があったと推算している。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７， ４６（ＲＲ−８）：１−１３を参照する。さらに、これらの疾患の合併症は重大となる可能性があり、いくつかの研究で、肺炎球菌性髄膜炎で８％までの死亡率及び２５％の神経系続発症が報告されている。Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７−９７を参照する。

Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ １９９７， ４６（ＲＲ−８）：１−１３ Ａｒｄｉｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７−９７

長年にわたって認可されている多価肺炎球菌多糖ワクチンは、成人、特に、高齢者及び高リスク者における肺炎球菌性疾患の予防に非常に有益であることが証明されている。しかしながら、乳児および幼児では、非コンジュゲート肺炎球菌多糖に対する応答は不充分である。細菌多糖は、乳児において弱い応答若しくは無応答を誘発する、Ｔ細胞非依存性免疫原である。細菌多糖免疫原のキャリアタンパク質への化学的コンジュゲーションは、乳児におけるＴ細胞依存性免疫原に対する免疫応答を変化させる。ジフテリアトキソイド（ＤＴｘ、ＤＴの化学的解毒版）及びＣＲＭ１９７が、それらのアミノ酸配列におけるＴ細胞刺激エピトープの存在により、細菌多糖免疫原のキャリアタンパク質であると報告されている。

肺炎球菌ワクチンであるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）は、当時、幼児及び乳児において侵襲性の肺炎球菌性疾患を引き起こした７種類の最も高頻度で単離された血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ）を含有しており、米国で２０００年２月に最初に認可された。米国でＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）が広く使用されるようになってから、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）に存在する血清型により、小児では侵襲性肺炎球菌性疾患の大幅な減少があった。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５， ５４（３６）：８９３−７を参照する。しかしながら、世界の特定の地域ではＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）による血清型の網羅に限界があり、米国では、ある種の新たな血清型（例えば、１９Ａなど）の証拠がある程度ある。例えば、Ｏ′Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４−４４；Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７−４６；Ｋｙａｗ ｅｔ ａｌ．， ２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５−６３；Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．， ２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６−５４；Ｔｒａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１−Ｓ１８９を参照する。

Ｐｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆを含む１３価肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンである。例えば、米国特許出願公開番号第ＵＳ２００６／０２２８３８０Ａ１、Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ， ２００６， Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０−４８及びＫｉｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７−ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４−Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ（ｔｈｅ ４８^ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６^ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５−２８， ２００８で発表）を参照する。Ｄａｇａｎ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６６： ２０９３−２０９８及びＦａｔｔｏｍ， １９９９， Ｖａｃｃｉｎｅ １７： １２６も参照する。

現在の多価肺炎球菌ワクチンは、ワクチン中に存在する血清型に関連する肺炎球菌性疾患の発生率低下において有効であった。しかしながら、そのワクチンに存在しない肺炎球菌発現血清型の流行が高くなってきている。新規な血清型のプロセス条件を、コンジュゲーション効率及びある種の血清型が提示する特有の課題に関して各血清型について決定する必要がある。従って、将来のワクチンに含めるため、新規な肺炎球菌血清型をコンジュゲートする改善されたプロセス条件が必要とされている。

本発明は、特定の血清型に固有である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの多糖（Ｐｓ）製造における多くのプロセス変更を提供する。

これらのプロセス変更は、多糖及び／又は多糖溶解の特性を改善することで、コンジュゲーションをより良好にするものである。

１実施形態において、本発明は、非プロトン性溶媒中でキャリアタンパク質（Ｐｒ）にコンジュゲートした場合に、所望のコンジュゲート特性を示すサイズ低下した血清型１２Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ及び３１からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を得るためのプロセス条件を提供する。

具体的には、酸加水分解によるこれら血清型のＰｓサイズ低下により、均質化と比較して、タンパク質コンジュゲーションのＰｓ分子量が低くなり、それによって、リジン消費、遊離Ｐｓ又は遊離Ｐｒのようなコンジュゲート特性が改善される。

１実施形態において、本発明は、特に血清型１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２４Ｆ、及び３５Ｂからの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖に関して、塩化ナトリウムを用いるＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中でのコンジュゲーション後に改善された多糖−タンパク質コンジュゲート特性を得るためのプロセス条件を提供する。具体的には、この実施形態において、コンジュゲーション反応の前若しくはその途中で≧１ｍＭ塩化ナトリウムを含ませることで（そのプロセスのどの段階で、塩化ナトリウムを加えるかとは無関係に）、コンジュゲートサイズの拡大、リジン消費の増加、遊離Ｐ類若しくは遊離Ｐｒの低下のようなコンジュゲート特性の改善を生じる。

１実施形態において、本発明は、凍結乾燥後に完全溶解を確保するための、血清型３、８、及び２４Ｆの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖の各種前凍結乾燥製剤条件を提供する。具体的には、多糖は、ショ糖の多糖に対する質量比が≧３０倍、至適には≧４０倍となるように、ショ糖及び水とともに製剤化する。例えば、所与の前凍結乾燥多糖濃度２ｍｇＰｓ／ｍＬの場合、ショ糖濃度は、凍結乾燥後の溶解のために、最小限６０ｍｇショ糖／ｍＬ（６％重量／体積ショ糖）であるべきであり、至適には≧８０ｍｇショ糖／ｍＬ（８％重量／体積ショ糖）であるべきである。

これらの方法で製剤された多糖によって、凍結乾燥及び再溶解後のタンパク質とのコンジュゲーションが可能となり、所望の特性が得られる。

血清型２０からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖についてのコンジュゲートサイズに対する塩化ナトリウムの影響を示す図である。 血清型２０からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖についてのリジン消費に対する塩化ナトリウムの影響を示す図である。 血清型２０からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖についての遊離Ｐ類及びＰｒに対する塩化ナトリウムの影響を示す図である。

本発明は、特定の血清型に固有である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの多糖（Ｐｓ）製造における多くのプロセス変更を提供する。これらのプロセス変更は、多糖及び／又は多糖溶解の特性を改善することで、コンジュゲーションをより良好にするものである。

本発明者らは、タンパク質コンジュゲーション前の酸加水分解によるある種の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖のサイズ低下によって、実施例に示したようにコンジュゲート特性の改善を生じることを発見した。何らかの特定の理論によって拘束されるものではないが、観察された挙動を説明できると考えられる酸加水分解の使用についての一つの可能なメカニズムは、酸加水分解からの低分子量Ｐｓとのコンジュゲーションでは、そのコンジュゲーション反応時のＰｓとＰｒ分子との間の立体障害が小さく、それによって、相互作用が促進され、コンジュゲーションが改善され得るというものである。

本発明者らは、ある種の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖が完全に溶解するには、実施例で示したように凍結乾燥後のショ糖の存在が必要であることを発見した。何らかの特定の理論によって拘束されるものではないが、観察された溶解挙動を説明できると考えられるショ糖の使用についての一つの可能なメカニズムは、一部の多糖血清型が、それの化学構造の故に、凍結乾燥又は溶解時に他の血清型より容易に自己会合し、ショ糖／多糖比が相対的に高いことで自己会合が阻害されて、凍結乾燥後の溶解が可能となるというものである。

本発明者らは、実施例で示したように、コンジュゲーション反応の前若しくはその途中で≧１ｍＭ塩化ナトリウムを含ませることで、特に、血清型１６F、２０及び２４Fからの肺炎連鎖球菌多糖について（そのプロセスのどの段階で、塩化ナトリウムを加えるかとは無関係に）、コンジュゲートサイズの拡大、リジン消費の増加、遊離Ｐｓ若しくは遊離Ｐｒの低下のようなコンジュゲート特性の改善を生じることを発見した。何らかの特定の理論によって拘束されるものではないが、塩化ナトリウムに関して観察されたコンジュゲーション挙動を説明できると考えられる塩化ナトリウムの使用についての一つの可能なメカニズムは、一部の多糖血清型に関して、それの化学構造及び電荷分布のため、塩化ナトリウムが静電遮蔽をもたらすことで、タンパク質との相互作用が促進され、コンジュゲーションが改善されるとういうものである。塩化ナトリウムは、反応混合物に対して追加的なイオン強度も提供し、それによって、キャリアタンパク質の疎水性領域の曝露が低下して、タンパク質凝集が減少し得る。

本明細書で使用される場合、「多糖」（Ｐｓ）という用語は、免疫分野及び細菌ワクチン分野で一般に使用される抗原性糖要素（又は抗原性単位）、例えば、限定されるものではないが、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ糖」、「リポ−オリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「複合多糖」、「誘導体化若しくは活性化多糖又はオリゴ糖」などを含むことを意味する。別段の断りがない限り、本明細書で使用される多糖の命名法は、ＩＵＢ−ＩＵＰＡＣ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＭ） Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ １９８０に従う。ＪＣＢＮ， １９８２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：３３５２−３３５４を参照する。

本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は、体液介在若しくは細胞介在又はその両方で、哺乳動物のような宿主において免疫応答を誘発する能力を有する細菌莢膜多糖又は多糖−タンパク質コンジュゲートのような抗原を含む組成物を指す。免疫原性組成物は、細胞表面でＭＨＣ分子と協同で抗原を提供することによって宿主を感作する働きをし得る。さらに、抗原特異的Ｔ細胞又は抗体を発生させて、免疫化宿主の将来的な保護を可能とすることができる。従って、免疫原性組成物は、細菌による感染から宿主を保護し、重度を低下させることができるか、細菌感染による死から宿主を保護することができる。免疫原性組成物を用いて、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を発生させることもでき、それらは対象者に受動免疫を賦与するのに用いることができる。免疫原性組成物を用いて、動物効力モデルで又はオプソニン作用滅菌アッセイを介して、細菌の死滅によって測定される機能性を有する抗体を生成することもできる。

本明細書で使用される場合、多糖との関連での「単離（された）」という用語は、遠心、深層濾過、沈澱、限外濾過、活性炭による処理、ダイアフィルトレーション及び／又はカラムクロマトグラフィーの使用を含む当業界で公知の精製技術を用いる、精製多糖からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型特異的莢膜多糖の単離を指す。概して、単離多糖は、タンパク質、核酸及び非特異的内在性多糖（Ｃ−多糖）の部分的除去を指す。単離多糖は、１０％、８％、６％、４％又は２％未満のタンパク質不純物及び／又は核酸を含む。単離多糖は、型特異的多糖に関してＣ−多糖の２０％未満を含む。

本明細書で使用される場合、細菌莢膜多糖の関連での「精製（された）」という用語は、遠心、沈澱及び限外濾過のような手段による細胞溶解物からの多糖の精製を指す。概して、精製多糖は、細胞残屑及びＤＮＡの除去を指す。

本明細書で使用される場合、「Ｍｗ」という用語は、重量平均分子量を指し、代表的にはＤａ又はｋＤａで表現される。Ｍｗは、相対的に大きい分子は、相対的に小さい分子よりポリマーサンプルの合計質量の相対的に大きい部分を含むことを考慮している。Ｍｗは、静的光散乱、小角中性子散乱、Ｘ線散乱及び沈降速度のような技術によって求めることができる。

本明細書で使用される場合、「Ｍｎ」という用語は、数平均分子量を指し、典型的にはＤａ又はｋＤａで表される。Ｍｎは、サンプルの合計重量をサンプル中の分子数で割って計算され、ゲル浸透クロマトグラフィー、（マルク−ホウインクの式）を介した粘度測定、束一的方法、例えば蒸気圧浸透法、末端基定量又はプロトンＮＭＲのような技術によって求めることができる。Ｍｗ／Ｍｎは、多分散性を反映するものである。

本明細書で使用される場合、本発明の免疫原性組成物で用いられる場合の「（を）含む」という用語は、いずれか他の成分（抗原混合物については「からなる」という言語の制限を受ける）、例えばアジュバント及び賦形剤を含むことを指す。多価多糖−タンパク質コンジュゲート混合物で用いられる場合、「からなる」という用語は、特定の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを有し、異なる血清型からの他の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖タンパク質コンジュゲートを全く持たない混合物を指す。

別段の断りがない限り、本明細書で提供される全ての範囲は、挙げられている下限及び上限を含むものである。

莢膜多糖
本発明の血清型（例えば、血清型２３Ａ、２４Ｆ及び３１）からの肺炎球菌（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な技術によって製造することができる。例えば、多糖は、細菌から単離することができ、公知の方法（例えば、欧州特許第ＥＰ４９７５２４号及びＥＰ４９７５２５号参照）により；及び好ましくはホモジナイザーを用いて行われる顕微溶液化によって、若しくは化学的加水分解によってある程度サイズ分けすることができる。１実施形態において、各多糖血清型に相当する肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を大豆系培地で増殖させる。次に、個々の多糖を、遠心、沈澱及び限外濾過のような標準的な段階によって精製する。例えば、米国特許公開番号２００８／０２８６８３８及び米国特許第５，８４７，１１２号を参照する。多糖をサイズ分けして、粘度を低下させたり、及び／又は後のコンジュゲート化生成物の濾過性を向上させることができる。化学的加水分解は、酢酸を用いて行うことができる。機械的サイズ分けは、高圧均質化剪断を用いて行うことができる。

血清型１２Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ及び３１に関して、これら血清型からの多糖の均質化では、所望の特性が得られないことが認められた。実施例３を参照する。１２Ｆ以外の血清型については、多糖バッチを８０〜９２℃、好ましくは９０℃まで加熱し、酢酸、塩酸、リン酸、クエン酸のような酸を、最終濃度５０〜２００ｍＭまで加え、次に、少なくとも１０分間、２０分間、３０分間、４０分間若しくは５０分間インキュベートすることで、酸加水分解を行うことができる。ある種の実施形態において、酸加水分解は、９０分間まで、１５０分間まで、又は１５５分間まで行う。インキュベーション期間が終了したら、例えば濃リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を最終濃度４００ｍＭまで加え、冷却して≦２２℃とすることでバッチを中和する。サイズ低下した多糖を、０．２ミクロン濾過し、濃縮し、そして、５〜１０ｋＤａ ＮＭＷＣ接線流限外濾過膜を用いて水に対して透析濾過する。

一部の実施形態において、コンジュゲーション前の精製多糖は、５ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。分子量は、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）及び屈折率検出器（ＲＩ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算することができる。他のそのような実施形態において、多糖は、１０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１００〜４００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；又は２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの平均分子量を有する。ある種の実施形態において、平均分子量は５０〜３００ｋＤである。

ある種の実施形態において、多糖は、１０〜１０，０００、１０〜５，０００、１０〜４，０００又は１０〜１０００の繰り返し単位を有する。ある種の態様において、多糖は、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２００又は５０〜１００の繰り返し単位を有する。ある種の態様において、多糖は、４０〜９００の繰り返し単位を有する。

キャリアタンパク質
本明細書に記載の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の１以上からの多糖を、キャリアタンパク質にコンジュゲートして、小児、高齢者及び／又は免疫不全対象者における免疫原性を高めることができる。複数の血清型を多価組成物で使用する場合、その血清型は、同一のキャリアタンパク質又は異なるキャリアタンパク質で製造することができる。同じ血清型の各莢膜多糖は、代表的には同じキャリアタンパク質にコンジュゲートする。

本発明の特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、キャリアタンパク質として使用される。ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素（ＤＴ）の無毒性変異体である。ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質は、残基５２の断片Ａにおける単一のアミノ酸置換によって無毒とされたＤＴの突然変異型である。１実施形態において、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質は、カザミノ酸及び酵母抽出物系培地で増殖させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載の方法に従って組換え的に得られる。典型的には、ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈澱、及びイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。一部の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標名）（Ｐｆｅｎｅｘ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）で得られる。

他の好適なキャリアタンパク質には、ＤＴ、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＴＴ（破傷風トキソイド）又はＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００４／０８３２５１に記載のもの）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＬＴ（易熱性エンテロトキシン）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＳＴ（耐熱性エンテロトキシン）、及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのエキソトキシンＡのような別の不活化細菌毒素を含む。細菌外膜タンパク質、例えば他の外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン類、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０９１９９８参照）、肺炎球菌付着分子タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群若しくはＢ群連鎖球菌からのＣ５ａペプチダーゼ、又はインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６−１３）、例えば何らかの形で解毒されたｐｌｙ、例えばｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際特許出願公開番号ＷＯ０４／０８１５１５参照）又はｄＰＬＹ−ホルモル、ＰｈｔＸ、例えばＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ及びＰｈｔタンパク質の融合体、例えばＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際特許出願公開番号ＷＯ０１／９８３３４及びＷＯ０３／５４００７参照）も用いることができる。他のタンパク質、例えばオボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から）、ＰＤ｛インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、欧州特許ＥＰ０５９４６１０Ｂ参照｝、又はそれの免疫的に機能性の等価物、合成ペプチド（欧州特許ＥＰ０３７８８８１及びＥＰ０４２７３４７参照）、ヒートショックタンパク質（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１７７１２及びＷＯ９４／０３２０８参照）、百日咳タンパク質（国際特許出願公開番号ＷＯ９８／５８６６８及び欧州特許ＥＰ０４７１１７７参照）、サイトカイン類、リンホカイン類、増殖因子類又はホルモン類（国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０１１４６参照）、各種病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６−３８２４参照）、例えばＮ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ ｅｔ ａｌ， ２００４， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４−７参照）、鉄取り込みタンパク質（国際特許出願公開ＷＯ０１／７２３３７参照）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素Ａ若しくはＢ（国際特許公開ＷＯ００／６１７６１参照）、及びフラジェリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９参照）も、キャリアタンパク質として用いることができる。

他のＤＴ突然変異体も、キャリアタンパク質として用いることができ、例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ， １９７３， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８−３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３及びＣＲＭ１０７及びＮｉｃｈｏｌｌｓ ａｎｄ Ｙｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄ： Ｆｒａｎｋｅｌ， Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ， １９９２に記載の他の突然変異；欠失又はＧｌｕ−１４８のＡｓｐ、Ｇｌｎ若しくはＳｅｒへの突然変異及び／又はＡｌａ１５８のＧｌｙへの突然変異及び米国特許第４，７０９，０１７号又は米国特許第４，９５０，７４０号に開示の他の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０及び／又はＬｙｓ５３４の突然変異及び米国特許第５，９１７，０１７号又は米国特許第６，４５５，６７３号に開示の他の突然変異；又は米国特許第５，８４３，７１１号に開示の断片である。

多価ワクチンを用いる場合、１以上の抗原に、第２のキャリアタンパク質を用いることができる。その第２のキャリアタンパク質は好ましくは、無毒性であって無反応原性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり、十分な量及び純度で得られるタンパク質である。第２のキャリアタンパク質はさらに、抗原、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖とコンジュゲート若しくは接合して、その抗原の免疫原性を高める。キャリアタンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に従い易いものでなければならない。１実施形態において、第１のキャリアタンパク質にコンジュゲートしていない各莢膜多糖を、同じ第２のキャリアタンパク質にコンジュゲートさせる（例えば、各莢膜多糖分子を単一のキャリアタンパク質にコンジュゲートさせる。）。別の実施形態において、第１のキャリアタンパク質にコンジュゲートしていない莢膜多糖を、２以上のキャリアタンパク質にコンジュゲートさせる（各莢膜多糖分子を単一のキャリアタンパク質にコンジュゲートさせる。）。そのような実施形態において、同一の血清型の各莢膜多糖を、典型的には同じキャリアタンパク質にコンジュゲートさせる。

コンジュゲーション
ＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化による肺炎球菌多糖のタンパク質へのコンジュゲーションが一般に使用される。活性化多糖（Ｐｓ）及びタンパク質（Ｐｒ）を、典型的には凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再懸濁し、次にコンジュゲーションを行うために加えられた水素化シアノホウ素ナトリウム及び水素化ホウ素ナトリウムと合わせる。プロセスの詳細を以下で提供する。

多くの肺炎球菌血清型について、このプロセスによって、大きさ、リジン消費、遊離多糖、及び遊離タンパク質についての目的の特性を満足するコンジュゲートが得られる。しかしながら、一部の血清型について、Ｐｓ及びＰｒ濃度及びコンジュゲーション時間のようなコンジュゲーションパラメータを至適化した後であっても、このＤＭＳＯプロセスで目的のコンジュゲート特性を達成することは比較的困難であることが認められた。実施例を参照する。下記で記載のように、本発明は、いくつかの解決を提供して、これらの問題を克服する。

コンジュゲーションに先だって、精製多糖を化学的に活性化して、キャリアタンパク質と反応して活性化多糖を形成する能力を有する糖類を作ることができる。本明細書で使用される場合、「活性化多糖」という用語は、下記で記載のように化学修飾されていることで、リンカー若しくはキャリアタンパク質へのコンジュゲーションが可能となる多糖を指す。精製多糖は、リンカーに連結させても良い。活性化され、リンカーに連結されたら、各莢膜多糖を別個にキャリアタンパク質にコンジュゲートして、複合糖質を形成する。その多糖コンジュゲートは、公知のカップリング技術によって製造することができる。

ある種の実施形態において、多糖をリンカーにカップリングさせて、リンカーの遊離末端がエステル基である多糖−リンカー中間体を形成することができる。従って、そのリンカーは、少なくとも一方の末端がエステル基であるものである。他方の末端を選択して、それが多糖と反応して、多糖−リンカー中間体を形成できるようにする。

ある種の実施形態において、多糖を、その多糖中の１級アミン基を用いてリンカーにカップリングさせることができる。この場合、リンカーは典型的には、両方の末端にエステル基を有する。これによって、そのエステル基のうちの一つを求核アシル置換によって多糖中の１級アミン基と反応させることでカップリングを行うことができる。その反応によって、多糖がアミド連結を介してリンカーにカップリングしている多糖−リンカー中間体が得られる。従って、そのリンカーは、多糖における１級アミン基と反応するための第１のエステル基及び担体分子における１級アミン基と反応するための第２のエステル基を提供する二官能性リンカーである。代表的なリンカーは、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。

ある種の実施形態において、カップリングは、間接的に、即ちリンカーへのカップリングに先立って多糖を誘導体化するのに用いられる追加のリンカーを用いて行うこともできる。多糖を、多糖の還元末端のカルボニル基を用いてその追加のリンカーに結合させる。このカップリングは、（ａ１）カルボニル基を追加のリンカーと反応させる段階；及び（ａ２）その追加のリンカーの遊離末端をリンカーと反応させる段階という二つの段階を含む。これらの実施形態において、前記追加のリンカーは、典型的には、両方の末端に１級アミン基を有することで、還元的アミノ化によって、その１級アミン基の一方を多糖中のカルボニル基と反応させることで、段階（ａ１）を行うことができる。多糖中のカルボニル基と反応性である１級アミン基を用いる。ヒドラジド基又はヒドロキシルアミノ基が好適である。典型的には、前記追加のリンカーの両端には、同じ１級アミン基が存在する。その反応により、多糖がＣ−Ｎ連結を介して当該追加のリンカーにカップリングしている多糖−追加のリンカー中間体が得られる。

ある種の実施形態において、多糖中の異なる基、特にはカルボキシル基を用いて、多糖を追加のリンカーにカップリングさせることができる。このカップリングは、（ａ１）その基を追加のリンカーと反応させる段階；及び（ａ２）その追加のリンカーの遊離末端をリンカーと反応させる段階という二つの段階を含む。この場合、前記追加のリンカーは、典型的には、両末端に１級アミン基を有することで、ＥＤＡＣ活性化により、前記１級アミン基の一方を多糖中のカルボキシル基と反応させることで段階（ａ１）を行うことができる。多糖におけるＥＤＡＣ活性化カルボキシル基と反応性である１級アミン基を用いる。ヒドラジド基が好適である。典型的には、前記追加のリンカーの両端には、同じ１級アミン基が存在する。その反応により、多糖がアミド連結を介して当該追加のリンカーにカップリングしている多糖−追加のリンカー中間体が得られる。

１実施形態において、多糖の化学的活性化及びその後の還元的アミノ化によるキャリアタンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、同４，６７３，５７４号及び同４，９０２，５０６号、米国特許出願公開２００６／０２２８３８０、同２００７／１８４０７２、同２００７／０２３１３４０及び同２００７／０１８４０７１、及び国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、及びＷＯ２００８／１４３７０９に記載の手段によって行うことができる。その化学は、１級ヒドロキシル基をアルデヒドとする酸化剤、例えば酸化剤存在下のＴＥＭＰＯ（Ｗ０２１０４／０９７０９９）、又は二つの隣接ヒドロキシル基を反応させていずれもアルデヒドとする酸化剤、例えば過ヨウ素酸化合物（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム又は過ヨウ素酸を含む）との反応による、肺炎球菌多糖の活性化を伴い得る。その反応により、１級ヒドロキシル基のランダム酸化又は反応性アルデヒド基の形成を伴う炭化水素の隣接ヒドロキシル基のランダム酸化的開裂が生じる。

この実施形態において、キャリアタンパク質へのカップリングは、タンパク質のリジル基への直接アミノ化を介した還元的アミノ化による。例えば、コンジュゲーションを、任意に水系コンジュゲーション用のニッケルの存在下に、水素化シアノホウ素ナトリウムのような還元剤と活性化多糖及びキャリアタンパク質の混合物を反応させることで行う。そのコンジュゲーション反応は、水溶液下に又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下に行うことができる。例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２３１２７０及びＵＳ２０１１／０１９５０８６及び欧州特許ＥＰ０４７１１７７Ｂ１を参照する。次に、強還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムを加えることで、未反応のアルデヒドのキャッピングを行う。

還元的アミノ化には、二つの段階、（１）多糖の酸化による反応性アルデヒドの生成、（２）活性化多糖とキャリアタンパク質との間で形成されたイミン（シッフ塩基）の還元による安定なアミンコンジュゲート結合の形成が関与する。酸化の前に、多糖をサイズ低下させても良い。機械的方法（例えば、均質化）又は化学的加水分解を用いても良い。化学的加水分解は、酢酸を用いて行うことができる。酸化段階では、過ヨウ素酸化合物との反応を行うことができる。本発明に関して、「過ヨウ素酸化合物」という用語は、過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸の両方を含み、その用語はメタ過ヨウ素酸化合物（ＩＯ_４ ⁻）及びオルト過ヨウ素酸化合物（ＩＯ_６ ^５−）も含み、過ヨウ素酸化合物の各種塩を含む（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム及び過ヨウ素酸カリウム）。１実施形態において、莢膜多糖をメタ過ヨウ素酸化合物の存在下に、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）の存在下に酸化する。別の実施形態において、莢膜多糖をオルト過ヨウ素酸化合物の存在下に、好ましくは過ヨウ素酸の存在下に酸化する。

１実施形態において、酸化剤は、１級ヒドロキシルを選択的に酸化するための酸化剤存在下の、安定なニトロキシル若しくはニトロキシドラジカル化合物、例えばピペリジン−Ｎ−オキシ若しくはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である（例えば国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／０９７０９９に記載のもの）。前記反応において、実際の酸化剤は、触媒回路におけるＮ−オキソアンモニウム塩である。１態様において、前記安定なニトロキシル若しくはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン−Ｎ−オキシ若しくはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。１態様において、前記安定なニトロキシル若しくはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）部分又はＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する。１態様において、前記安定なニトロキシルラジカル化合物はＴＥＭＰＯ又はそれの誘導体である。１態様において、前記酸化剤は、Ｎ−ハロ部分を有する分子である。１態様において、前記酸化剤は、Ｎ−クロロコハク酸イミド、Ｎ−ブロモコハク酸イミド、Ｎ−ヨードコハク酸イミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸及び１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される。好ましくは前記酸化剤は、Ｎ−クロロコハク酸イミドである。

ある種の態様において、酸化剤は、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカル及び共酸化剤としてのＮ−クロロコハク酸イミド（ＮＣＳ）である（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／０９７０９９に記載）。従って、１態様において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの複合糖質は、ａ）水系溶媒中でサッカリドを２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）及びＮ−クロロコハク酸イミド（ＮＣＳ）と反応させて活性化サッカリドを作る段階；及びｂ）その活性化サッカリドを、１以上のアミン基を有するキャリアタンパク質と反応させる段階を含む方法によって得ることができる（当該方法は、以下、「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ−還元アミノ化」と称される。）。

任意に、その酸化反応は、クエンチング剤を加えることで反応停止する。クエンチング剤は、隣接ジオール類、１，２−アミノアルコール類、アミノ酸類、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩又はリン酸（例えば、グリセリン、エチレングリコール、プロパン−１，２−ジオール、ブタン−１，２−ジオール又はブタン−２，３−ジオール、アスコルビン酸）から選択することができる。

還元的アミノ化のためのコンジュゲーションプロセスの第２段階は、還元剤を用いる、活性化多糖とキャリアタンパク質との間のイミン（シッフ塩基）結合の還元による、安定なコンジュゲート結合の形成である（いわゆる還元的アミノ化）。好適な還元剤には、水素化シアノホウ化物（例えば、水素化シアノホウ素ナトリウム）又は水素化ホウ素ナトリウムを含む。１実施形態において、還元剤は水素化シアノホウ素ナトリウムである。

本発明の方法のある種の実施形態において、還元的アミノ化反応は、非プロトン性溶媒（又は非プロトン性溶媒の混合物）中で行われる。１実施形態において、その還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。凍結乾燥されている場合、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ溶媒を用いて、活性化多糖及びキャリアタンパク質を再生することができる。１実施形態において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。

ショ糖：Ｐｓ質量比２５倍での５％までのショ糖を用いて、凍結乾燥後のＤＭＳＯ中での至適な溶解が達成されている。例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７／０１３５４８を参照する。血清型３、８及び２４Ｆから得られる肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖の場合、非プロトン性溶媒中でタンパク質コンジュゲーション前に多糖を十分に溶解させるには、より高レベルのショ糖が必要であることが認められた。一部の実施形態において、これらの血清型については、水溶液での５％を超えるショ糖濃度が用いられる。一部の実施形態において、これらの血清型について、２５倍より大きいショ糖：Ｐｓ質量比、例えば、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、又は少なくとも４０倍を用いる。一部の実施形態において、ショ糖：多糖の前凍結乾燥質量比は、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０又はそれ以上である。トレハロース又はマンニトールなどの他の糖を用いることができる。

水溶液であるか非プロトン性溶媒中であるかを問わず、タンパク質コンジュゲーションプロセスにおける塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在を用いて、血清型１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２４Ｆ、及び３５Ｂから精製される肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖について、遊離タンパク質レベルを低下させ、コンジュゲート分子量を高め、遊離多糖を減少させ、及び／又はリジン消費を増加させることが可能であることも認められた。従って、本発明は、多糖タンパク質コンジュゲートの製造方法であって、第１の溶液中の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を第２の溶液中のタンパク質と反応させて第３の溶液を生成させ、その溶液中で、前記多糖タンパク質コンジュゲート反応を生じさせて、前記多糖タンパク質コンジュゲートを生成することを含み、ここで、前記第３の溶液が少なくとも１ｍＭの塩を含む方法に関し得る。

塩化ナトリウムは、コンジュゲーション反応前の凍結乾燥のための多糖及びタンパク質の製造からコンジュゲーション反応自体までのコンジュゲーションプロセスのいずれの箇所でも加えることができ、例えば、シッフ塩基反応の際、又は水素化シアノホウ素ナトリウム存在下での還元的アミノ化の際に加えることができる。一部の実施形態において、多糖及びタンパク質を別個に凍結乾燥し、そして、多糖溶液（第１の溶液）若しくはタンパク質溶液（第２の溶液）又は両方に塩を加えることができる。一部の実施形態において、多糖及びタンパク質を、塩を加えた同一の溶液から凍結乾燥する（即ち、第１及び第２の溶液が同一である。）。一部の実施形態において、塩を、多糖タンパク質コンジュゲート反応を行う溶液に加える（即ち、第３の溶液）。

他のナトリウム塩、カリウム塩、例えば塩化カリウム、リチウム塩、マグネシウム塩及びカルシウム塩のような他の塩を用いることができる。一部の実施形態において、多糖の場合、又はシッフ塩基反応の際、又は水素化シアノホウ素ナトリウム存在下での還元的アミノ化反応の際に、１ｍＭ〜１００ｍＭの塩化ナトリウムを溶解溶液に加える。一部の実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍＭ塩化ナトリウムを用いる。これらの実施形態の一部の態様において、１００、７５又は５０ｍＭ以下の塩化ナトリウムを用いる。

還元反応が終了したら、コンジュゲート中に残存する未反応アルデヒド基があり得、それを好適なキャッピング剤若しくはクエンチング剤を用いてキャッピング若しくはクエンチングすることができる。１実施形態において、このキャッピング又はクエンチング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）である。好適な代替物には、プレンステッド若しくはルイス酸存在下での水素化ホウ素トリアセトキシナトリウム又は水素化ホウ素ナトリウム若しくは水素化ホウ素亜鉛、アミンボラン類、例えばピリジンボラン、２−ピコリンボラン、２，６−ジボラン−メタノール、ジメチルアミン−ボラン、ｔ−ＢｕＭｅ^ｉＰｒＮ−ＢＨ_３、ベンジルアミン−ＢＨ_３又は５−エチル−２−メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）又はホウ化水素交換樹脂を含む。

非プロトン性溶媒中の還元的アミノ化を用いて製造される複合糖質は、通常、多価肺炎球菌タンパク質コンジュゲートワクチンで用いられる。従って、非プロトン性溶媒中で全ての血清型が製造されるわけではない多価組成物についてのある種の実施形態において、残りの血清型の還元反応は、水系溶媒（例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ビス−トリス、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸））、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ビシン又はＨＥＰＢから選択され、６．０〜８．５、７．０〜８．０、又は７．０〜７．５のｐＨで）中で行う。

一部の実施形態において、本発明の複合糖質は、１０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの分子量を有する多糖を含む。他のそのような実施形態において、多糖は、２５ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態において、多糖は、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態において、多糖は、７０ｋＤａ〜９００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態において、多糖は、１００ｋＤａ〜８００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態において、多糖は、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態において、多糖は、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜４００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜４００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜３００；２５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜４００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；又は５００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。酸加水分解を用いるある種の実施形態において、多糖は、１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、２５ｋＤａ〜２００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、２５ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、又は５０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量を有する。

好適な代替化学には、サッカリドの１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）による活性化によるシアナートエステルの生成を含む。従って、活性化サッカリドは、直接又はスペーサー（リンカー）基を介して、キャリアタンパク質上のアミノ基にカップリングさせることができる。例えば、前記スペーサーは、シスタミン又はシステアミンであることで、チオレート化多糖を得ることができ、それをマレイミド活性化キャリアタンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いて）又はハロアセチル化キャリアタンパク質（例えば、ヨードアセトアミド［例えば、エチルヨードアセトアミドＨＣｌ］又はＮ−スクシニミジルブロモアセテート又はＳＩＡＢ、又はＳＩＡ、又はＳＢＡＰを用いて）との反応後に得られるチオエーテル連結を介してキャリアにカップリングすることができ得る。好ましくは、シアナートエステル（任意に、ＣＤＡＰ化学によって製造される）をヘキサンジアミン又はアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、アミノ誘導体化サッカリドを、タンパク質担体上のカルボキシル基を介したカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣ又はＥＤＣ）化学を用いて、キャリアタンパク質にコンジュゲートする。そのようなコンジュゲートは、国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８及びＷＯ９６／２９０９４；及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ， １９８３， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５−２５６に記載されている。

他の好適な技術は、カルボジイミド類、ヒドラジド類、活性エステル類、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｓ−−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いるものである。多くのものが、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／４２７２１に記載されている。コンジュゲーションには、サッカリドの遊離ヒドロキシル基のＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ， １９７９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：２５７２−４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ， １９８１， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ２１８：５０９−１８参照）とそれに続くタンパク質との反応によるカーバメート連結の形成によって形成することができるカルボニルリンカーを用いることができる。これにおいては、アノマー末端の１級ヒドロキシル基への還元、任意に１級ヒドロキシル基の保護／脱保護、１級ヒドロキシル基のＣＤＩとの反応によるＣＤＩカーバメート中間体の生成及びＣＤＩカーバメート中間体のタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含む。

コンジュゲーション（還元反応及び任意にキャッピング若しくはクエンチング反応）後に、当業者に公知の各種技術によって、複合糖質を精製することができる（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して豊富化）。これらの技術には、透析、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、接線流濾過、限外濾過、沈澱／溶離、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、多モードイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）及び深層濾過を含む。例えば、米国特許第号６，１４６，９０２を参照する。ある実施形態において、複合糖質は、ダイアフィルトレーション又はイオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。

本発明の複合糖質を特徴付ける一つの方法は、サッカリドにコンジュゲートするようになるキャリアタンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリジン残基の数によるものであり、それは、コンジュゲートしたリジンの範囲として特徴付けることができる（コンジュゲーション度）。キャリアタンパク質のリジン修飾の証拠は、多糖への共有結合的連結のため、当業者に公知の通常の方法を用いるアミノ酸分析によって得ることができる。コンジュゲーションによって、コンジュゲート物を作るのに使用されたキャリアタンパク質原料と比較して、回収リジン残基数が減少する。好ましい実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は、２〜１５、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１５、５〜１０、８〜１５、８〜１２、１０〜１５又は１０〜１２である。ある実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４又は約１５である。好ましい実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は７〜１２である。一部のそのような実施形態において、キャリアタンパク質はＣＲＭ１９７である。

本発明の複合糖質は、サッカリド：キャリアタンパク質の比率（重量比）によって特徴付けることもできる。一部の実施形態において、複合糖質における多糖：キャリアタンパク質の比（重量比）は、０．５〜３．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、又は約３．０）である。他の実施形態において、サッカリド：キャリアタンパク質比（重量比）は、０．５〜２．０、０．５〜１．５、０．８〜１．２、０．５〜１．０、１．０〜１．５又は１．０〜２．０である。さらに別の実施形態において、サッカリド：キャリアタンパク質比（重量比）は０．８〜１．２である。好ましい実施形態において、コンジュゲートにおける莢膜多糖：キャリアタンパク質の比率は１〜２である。一部のそのような実施形態において、キャリアタンパク質はＣＲＭ１９７である。本発明の複合糖質及び免疫原性組成物は、キャリアタンパク質に共有結合的にコンジュゲートしていないが、そうではあっても複合糖質組成物中に存在する遊離サッカリドを含むことができる。遊離サッカリドは、複合糖質と非共有結合的に関わることができる（即ち、それに非共有結合的に結合しているか、それに吸着されているか、又はそれに若しくはそれによって捕捉されている）。

好ましい実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１５％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して約２５％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して約２０％未満の遊離多糖を含む。好ましい実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して約１５％未満の遊離多糖を含む。

多価多糖−タンパク質コンジュゲートワクチン
本発明の方法を用いて得られる多糖−タンパク質コンジュゲートは、多価多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンにおいて用いることができる。ある種の実施形態において、多価多糖−タンパク質コンジュゲートワクチンは、遊離多糖、多糖−タンパク質コンジュゲートの成分又はそれらの組み合わせのいずれかとして、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、及び３８の１以上からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含み、多価肺炎球菌ワクチンを提供する。ある種の実施形態において、免疫原性組成物は、１以上のキャリアタンパク質に個別にコンジュゲートした２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、又は４４肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含むか、本質的にそれらからなるか、それらからなるものである。好ましくは、ある特定の血清型からのサッカリドは、複数のキャリアタンパク質にはコンジュゲートされない。

個々の複合糖質を精製した後、それらを混ぜ合わせて、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別個のプロセスによって製造され、個々の投与製剤にバルク製剤される。

医薬／ワクチン組成物
本発明はさらに、薬学的に許容される担体及びアジュバントとともに、上記で記載の多糖肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の組み合わせのいずれかを含む、本質的にそれからなる或いはそれからなる、医薬的、免疫原性及びワクチン組成物を含む組成物を提供する。

多糖−タンパク質コンジュゲートの製剤は、当該分野において認識されている方法を用いて行うことができる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、生理的に許容される媒体で製剤して組成物を調製することができる。そのような媒体の例には、水、緩衝生理食塩水、多価アルコール類（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びブドウ糖溶液を含み、これらに限定されるものではない。

好ましい製剤において、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジン緩衝液で製剤される。

本明細書において定義する場合、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性の増強を果たす物質である。免疫アジュバントは、単独で投与した場合は免疫原性が弱い（例えば、誘発される抗体力価若しくは細胞媒介性免疫応答がない、若しくは弱い）抗原に対する免疫応答を増強し、抗原に対する抗体力価を増大させ、及び／又は個体において免疫応答を得るのに有効な抗原の用量を低減させるものであり得る。従って、アジュバントは、多くの場合、免疫応答を押し上げるために与えられ、当業者には周知である。該組成物の有効性を増強するための好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが、下記を含む：

（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；

（２）水中油型乳剤製剤（ムラミルペプチド（下記に定義）又は細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤あり、又はなし）、例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、及び０．５％Ｓｐａｎ ８５を含み（種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含んでいてもよい）、マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｎｅｗｔｏｎ， ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に配合されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズされているか、又はボルテックスして大粒径の乳剤が生成されているかのいずれかであるＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、並びに３−Ｏ−脱アセチル化モノホスホリルリピド（ｄｅａｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ（商標名））（米国特許第４，９１２，０９４号に記載）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標名））からなる群の１種類以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標名）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；並びに（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ；

（３）サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ若しくはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標名）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号参照）が使用され得るか、又は該アジュバントから生成させた粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質、及び両親媒性タンパク質の組合せによって形成された免疫賦活性複合体）並びにＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するがタンパク質を含まない）；

（４）細菌リポ多糖、合成リピドＡ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、又はその誘導体若しくは類似体、これらは、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；かかるＡＧＰの一例は、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ｝−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、５２９としても知られており（以前はＲＣ５２９として公知であった）、水性形態又は安定な乳剤として配合されたもの；

（５）合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフ（１以上）を含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；

（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共起刺激分子Ｂ７−１及びＢ７−２など；および

（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体。

別の実施形態では、アジュバントは、上記のアジュバントの２種類、３種類又はそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３−脱アセチル化モノホスホリルリピドＡ及びＱＳ２１も含有している水中油型乳濁液）である。

ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１′−２′ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含み、これらに限定されるものではない。

ある種の実施形態において、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチン又はミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）並びにＮｉｃｋｌａｓ， Ｗ． （１９９２； Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９−４９３）に記載されている。アルミニウム塩としては、限定されないが、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ（登録商標）、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウム（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、非晶質アルミナ、三水和アルミナ又はトリヒドロキシアルミニウムを含む。

ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを１：１の容量比でブレンドし、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることにより製造される。ブレンドプロセス後、その物質をハイシェアミキサーを用いてサイズ低下させて、単分散粒径分布を達成する。次いで、生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。

一部の特定の実施形態では、市販のＡｌ（ＯＨ）_３（例えば、Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ又はＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用し、タンパク質を吸着させる。タンパク質の吸着は、別の実施形態において、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）及び媒体のｐＨに依存性である。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強力に正荷電アルミニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は、２〜３週間の期間にわたってゆっくり放出されるＡｇの貯蔵部を構築し、マクロファージの非特異的活性化及び補体活性化に関与し、及び／又は先天性免疫機構を刺激する（おそらく、尿酸の刺激によって）ことがあり得る。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ， ２００９， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照する。

一価のバルク水性コンジュゲートは、典型的には、一緒に混合及び希釈する。希釈したら、バッチを無菌濾過する。リン酸アルミニウムアジュバントを無菌的に加えて、血清型６Ｂ（所期の８μｇ／ｍＬまで希釈する）を除く全ての肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型について、所期の最終濃度４μｇ／ｍＬとし、最終アルミニウム濃度２５０μｇ／ｍＬとする。アジュバント添加された製剤バッチを、バイアル又は注射器に入れる。

ある種の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。別の実施形態では、アジュバントはＯＤＮ １８２６であり、これは、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから取得可能である。

「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」及び類似した用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含む６〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド分子を指す。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００３， Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４２９７を参照する。別の実施形態では、該用語の任意の他の当該技術分野で認知された定義が意図される。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、任意の合成ヌクレオシド間連結を用いた修飾オリゴヌクレオチド、修飾塩基及び／又は修飾糖鎖を含む。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｕｒ ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：６２８４−９３；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ， ２００６， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９−５８；及びＹａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ， ２００６， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． ２３：８９−１１０に記載されている。

投与／投薬量
本明細書に記載の組成物及び製剤は、ワクチンを全身経路又は粘膜経路によって投与することによって、感染、例えば肺炎球菌感染を受けやすいヒトを保護又は治療するのに用いることができる。例えば、本明細書に記載の組成物及び製剤を、ヒトに免疫学的有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物若しくは製剤を投与することを含む、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答の誘発方法で用いることができる。別の例において、本明細書に記載の組成物及び製剤を、ヒトに免疫学的（ｉｍｍｕｎｏｇｉｃａｌｌｙ）有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物若しくは製剤を投与する段階を含む、ヒトに肺炎球菌感染に対するワクチン化する方法で用いることができる。

特定のワクチンのための成分の至適量は、対象者における適切な免疫応答の観察が関与する標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトワクチン化のための投薬量は、動物試験からヒトデータへの外挿によって決定される。別の実施形態において、投薬量は経験的に決定される。

本発明の組成物の「有効量」は、後の抗原刺激の際に、微生物、例えば肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｉｙ）の尤度又は重症度を有意に低減させる抗体を誘発するに必要とされる用量を指す。

本明細書に記載の組成物及び製剤を用いる方法は、微生物、例えば肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる主要な臨床症候群（侵襲性感染（髄膜炎、肺炎、及び菌血症）と、非侵襲性感染（急性中耳炎、及び副鼻腔炎）の両方を含む）の予防及び／又は低減のために用いることができる。

本明細書に記載の組成物及び製剤の投与は、筋肉、腹腔内、皮内若しくは皮下経路による注射；又は経口／消化管、気道若しくは尿生殖路への粘膜投与のうちの１以上を含むものであり得る。１実施形態では、鼻腔内投与が肺炎又は中耳炎の処置に使用される（肺炎球菌の鼻咽頭通過がより有効に抑制され得ることから、初期の段階で感染が減弱されるため）。

各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、有意な有害効果なく免疫防御応答を誘発する量として選択される。そのような量は、肺炎球菌の血清型に応じて異なり得る。一般的に、多糖系コンジュゲートの場合、各用量は、０．１〜１００μｇ、特に０．１〜１０μｇ、より特別には１〜５μｇの各多糖を含む。例えば、各用量は、各多糖１００、１５０，２００、２５０、３００、４００、５００若しくは７５０ｎｇ又は１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００μｇを含み得る。

特定のワクチンのための成分の至適量は、対象者における適切な免疫応答の観察が関与する標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトワクチン接種のための投薬量は、動物試験からヒトデータへの外挿によって決定される。別の実施形態において、投薬量は経験的に決定される。

１実施形態において、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００若しくは７００μｇ、又は１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ若しくはそれ以上である。また別の実施形態では、上記のアルミニウム塩の用量は、組換えタンパク質１μｇ当たりのものである。

概して、各０．５ｍＬ用量は、血清型６Ｂ多糖が４μｇである以外は２μｇの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖；約３２μｇのＣＲＭ１９７キャリアタンパク質（例えば、３２μｇ±５μｇ、±３μｇ、±２μｇ、又は±１μｇ）；０．１２５ｍｇの元素アルミニウム（０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）アジュバント；並びに塩化ナトリウム及びＬ−ヒスチジンバッファーを含むように製剤される。塩化ナトリウム濃度は、約１５０ｍＭ（例えば、１５０ｍＭ±２５ｍＭ、±２０ｍＭ、±１５ｍＭ、±１０ｍＭ、又は±５ｍＭ）であり、Ｌ−ヒスチジンバッファーは約２０ｍＭ（例えば、２０ｍＭ±５ｍＭ、±２．５ｍＭ、±２ｍＭ、±１ｍＭ、又は±０．５ｍＭ）である。

本明細書に記載の組成物若しくは製剤を用いる方法によれば、そして１実施形態において、対象者はヒトである。ある種の実施形態では、ヒト患者は乳児（１歳未満）、よちよち歩きの子供（およそ１２〜２４ヶ月）、又は幼児（およそ２〜５歳）である。他の実施形態では、ヒト患者は高齢患者（＞６５歳）である。また、本発明の組成物は、年長児、青年及び成人（例えば、年齢１８〜４５歳又は１８〜６５歳）での使用にも適している。

本明細書に記載の組成物若しくは製剤を用いる方法の１実施形態では、組成物若しくは製剤は単回接種物として投与される。別の実施形態では、その組成物若しくは製剤は、２回、３回又は４回又はそれ以上、充分に間隔をあけて投与される。例えば、該組成物若しくは製剤は、１、２、３、４、５若しくは６ヶ月間隔で、又はその任意の組合せの間隔で投与され得る。免疫化スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に設計されたスケジュールに従うことができる。例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児及びよちよち歩きの子供での常套的なスケジュールは、２、４、６及び１２〜１５ヶ月齢のときである。従って、好ましい実施形態では、該組成物は、年齢が２、４、６及び１２〜１５ヶ月齢で一連の４回の用量で投与される。

また、本明細書に記載の組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の１以上のタンパク質も含んでいてもよい。含めるのに適した肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）タンパク質の例としては、国際特許公開第０２／０８３８５５号及び同第０２／０５３７６１号において特定されるものを含む。

製剤
本明細書に記載の組成物は、対象者に当業者に公知の１以上の方法、例えば、非経口、経粘膜、経皮、筋肉、静脈、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内にて投与することができ、それに応じて製剤化することができる。

１実施形態において、本明細書に記載の組成物は、液体製剤の表皮注射、筋肉注射、静脈、動脈、皮下注射、又は呼吸粘膜内注射によって投与される。注射のための液体製剤としては液剤などを含む。

当該組成物は、単回投与バイアル、複数投与バイアル又は充填済注射器として製剤化することができる。

別の実施形態では、当該組成物は、経口投与され、従って、経口投与に適した形態、即ち、固体又は液体の調製物として製剤される。固体経口製剤としては、錠剤、カプセル、丸剤、粒剤、ペレットなどを含む。液体経口製剤としては、液剤、懸濁液、分散液、乳濁液、オイルなどを含む。

液体製剤用の薬学的に許容される担体は、水系若しくは非水系の溶液、懸濁液、乳濁液又はオイルである。非水系溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水系担体には、水、アルコール系／水系の溶液、乳濁液又は懸濁液、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体を含む。オイルの例は、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、又はミルク若しくは卵に由来する脂質である。

医薬組成物は、等張性、低張性、又は高張性であることができる。しかしながら、多くの場合、注入又は注射用の医薬組成物は、投与されるとき本質的に等張性であることが好ましい。従って、保存の際、医薬組成物は、好ましくは等張性又は高張性であり得る。医薬組成物が保存の際に高張性である場合、投与前に等張性溶液となるように希釈することができる。

等張性薬剤は、塩のようなイオン性等張性薬剤又は糖類のような非イオン性等張性薬剤であり得る。イオン性等張性薬剤の例としては、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ及びＭｇＣｌ_２を含み、これらに限定されるものではない。非イオン性等張性薬剤の例としては、ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含み、これらに限定されるものではない。

また、少なくとも１種類の薬学的に許容され得る添加剤は、緩衝剤であることが好ましい。目的によっては、例えば、医薬組成物が注入又は注射用である場合、その組成物に緩衝剤を含有させることが望ましいことが多く、緩衝剤は、溶液を４〜１０の範囲、例えば５〜９、例えば６〜８のｐＨに緩衝する能力を有する。

緩衝剤は、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸、グルタミン、乳酸、マレイン酸、酒石酸、リン酸、クエン酸、炭酸、グリシン酸、ヒスチジン、グリシン、コハク酸及びトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択され得る。

さらに、緩衝剤は、例えば、特に、医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためＵＳＰ適合緩衝剤から選択されるものであり得る。例えば、緩衝剤は、一塩基酸（酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸及び乳酸）；二塩基酸（アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸及び酒石酸）、多塩基酸（クエン酸及びリン酸）；並びに塩基（アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミン及びＴＲＩＳ）からなる群から選択することができる。

非経口媒体（皮下、静脈、動脈又は筋肉注射用）としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液及び揮発油を含む。静脈用媒体としては、体液補給液及び栄養補給液、電解質補給液（例えば、リンゲルデキストロース主体のもの）などを含む。例は、界面活性剤及び他の薬学的に許容されるアジュバントの添加を伴う又は伴わない、滅菌液状物（水及びオイルなど）である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連糖溶液、グリコール（プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、ポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）、ポリソルベート−２０（ＰＳ−２０）、及びポロキサマー１８８（Ｐｌ８８）が好ましい液体担体である（特に、注射用液剤に）。オイルの例は、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の魚油、又はミルク若しくは卵に由来する脂質である。

また、当該製剤に界面活性剤を含めてもよい。好ましい界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にはＴｗｅｅｎと称される）、特に、ＰＳ−２０及びＰＳ−８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（商標名ＤＯＷＦＡＸ（商標名）で販売）、例えば、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール（これは、反復エトキシ（オキシ−ｌ，２−エタンジイル）基の数が多様であることができ、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標名）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリル及びオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；並びにソルビタンエステル（一般的にはＳＰＡＮとして公知である）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）及びソルビタンモノラウレートを含み、これらに限定されるものではない。本乳濁液に含めるのに好ましい界面活性剤は、ＰＳ−２０又はＰＳ−８０である。

界面活性剤の混合物（例えば、ＰＳ−８０／Ｓｐａｎ ８５混合物）を使用することもできる。また、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ−８０））とオクトキシノール（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））の組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステル及び／又はオクトキシノールを含む。

界面活性剤の好ましい量は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＰＳ−８０など）が０．０１〜１重量／体積％、特に約０．１重量／体積％；オクチル−又はノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤）が０．００１〜０．１重量／体積％、特に０．００５〜０．０２重量／体積％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）が０．１〜２０重量／体積％、好ましくは０．１〜１０重量／体積％、特に０．１〜１重量／体積％又は約０．５重量／体積％である。

ある種の実施形態において、当該組成物は、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）とともに、ｐＨ５．８のＬ−ヒスチジン（２０ｍＭ）、生理食塩水（１５０ｍＭ）及び０．２％重量／体積ＰＳ−２０から本質的になる。ＰＳ−２０は、模擬製造時及び一次包装を用いる輸送での凝集を抑制する製剤中、ＰＳ−２０又はＰＳ−８０が存在して、０．００５〜０．１％重量／体積の範囲であることができる。プロセスは、最大４４種類の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖血清型／Ｌ−ヒスチジン、塩化ナトリウム、及びＰＳ−２０の混合物を合わせること、次にこの混合物を抗菌性保存剤とともに若しくはそれを含まずにＡＰＡ及び塩化ナトリウムと合わせることからなる。

異なる薬剤製品及び薬剤原料について、界面活性剤の選択を至適化する必要がある場合がある。１５以上の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖血清型を含む多価ワクチンの場合、ＰＳ−２０及びＰ１８８が好ましい。コンジュゲートを作るのに用いられる化学の選択も、製剤の安定化に影響し得る。特に、下記で例示するように、水系媒体若しくはＤＭＳＯ溶媒中で調製され、多価組成物に組み合わされた肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートは、製剤に使用される特定の界面活性剤系に依存して、安定性に大きな差を示す。

本明細書に記載の製剤の場合、ポロキサマーは通常、１，１００Ｄａ〜１７，４００Ｄａ、７，５００Ｄａ〜１５，０００Ｄａ又は７，５００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ポロキサマーは、ポロキサマー１８８又はポロキサマー４０７から選択することができる。本発明の製剤中のポロキサマーの最終濃度は、０．００１〜５％重量／体積、又は０．０２５〜１％重量／体積である。ポロキサマーを含む界面活性剤系はさらに、多価アルコールを含むものでなければならない。ある種の態様において、その多価アルコールは、プロピレングリコールであり、そして、最終濃度１〜２０％重量／体積で含まれる。ある種の態様において、多価アルコールはポリエチレングリコール４００であり、そして、最終濃度１〜２０％重量／体積で含まれる。

製剤に好適な多価アルコールは、ポリマー性多価アルコール、特にポリエーテルジオール類、例えばプロピレングリコール及びポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル類（これらに限定されるものではない）を含む。プロピレングリコールは、約４２５Ｄａ〜約２，７００Ｄａのモノマー分子量範囲で入手可能である。ポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールモノメチルエーテルは、約２００Ｄａ〜約３５，０００Ｄａの範囲の分子量でも入手可能であり、例えばＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧＭＭＥ５５０、ＰＥＧＭＭＥ６００、ＰＥＧＭＭＥ２０００、ＰＥＧＭＭＥ３３５０及びＰＥＧＭＭＥ４０００を含み、これらに限定されるものではない。好ましいポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール４００である。製剤中の多価アルコールの最終濃度は、１〜２０％重量／体積又は６〜２０％重量／体積であることができる。

当該製剤は、ｐＨ緩衝生理食塩水溶液も含む。緩衝剤は、例えば、Ｔｒｉｓ、酢酸、グルタミン、乳酸、マレイン酸、酒石酸、リン酸、クエン酸、炭酸、グリシン酸、Ｌ−ヒスチジン、グリシン、コハク酸、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）及びトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択することができる。緩衝剤は、４〜１０、５．２〜７．５又は５．８〜７．０の範囲のｐＨに溶液を緩衝する能力を有する。ある種の態様において、緩衝剤は、リン酸塩、コハク酸塩、Ｌ−ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩又はクエン酸塩からなる群から選択される緩衝剤である。緩衝剤はさらに、例えば、特に、医薬製剤が非経口用である場合、非経口用途についてのＵＳＰ適合緩衝剤から選択することができる。緩衝液の濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭ又は５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲である。ある種の態様において、緩衝剤は、最終濃度５ｍＭ〜５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、又は最終濃度１ｍＭ〜１０ｍＭのコハク酸塩である。ある種の態様において、Ｌ−ヒスチジンは最終濃度２０ｍＭ±２ｍＭである。

生理食塩水溶液（即ち、ＮａＣｌを含む溶液）が好ましいが、製剤に好適な他の塩には、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ及びＭｇＣｌ_２及びそれらの組み合わせを含み、これらに限定されるものではない。ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール及びグリセリン（これらに限定されるものではない）のような非イオン性等張性剤を、塩の代わりに用いることもできる。好適な塩の範囲は、２５ｍＭ〜５００ｍＭ又は４０ｍＭ〜１７０ｍＭを含み、これらに限定されるものではない。１態様において、生理食塩水はＮａＣｌであり、濃度２０ｍＭ〜１７０ｍＭで存在しても良い。

好ましい実施形態では、当該製剤は、塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジン緩衝剤を含む。

別の実施形態では、医薬組成物は制御放出系にて送達される。例えば、該薬剤は、静脈注入、経皮貼付剤、リポソーム、又は他の投与様式を用いて投与することができる。別の実施形態では、ポリマー物質は、例えばマイクロスフィア又はインプラントにおいて使用される。

本明細書に記載の組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの１以上のタンパク質を含むこともできる。含めるのに好適な肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）タンパク質の例は、国際特許出願公開番号ＷＯ０２／０８３８５５及びＷＯ０２／０５３７６１で確認されているものを含む。

分析方法
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを用いるコンジュゲートの分子量及び濃度分析
コンジュゲートサンプルを注入し、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって分離する。検出は、一連の紫外線（ＵＶ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）及び屈折率（ＲＩ）検出によって行う。減衰係数を用いて、ＵＶ２８０からタンパク質濃度を計算する。ｍＬ／ｇ単位で報告される溶質濃度における変化による溶液の屈折率変化であるｄｎ／ｄｃ係数を用いて、ＲＩシグナル（タンパク質及び多糖の両方による寄与）から、多糖濃度を解明する。サンプルの平均分子量は、測定された濃度及びサンプルピーク全体の光散乱データを用いて、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡ）から計算する。多分散分子については、多くの形態の分子量平均値がある。例えば、数平均分子量Ｍｎ、重量平均分子量Ｍｗ、及びｚ−平均分子量Ｍｚ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１５， ２０：１０３１３−１０３４１）である。指定がなければ、本明細書を通じて使用される場合、「分子量」という用語は、重量平均分子量である。

多糖とキャリアタンパク質の間の共有結合的結合数の尺度としてのコンジュゲート化タンパク質におけるリジン消費の測定
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ−Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて、コンジュゲートサンプル中のコンジュゲーションの程度を測定する。Ｅｌｄｅｘワークステーションでの気相酸加水分解を用いてサンプルを加水分解して、キャリアタンパク質をそれの成分アミノ酸に分解する。その遊離アミノ酸を、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカーバメート（ＡＱＣ）を用いて誘導体化する。次に、得られた誘導体化サンプルを、Ｃ１８カラムでのＵＶ検出を行うＵＰＬＣを用いて分析する。平均タンパク質濃度を、リジン以外の代表的なアミノ酸を用いて得る。コンジュゲーション時のリジン消費（即ち、リジン損失）を、コンジュゲート中のリジンの平均測定量と出発タンパク質中のリジンの予測量との間の差によって求める。

遊離多糖試験
最初に遊離タンパク質及びコンジュゲートをデオキシコール酸塩（ＤＯＣ）及び塩酸を用いて沈澱させることで、コンジュゲートサンプル中の遊離多糖（即ち、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしない多糖）を測定する。次に、沈澱を濾去し、濾液について、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって遊離多糖濃度を分析する。遊離多糖を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって測定される総多糖のパーセントとして計算する。

遊離タンパク質試験
コンジュゲートサンプル中の遊離多糖、多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、及び遊離ＣＲＭ１９７を、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）モードでのキャピラリー電気泳動によって分離する。即ち、サンプルを、２５ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭＳＤＳ、ｐＨ９．３を含むＭＥＫＣランニングバッファーと混合し、予めコンディショニングした未処理溶融シリカキャピラリーで分離する。分離を２００ｎｍでモニタリングし、遊離ＣＲＭ１９７を、ＣＲＭ１９７標準曲線を用いて定量する。遊離タンパク質の結果を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ手順によって求めた総タンパク質含有量のパーセントとして報告する。

以上、添付の説明文及び図面に関して本発明の種々の実施形態を記載したが、理解すべき点として、本発明は、詳述した実施形態に限定されないこと、及び当業者には、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく種々の変更及び修正が行われ得る。

以下の実施例により本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。

実施例１：肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖の製造
肺炎球菌の培養方法は当業界で公知である。例えば、Ｃｈａｓｅ， １９６７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：５２を参照する。肺炎球菌莢膜多糖の製造方法も当業界で公知である。例えば、欧州特許ＥＰ０４９７５２４Ｂ１を参照する。下記に記載のプロセスは、欧州特許ＥＰ０４９７５２４Ｂ１に記載の方法に従っており、特異的に修飾されている場合を除き全ての肺炎球菌血清型に適用可能である。

肺炎球菌血清型３、８、１２Ｆの単離物を、ペンシルバニア大学から入手した（Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕｓｔｒｉａｎ博士）。肺炎球菌血清型１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ、３５Ｂの単離物は、Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。肺炎球菌血清型２３Ｂ及び３１の単離物は、疾病管理予防センター（Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）から得た。肺炎球菌血清型１７Ｆの単離物は、ＦＤＡ生物学的製剤オフィスから得た（Ｊｏｈｎ Ｒｏｂｂｉｎｓ博士）。肺炎球菌血清型２０の単離物は、ＡＴＣＣから入手した。必要な場合、特異的抗血清を用いるクエルング（Ｑｕｅｌｌｉｎｇ）反応に基づいて、サブタイプを分識別することができる。例えば、米国特許第号５，８４７，１１２を参照する。得られた単離物を、ヘミンを含まない大豆ペプトン、酵母抽出物及びグルコースを含む動物成分非含有培地からなる寒天プレートで２段階で連続的に蒔くことで、さらにクローン的に単離した。大豆ペプトン、酵母抽出物、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、グルコース及びグリセリンを含む動物成分非含有培地を用いる液体培養で、各血清型についてのクローン単離物をさらに増殖させて、プレマスターセルバンクを作った。

肺炎球菌多糖の各血清型の製造は、細胞増殖及びバッチ製造発酵とそれに続く化学的失活とそれに続く下流精製からなるものであった。各血清型からの解凍セルバンクバイアルを、大豆ペプトン若しくは大豆ペプトン限外濾過液、酵母抽出物又は酵母抽出物限外濾過液、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム及びグルコースを含む滅菌済み動物成分非含有増殖培地の入った振盪フラスコ若しくは培養瓶を用いて増殖させた。細胞増殖培養物を密閉振盪フラスコ又は瓶中で増殖させて、温度及び攪拌制御下にガス交換を最小とした。６００ｎｍでの光学密度によって測定される指定の培養物密度を達成したら、細胞増殖培養物の一部を、大豆ペプトン若しくは大豆ペプトン限外濾過液、酵母抽出物若しくは酵母抽出物限外濾過液、塩化ナトリウム、リン酸カリウム及びグルコースを含む滅菌済み動物成分非含有増殖培地の入った製造発酵槽に移し入れた。温度、ｐＨ、圧力及び攪拌を制御した。スパージングを用いずに、空気流オーバーレイも制御した。

グルコースがほぼ消耗したら、化学失活剤であるフェノールを加えることで、バッチ発酵を終了させた。純粋なフェノールを最終濃度０．８〜１．２％の最終濃度まで加えて、細胞を失活させ、細胞壁から莢膜多糖を放出させた。一次失活は発酵槽内で指定時間にわたって行い、その際に温度及び攪拌の継続を制御される。一次失活後、バッチを別の容器に移し入れ、そこでそれを、さらなる指定時間にわたり、制御された温度及び攪拌下に保持して、失活を完了させた。それを、微生物プレーティング技術又はフェノール濃度及び指定時間の検証のいずれかによって確認した。次に、失活したブロスを精製した。

Ｐｓの精製
肺炎球菌多糖の精製は、数回の遠心、深層濾過、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、及び沈澱段階からなるものであった。全ての手順は、別段の断りがない限り室温で行った。

肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の発酵槽培養物からの失活ブロスを、カチオン性ポリマー（例えば、ＢＰＡ−１０００、Ｐｅｔｒｏｌｉｔｅ「Ｔｒｅｔｏｌｉｔｅ」及び「Ｓｐｅｃｔｒｕｍ８１６０」及びポリ（エチレンイミン）、「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐＤＡＤＭＡＣ」）で凝集させた。カチオン性ポリマーが、不純物であるタンパク質、核酸及び細胞残屑に結合した。凝集段階及び熟成期間後、凝集固体を遠心及び複数回の深層濾過段階によって除去した。精製したブロスを濃縮し、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）フィルターを用いてダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ_２緩衝剤及びリン酸ナトリウム緩衝剤を用いて行った。ダイアフィルトレーションによって、残留核酸及びタンパク質を除去した。

酢酸ナトリウム及びフェノール中の多糖の変性アルコール及び／又はイソプロパノールによる再沈澱によって、さらなる不純物除去を行った。フェノール沈澱段階の際、酢酸ナトリウム／リン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液及びフェノール（液化フェノール類又は固体フェノール類）を、ダイアフィルトレーションした残余物に加えた。次に、多糖のアルコール分別を、２段階で行った。第１の段階では、低パーセントアルコールを沈澱に加えて、細胞残屑及び他の望ましくない不純物を沈澱させたが、粗多糖は溶液中に残った。不純物を、深層濾過段階によって除去した。次に、追加のイソプロパノール又は変性アルコールをバッチに加えることで、多糖を溶液から回収した。沈澱した多糖ペレットを、遠心によって回収し、摩砕し、粉末として乾燥させ、−７０℃で冷凍保存した。

実施例２：一般的なコンジュゲーション法
多糖サイズ低下及び酸化
精製した肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶かし、０．４５ミクロン濾過した。別段の断りがない限り、多糖は均質化して、多糖分子量を低下させた。均質化圧力及びホモジナイザーを通過する回数を、血清型固有の設定に制御した（１５０〜１０００バール；４〜７回通過）。

サイズ低下した多糖を０．２ミクロン濾過し、濃縮し、５ｋＤａ又は１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を用いて蒸留水に対してダイアフィルトレーションした。

次に、多糖溶液を２２℃に調節し、酢酸ナトリウム緩衝剤でｐＨ５に調節して、活性化による多糖サイズ低下を最小化した。

精製多糖をコンジュゲーション用に準備し、即ち、メタ過ヨウ素酸ナトリウム酸化を用いて活性化した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：１１８１−１１８６；及び米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１０１９５０８６を参照する）。１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を、多糖の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中溶液に加えた。加えたメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、約０．１〜０．５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム／多糖繰り返し単位１モルの範囲で、血清型に固有のものとして、目的のレベルの多糖活性化が達成されるようにした（多糖繰り返し単位１モル当たりのアルデヒドモル数）。サンプルを、遮光しながら所定のインキュベーション時間にわたって混和した。

得られた活性化生成物を、５ｋＤａ又は１０ｋＤａＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を用いて、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対して、次に蒸留水に対してダイアフィルトレーションし、次に水に対してさらなるダイアフィルトレーションを行った。全ての血清型についての限外濾過を２〜８℃で行った。

コンジュゲーション
既報の方法（ＷＯ２０１２／１７３８７６Ａ１）に従って蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現によって得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を用いて２ｍＭリン酸ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロンフィルターで濾過した。

活性化多糖を、ショ糖濃度０．５〜３０％重量／体積で、１〜６ｍｇＰｓ／ｍＬでの凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、ショ糖濃度１％重量／体積で、６ｍｇＰｒ／ｍＬでの凍結乾燥用に製剤化した。

製剤化したＰｓ及びＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓ及びＣＲＭ１９７物を，個別に等体積のＤＭＳＯに再溶解させた。多糖及びＣＲＭ１９７溶液を混合して、目的の多糖濃度及び多糖：ＣＲＭ１９７質量比を達成した。その質量比を選択して、得られたコンジュゲートにおける多糖：ＣＲＭ１９７比を制御した。水素化シアノホウ素ナトリウム（１モル／多糖繰り返し単位１モル）を加え、コンジュゲーションを、２２℃で所定の期間にわたって進行させた。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後に、水素化ホウ素ナトリウム（２モル／多糖繰り返し単位１モル）を加えた。そのバッチを、約４℃で、約０．０２５％（重量／体積）ポリソルベート２０によって１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に希釈した。次に、リン酸カリウム緩衝液を加えてｐＨを中和した。

最終濾過及び生成物貯蔵
次に、コンジュゲートを、３００ｋＤａ ＮＭＷＣ膜を用い、約４℃で０．０５％（重量／体積）ポリソルベート２０を用いて１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析するか、３０ｋＤａＮＭＷＣ接線流限外濾過膜を用いて２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７を含む若しくは含まない１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対してダイアフィルトレーションし、次に濃縮し、そして、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を用いて４℃で０．０１５％（重量／体積）ポリソルベート２０を含む１０ｍＭヒスチジン／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）に対してダイアフィルトレーションした。残余バッチを追加の１０ｍＭヒスチジン／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）で濾過し、０．２ミクロン濾過した。最終コンジュゲート溶液を小分けし、≦−６０℃で凍結させた。

実施例３：血清型１２Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ及び３１からの多糖の酸加水分解
ＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化による肺炎球菌多糖のタンパク質へのコンジュゲーションが以前に報告されている。典型的には、活性化多糖（Ｐｓ）及びタンパク質（Ｐｒ）を凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再懸濁させ、次に混合し、そして、水素化シアノホウ素ナトリウム及び水素化ホウ素ナトリウムとともにインキュベートして、コンジュゲーションを行った。多糖を機械的にサイズ低下させてから（例えば、均質化によって）、酸化させてＰｓ分子量を低下させ、コンジュゲーション用の一定のＰｓサイズを得ることができる。多くの肺炎球菌血清型について、機械的にサイズ低下し、酸化したＰｓのコンジュゲーションによって、サイズ、リジン消費、遊離多糖及び遊離タンパク質についての目的の特性を満足するコンジュゲートを得る。しかしながら、一部の血清型について、プロセスパラメータを至適化した後であっても、このプロセスでは、目的のコンジュゲート特性が達成困難であることが認められた。

Ｐｓサイズ低下
血清型２３Ａ、２４Ｆ及び３１からの精製肺炎球菌莢膜多糖粉末を、水に溶かした。異なる実験アームを、均質化によって機械的に又は酸加水分解によって化学的に処理して、Ｐｓの分子量を低下させた。均質化圧力及びホモジナイザーを通過する回数を、血清型固有の設定に制御した（１５０〜１０００バール；４〜７回通過）。バッチを加熱して９０〜９２℃とし、濃酢酸を加えて最終濃度２００ｍＭとし、次に最大９０分間インキュベートすることで、酸加水分解を行った。インキュベーション期間終了後、濃リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を最終濃度４００ｍＭまで加え、冷却して≦２２℃とすることで、バッチを中和した。サイズ低下した多糖を０．２ミクロン濾過し、濃縮し、５ｋＤａ又は１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を用いて水に対してダイアフィルトレーションした。

多糖を、実施例２に記載の方法に従って、コンジュゲートした。

実験条件及び結果を表１にまとめてある。

表１．肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２３Ａ、２４Ｆ、及び３１についての実験アーム、均質化と酸加水分解によるＰｓサイズ低下のまとめ

表１でわかるように、酸加水分解によるサイズ低下によって、均質化の場合と比較して、高いリジン損失（血清型２３Ａ）、低い遊離Ｐ類（血清型２４Ｆ及び３１）、又は低い遊離Ｐｒ（血清型２３Ａ、２４Ｆ及び３１）を達成する手段が提供された。血清型２３Ａ及び２４Ｆの場合、均質化におけるより高い遊離タンパク質レベルは、凝集型に関連していた可能性があり、そしてそれがより高い測定コンジュゲートＭｗレベルに寄与していた可能性がある。

いずれか特定の理論に拘束されるものではないが、データは、酸加水分解によって達成された酸化多糖の相対的に低い分子量（優先的には、１５０ＫＤａ未満）がコンジュゲーションを改善する上で役だった（より少ない遊離Ｐ類又は遊離Ｐｒ）ことを示唆している。別のサイズ低下プロセス（例えば、酸加水分解によるもの）を用いて、この好ましいサイズ範囲での多糖を達成して、同様のコンジュゲーション効果を得る事が可能であると考えられる。

血清型１２Ｆの酸加水分解に対する一定ｐＨを維持しながらの酸型の影響
酸型が多糖サイズに影響したか否かを確認するため、塩酸を用いる酸加水分解を酢酸と比較した。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆからの精製肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶かし、０．４５μｍ濾過した。そのバッチを２．５ｇ Ｐｓ／Ｌに希釈し、二つのアームに分けた。両方のアームについて、最初にそれらを８０℃まで加熱することで、酸加水分解を行った。両方のアームとも同様のｐＨを維持するために、酸を加えた。一方のアームに、氷酢酸を最終濃度２００ｍＭ、ｐＨ２．６まで加えた。他方のアームに、１Ｎ塩酸を最終濃度２．５ｍＭ、ｐＨ２．７まで加えた。次に、両方のアームを１５５分間インキュベートした。インキュベーション期間終了後、濃リン酸カリウムｐＨ緩衝液を最終濃度約４００ｍＭまで加え、冷却して４℃とすることでアームを中和した。結果を表２に示してある。

表２：塩酸を用いる肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）１２Ｆ多糖の酸加水分解

実施例４：肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３、８及び２４Ｆからの多糖のＤＭＳＯ中の溶解に対する、ショ糖：多糖質量比の影響
非プロトン性溶媒中での多糖のタンパク質へのコンジュゲーションへの準備のため、代表的には、多糖及びタンパク質溶液を凍結乾燥する。ほとんどの肺炎球菌血清型について、ショ糖濃度５％重量／体積（５０ｍｇショ糖／ｍＬ）とともに６ｍｇＰｓ／ｍＬの水溶液での凍結乾燥用に活性化多糖（Ｐｓ）を製剤化することで、ＤＭＳＯ中での再溶解及びコンジュゲーションに適した凍結乾燥物が得られた。血清型３、８、及び２４Ｆに関して、この製剤（６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬ、５０ｍｇショ糖／ｍＬ、ショ糖：Ｐｓ質量比＝８．３）により、ＤＭＳＯに溶けない凍結乾燥物が得られることがわかった。

ＤＭＳＯ中での溶解のために活性化多糖凍結乾燥製剤を至適化することを目的として、実験を行った。ポリプロピレン容器中、活性化多糖を、広範囲の多糖濃度（１〜６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬ）及びショ糖濃度（５０〜３００ｍｇショ糖／ｍＬ）で製剤化した。溶液を凍結乾燥して水を除去し、次に、混和しながら環境温度でＤＭＳＯを加えて、多糖を再溶解させた。肉眼観察によって、良好に溶解したか否かを確認した。

血清型３、２４Ｆ、及び８についての結果を、それぞれ表３、４及び５に示してある。

表３．血清型３凍結乾燥製剤及び溶解実験

表４．血清型２４Ｆ凍結乾燥製剤及び溶解実験

表５：血清型８凍結乾燥製剤及び溶解実験

これらの血清型については、（凍結乾燥及び溶解の両方について）調べた多糖濃度の範囲で、完全な溶解が認められたが、溶解は多糖及びショ糖濃度の両方に依存するものであった。具体的には、ショ糖の質量比が、多糖の場合の３０倍未満であった場合、凍結乾燥後のＤＭＳＯ中での溶解は達成されなかった。最も一貫性のある溶解結果は、ショ糖質量比が多糖の場合の少なくとも４０倍であった場合に認められた。

陽性溶解条件からのいくつかのアームが、実施例２に記載のようにＣＲＭ１９７に良好にコンジュゲートされた。

ＤＭＳＯ中での血清型３からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖の溶解に対する糖の種類及び糖：多糖質量比の影響
ＤＭＳＯ中での凍結乾燥された活性化多糖溶解に対する糖の種類及び糖：多糖質量比の影響を評価するために実験を行った。活性化血清型３多糖を、ポリプロピレン容器中、２．５若しくは６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬのいずれか、及びある範囲の糖濃度（５０〜１５０ｍｇ糖／ｍＬ）で製剤化した。調べた糖は、ショ糖、トレハロース及びマンニトールであった。溶液を凍結乾燥して水を除去し、次に、混和しながら環境温度でＤＭＳＯを加えて、多糖を再溶解させた。肉眼観察によって、良好に溶解したか否かを確認した。結果を表６に示してある。

表６：血清型３多糖に対する糖の種類の影響

使用した全ての糖について、６０倍でＤＭＳＯ中の溶解度限界に達するように見えたマンニトールを除き、３０倍以上の糖質量比で、ＤＭＳＯ中の溶解が達成された。最も一貫性のある溶解結果は、糖質量比が多糖の場合の少なくとも４０倍であった場合に認められた。

活性化血清型３多糖凍結乾燥製剤での糖の組み合わせの使用を見ながら、別の実験を行った。全てのアームを４０倍の総糖質量比に製剤化したが、それは、この比率によってＤＭＳＯ中での一貫した溶解が得られたからである。多糖の分子量は１７１ｋＤであった。全てのアームは、ショ糖を、単独で、トレハロースとともに又はマンニトールとともに使用した。溶液を凍結乾燥して水を除去し、次に混和しながら環境温度でＤＭＳＯを加えて多糖を再溶解させた。肉眼観察によって、良好に溶解したか否かを確認した。結果を表７に示してある。

表７：多糖のＤＭＳＯ中での溶解に関する糖組み合わせ

試験を行った全てのアームについて、ＤＭＳＯ中の溶解が達成された。

実施例５：ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いる肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２４Ｆ及び３５Ｂのコンジュゲーションに対する塩化ナトリウムの効果
活性化多糖を、ポリプロピレン容器中、ショ糖濃度５〜１０％重量／体積とともに２〜６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、ショ糖濃度１％重量／体積とともに６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。

製剤化したＰｓ及びＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥Ｐｓ及びＣＲＭ１９７材料を、ＤＭＳＯ中で再溶解させた。一部のアームについて、５Ｍ塩化ナトリウムストック溶液を用いて、凍結乾燥前のＣＲＭ１９７溶液又は再溶解Ｐｓ溶液をスパイクして、１０〜１００ｍＭ塩化ナトリウムのコンジュゲーション時最終濃度を達成した。他のプロセスパラメータは、これらの実験において一定に維持した。

再溶解したＰｓ溶液及びＣＲＭ１９７溶液を混合し、混和して、血清型固有の多糖及びタンパク質濃度を得た。水素化シアノホウ素ナトリウム（１モル／多糖繰り返し単位１モル）を加え、血清型固有の期間にわたってコンジュゲーションを進行させた。水素化ホウ素ナトリウムによる還元及び最終濾過を、実施例２に記載のように行った。

結果
コンジュゲート特性に対するコンジュゲーション時の塩化ナトリウムの影響を示す肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０からの多糖についての実験結果を、図１、２及び３に示している。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１６Ｆ及び２４Ｆについての実験結果を表８に示している。

血清型２０について図１に示したように、コンジュゲーション時の塩化ナトリウム濃度上昇（最大５０ｍＭ）によって、コンジュゲートサイズが大きくなった。図２に示したように、塩化ナトリウム濃度の上昇（最大約２５ｍＭ）によって消費が増加し、図３に示したように、塩化ナトリウム濃度上昇（最大約５０ｍＭ）によって遊離Ｐ類及び遊離Ｐｒが減少した。

表８．肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１６Ｆ及び２４Ｆについてのコンジュゲート特性に対する塩化ナトリウムの影響

血清型１６Ｆについて表８に示したように、コンジュゲーション時に２５ｍＭ塩化ナトリウムを含めることで、コンジュゲートサイズ及びリジン消費が増加したが、遊離Ｐ類及び遊離Ｐｒは減少した。血清型２４Ｆについて表８に示したように、コンジュゲーション時に２５ｍＭ塩化ナトリウムを含めることで、リジン消費が増加したが、遊離Ｐ類及び遊離Ｐｒが減少した。

同様の結果が血清型１５Ａ及び３５Ｂについて認められた。血清型１５Ａの場合、コンジュゲーション時に２５ｍＭ塩化ナトリウムを含めることで、コンジュゲーション時に無塩の場合と比較して、コンジュゲートサイズ及びリジン消費が増加したが、遊離多糖及び遊離タンパク質が減少した。血清型３５Ｂの場合、コンジュゲーション時に２５ｍＭ塩化ナトリウムを含めることで、コンジュゲーション時に無塩の場合と比較して、コンジュゲートサイズ及びリジン消費が増加したが（データは示していない）、遊離タンパク質は減少した。

ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いる肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１７Ｆのコンジュゲーションに対する塩の種類及び濃度の効果
活性化血清型１７Ｆ多糖を、ポリプロピレン容器中、ショ糖濃度５％重量／体積とともに６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、ショ糖濃度１％重量／体積とともに６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。

製剤化したＰｓ及びＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥Ｐｓ及びＣＲＭ１９７材料をＤＭＳＯ中で再溶解させた。一部のアームについて、濃塩溶液を、再溶解Ｐｓ溶液又はＰｓ−ＣＲＭブレンドにスパイクして、コンジュゲーション時最終濃度１〜１００ｍＭ塩を達成した。用いた原液には、１Ｍ又は５Ｍ塩化ナトリウム、１Ｍ又は３Ｍ塩化カリウム及び１Ｍ塩化マグネシウムを含んだ。他のプロセスパラメータは、これらの実験において一定に維持した。

再溶解したＰｓ及びＣＲＭ１９７溶液を混合し、混和して、２．７ｇ Ｐｓ／ｍＬ及び１．８ｍｇ ＣＲＭ１９７／ｍＬとした。水素化シアノホウ素ナトリウム（１モル／多糖繰り返し単位１モル）を加え、コンジュゲーションを１時間進行させた。コンジュゲーション反応後に、水素化ホウ素ナトリウム（２モル／多糖繰り返し単位１モル）を加えた。バッチを、約４℃で、約０．０２５％（重量／体積）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムで希釈した。次に、リン酸カリウム緩衝液を加えて、ｐＨを中和した。

次に、コンジュゲートを、３００ｋＤａ ＮＭＷＣ膜を用い、約４℃で、０．０５％（重量／体積）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析した。最終コンジュゲート溶液を小分けし、４℃に維持した。

結果
結果を表９に示してある。２％が検出限界である。

塩化ナトリウム及び塩化カリウム条件について、コンジュゲーション時の塩濃度を高めることで、コンジュゲートサイズ及びリジン消費が増加し、遊離Ｐ類及び遊離Ｐｒが減少した。これらの効果は、両方の塩の種類について、約１２．５ｍＭで横ばい状態となった。２５ｍＭ及び５０ｍＭ塩化マグネシウムは、無塩条件の場合と比較してコンジュゲートサイズ及びリジン消費に増加を示した。しかしながら、塩化マグネシウム濃度の２５ｍＭから１００ｍＭへの上昇に伴って、遊離多糖レベル及び遊離タンパク質レベルの上昇、及びコンジュゲーションの程度低下（リジン損失及びコンジュゲートサイズによって測定）があるように思われる。従って、塩化マグネシウムを０〜５０ｍＭの濃度範囲に維持することが好ましい可能性がある。

実施例６：一価コンジュゲートの製剤
肺炎球菌多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、実施例２〜５に記載の方法に従って調製した。個々の血清型の目的濃度を得るのに必要なバルクコンジュゲートの必要量を、バッチ体積及び個々のバルク多糖濃縮物の濃度に基づいて計算した。個々の血清型（１２Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、及び３５Ｂ）を賦形剤と合わせ、無菌濾過し、混和条件下でＡＰＡに加えた。各一価コンジュゲートワクチンの最終濃度は、４μｇ／ｍＬ（重量／体積ＰｎＰｓ）であり、２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％（重量／体積）ＰＳ−２０及びＡＰＡの形態で０．２５０ｍｇ／ｍＬ（重量／体積Ａｌ）を含んでいた。

実施例７：一価コンジュゲートニュージーランド白ウサギ免疫原性試験（１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、及び３５Ｂ）
一価コンジュゲートの免疫原性を、ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷＲ）モデルで評価した。成体ニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝３／群）を、第０日及び第１４日に（サイドを変えて）、個々の一価コンジュゲートワクチン０．２５ｍＬにより筋肉注射（ＩＭ）で免疫付与した。一価肺炎球菌ワクチンは、免疫付与当たりリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）６２．５μｇとともに、１μｇ ＰｎＰｓ（１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１又は３５Ｂ、それぞれＣＲＭ１９７にコンジュゲート）で投与した。試験開始前（免疫前）及び第１４日（投与後１、ＰＤ１）及び２８（投与後２、ＰＤ２）に血清を採取した。疾病若しくは苦痛の徴候に関して、熟練の動物ケア担当者が少なくとも１日１回ＮＺＷＲを観察した。ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は、安全で、良好に耐容されるように思われた。いずれの動物実験も、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針における推奨事項に厳密に従って行った。ＮＺＷＲ実験プロトコールは、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｉｎｃ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， ＮＪ）及びＣｏｖａｎｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ， ＰＡ）の両社における社内動物管理及び使用委員会によって承認された。

ＮＺＷＲ血清を、１〜２ｍｇ／ｍＬの個々のＰｎＰｓコーティング濃度を用いてＥＬＩＳＡアッセイで調べて、ＩｇＧ免疫原性を評価した。既報のプロトコールに基づくオプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）によって、機能的抗体を確認した。例えば、Ｃａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｖａｃｃｉｎｅ ３５：８６５−７２及びＢｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（９）：１００４−９を参照する。

全ての一価肺炎球菌ワクチンが、ウサギにおいて免疫原性であり、個々の細菌株を殺す機能的抗体を発生させることが認められた（データは示していない）。血清型１２Ｆが、マウスにおいて免疫原性であることが認められた（データは示していない）。

Claims (47)

1. 血清型１２Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ又は３１からの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖をサイズ低下させる方法であって、当該多糖を酸加水分解反応させて、サイズ低下多糖生成物を得ることを含む方法。
2. 前記酸加水分解を、少なくとも一つの酸の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
3. 前記酸加水分解反応のｐＨが１．０〜５．０である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ｐＨが２．０〜４．０である、請求項３に記載の方法。
5. 前記ｐＨが２．５〜３．０である、請求項３に記載の方法。
6. 前記酸が、酢酸、塩酸、リン酸若しくはクエン酸、又はそれらの混合物である、請求項２に記載の方法。
7. 前記酸が酢酸である、請求項６に記載の方法。
8. 酢酸の濃度が５０〜２００ｍＭであるか、塩酸の濃度が１〜５ｍＭである、請求項６に記載の方法。
9. 前記酸加水分解を、８０℃〜９２℃の温度で行う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記サイズ低下多糖反応液を、リン酸カリウムを加えることで中和する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記サイズ低下多糖反応生成物が、無菌濾過及び／又はダイアフィルトレーションされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記サイズ低下多糖反応生成物が、１５０ｋＤａより下の平均分子量を有する多糖を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 多糖−タンパク質コンジュゲートの製造方法であって、該方法は、第１の溶液中の多糖を第２の溶液中のタンパク質と反応させて第３の溶液を形成し、その第３の溶液中で、多糖タンパク質コンジュゲーション反応を行って、多糖タンパク質コンジュゲートを生成することを含み、ここで、前記第３の溶液が少なくとも１ｍＭの塩を含む、方法。
14. 前記塩が一価若しくは二価カチオンを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記塩がナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩又はカルシウム塩である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記塩が塩化ナトリウムである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第３の溶液中の塩化ナトリウムの濃度が１〜１００ｍＭである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記塩が、第１の溶液中に存在する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記塩が、前記タンパク質を含む前記第２の溶液中に存在する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記第１の溶液及び第２の溶液が同一である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記塩を前記第３の溶液に加える、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記第３の溶液が水溶液である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記第３の溶液が非プロトン性溶媒を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記非プロトン性溶媒がＤＭＳＯである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記コンジュゲーション反応がシッフ塩基還元又は還元的アミノ化である、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記多糖が肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのものである、請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記多糖が肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１６Ｆ，１７Ｆ、２０、２３Ａ、２４Ｆ又は３５Ｂからのものである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド又はＣＲＭ１９７である、請求項１３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項２８に記載の方法。
30. 多糖を含む溶液の凍結乾燥方法であって、該方法は、
    ａ）多糖を含む溶液に糖を加えて、少なくとも３０の糖：多糖質量比を得ること；及び
    ｂ）多糖を含む溶液を凍結乾燥させること
    を含む方法。
31. 前記糖が非還元糖である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記糖が単糖類若しくは二糖類である、請求項３０に記載の方法。
33. 前記糖が、マンニトール、ショ糖、トレハロース又はそれらの組み合わせである、請求項３２に記載の方法。
34. 前記多糖が、髄膜炎菌多糖、肺炎球菌多糖、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）のＶｉ多糖、及びＢ群連鎖球菌多糖からなる群から選択される、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記多糖が肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖が、前記糖：多糖質量比が２５である条件下で溶解しない、請求項３５に記載の方法。
37. 前記肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖が血清型３、８又は２４Ｆからのものである、請求項３５に記載の方法。
38. 前記糖：多糖質量比が少なくとも４０又は少なくとも５０である、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記糖濃度が５％より大きい、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 多糖を含む溶液が、さらにタンパク質を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びＣＲＭ１９７からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記多糖をタンパク質とコンジュゲートすることをさらに含む、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びＣＲＭ１９７からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
44. 前記タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記コンジュゲーションが還元的アミノ化によるものである、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記還元的アミノ化を水系条件下で行う、請求項４５に記載の方法。
47. 前記還元的アミノ化をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行う、請求項４５に記載の方法。

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