JPH11506110A

JPH11506110A - 免疫原性および免疫刺激性オリゴサッカライド組成物ならびにそれらの作製法および使用法

Info

Publication number: JPH11506110A
Application number: JP9500049A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．マルコルム，アンドリュー
Original assignee: アルバータリサーチカウンセル
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-06-02
Also published as: MX9707944A; IL121585A0; NO974727D0; NO974727L; KR19990007777A; NZ309713A; CZ327897A3; WO1996040225A1; EP0831894A1; AU5994496A; AU725279B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫原性オリゴサッカライド組成物、ならびにそれらの作製法、および使用法を提供する。詳細には、本組成物は、キャリアタンパク質と共有結合的にカップリングされたオリゴサッカライドを含み、得られたコンジュゲートは特異的免疫原性エピトープを含み、そして防御的な免疫原性応答を誘導することが示されている。本発明はまた、抗原に対する免疫応答を刺激するに有用なS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドを含む組成物、これらの組成物を使用した細菌性病原体に対する防御免疫化を提供する方法、これらのS．pneumoniae８血清型オリゴサッカライド組成物を抗原と共に投与することによる抗原に対する免疫原性応答を増大させる方法、および上記の免疫刺激性組成物を作製する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】免疫原性および免疫刺激性オリゴサッカライド組成物ならびにそれらの作製法および使用法発明の分野：本出願は、免疫原性および免疫刺激性オリゴサッカライド組成物、ならびにそれらの作製法および使用法に関する。詳細には、免疫原性組成物は、キャリアに共有結合的にカップリングされたオリゴサッカライドを含み、得られたコンジュゲートは、免疫防御性応答を誘導する。免疫刺激性組成物はキャリアに共有結合的にカップリングされているか、または処方物中の混合物としてのS．pneumococ cus ８血清型オリゴサッカライドを含む。参考文献：以下の参考文献は、本出願の関連部分で本出願中に引用される。上記刊行物、特許および特許出願の開示内容は、各々の刊行物、特許、および特許出願の用語が、特にそして個々に本明細書中に含まれるのと同程度に、その全体が参考として本明細書中に引用される。発明の背景：ポリサッカライドの免疫応答 HeidelbergerおよびAvery(1923)は、肺炎球菌の型特異的抗原がポリサッカライドであることを示した。細菌莢膜ポリサッカライドは伸長したサッカライド鎖を形成する同一の反復単位からなる細胞表面抗原である。ポリサッカライド構造は、病原性細菌に存在し、そしてEscherichia coli、Neisseria meningitidis、 Haemophilus influenzae、Ａ群およびＢ群Streptococcus、Streptococcus pneum oniaeおよび他の種で同定されている(KenneおよびLindberg 1983)。特異的血液型決定基および「腫瘍関連」抗原は、哺乳動物細胞表面炭水化物の例である。発ガン性に形質転換した細胞は、しばしば、形質転換しない細胞の表面炭水化物と明らかに異なる表面炭水化物を提示する。これらのグリカンは、ごくわずかのモノサッカライドからなる(HakomoriおよびKannagi 1986)。グリカン構造はそれ自体で通常は抗原性でないが、タンパク質または糖タンパク質マトリクスと共に、ハプテンの構成要素となる。サッカライド抗原の一般的な特徴は、著しいレベルのIgG抗体クラス(IgGアイソタイプ)または記憶応答を誘導できないことであり、それらは胸腺非依存性(T I)抗原と考えられる。ポリサッカライド抗原または免疫学的に不活性な炭水化物ハプテンの、タンパク質のような胸腺依存性(TD)抗原との結合は、それらの免疫原性を増強させる。タンパク質は、抗炭水化物抗体合成の誘導において役割を果たすキャリア特異的Ｔヘルパー細胞を刺激する(BixlerおよびPillai 1989)。 TIおよびTD応答について現在知られていることのほとんどは、関連のマウスモデルの研究によるものである(Steinら、1983；Stein、1992；Stein、1994)。TI 抗原は、一般に、拘束されたクラスの低親和性抗体を誘導し、そして免疫学的記憶を生成しない。アジュバントは、TI抗原に対する応答にほとんど効果を有さない。対照的に、TD抗原は、免疫化により異種のそして高親和性の抗体を誘導し、そして免疫学的記憶を生成する。アジュバントは、TD抗原に対する応答を増強する。TD抗原に対する２次応答は、IgGのIgMに対する比の増加を示し、一方でTI抗原については２次応答でIgGのIgMに対する比は１：１であり、１次応答の比と同様である(Steinら、1982; Stein、1992および1994)。マウスおよびヒトにおいて、TD抗原は、いくらかの量のIgG₂およびIgG₃アイソタイプとともに、IgG₁アイソタイプを支配的に誘導する。ポリサッカライドに対するTI応答は、IgGアイソタイプのIgG₃に拘束される(Perlmutterら、1978; Slackら、1980)。現在の肺炎球菌ワクチン肺炎球菌は、現在、それらの莢膜ポリサッカライドに基づき84の血清型に分離されている。地理的位置に伴い通例生じる血清型のいくつかの変異性が存在するが、一般に、１、３、４、７、８、および12血清型が成人集団でより優勢である。１、３、４、６、９、14、18、19、および23血清型は、しばしば、子供の肺炎の原因になる(Mandell，1990; ConnellyおよびStarke，1991; Leeら、1991; Sor ensen、1993; NielsenおよびHenricksen，1993)。現在、最も広範に使用されている抗肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌の23株由来 6B、7F、８、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F 、23F、33Fが挙げられる(Danish命名法)。これらの血清型は、世界中の重篤な肺炎球菌による疾患の90％の原因であるといわれている。 (Borganoら、1978; Broomeら、1980; Sloyerら、1981; ShapiroおよびClemens、 1984; Bolanら、1986; Simberkoffら、1986; Foresterら、1987; Shapiro、1987 ; Simsら、1988; Simberkoff、1989; Shapiro、1991)。肺炎球菌ワクチンは、健常な若い成人において抗体応答の誘導に有効である(Hillemanら、1981; Mufson ら、1985; Bruyanおよびvan Furth、1991)。これらの抗体は、インビトロでオプソニン活性を有することが示されている(Chudwinら、1985)。しかし、応答の強度および異なる血清型に対する抗体価の持続性には顕著な変化性がある(Hillema nら、1981; Mufsonら、1987)。２歳未満の小児は、肺炎菌により引き起こされる全身疾患、中耳炎、および急性下部呼吸器感染症の危険性が最も高い群に属するが、このワクチンに対しては応答しない(Sellら、1981; Hazelwoodら、1993; Saundersら、1993)。さらに、は変化している(Siberら、1978; Schildtら、1983; Foresterら、1987; Simberk off，1989; Shapiro，1991)。これらの集団群は、このワクチンの胸腺依存性ポリサッカライド抗原に対し十分に応答しない。胸腺依存性抗原の代表的な、IgM からIgGアイソタイプに変化する抗体クラスは、通常観察されず、また追加免疫化に対する既往性応答でもない(Borganoら、1978)。細菌の抗生物質抵抗性株の最近の出現は、小児感染の予防のための効きめのあるワクチンの開発が必要であることを強調する。明らかに、肺炎球菌に対する新しいワクチンが、特に、危険性の高い群および小児のために必要である。コンジュゲートワクチン AveryおよびGoebelは、細菌感染に対するワクチンを最初に調製した人である( AveryおよびGoebel 1929; GoebelおよびAvery 1929)。さらに最近、種々の細菌ポリサッカライドに対する胸腺依存性応答を誘導するいくつかのタンパク質キャリアコンジュゲートが開発されている。現在までのところ、Hemophilus influen zaeタイプｂ(Hib)に対するコンジュゲートワクチンの開発は、最大の関心を受けている。Schneersonら(1980)は、Hibポリサッカライド(ポリリビトール-ホスフェート)とジフテリアトキソイドを共有結合的にカップリングさせた。このグループはまた、アジピン酸ジヒドラザイドスペーサーでポリサッカライドを誘導体化させ、そしてこの材料をカルボジイミドを用いて、破傷風トキソイドにカップリングさせることにより、Hibワクチンを開発した(Schneersonら、1986)。類似の手順がキャリアとしてジフテリアトキソイドを含有するコンジュゲートの作製に使用された(Gordon、1986および1987)。２官能スペーサーを、Ｂ群Neisseria meningitidisの外膜タンパク質をHibポリサッカライドにカップリングさせるために利用した(Marburgら、1986、1987、および1989)。最終的に、Anderson(1983 および1987)は、還元アミノ化により非毒性交差応答変異体ジフテリア毒素CRM₁₉ ₇ にカップリングされたHibオリゴサッカライドを使用して、コンジュゲートワクチンを作製した。これらの文献における報告では、これらのワクチンの効力が異なっており、そして多くの研究が今も進行中である。しかし、オリゴサッカライドコンジュゲート(Andersonら、1985a,1985b,1986,1989; Seidら、1989; Madoreら、1990; Eby ら、1994)およびポリサッカライドコンジュゲート(Barraら、1993)は、幼若動物において免疫原性であり、そして胸腺依存性応答を誘導すると報告されている。ハプテン付加はコンジュゲート免疫原性についての重要な要素である(Anderson ら、1989; Ebyら、1994)。他のコンジュゲートワクチンが、Jenningsら(1985および1989)により開発されている。彼らはNeisseria meningitidisのポリサッカライドを破傷風またはジフテリアトキソイドキャリアへカップリングさせるために過ヨウ素酸塩活性化を利用した。Porro(1987)は、エステル化したN．meningitidisオリゴサッカライドの、キャリアタンパク質へのカップリング法を規定した。過ヨウ素酸塩手順により、同一生物由来の解毒化タンパク質にカップリングしたPseudomonas aeruginosa のポリサッカライドを含むコンジュゲートワクチン(TsayおよびCollins,1987)が開発された。CryzおよびFurer(1988)は、アジピン酸ジヒドラザイドをスペーサーアームとして使用し、P．aeruginosaに対するコンジュゲートワクチンを作製した。 S．pneumoniaeの特異的血清型のポリサッカライドをまた、破傷風またはジフテリアトキソイドのような古典的キャリアタンパク質(Schneersonら、1984; Fat tomら、1988および1990; Schneersonら、1992)、N．meningitidis膜タンパク質( Marburgら、1987; Giebinkら、1993)およびニューモリシン(pneumolysin)変異キャリア(Patonら、1991; Lockら、1992; Leeら、1994)にカップリングさせた。 S．pneumoniaeオリゴサッカライドをCRM₁₉₇タンパク質にカップリングさせる技術は開発されている(Porro，1990)。これらのコンジュゲートワクチンは、変化し得るか、またはまだ決定されていない免疫増強特性を有する。これらのカップリング技術の免疫原性エピトープの維持を伴う再現性は、現在、有効なS．pne umoniae糖-コンジュゲートワクチンの開発において最も大きな問題である。最適の免疫原性オリゴサッカライドのサイズは、血清型に依存して変化するようであり、このことは、特定の免疫原性エピトープの配座の局面を示す(Ebyら、1994; Steinhoffら、1994)。長期にわたる防御を誘導するDTP、結核、ポリオ、麻疹、肝炎、Hib、および肺炎に対するワクチンが必要である。幼若動物におけるS．pneumoniaeに対する防御を誘導するために、各血清型に対する最適の免疫原性サイズの、高レベルのオリゴサッカライドを含むマルチ-ハプテンタンパク質コンジュゲートが所望される。さまざまな研究者が、アジュバント投与によるコンジュゲートワクチンの免疫原性の増強を提唱している。アルミニウム塩は、ヒトでの使用に承認され、１つの例である。ベータグルカン粒子および低分子量のデキストランのような炭水化物の部分もまた、アジュバント活性を有することが報告されている。Adjuvax(Al pha-Beta Technology)は、ベータグルカン粒子を含むアジュバント組成物である。Leesら(1994)は、低分子量デキストラン構造物のアジュバントとしての使用を報告している。Penneyら(1992)は、免疫学的活性を有する長鎖アルキル化合物を報告している。図面の簡単な説明：図１は、本発明の実施例で使用されたポリサッカライドの反復単位構造を示す。図２は、酸加水分解(0.5M トリフルオロ酢酸、100℃、20分)後、BioGel P-10 カラムを通して１〜８の反復単位の識別可能なオリゴサッカライドを生じたStre ptococcus pneumoniae ８血清型莢膜ポリサッカライドの分離プロフィールを示す。図３は、HPLC分析により測定したときの、加水分解されたStreptococcus pneu moniae ８血清型莢膜ポリサッカライドのピーク１、２、３、および４における反復単位の相対的サイズを示す。図４は、種々のオリゴサッカライド反復単位の相対的サイズを決定するために使用したグルコース、M-3マルトトリオース、M-7マルトヘプトース、およびM-10 マルト-オリゴサッカライド標準の、HPLC保持時間を示す。図５は、加水分解された反復単位の炭水化物含有量を決定するために使用したリビトール、ラムノース、ガラクトース、フコース、およびマンノースモノサッカライド標準の保持時間の例を示す。図６は、P-10 BioGelカラムを通したS．pneumoniae 6B血清型ポリサッカライドフッ化水素酸加水分解物の分離プロフィールを示す。図７は、P-60 BioGelカラムを通したS．pneumoniae 6B血清型ポリサッカライドTFA加水分解物の分離プロフィールを示す。図８は、P-30 BioGelカラムを通したS．pneumoniae 14血清型ポリサッカライドTFA加水分解物の分離プロフィールを示す。図９は、P-10 BioGelカラムを通したS．pneumoniae 19F血清型ポリサッカライド酢酸加水分解物酢酸の分離プロフィールを示す。図10は、P-10 BioGelカラムを通した、S．pneumoniae 23F血清型ポリサッカライドTFA加水分解物の分離プロフィールを示す。図11は、P-10 BioGelカラムを通した、セルラーゼにより切断されたS．pneumo niae ８血清型ポリサッカライドの分離プロフィールを示す。図12は、P-10 BioGelカラムを通した肺炎球菌C-物質(C-substance)ポリサッカライドフッ化水素酸加水分解物の分離プロフィールを示す。図13は、Streptococcus pneumoniae ８血清型オリゴサッカライドタンパク質キャリアコンジュゲートに対してマウス抗血清を使用した阻害ELISAの結果を示す。図14は、カルボジイミドカップリングのためのオリゴサッカライドの酸性化を図示する。図15は、ポリサッカライドの還元および過ヨウ素酸塩の画分の分離を示す(23 図16は、Streptococcus pneumoniaeの6B血清型のオリゴサッカライドの還元および過ヨウ素酸塩の画分の分離を示す。図17は、Streptococcus pneumoniaeの19F血清型のオリゴサッカライドの還元および過ヨウ素酸塩の画分の分離を示す。図18は、過ヨウ素酸塩およびEDCカップリング化学応答を示す。図19は、モノ-ハプテン8-オリゴサッカライド破傷風トキソイドコンジュゲートが、どのように８ポリサッカライドでコーティングしたELISAプレートへの抗８血清の結合を阻害したかを示す。図20は、8:14ジ-ハプテン-オリゴサッカライド-TTコンジュゲートで免疫化した後S．pneumoniae ８血清型ポリサッカライドにより誘導されたIgG抗体アイソタイプを示す。図21は、8:14ジ-ハプテン-オリゴサッカライド-コンジュゲート、代表的なTD 応答で免疫化した後ポリサッカライドによって誘導されたIgG₁抗体アイソタイプの増加したレベルを示す。図22Aおよび22Bは、14-ポリサッカライドおよびオリゴサッカライドコンジュゲートで、アジュバントとともに、またはアジュバントなしで免疫化したマウスの群から誘導されたIgGアイソタイプを示す。発明の要旨：一つの局面において、本発明は：ａ）少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むサイズ分離された炭水化物ハプテン；およびｂ）キャリアを含む組成物を提供し、ここで、該ハプテンは該キャリアに共有結合的にカップリングし、そして該ハプテン-キャリアコンジュゲートは防御的に免疫原性である。別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、コンジュゲート組成物を作製する方法を提供する：ａ）細菌ポリサッカライドを、得られるオリゴサッカライド上で免疫原性エピトープを保存するようにオリゴサッカライドに切断する工程；ｂ）得られたオリゴサッカライドをサイズに基づいて分離する工程；ｃ）免疫原性エピトープを含むこれらのオリゴサッカライドを、阻害ELISAに基づいて選択する工程；ｄ）工程ｃ）で選択したオリゴサッカライドを活性化する工程；およびｅ）活性化したオリゴサッカライドを精製されたキャリアにカップリングさせる工程。ここで、得られた組成物は、免疫原性エピトープを含み、そして防御的に免疫原性である。さらなる局面において、本発明は、細菌性病原体に対して防御免疫化を提供する方法を提供し、これは、このような処置が必要な哺乳動物に有効量の上記のワクチン組成物を投与する工程を包含する。なおさらなる局面において、本発明は、抗原に対する免疫応答を刺激するに有用な組成物を提供する。この免疫刺激性組成物は、阻害ELISAによって決定されるような免疫原性エピトープを含むS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライド、および適切な薬学的賦形剤を含有し、ここで、該オリゴサッカライドは免疫刺激性効果を提供する。まださらなる局面において、本発明は、細菌性病原体に対して防御免疫化を提供する方法を提供し、これは、このような処置が必要な哺乳動物に有効量の上記の８血清型組成の組成物を投与する工程を包含する。まだなおさらなる局面において、本発明は、抗原に対する免疫原性応答を増加させる方法を提供し、これは、阻害ELISAによって決定されるような免疫原性エピトープを含むS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドを、この抗原と共に投与する工程を包含する。別のさらなる局面において、本発明は、以下の工程を含む、上記の免疫刺激性組成物を作製する方法を提供する：ａ）S．pneumoniae ８血清型ポリサッカライドを、得られるオリゴサッカライド上で免疫原性エピトープを保存するようにオリゴサッカライドに切断する工程；ｂ）得られたオリゴサッカライドをサイズに基づき分離する工程；ｃ）免疫原性エピトープを含むこれらのオリゴサッカライドを阻害ELISAに基づいて選択する工程；およびｄ）選択したオリゴサッカライドを適切な薬学的キャリアと混合する工程。発明の詳細な説明：本発明は、オリゴサッカライド-タンパク質キャリアコンジュゲートの調製のための改良された方法に関する。コンジュゲート生成物は、種々のハプテンまたはキャリアから成り得る。モノ、ジ、およびマルチ-ハプテンコンジュゲートが調製され得る。得られたコンジュゲートのハプテンまたはキャリア上の免疫原性エピトープの存在の決定法が記載される。このようなコンジュゲートは、ワクチン、治療剤および予防剤、免疫調節剤、診断薬、開発手段および研究手段として有用である。本発明は、以下を含む細菌性病原体(しかしこれらに限定されない)に対するワクチンとしてコンジュゲートを開発するために、特に適している：Streptococcu s pneumoniae、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae B、B群Strep tococcus、A群Streptococcus、Bordetella pertussis、Escherichia coli、Stre ptococcus mutans、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Cryptococcus neoformans、Pseudomonas aeruginosa、およびKlebsiella pneumoniae。本発明のコンジュゲートは、免疫原性が弱いかまたはない分子を特異的免疫防御性抗体または細胞応答を誘導する分子に変化させる。ポリサッカライドワクチンに対する乏しい免疫応答(胸腺非依存性抗原、TI)は、年配および２歳未満の小児のような危険性の高い群で見出されている。何人かの研究者は、タンパク質キャリアを使用して、種々の細菌ポリサッカライドに対する胸腺依存性(TD)応答を誘導することを試みている。重要な免疫原性エピトープの完全な状態および炭水化物とタンパク質との間の共有結合の不一致は、これらのコンジュゲートワクチンの主要な制限となっている。本発明は、コンジュゲートの炭水化物とキャリアの比に関して高い再現性を与えるカップリング技術の発見に注目する。本発明はまた、オリゴサッカライドハプテンおよびハプテン- キャリアコンジュゲート上の免疫原性エピトープの存在を確認する方法を提供する。ポリサッカライドコンジュゲートは、TI抗原に代表的な、追加免疫できないIg M抗体応答を誘導する。これらのポリサッカライドコンジュゲートへの応答において生成された抗血清は、オプソニン活性を有さない。本発明において、種々の細菌株由来のポリサッカライドの切断によって調製されたオリゴサッカライドを、サイズ分離し、そしてモノ-ハプテンコンジュゲートを作製するために使用する。これらのコンジュゲートは、免疫防御性、オプソニン作用能を有するIgG抗体アイソタイプを誘導する。この抗体応答は、いかなるアジュバントの使用も伴わずに、誘導される。従って、本発明の方法は、種々の株の免疫原性が弱いかまたはないポリサッカライドを利用する、免疫原性オリゴサッカライドハプテン- キャリアコンジュゲートを生成するに理想的に適切である。これらのオリゴサッカライド上の免疫原性エピトープの存在は、免疫防御性応答の誘導について重要であることが見出された。効き目のある抗病原体ワクチンの開発が必要である細菌抗原の数は、拡張している。しかし、破傷風またはジフテリアトキソイドの反復投与(ワクチン組成物におけるキャリアタンパク質として、および外傷後の予防措置としてしばしば使用される)は、キャリア誘導性エピトープ抑制と呼ばれる現象を引き起こし得る。エピトープ抑制は、合成ペプチドおよびサッカライド-トキソイドコンジュゲートに関する文献中に記載されている(Gaurら、1990; Peetersら、1991)。キャリアタンパク質にカップリングしたハプテンに対する免疫応答は、レシピエントが前もってこのキャリアで免疫化されていた場合、減少または欠如し得る。多くの研究者の最終目的は、キャリア抑制を誘導せずに、幼若動物における急性下部呼吸器感染、中耳炎、および菌血症を引き起こす優勢な細菌血清型に対する防御を導き出すワクチンの開発である。本発明の方法は、各細菌血清型に対する最適の免疫原性エピトープを有するマルチ-ハプテンコンジュゲートを生成するために利用され得る。従来のコンジュゲートに比べて含まれるキャリアタンパク質の量が少ないこれらのコンジュゲートは、キャリア抑制現象の発生を低下させる。これらのコンジュゲートを用いて可能な減少した抗原負荷は、従来のコンジュゲートに見出された抗原性競合を最少化する。以前、本発明者らは、結晶性細菌細胞表面層(Ｓ層)が、原型のコンジュゲートワクチンの開発のためのキャリアとして(Malcolmら、1993a)、およびキャリア抑制現象を回避する手段として(Malcolmら、1993b)有用であることを報告した。本発明者らの研究所において、本発明者らは非交差応答抗体および細胞応答を誘導するいくつかのＳ層糖タンパク質を同定した。種々の疾患に対するワクチンが、種々の細菌株から単離されたＳ層を使用して開発され得、それによって、破傷風およびジフテリアトキソイドで見出されるキャリア抑制が避けられる。しかし、Ｓ層は、単離および精製が困難であり、ならびに生成コストがかかり、このことは、ワクチンキャリアとしてのそれらの広範な使用を非実用的にする。本発明は、特異的応答の誘導に必要なキャリアの量を減少させ、それによって、破傷風またはジフテリアトキソイドがキャリアとして使用される場合でさえ、キャリア誘導性エピトープ抑制の危険性を減少させる、モノ、ジ、およびマルチハプテンオリゴサッカライドコンジュゲートの調製法を記載する。本発明の技術の一つの特定の適用は、小児科の肺炎感染の予防のための効果的なワクチンの開発についてである。本発明の別の適用は、幼児疾患、年配または免疫抑制された患者において優勢なＢ群Streptococcus、Ａ群Streptococcus、Ha emophilus influenzae B、Streptococcus pneumoniae、およびN．meningitidis 株に対する防御のためのワクチンの開発である。他の適用は、種々の細菌性またはウイルス性病原体に対する防御を誘導するためのコンジュゲートの開発を含む。本発明者らは、特定の結合(すなわち、１-４結合)を切断するが、糖モノサッカライドおよびリン酸塩のような他の免疫学的に重要な化合物を無傷なままにしておく条件の使用により、得られたコンジュゲートの免疫原性が改善されることを見出した。本発明者らは、オリゴサッカライドのサイズおよび配座が、コンジュゲート調製物の免疫原性を最大化させるのに重要であることを見出した。異なるオリゴサッカライドサイズを加水分解されたポリサッカライドの混合物からサイズ分画によって分離し、そして単離した。分離されたオリゴサッカライドのモノサッカライド含有量および相対的サイズを、例えば、HPLC分析によって測定する。異なるサイズの反復単位を、阻害ELISAを使用して試験する。本発明者らは、ELISA阻害が、オリゴサッカライド調製物および得られたコンジュゲートの免疫原性と正比例することを見出した。特に、S．pneumococcus株３、6B、８、14、19F、および23；肺炎球菌C-物質(C -substance)；およびN．meningitidis C-ポリサッカライドのポリサッカライドの切断により調製したオリゴサッカライドを、本発明者らの研究所において使用している。オリゴサッカライドのための好ましい反復単位(R.U.)は、いくつかの S．pneumococcus血清型および肺炎球菌C-物質について以下の通りである：血清型３：４〜８ R.U. 6B：４〜10 R.U. ８：２〜８ R.U. 14：４〜６ R.U. 19F：４〜10 R.U. C-物質：６〜10 R.U. N．meningitidis C-ポリサッカライドのための好ましい反復単位は、６〜10 R.U .である。サッカライドハプテン上に帯電基を作製すると、ハプテンのキャリアへのカップリングが促進されることが発見されている。陽イオンまたは陰イオン交換カラムの使用は、キャリアに対する糖の比がより高い状態において、キャリアにオリゴサッカライドをカップリングさせるに効果的である。このことは、キャリア毎により多くのハプテンを提供し、そしてキャリア抑制現象を減少させる。炭水化物の減少した画分は、キャリアへのカップリングに使用される。有効なコンジュゲートワクチンを作製するための別の重要な局面は、精製キャリアの使用である。キャリア調製物中に見出される不純物は、カップリング手順の妨げになり得る。キャリア調製物中に見出されるキャリアタンパク質の凝集物は、所望の応答を誘導するに必要な、キャリアに対するハプテンの最適の比に影響し得る。不純物および凝集物を除去する任意の標準的な方法が使用され得るが、キャリアは、一般に、サイズ排除カラムクロマトグラフィーを使用して精製される。カップリング反応時間、ならびにオリゴサッカライド、カップリング試薬、およびキャリアの量は、キャリアコンジュゲートに対する炭水化物の理想的な比を得るためには、重要である。本発明者らは、再現可能なアッセイにより、キャリアに対する炭水化物の比を定量する方法を開発した。カップリング反応の間最適であると決定されたpHおよび温度条件の維持もまた、有効なコンジュゲートを生成するために重要である。同様に、カップリング反応を停止させるが、免疫原性基を遮断しない有効なブロッキング試薬の使用は、有効なコンジュゲート組成物の作製に重要である。オリゴサッカライド／ポリサッカライド上の免疫原性エピトープを維持するカップリング化学の使用は、必要不可欠である。本発明者らは、下記のようなEDC および過ヨウ素酸塩カップリングがオリゴサッカライドをキャリアにカップリングさせるために使用され得ることを見出した。糖のキャリアへの直接的なカップリングに加えて、種々のリンカーが、タンパク質表面からのサッカライドの間隔をあけるために使用され得る。適切なリンカーはまた、帯電しているかまたは帯電していない部分を所望のように提供し得る。カップリングされた糖-キャリア組成物の免疫原性は、阻害ELISAによって決定される。本発明の方法を使用することにより、本発明者らは、なおそれらの免疫原性エピトープを保持するジ-ハプテンおよびマルチ-ハプテンコンジュゲートを作製するための手段を発見した。種々のオリゴサッカライド配列および／またはサイズを有するコンジュゲートが作製され得る。同様に、オリゴサッカライドおよびポリサッカライドの組み合わせを含むコンジュゲートが合成され得る。このようなコンジュゲートは、抗原性競合を減少または排除し得る。従って、適切なコンジュゲートの設計は、キャリア誘導性エピトープ抑制を減少させる能力を提供する。これに関連して重要なことは、免疫原性オリゴサッカライドエピトープの同定および使用であり、そして糖のタンパク質へのより効果的なカップリングである。１タンパク質分子あたりより多くの数の免疫原性エピトープが結合することは、防御免疫化の提供のために必要なキャリアの数がより少ないことを意味する。本発明者らは、アイソタイピングELISA、殺菌アッセイおよびオプソニン作用アッセイにより、コンジュゲート組成物に対する免疫防御性抗体応答を定量する方法を開発した。このことは、どのコンジュゲートが、哺乳動物の防御免疫化に使用した場合、適切な免疫グロブリンアイソタイプ応答、すなわち、IgGアイソタイプを誘導するかの決定を可能にする。定義：本明細書中で引用される場合、以下の用語は以下の意味を有する：オリゴサッカライドは、少数のモノサッカライド単位から構成される炭水化物化合物を意味する。詳細には、オリゴサッカライドは、ポリサッカライドを切断することにより形成され得る。ポリサッカライドは、多数のサッカライド基を含有する炭水化物化合物を意味する。細菌またはウイルスの外部表面に見出されるポリサッカライドは、本発明において特に有用である。キャリアは、ハプテンまたは抗原にカップリングされてコンジュゲートを形成し得る、胸腺依存性免疫応答を誘導する物質を意味する。詳細には、種々のタンパク質、糖タンパク質、炭水化物、またはサブユニットキャリアが使用され得、破傷風トキソイド/毒素、ジフテリアトキソイド/毒素、細菌外膜タンパク質、結晶性細菌細胞表面層、血清アルブミン、γグロブリン、またはキーホールリンペットヘモシアニンを包含するが、これらに限定されない。免疫原性は、免疫応答を引き起こすことを意味する。免疫原性エピトープは、免疫系によって認識され、免疫原性応答を引き起こす分子の部分を意味する。ハプテンは抗原を意味し、単独では抗体の産生を引き起こし得ないかもしれない不完全抗原または部分抗原を包含する。本発明の目的に関して、ジハプテンおよびマルチハプテンは、キャリアに結合した２つ（ジ）オリゴサッカライドハプテンまたはそれ以上（マルチ）オリゴサッカライドハプテンを含む組成をいう。防御的に免疫原性または免疫防御性は、病原体の感染を予防する免疫応答を刺激することを意味する。免疫刺激性は、免疫原性の弱いハプテンまたは抗原に対する免疫応答を刺激または増強することを意味する。新生児は、幼若動物を含む、生まれたての動物を意味する。方法論：切断ポリサッカライドの調製および分離：ポリサッカライド（American Type Culture Collection，Rockvill，Maryland より入手可能、または当該分野で公知の単離手順により入手可能）を、適切な濃度の化学薬品を用いてオリゴサッカライド単位に切断した。これらの化学薬品には、トリフルオロ酢酸、酢酸、フッ化水素酸、塩酸、水酸化ナトリウム、および酢酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。特定の化学的性質および濃度、ならびに所望の得られるオリゴサッカライドに依存して、異なる時間および温度が用いられ得る。市販の酵素（例えば、セルラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ）、または当該分野で公知の、または当該分野の認められた方法で調製された、バクテリオファージに関連した単離されたエンドグリカンもまた、ポリサッカライドからオリゴサッカライドを調製するために用いられ得る。図１は、本発明の実施例において使用されるポリサッカライドの反復単位構造を示す。他の細菌性およびウイルス性ポリサッカライドが当業者に公知であり、そして本発明の方法および組成物に用いられ得る。種々のポリサッカライドが切断され得、この中には、肺炎球菌群抗原（C-物質）、およびStreptococcus pneu moniae、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、Ａ群Streptoccocu sおよびＢ群Streptococcusの血清型の莢膜ポリサッカライドが含まれるが、これらに限定されない。切断後、得られるオリゴサッカライド混合物を、P-10（分画範囲、1,500〜20, 000の分子量）、P-30（2,500〜40,000の分子量）、およびP-60（3,000〜60,000 の分子量）BioGelカラムを用いてサイズにより分離する。種々のカラム画分における炭水化物の存在を、フェノール-硫酸またはシアル酸アッセイ、および薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて決定する。次いで、炭水化物含有カラム画分を、HPLCにより分析する。切断ポリサッカライドのサイズ分離画分における免疫原性エピトープの存在を、下記のような阻害ELISAにより決定する。調製物がELISA試験において阻害するオリゴサッカライド画分を生じない場合、免疫原性エピトープを作成するために、切断手順を、酵素または化学薬品、重量モル濃度、反応時間または反応温度を変化することによって改変し得る。オリゴサッカライド調製物中の免疫原性エピトープの決定：カラム画分中の免疫原性エピトープの存在を、実施例のセクションで記載のような阻害ELISAおよびリンアッセイ（phosphorous assay）により確認する。免疫原性エピトープ（12.5μgの濃度でO.D.₄₀₅において少なくとも約25％減少、そして好ましくは約50％減少をもたらすエピトープとして定義される）を含有するオリゴサッカライド画分を、キャリアへのカップリングのために選択する。キャリアへのカップリング：キャリアへのカップリングのために使用されるべきオリゴサッカライドまたはポリサッカライドを、EDCまたは過ヨウ素酸塩酸化カップリングのための調製物中で、酸性化または還元する。例えば、オリゴサッカライド調製物をRexyn^TM101 （H）有機酸陽イオン交換カラムを用いて還元して、EDCカップリングのための糖を酸性化し得る。同様に、過ヨウ素酸塩酸化カップリングのための標準的な方法を用いて、糖を還元し得る。ジハプテンまたはマルチハプテンコンジュゲートを調製する場合、各オリゴサッカライドを、EDCまたは過ヨウ素酸塩コンジュゲーションのために個々に活性化する。好ましいジハプテンオリゴサッカライドコンジュゲートには、以下が包含される：3:8-TT、6:8-TT、6:14-TT、8:14-TT、8:19-TT、8:23-TT、および14:19-TT。キャリア：種々のタンパク質、糖タンパク質、炭水化物、またはサブユニットキャリアが使用され得、この中には破傷風トキソイド/毒素、ジフテリアトキソイド/毒素、細菌外膜タンパク質、結晶性細菌細胞表面層、血清アルブミン、γグロブリン、またはキーホールリンペットヘモシアニンが包含されるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施例において、破傷風トキソイドをキャリアとして使用した。破傷風トキソイド調製物は、日常的に凝集物および低分子量不純物を含む。キャリアの純度は、カップリング反応と一貫性を得るために必須である。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、精製したキャリア調製物を得る。サイズ分離した、免疫原性エピトープ含有オリゴサッカライドを、実施例のセクションに記載の手順を用いて、カルボジイミド（EDC）または過ヨウ素酸塩活性化により精製キャリアにカップリングする。任意の遊離ハプテンオリゴサッカライドを、カラムクロマトグラフィーによりハプテン-キャリアコンジュゲートから分離する。コンジュゲートのタンパク質に対する炭水化物の比を、フェノール硫酸またはシアル酸およびLowryタンパク質アッセイにより決定する。代表的には、EDCカップリングにより調製されたコンジュゲートは、１：２のキャリアに対する炭水化物の比を有するが、過ヨウ素酸塩酸化カップリングを用いて調製されたコンジュゲートは、１：５〜１：10の範囲のキャリアに対する炭水化物の比を有する。コンジュゲート上の免疫原性エピトープの決定：上記のように、重要な免疫原性エピトープの完全性は、以前に公知のコンジュゲーション技術の問題である。本発明において、ELISA阻害アッセイを用いて、本発明者らのコンジュゲーション手順により作製された種々のコンジュゲートの潜在的な免疫原性を決定する。本発明者らは、実施例で記載する方法を用いる本アッセイにおける阻害（6.25μgの濃度でO.D.₄₀₅において少なくとも約25％の減少、そして好ましくは約50％の減少）を示すコンジュゲートが、哺乳動物においてワクチンとして使用される場合、防御免疫原性を提供することを見出している。従って、本アッセイは、有用なコンジュゲート組成物をスクリーニングするために使用される。免疫防御性抗体応答を誘導するための免疫化：代表的には、マウスを、EDCコンジュゲートに対する炭水化物含有量および過ヨウ素酸塩コンジュゲートに対するタンパク質含有量に基づいて、0.1、0.5、１、2.5、および５μgの用量で、抗原（ポリサッカライドコンジュゲート、オリゴサッカライドコンジュゲート、カップリングしていないポリサッカライドもしくはオリゴサッカライド、またはカップリングしていない破傷風トキソイド）を用いて、０日目（１°-一次免疫化）、７日目（２°-二次免疫化）、および28日目（３°-三次免疫化）に、皮下注射（２箇所の側面部位に100μl）によって免疫化する。抗原を、0.9％NaCl中に種々の用量に希釈し、そして0.9％NaClを注射したマウスをネガティブコントロールとして使用した。マウスを、２°および３°免疫化後７〜10日目に採血し、血清を集めて免疫防御性抗体応答をアッセイした。代表的な免疫化スケジュールを、EDCカップリングを用いて調製したS．Pneumoniae ３血清型ポリサッカライドおよびオリゴサッカライド-破傷風トキソイドコンジュゲートに関して表１に示す。以下を包含する種々の他の免疫化スケジュールが有効である：０日目（１°）、14日目（２°）、および44日目（３°）；ならびに０日目（１°）、30日目（２°）、および60日目（３°）。本発明のコンジュゲートを、古典的ワクチンとして、特定の抗体産生を誘導するか、または特定の細胞媒介性免疫応答を刺激する免疫原として使用し得る。これらはまた、治療的モダリティーとして（例えば、免疫系を刺激して腫瘍関連抗原を認識するために）；免疫調製剤として（例えば、特定の細胞レセプターを活性化することにより、リンホカイン/サイトカイン産生を刺激するために）；予防剤として（例えば、細胞膜上のレセプターをブロックして細胞接着を防止するために）；診断薬として（例えば、特定の細胞を同定するために）；ならびに開発/研究手段として（例えば、モノクローナル抗体産生のために細胞を刺激するために）、利用され得る。応答の決定：上記のように、TI抗原およびTD抗原に対する抗体応答は異なる。マウスにおいて、ポリサッカライド（TI）抗原に対する応答は、通常、１対１比のIgMおよびI gGからなる。一般に、IgGアイソタイプは、抗ポリサッカライド血清中で過剰発現されているIgG₃によって拘束される。IgAアイソタイプもまた存在し得る。TI 抗原は低親和性の抗体を誘導し、そして免疫学的記憶を生じない。 TD抗原を用いて、二次IgG抗体応答（既往性応答）の増加が、より高いIgG-IgM 比で見出される。著しいレベルのIgAは通常存在しない。TD抗原は不均一なIgGアイソタイプ応答を誘導し、支配的なアイソタイプはIgG₁、IgG_2aであり、そして2 bアイソタイプが発現され得るが、IgG₃アイソタイプのレベルは通常比較的低い。TD抗原は、免疫学的記憶を誘導し、そして抗体親和性は免疫化により増加する。従って、コンジュゲート投与に応答して産生される免疫グロブリンアイソタイプの分析は、コンジュゲートが防御的に免疫原性であるか否かの決定を可能にする。本発明者らは、本発明のコンジュゲートが、直接およびアイソタイピングELIS A、殺菌アッセイおよびオプソニン作用アッセイによって測定した場合、TI抗原よりもむしろTDを代表する応答を誘導することを見出している。本発明者らのEDCカップリング方法を用いて調製されたコンジュゲートは、過ヨウ素酸塩活性化により調製されるコンジュゲートよりも良好な抗体応答を誘導した。１μgの用量が最も免疫原性であった。ジフテリアトキソイドキャリアを用いて調製したオリゴサッカライドコンジュゲートは、オリゴサッカライド-破傷風トキソイドコンジュゲートを用いて誘導した応答と類似の抗体応答を誘導した。上記のように、数人の研究者が、破傷風およびジフテリアトキソイドにポリサッカライド物質をカップリングすることによって免疫原性を増加し、そして胸腺依存性抗体防御を誘導することを試みている。結果は、これらのコンジュゲートが、カップリングしていない莢膜ポリサッカライド（CPS）よりもわずかにだけ免疫原性であることを示す。これに対する１つの可能な説明は、百日咳、ジフテリア、および破傷風のトキソイドが（アルミニウム塩アジュバント中で）、幼若動物に対する予防的４用量免疫化レジメとしてしばしば投与されることであり得る。このレジメは幼若動物を抵抗性にし得、幼若動物がこれらのトキソイドキャリアにカップリングされたハプテン/抗原に対する防御抗体応答を増加させることを不可能にする（キャリア抑制）。防御を誘導しない別の可能な理由は、構造的なものであり得る。タンパク質キャリアはハプテンに対する免疫応答を誘導し、そして増大させるが、CPS-タンパク質コンジュゲートの場合、CPS部分は、比較的大きなTI抗原である。免疫系は、CPS-タンパク質をコンジュゲートとしてでなく、単に２つの別個の物質として認識し得、その結果、CPSに対する胸腺非依存性応答およびキャリアに対する胸腺依存性応答をもたらす。これは、表２に示すような本発明者らの研究の場合のようである。免疫系は、本発明者らのポリサッカライド-破傷風トキソイド（TT）コンジュゲートのポリサッカライドをTI抗原として認識する。ポリサッカライドに対する抗体に関して、キャリアの潜在的なTD誘導能力は観察されない。本発明者らは、TI応答をTD応答に転換させるために、炭水化物ハプテン（オリゴサッカライド）の免疫原性エピトープがキャリアのTD誘導エピトープに十分に近接しなければならないと仮定する。本発明者らはまた、リンカーアーム技術を使用してコンジュゲートを調製した。本発明者らは、例えば、6-アミノ-n-ヘキサン酸をリンカーとして用いている。得られたコンジュゲートは、EDC活性化オリゴサッカライドハプテンをキャリアに直接カップリングすることにより調製したコンジュゲートよりも、抗体応答を誘導するのに効果的でないことが見出された。この知見は、TD応答を誘導するためにはハプテン-キャリアが極めて近接していることが必要であるという本発明者らの仮説を支持する。本発明者らはまた、殺菌アッセイまたはオプソニン作用アッセイを用いて、本発明のコンジュゲートにより誘導される免疫防御性抗体のレベルを決定するための方法を開発した。これらの試験は、本発明のコンジュゲートがこれらのアッセイで測定された場合、防御抗体を誘導するのに効果的であることを示している。上記のように、エピトープ-キャリア抑制現象は、他の研究者によって観察され、そしてＳ-層キャリア（S-layer carrier）研究を用いる本発明者らの研究室において観察されている（Malcolmら、1993b）。本発明者らのマルチ-ハプテンコンジュゲートは、この抑制を減少または回避する。なぜならば、これらのコンジュゲートは、従来のコンジュゲートワクチンよりもキャリア分子当たりの免疫原性エピトープの量を多く含有するからである。本発明者らのコンジュゲートにより、免疫系はキャリアにより「オーバーチャレンジ」されない。例えば、本発明の方法により調製されたトリ-ハプテンコンジュゲートは、３種の異なる標的病原体に対する特異的免疫応答を誘導するのに３回の注射を必要とするのみである。対照的に、従来のモノハプテンコンジュゲートを用いた場合、同様の応答を誘導するために９回の注射が必要である。これは、３倍量のタンパク質が必要であることを意味する。さらに、抗ポリサッカライドTI応答をTD応答に転換する免疫化レジメが、本発明のコンジュゲートを用いて設計され得る。ポリサッカライド（例えば、Pneumo vax 23を用いる）への経済的な初回曝露およびその後の本発明のコンジュゲートの単回投与は、IgG抗体レベルを誘導する（既往性応答）。このような免疫化レジメは、キャリア抑制を誘導しない。このような場合、種々の炭水化物エピトープおよび抗原に対して最初に教育された免疫系（TI応答）が、マルチ-ハプテンコンジュゲートにより誘導され、特定の集団群（例えば、幼若動物における、１、３、４、６、９、14、18、19、および23血清型）において疾患を頻繁に引き起こす病原体に対するより強い免疫原性応答を誘導する。薬学的組成物：特定の病原体および/または種々の炭水化物部分に対する抗体を誘導するために、本発明のコンジュゲートは、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、経口、または鼻を含む、種々の送達方法によって投与され得る。本発明の組成物の処方物は、適切な薬学的キャリアを含有し得る。本発明のコンジュゲートは、アジュバントなしで免疫原性であるが、アジュバントは、免疫防御性抗体価または細胞媒介性免疫応答を増加し得る。このようなアジュバントには、Freunds完全アジュバント、Freunds不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Adjuvax（Alpha-Beta Te chnology）、Inject Alum（Pierce）、Monophosphoryl Lipid A（Ribi Immunoch em Research）、MPL＋TDM（Ribi Immunochem Research）、Titermax（CytRx）、毒素、トキソイド、糖タンパク質、脂質、糖脂質、細菌細胞壁、サブユニット（細菌性またはウイルス性）、炭水化物部分（モノ-、ジ-、トリ-、テトラ-、オリゴ-、およびポリ-サッカライド）、種々のリポソーム処方物、またはサポニンが包含され得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントの組み合わせが、免疫原処方物を調製するためにコンジュゲートとともに使用され得る。組成物の厳密な処方物は、特定のコンジュゲート、免疫化されるべき種、および投与経路に依存する。このような組成物は、細菌またはウイルスの感染に感受性を有する任意の動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、およびトリの種）を免疫化するために有用である。飼育された動物および野生動物の両方が免疫化され得る。ヒトもまた、これらのコンジュゲート組成物で免疫化され得る。投与経路は、任意の従来の経路であり得、そして細菌またはウイルス、免疫化されるべき動物、および他の要因に依存して変化し得る。非経口投与（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内投与）が好ましい。皮下投与が最も好ましい。腸溶コーティングされた経口投与形態を含む経口投与もまた、使用され得る。投与スケジュールは、細菌またはウイルス病原体、および免疫化されるべき動物に衣存して変化し得る。動物は単回用量を投与され得るか、または追加免疫用量（単数または複数）を投与され得る。持続的な防御のために、年１回の追加免疫が用いられ得る。詳細には、０日目、７日目、および28日目での３用量が、抗体応答を最初に誘導するために好ましい。以下の実施例は、いかなる様式においても本発明の範囲を限定することは意図されない。実施例実施例１：ポリサッカライド加水分解物の調製および分離図２は、１〜８の反復単位の認識可能なオリゴサッカライドを生じる酸加水分解（0.5Mトリフルオロ酢酸、100℃、20分）後、BioGel P-10カラムを通したStre ptococcus pneumoniae ８血清型の莢膜ポリサッカライドの分離プロフィールを示す。１〜８の数字は各ピークにおいて見出される反復単位の数に対応し、ピーク９は８つの反復単位より大きなオリゴサッカライドを含む。ヒアルロン酸由来のオリゴサッカライドを用いて、クロマトグラフィー系を標準化した。ピーク１、２、３、および４における反復単位の相対的なサイズを、HPLC分析により測定した（図３）。種々のオリゴサッカライド反復単位の相対的なサイズを決定するために標準として用いたグルコース、M-3マルトトリオース、M-7マルトヘプトース（maltoheptose）、およびM-10マルトオリゴサッカライド（Sigma Chemical Co.）のHPLC保持時間を、図４に示す。反復構造のモノサッカライド含有量を、2.0Mトリフルオロ酢酸（TFA）を用いて100℃で２時間のオリゴサッカライド反復のさらなる加水分解により確認した。加水分解された反復単位の炭水化物含有量を決定するために用いたリビトール、ラムノース、ガラクトース、フコース、およびマンノースのモノサッカライド標準の保持時間の例を、図５に示す。１つの８血清型の反復単位の化学構造は、GC-MSおよびNMR分析によって、β- グルコース（１→４）β-グルコース（１→４）α-ガラクトース（１→４）αグルクロン酸（１→４）であることが決定された。これは、文献（JonesおよびPer ry 1957）に引用される反復単位構造と一致する。図６〜10は、P-10、P-30、またはP-60 BioGelカラムを通過したS．pneumoniae 6B、14、19F、および23F血清型ポリサッカライド加水分解物（TFA、酢酸、またはフッ化水素酸）の分離プロフィールの例を示す。図11は、酵素で切断したポリサッカライド（セルラーゼで切断された８血清型）の分離を示す。C-物質オリゴサッカライドの分離を図12に示す。実施例２：オリゴサッカライド調製物の免疫原性エピトープを決定するための阻害ELISA オリゴサッカライド調製物、およびオリゴサッカライドまたはポリサッカライド-コンジュゲート上の免疫原性エピトープの存在について試験するための阻害E LISAに利用した基礎的な手順は、以下の通りであった：１．96ウェルEIAプレート（NUNC）を、0.05M NaCO₃コーティング緩衝液（100μl ）を用いて１ウェルあたり１μgの抗原（Ag）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。２．同じ日に、１×PBS-0.01％ Tween 20を希釈剤として用いて阻害Agチューブ（例えば、種々のオリゴサッカライド加水分解物）を調製する。 −チューブ中に、７倍連続希釈液（25μg/ウェルから始まり、0.391μg/ウェルまで３連で）を作製する。各チューブ内の総容量は、連続希釈後、175μlであるはずである。 −１×PBS＋Tween中で、特定の型（例えば、ウサギで惹起されたDiagnostic ant i-serum 14、Statum Seruminstitut）の抗血清の１：1000希釈液を調製する。 −各チューブに175μlのこの溶液を加える。各チューブの総容量はその時350μl である。このチューブを４℃で一晩インキュベートする。３．翌日、100μl/ウェルのブロッキング緩衝液（１×PBS＋１％BSA）で、EIAプレートをブロッキングする。室温で１時間インキュベートする。４．プレートを払い出し、そして各チューブの内容物をウェルに移し（100μl/ ウェル）、室温で２時間インキュベートする。５．プレートを、洗浄溶液（0.01％Tween＋１×PBS）で３回洗浄する。６．１×PBS＋１％Tween緩衝液中にヤギ抗ウサギ（または第２段階で用いた抗種の血清型特異的血清）IgGアルカリホスファターゼコンジュゲート（TAGO）の１：1500希釈液を調製する（100μl/ウェル）。室温で２時間インキュベートする。７．プレートを洗浄溶液で４回洗浄し、余分な液体を払い出す。８．DEA（ジエチレンアミン）緩衝液（pH9.98）中にアルカリホスファターゼの基質錠剤（#104-Sigma）を溶解させる（５ml/錠剤、100μl/ウェル）。９．プレートを暗所でインキュベートし、そして15分毎に405nm波長の吸光度を読み取る。このアッセイでは、種々の市販の抗血清および研究室で調製した抗血清が用いられ得る。この中には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、サル、ヒヒ、およびヒトで産生された血清が含まれるが、これらに限定されない。図13は、Streptococcus pneumoniae ８血清型オリゴサッカライドタンパク質キャリアコンジュゲート（EDCを用いて破傷風トキソイドにカップリングされた２〜４反復単位）に対するマウス抗血清を用いた阻害ELISAの結果を示す。１、２、３、４、６、および８＋反復単位の８型オリゴサッカライド（0.5M TFA、10 0℃、20分調製物）および８型ポリサッカライドを用いて、阻害を試験した。これらの結果から、１つの反復単位（４つのモノサッカライド鎖）は免疫原性エピトープを含まないことが観察され得る。２つの反復単位（８つのモノサッカライド）は、ELISAプレートへの抗体の結合を阻害し得ず、免疫原性エピトープを含むことを示した。反復単位２の分子量は、FAB-MS分析によって1365であると決定された。これは、８つのサッカライドの理論上の分子量に良く相関する。３、４、６、８＋および完全なポリサッカライドの反復単位もまた、ELISAプレートへの抗体の結合を阻害し、これらのオリゴ/ポリサッカライド中に免疫原性エピトープが存在することをさらに示した。表３は、ウサギ抗-S．pneumoniae ８血清型特異的血清（Statems Seruminstit ut）を用いて見出された同様の結果を実証する。反復単位１は結合を顕著には阻害しなかった；反復単位２、３、４、５、６、７、８＋および完全なポリサッカライドは、結合を阻害した。阻害ELISAはまた、種々のポリサッカライドにおいて異なる加水分解手順を用いて調製されたオリゴサッカライド上の免疫原性エピトープの存在を決定するために用いられた。表４は、S．pneumoniae ６血清型ポリサッカライドを加水分解するための、先行技術（例えば、Porroのカナダ特許第2 052 323号）によって用いられた方法（0.01M酢酸、100℃、30時間）を用いた結果を示す。完全なポリサッカライドは、低濃度の抗原（0.39μgの濃度で有効）で結合をブロックしたが、酢酸加水分解物は阻害しなかった。本発明者らは、加水分解された調製物が「カラメル化した」ので、これをサイズ分離できなかったことに留意のこと。本発明者らは、表５に示すように異なる加水分解剤（例えば、TFA）、ならびに時間および温度の減少が、より免疫原性なエピトープを有するオリゴサッカライドを産生することを見出した。0.5M TFA、70℃、１または２時間の加水分解物は、3.13μgの濃度で、抗体の結合を効果的に阻害した。４時間の調製物は阻害しなかった。表６および７もまた、免疫原性エピトープを有するまたは有さない 6Bオリゴサッカライドを調製するための時間の効果を示す。２時間の酢酸調製物は、抗体結合を（3.13μgの濃度で）ブロックし、24および48時間の調製物は阻害しなかった。同様に、1.5時間のTFA調製物は３時間調製物よりも効果的に結合をブロックした。表８に示すように、70℃、７時間でのS．pneumoniae 14血清型の0.5M TFA加水分解は、先行技術（Porro、カナダ特許第2 052 323号）で開示されたように、好ましくない。TFAのモル濃度減少（例えば、0.1M）は、免疫原性14オリゴサッカライドを調製するのにより良い。表９は、キャリアにカップリングするための免疫原性エピトープを含むオリゴサッカライドを選択することの重要性を示す。14血清型オリゴサッカライドの３つの反復単位構造は、抗体結合を阻害出来なかったが、４および８反復は免疫原性エピトープを含み、そして抗体結合を効果的にブロックした。表10は、加水分解物濃度の効果および免疫原性エピトープを含む14オリゴサッカライドを調製するための反応時間を示す。免疫原性エピトープは、TFAの７時間加水分解によって保存されたが、24時間加水分解した場合、破壊された。表11は、免疫原性エピトープを含む19Fオリゴサッカライドを産生するために最適加熱条件を用いることの重要性を示す。免疫原性エピトープは、室温でのHC l加水分解により破壊されたが、加水分解を70℃で行なった場合、保持された。表12に示すように、23Fポリサッカライドの0.25M TFA、70℃、３時間の加水分解物では抗体結合の弱い阻害が観察された（Porro、カナダ特許第2 052 323号）。表13は、免疫原性23-オリゴサッカライドの生成における時間の効果を示す。7 0℃、３時間の0.1M TFA加水分解により産生されたオリゴサッカライドは、抗体結合を阻害したが、５時間の加水分解により調製されたオリゴサッカライドは阻害しなかった。表14は、70℃、15分間の0.5M TFA加水分解後、または70℃、５時間の５M酢酸での免疫原性オリゴサッカライドの存在を示す。これらの加水分解物は0.78μgの濃度まで効果的に阻害した。表15は、Neisseria meningtidis血清型Ｃの免疫原性オリゴサッカライドを認識するための阻害ELISAの有用性を示す。NaOAcを用いて調製した加水分解物は、完全なポリサッカライドと同じくらい効果的に抗体結合をブロックした。実施例３：カルボジイミドカップリングに対する炭水化物部分の酸性化 Rexyn 101（H）有機酸陽イオン交換カラム（Fisher Scientific）を準備し、そしてdH₂Oで洗浄した。dH₂O（pH中性）中に溶解したポリサッカライドまたはオリゴサッカライドサンプルをこのカラムに流し、そして６秒当たり１滴の速度で回収した。酸性化をpH色固定指示棒により確認した。過剰のdH₂Oを使用し、カラムを洗浄した。酸性化した画分をプールし、そしてカップリング反応での使用のために凍結乾燥した。図14は、アルデヒドおよび水酸基の形成をもたらすオリゴサッカライド構造の β-D-Glcp（１→４）β-D-Galの間のTFA切断を描く。アルデヒドのさらなる酸化はカルボキシル基を生じる。この物質を陽イオン交換カラムに通過させる場合、 COO^-基が生じる。実施例４：カップリング手順および定量アッセイカルボジイミド（EDC）カップリング手順１：１重量比のイオン荷電炭水化物（ポリサッカライドまたはオリゴサッカライド）サンプル（例えば、３mg）およびEDC（３mg）を、２mlの0.1M KH₂PO₄中に溶解し、１N NaOHまたはHClでpH 4.5を維持した。この混合物を、１時間室温で撹拌した。キャリア（３mg）を、EDCで活性化した炭水化物に添加し、次いで４時間室温で撹拌した。この反応を、200μlの10％重炭酸アンモニウムの添加によって停止させ、次いでこの混合物を１時間室温でさらに撹拌した。得られたコンジュゲートを、50,000分子量カットオフ（MWCO）透析チューブを用いて、一晩、d H₂Oに対して透析した。コンジュゲートを凍結乾燥し、次いで、Lowryタンパク質アッセイ、フェノール硫酸アッセイ、シアル酸アッセイ、およびリンアッセイによって組成についてアッセイした（下記の方法）。代表的に、このカップリング方法を用いて調製されたコンジュゲートは、１：２のキャリアに対する炭水化物の比を有する。炭水化物の定量のためのフェノール硫酸アッセイ試薬：５％フェノール溶液（94.5mLの蒸留水に添加した5.5mLの液体フェノール（90％））。標準：グルコース１mg/mlストック溶液。標準曲線のために、２〜60μg/200μl サンプル緩衝液を調製する。手順：（Handbook of Micromethods for the Biological Sciences．Keleti，G ．およびW．H．Lederer（編）、1974、Van Nostrand Reinhold Co.，New York：からの改変）１．非常に清潔なチューブに200μlのサンプルを入れる。２．200μlのフェノール試薬を添加する。３．１mLの濃硫酸を素早く添加する。４．よくボルテックスする。５．30分間室温で静置する。６．２〜30時間室温で色は安定である。７．490nmの吸光度を読み取る：#１のサンプルとして水のみを含むチューブをブランクとする。シアル酸の定量評価試薬：ａ．蒸留水で20mlに溶解した６gのAl₂(SO₄)₃・18H₂O。ｂ．６N HClに20mlまで溶解した１gのパラジメチルアミノベンズアルデヒド。（冷蔵庫中で暗瓶内で保存）標準：総容量350μlの０、2.5、５、10、15、20、25、30、35、40、45、および5 0μg/μlのN-アセチルノイラミン酸。350μlにするために蒸留水を使用する。方法：１．２連の200μlのサンプル。蒸留水で350μlにする。２．各チューブに700μlの試薬Ａを添加する。振動させる。３．350μlのEhrlich試薬Ｂを添加する。４．大理石で全てのチューブを覆う。５．Pierce Heating moduleを用いて100℃で30分間チューブを加熱する。６．氷浴中でチューブを素早く室温に冷却する。７．530nm波長の吸光度を読み取る。リンアッセイ試薬：ａ．2.5％のモリブデン酸アンモニウム；ｂ．10％のアスコルビン酸；ｃ．70％の過塩素酸；およびｄ．１mMのリン酸ナトリウム標準手順：（Rouser，G.，Siakotos，A．N.およびFleischer，S．1966、Lipids 1:85 -86：からの改変）１．清潔なチューブにサンプルおよび標準（０、25、50、100、および200μl；2 5〜200nmole）を入れる。２．蒸気フード内で180℃で５分間加熱ブロック中でサンプルを乾燥させる。３．各チューブに450μlの過塩素酸を添加し、チューブを大理石で覆い、そして 180℃で30〜60分間加熱する。４．チューブが冷却した後、2.5mLのd.H₂Oを添加する。５．0.5mlのモリブデン酸アンモニウムを添加し、そして直ぐにボルテックスする。６．0.5mlのアスコルビン酸を添加し、直ぐにボルテックスする。７．95℃の水中に15分間チューブを置く。８．チューブが冷却した後、820nmの吸光度を読み取る。９．読み取る前に、サンプルは数時間放置され得る。Lowry タンパク質アッセイ試薬：ａ．0.1M NaOH中の２％（w/v）Na₂CO₃（１L）ｂ．１％クエン酸ナトリウム中の0.5％CuSO₄（100mL）ｃ．Folin-Ciocalteuフェノール試薬（２×）ｄ．ウシ血清アルブミン（１mg/mL）手順：１．最終容量200μl中の０、12.5、25、50、100、および200μgのBSA：からなる標準曲線を調製する。２．未知のタンパク質サンプルをd.H₂Oで200μLにする。３．試薬ＡおよびＢを50：１（v/v）で混合し、そして各サンプル２mLを添加する。４．ボルテックスし、そして10分間室温で放置する。５．Folin-Ciocalteuフェノール試薬をd.H₂Oで１：１に希釈し、そして各サンプルに200μL添加する。６．ボルテックスし、そして30分間室温で放置する。７．660nmの吸光度を読み取る。過ヨウ素酸塩酸化カップリング手順ポリサッカライドまたはオリゴサッカライドのサンプル（例えば、３mg）を、新たに調製した３mlの50mM酢酸ナトリウム中の60mMメタ過ヨウ素酸ナトリウムに溶解した。次いでこの調製物を、４℃で一晩撹拌した。次いで、エチレングリコール（300μl）を添加して反応を停止させ、続いてこの混合液を１時間室温で撹拌し、次いで凍結乾燥した。1.5mlの0.03M重炭酸アンモニウム（pH＝8.0）に溶解したサンプルを、P-2 Bio-Gelカラムに通過させた。フェノール硫酸またはシアル酸アッセイを用いて、過ヨウ素酸塩で還元した形態のサンプルを含む画分を決定し、これを続いて凍結乾燥した。図15は、還元されたポリサッカライド（23価ポリサッカライドワクチン-Pneum れぞれ、Streptococcus pneuminiaeの6Bおよび19F血清型の還元されたオリゴサッカライドの分離を示す。３mgの還元されたサッカライドおよび３mgのキャリアを、３mlの0.1M四ホウ酸ナトリウム10水和物、pH8.9中に溶解した。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（H＋供給源）をこの混合物に添加し、そして50℃で48時間撹拌した。80％酢酸でpH３〜４に調整することによってこの反応を停止させた。次いで、このコンジュゲートを、50,000 MWCO透析チューブを用いて48時間dH₂O（２〜３回dH₂O 交換）に対して透析した。コンジュゲートを凍結乾燥し、そしてコンジュゲートの組成をLowryタンパク質アッセイ、フェノール硫酸アッセイ、シアル酸アッセイおよびリンアッセイによって決定した。代表的には、このカップリング法を用いて調製したコンジュゲートは、１：５〜１：10のキャリアに対する炭水化物の比を有する。図18は、過ヨウ素酸塩およびEDCカップリング化学反応を描写する。実施例５：コンジュゲートキャリア実施例４は、弱い免疫原性かまたは非免疫原性ポリサッカライドから免疫原性オリゴサッカライド／ポリサッカライドコンジュゲートを作製するために使用される方法を記載する。破傷風トキソイドを、キャリアとして使用するためにカラムクロマトグラフィーにより精製した。この精製したトキソイドは、高レベルのIgM(例えば、50μg/ mlのマウス血清)およびIgGアイソタイプ(例えば、IgG、100μg/mlの血清；IgG_2a 、38μg/mlの血清；IgG_2b、68μg/mlの血清；およびIgG₃、105μg/mlの血清)を誘発した。実施例６：オリゴサッカライド／ポリサッカライドコンジュゲート上の免疫原性エピトープの決定：実施例２に記載のように阻害ELISAを使用した。モノ-ハプテン８-オリゴサッカライド破傷風トキソイドコンジュゲート上の免疫原性エピトープの存在を阻害 ELISAによって確かめた。このコンジュゲートは、８ポリサッカライドをコーティングしたELISAプレートへの抗８血清の結合を阻害した(図19)。遊離の破傷風トキソイドは、結合を阻害しなかった。ジ-ハプテン６：８；14：８、および19 ：８コンジュゲート上の免疫原性８オリゴサッカライドの存在もまた示された。８-モノ-ハプテンコンジュゲートとジ-ハプテンコンジュゲートとが同程度に抗体結合をブロックしたように、この図は、本発明者らのカップリング手順の再現性を示し、これは、各コンジュゲートが、等量の８オリゴサッカライドを含有したことを示す。表16は、6Bポリサッカライド、6Bオリゴサッカライド、6B:８ジ-ハプテン-オリゴサッカライド破傷風トキソイドコンジュゲート、または破傷風トキソイド単独を阻害抗原として使用した場合の阻害ELISAの結果を示す。破傷風トキソイドは、抗6B血清の6B-ポリサッカライドでコートしたELISAプレートへの結合を阻害しなかった。遊離の6B-オリゴサッカライドまたはポリサッカライドは結合を阻害した。6B:８ジ-ハプテン-オリゴサッカライド-TTコンジュゲートもまた結合を阻害した。これは、6B:８ジ-ハプテン-TTコンジュゲート上の免疫原性6Bエピトープの存在を確証する。同様に、14:８-ジ-ハプテン-TTコンジュゲートは、抗14血清結合を阻害し、14 血清型免疫原性エピトープの存在を示した(表17)。高濃度では、TT単独で非特異性阻害があることに注目されたい。本発明者らは、これが、このアッセイにおいて、抗14の人工産物であることを見出した。 23F加水分解物の種々のオリゴサッカライド画分をTTにカップリングした。表1 8に示すように、全てが、23F血清型の免疫原性エピトープを含有する。破傷風トキソイドにカップリングした場合、N．meningitidisオリゴサッカライドの免疫原性エピトープ(NaOAc調製)は、同様に維持された(表19を参照のこと )。実施例７：胸腺非依存性(TI)抗原および胸腺依存性(TD)抗原によって誘発された抗体アイソタイプレベルの決定抗体アイソタイプレベルを測定するための基本的な手順は、以下のように種々のコンジュゲートによって誘発されるIgM、IgG、およびIgAアイソタイプを定量することである：１．100μl/ウェルの0.05M炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.5)中の１μg/ウェルのAgを用いてEIAプレート（NUNC、IMMUNOSORB）をコートする。２．４℃で一晩インキュベートする。３．翌日、100μlウェルのブロッキング緩衝液(１×PBS＋1％BSA)を用いてプレートをブロッキングする。室温で約１時間インキュベートする。４．ワーキング緩衝液(１×PBS＋0.1％Tween)で、１:25希釈のマウス血清を調製する。適切なウェル中に100μl/ウェルを添加し、室温で２時間インキュベートする。５．洗浄緩衝液(１×PBS＋0.05％Tween)で３回、プレートを洗浄する。ベンチトップ上でプレートを軽くたたいて過剰な液体を振り出す。６．ワーキング緩衝液で１：２希釈のEIAグレードマウス型(ウサギ抗マウス、Ig M、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃およびIgA、Bio-Rad)を100μl/ウェルで調製する。室温で２時間インキュベートする。７．プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する。８．ワーキング緩衝液で１：1500希釈のヤギ抗ウサギIgAアルカリホスファターゼコンジュゲート(TAGO)を100μl/ウェルで調製する。室温で２時間インキュベートする。９．プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄する。 10．Sigma#104アルカリホスファターゼ基質タブレット(１タブレット／５mlの10 ％ジエタノールアミン基質緩衝液)を用いて、100μl/ウェルで酵素の基質を調製する。暗室にて室温でインキュベートし、30分毎に405nm波長を読みとる。 11．種々の濃度のマウスのクラスおよびサブクラス特異性免疫グロブリン(Zymed Labs.Inc.)に対するウサギ抗マウスアイソタイプ抗体のELISA応答から作製した用量-応答曲線を用いて、吸光度の読み取り値を抗体μg／血清mlに変換する。表２は、S．Pneumoniae ８血清型オリゴサッカライドコンジュゲートおよびポリサッカライドコンジュゲートを用いて免疫化した場合にマウスで誘発される抗体を示す。８オリゴサッカライド-コンジュゲートのみが全てのアイソタイプのI gG抗体を誘発し、コンンジュゲートしていないオリゴサッカライドは免疫原性ではなく、ポリサッカライドおよびポリサッカライド-コンジュゲートは、TI応答の代表的な抗体のアイソタイプ(主に、IgM、IgA、およびIgG₃アイソタイプ)を誘発した。アジュバントは、本発明者らのオリゴサッカライド破傷風トキソイドコンジュゲートを用いるIgGアイソタイプの誘発には必要なかった。比較的小さなオリゴサッカライドを含むコンジュゲート(２〜４反復単位(８〜16サッカライド )のハプテン)は、直接的なELISAによって測定される最適な抗体応答を誘発した。直接的なELISAプロトコル１．NUNC Maxisorp Immunoplateを使用する。２．炭酸塩-重炭酸塩緩衝液でコーティング抗原を1.0μg/100μlに希釈する。抗原はプラスチックに膠着するので、ガラスチューブを使用する。３．100μlを各プレートのウェルに添加する。４℃で一晩保存する。４．PBS-0.05％Tweenで３回洗浄する。キムワイプ／紙タオル上で軽くたたくことによって、過剰のPBSを取り除く。５．100μl/ウェルのブロッキング剤(1×PBS-１％BSA)を添加する。室温で60分間インキュベートする。６．工程４と同様に３回洗浄する。７．PBS-0.01％Tweenで適切に希釈した100μl/ウェルの試験抗体を添加する。90 分間室温でインキュベートする。８．工程４と同様に３回洗浄する。９．PBS-Tween １/1500で、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウスIg( TAGO カタログ#4653)を希釈する。100μl/ウェルを添加し、暗所で90分間インキュベートする。 10．工程４と同様に３回洗浄する。 11．100μl/ウェルのSigma 104 ホスファターゼ基質(ジナトリウム-ｐ-ニトロフェニルホスフェートタブレット)を添加する。基質の２タブレット(５mg/タブレット)を、10mlのジエタノールアミン緩衝液に添加する。基質は光によって不活化されるので、暗所で保存する。 12．暗所にて、室温でインキュベートする。反応の進行は、抗体に依存して変化する。吸光度を、Microelisa Auto Reader(405nm)で、約30分間隔で読み取り得る。表20の結果は、８-コンジュゲートを用いて免疫化した３週齢または８週齢のマウスにおけるIgG₁およびIgG₃レベルの比較を示す。有意なIgG₁レベルが、３週齢(0.273μg/ml)および８週齢(0.700μg/ml)の免疫化したマウスにおいて、８- オリゴサッカライド-TT-コンジュゲートによって誘発された。TD応答に示されるように、アジュバント(例えば、FCA)は、特定のIgG₁を増加した(1.22μg/ml)。８-ポリサッカライドは、ポリサッカライドTI応答に代表的な、IgG₃の過剰発現および低IgG₁を誘導した。８-ポリサッカライド-TTコンジュゲート(「TD抗原」と考えられる)は、TIポリサッカライド抗原に特徴的な、IgG₃の過剰発現を伴った、低レベルのIgG₁をわずかに誘導した。同様に、アジュバンドと８-ポリサッカライド-TTコンジュゲートとの組合せは、IgG₁レベルを増強しなかったが、IgG₃ 抗体は増加した(TI様応答)。いくつかのポリサッカライド-コンジュゲートは、 TIおよびTD抗体応答プロフィールの組合せを誘発することが公知である(Stein、 1992；Stein、1994)。図20は、８ポリサッカライドに対する８：14ジ-ハプテン-オリゴサッカライド -TTコンジュゲートによって誘発されたIgG抗体のアイソタイプを示す。８-モノ- ハプテンコンジュゲートのように、このジ-ハプテンコンジュゲートは、８-ポリサッカライド-コンジュゲートまたは８-ポリサッカライド単独よりも非常に高レベルの特異的IgG₁抗体を誘導し得た(TD応答)。ポリサッカライド免疫原に対する IgG₃アイソタイプの過剰発現を示す。コントロールマウスは、破傷風トキソイド単独で注射された。表21に、14血清型-オリゴサッカライドコンジュゲートを用いて得られた結果を示す。0.1M TFA加水分解によって調製された14-オリゴサッカライド-TT-コンジュゲートは、IgG₁、G_2a、G_2b、およびG3アイソタイプを誘発し、１μg用量が最も免疫原性であった。0.5M TFA加水分解物の分離ピーク７および８の炭水化物画分を用いて調製されたオリゴサッカライド-TTコンジュゲートは、より低いレベルのIgGアイソタイプを誘発した。コンジュゲート形態のより小さなオリゴサッカライド(0.5M TFA調製物のピーク４および５)は、低レベルのIgGアイソタイプを誘発した。14-ポリサッカライド-TTコンジュゲートは、比較的高レベルのIg G₁ アイソタイプを誘発した。しかし、このポリサッカライドコンジュゲートを注射したマウス由来の血清は、(実施例８(表24)に示されるように)免疫防御性ではなかった。14血清型病原体に対して免疫防御を提供するためには、閾値レベルのIg G抗体アイソタイプを必要とするようである。カップリングしていない14ポリサッカライド、破傷風トキソイド単独、または0.9％NaClネガティブコントロール血清の全ては、全て低レベルのアイソタイプを示し、正常なマウス血清(NMS)レベルに等しい。図21は、代表的なTD応答に、８：14ジ-ハプテン-オリゴサッカライド-コンジュゲートによって誘発された14-ポリサッカライドに対する増加したレベルのIgG₁ 抗体アイソタイプを示す。14-ポリサッカライドは、IgG₃の過剰発現(TI応答)を誘導し、14オリゴサッカライド単独では、免疫原性ではなかった。カップリングしていない破傷風トキソイドは、ネガティブコントロールであった。個々のヒトの場合と同様に、マウスの異なる群は、オリゴサッカライド-コンジュゲートおよびポリサッカライド-コンジュゲートに対して変化しやすい応答を示した。マウスの特定の群において、異なるIgG抗体アイソタイプレベルにおける変化を観察した。図22Aは、14-ポリサッカライドコンジュゲートに対してIg G₁を産生した(TD様応答)「良好な応答」のマウスの群の結果を示す。それにもかかわらず、14-オリゴサッカライド-コンジュゲートは、より高レベルのIgG₁を誘発した。このコンジュゲートはまた、実質的なレベルのIgG_2b(0.955μg/ml＝オリゴサッカライド-コンジュゲート；0.139μg/ml＝ポリサッカライド-コンジュゲート)を誘発した。この応答は、FCAで増強されたこれらのIgG_2b抗体として駆動されたTDであった(図22B)。(1.509μg/ml＝オリゴサッカライド-コンジュゲート；0.474μg/ml＝ポリサッカライド-コンジュゲート)。ポリサッカライド-コンジュゲートより高いTD抗体応答を誘発する本発明のオリゴサッカライド-コンジュゲートの能力は、S．pneumoniae免疫原に限られなかった。Neisseria meningitidisの群Ｃのオリゴサッカライドコンジュゲートは、ポリサッカライド-コンジュゲート(3.60μg/ml)またはポリサッカライド単独(0. 162μg/ml)より高レベルのIgG₁アイソタイプ抗体(7.01μg/ml)を誘発した。興味深いことに、オリゴサッカライドコンジュゲートによって誘導されたIgG₃アイソタイプ量もまたより多い(13.11μg/ml＝オリゴサッカライド-コンジュゲート；9 .84μg/ml＝ポリサッカライド-コンジュゲート；3.81μg/ml＝ポリサッカライド単独)。実施例８：コンジュゲートによって誘発された免疫防御性抗体を測定するための殺菌アッセイおよびオプソニン作用アッセイ使用した基本的な殺菌アッセイおよびオプソニン作用アッセイは、以下の通りである：殺菌アッセイ１．アメリカンタイプカルチャーコレクションより購入した所望のグラム陰性細菌を血液寒天プレートに線状に塗る。37℃で一晩インキュベートする。２．翌日、単離されたコロニーを拾い、そしてそれを滅菌試験管中の1.0mlのTod d-Hewitt Broth(THB)＋酵母抽出物(YE)培地に接種する。37℃で一晩インキュベートする。３．翌日、接種した細菌のO.D.を420nmの波長で測定する。ブランクとしてTHB＋ YE培地を使用する。４．滅菌平底96ウェルプレートに、各ウェルにつき滅菌2.5mmガラスビーズを添加する。５．各ウェルに： a．５μlの細菌 b．試験されるべき10μlのマウス血清を添加し、37℃で１時間インキュベートする。注意：工程５および工程６を、３連で行う。６．１時間のインキュベーション後、THB＋YEで１：20希釈の外因性補体(例えば、低毒性ウサギ補体(Low Tox Rabbit Complement,Cedarlane))を無菌的に調製する。50μl/ウェルで添加する。37℃で１時間インキュベートする。７．補体のインキュベーション後、50μlアリコートをガラススプレッダーを用いて血液寒天プレート上にプレートする。８．全ての寒天プレートをプラスチックバッグで包み、37℃で12時間インキュベートする。９．翌日、プラーク形成コロニーを計数する。オプソニン作用アッセイ１．(アメリカンタイプカルチャーコレクションより購入した)所望のグラム陰性または陽性細菌を血液寒天プレートに線状に塗る。37℃で一晩インキュベートする。２．翌日、単離されたコロニーを拾い、そしてそれを滅菌試験管中で1.0mlのTHB ＋YE培地と混合する。37℃で一晩インキュベートする。３．翌日、100U/mlの滅菌ハプテンを調製する。４．各マウス(５〜10匹のマウス)の尾に100μlの滅菌ハプテンをI.V.注射する。 10分後、マウスの後眼窩から滅菌試験管に採血する。５．細菌のO.D.を420nmの波長で測定する。ブランクとしてTHB＋YE培地を使用する。(O.D.の測定には、分光光度計4040を使用する) ６．滅菌2.5mmガラスビーズを含む滅菌平底96ウェルプレートの各ウェルに： a．50μlのヘパリン処理した血液 b．10μlの血清 c．５μlの細菌を添加する。この工程を３連で行う。７．プレートをスズ箔で覆い、そして37℃のインキュベーターで１時間振盪機( 低速)上でインキュベートする。８．１時間後、50μlアリコートを、ガラススプレッダーを用いて血液寒天プレート上にプレートする。９．全てのプレートをプラスチックラッパーで包み、そして37℃で12時間インキュベートする。 10．翌日、プラーク形成コロニーを計数する。 S.pneumoniae ８型オリゴサッカライドコンジュゲートを用いて免疫化したマウス由来の血清は、オプソニン作用アッセイで測定されたように免疫防御性であることが見出された。特定の抗莢膜抗体によって媒介されるS．pneumonae細菌のオプソニン作用は、宿主防御に不可欠である(Saundersら、1993)。このアッセイは、一般に、インビボにおける免疫防御能力の信頼性のある指標と考えられる。アッセイの結果は、８オリゴ-コンジュゲートに対する抗体が、血液寒天プレート上のS．pneumoniae ８血清型のコロニー形成単位の成長を著しく減少することを示す(表22)。(特異性コントロールとして使用した)３血清型および6B血清型のコロニー成長は阻害されなかったので、この減少は特異的であった。コンジュゲートしていないオリゴサッカライドまたはポリサッカライドを用いた免疫化(市販の肺炎球菌ワクチンを用いる)は、防御を誘発しなかった。ポリサッカライド- コンジュゲートを用いて誘発された防御(39％減少)は、オリゴサッカライドコンジュゲートを用いて誘発された防御(98％減少)よりはるかに低かった。これらの結果は、本発明者らの８オリゴ-破傷風トキソイドコンジュゲートが、８血清型S ．pneumoniae病原体に対して高レベルの免疫防御性抗体を誘発することを示す。ポリ-コンジュゲートによって誘発された免疫防御性抗体のレベルは、下限に近い。さらに、８-オリゴコンジュゲートは、全ポリサッカライドを単独で先に投与したマウスにおいて免疫防御性抗体応答を誘発し得た。２用量の８-ポリサッカライドを注射し、その後第三のオリゴ-コンジュゲートを注射したマウスは、それらの血清中に免疫防御性抗体を有した(オプソニン作用アッセイにおいて70％のコロニー減少)。予備実験において、３回のポリサッカライド注射を受けたマウスは、有意な量の防御抗体を誘発しなかった。キャリアタンパク質にカップリングした特定の血清型のオリゴサッカライドは、本発明の23価のポリサッカライドワクチンに対して応答しないかまたはわずかに応答する、危険性の高い群の免疫防御を増加するブースターとして有益であり得る。本発明者らは、ジ-ハプテン３オリゴ／８オリゴ-破傷風トキソイドコンジュゲートを用いる免疫原性研究を行った。両方の血清型のオリゴサッカライドを、TF A加水分解によって調製した。このマルチハプテンコンジュゲートを注射したマウスは、３血清型および８血清型に対する免疫防御性抗体を誘発した(96〜99％のコロニー減少−表23)。３／８-ポリサッカライドコンジュゲートは、免疫防御性抗体をほとんど誘発しなかった(10〜12％)。本研究に用いたモノ-ハプテン３オリゴ-破傷風トキソイドコンジュゲートは、阻害ELISAによって免疫原性エピトープを有すると決定されたオリゴサッカライドを用いて調製されず、そして免疫防御性応答を誘発し得なかった。免疫系をジ-ハプテン形態の３オリゴサッカライド上のエピトープに対して応答させる機構は、当然、推測である。しかし、本発明者らは、８オリゴサッカライドが３血清型オリゴサッカライド上のエピトープに対する応答を増加し得る細胞(すなわち、補助細胞またはヘルパー細胞)のクローンを刺激することを示唆する。本発明者らは、８オリゴサッカライド構造が、アジュバントまたはアジュバント「様」活性を有することを発見した。８オリゴサッカライドの比較的単純な反復単位構造(β-グルコース(１→４)β-グルコース(１→４)α-ガラクトース(１ →４)αグルコン酸)は、特異的にまたは非特異的に、免疫細胞を刺激／活性化するか、またはレセプターもしくは因子を誘発して、非免疫原性または弱い免疫原性のポリサッカライド／オリゴサッカライドに対する体液性／細胞性応答を増強し得る。８血清型オリゴサッカライドは、コンジュゲート形態における、またはワクチン処方物に対する混合物としてのアジュバント活性を有する。 14-オリゴサッカライド-TTコンジュゲート(0.1M TFA調製物−表24)のオプソニン作用の結果は、14血清型の良好な細菌のコロニー減少(76％)を示す。14-オリゴ-TTの0.5M TFA調製物は、より少ない免疫防御性抗体を誘発した(54％減少)。ポリサッカライド-TTコンジュゲート、ポリサッカライド単独、および破傷風トキソイドを注射したマウス由来の血清は、顕著に減少した阻害能力を示した(それぞれ18、２および15％)。コントロールマウス(0.9M NaClを注射およびNMS)由来の血清は、減少能力を示さなかった。ジ-ハプテン-オリゴサッカライドコンジュゲートはまた、オプソニン活性を有する抗体を誘発した。８：14-オリゴ-TTコンジュゲートに対する血清は、65％まで14血清型コロニー形成単位を減少した(表25)。このジ-ハプテンコンジュゲートは、モノ-ハプテン14-コンジュゲートと同等の免疫原性であった(CFUの減少＝ 68％)。ポリサッカライド-コンジュゲートを用いて免疫化したマウス由来の血清は、37％までCFUをわずかに減少した。実施例９：キャリア抑制の回避および抗原競合の減少多数の抗原が注射された場合の抗原競合による応答の減少は、いくつかの条件下で文献中に報告されている。免疫化スケジュールＡおよびＤから得られた結果は(表26)、本発明者らのマルチハプテンコンジュゲートの各成分に対する応答が単一のモノハプテンコンジュゲートによって誘発された応答に等しいかどうかの決定に使用される。本発明者らのモノ-およびマルチハプテンコンジュゲートの炭水化物抗原の単位質量は、等しい(すなわち、EDCコンジュゲートについては１：２のCHO：タンパク質比)。減少抗原負荷を用いる本発明者らのマルチハプテンコンジュゲートの設計は、抗原競合進行の可能性を最小化する。スケジュールＢおよびＥは、コンジュゲートを用いた最初の注射が、カップリングしていないポリサッカライド(単数または複数)を用いて追加免疫した場合、免疫系にＴ依存性応答を誘発するように記憶させるのに十分かどうかを決定する。スケジュールＣおよびＦは、本発明者らのコンジュゲートの予めポリサッカライド(単数または複数)でプライムしたマウスにおける免疫防御性抗体応答を促進する能力を確立する。そのような場合、３〜４血清型のオリゴサッカライドを含有するマルチハプテン肺炎球菌ワクチンは、危険性の高い患者においてPnemovax SAによって確証されるべき破傷風トキソイドに対する力価)で注射し、その後種々のS．pneumoniaeオリゴまたはポリ-TTコンジュゲートの３回の注射を行った( 図26)。全ての研究において、コンジュゲートを経口および皮下注射によって投与する。本発明のコンジュゲートは、幼児、未熟な免疫系を有する小児、および免疫抑制者における免疫応答を刺激する。これらの状況についてのモデルのように、本発明者らは、幼齢マウス、SCIDおよびヌードマウスにおける本発明者らのコンジュゲートの免疫能力効力を決定する。上述のように、これらのマウスはまた、キャリア抑制現象を研究するために、マルチコンジュゲート接種の前に破傷風トキソイドを用いて予備的に感作される。本発明の種々の実施態様の実施の上述の様式の改変は、本明細書中に記載のように、本発明の以下の教示により当業者に明らかである。上述の実施例は限定ではなく、本発明の単なる例示であり、その範囲は、以下の請求項によって制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号２，１５３，７３０ (32)優先日 1995年７月12日 (33)優先権主張国カナダ（ＣＡ） (31)優先権主張番号２，１５３，７３３ (32)優先日 1995年７月12日 (33)優先権主張国カナダ（ＣＡ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．a)少なくとも１つの免疫原性エピトープを含む、少なくとも１つのサイズ分離された炭水化物オリゴサッカライドハプテンであって、ここで、該オリゴサッカライドハプテンが特定の反復単位にサイズ分離されている炭水化物オリゴサッカライドハプテン；および b)被験体において胸腺依存性免疫応答を誘導するキャリアであって、ここで、該ハプテンが、該キャリアに直接的に共有結合的にカップリングされ、そして該ハプテン-キャリアコンジュゲートが防御的に免疫原性であるキャリア、を含有する、組成物。２．前記ハプテンが、細菌性またはウイルス性ポリサッカライドのオリゴサッカライドである、請求項１に記載の組成物。３．前記免疫原性エピトープの存在が、阻害ELISAを用いて決定される、請求項１に記載の組成物。４．前記オリゴサッカライドが、前記ポリサッカライドの酸加水分解により生成される、請求項２に記載の組成物。５．前記防御免疫原性が、アイソタイプELISAによって決定される、請求項１に記載の組成物。６．前記防御免疫原性が、殺菌アッセイまたはオプソニン作用アッセイによって決定される、請求項１に記載の組成物。７．前記ポリサッカライドが、S．pneumococcusの１、２、３、４、５、6B、７、7F、８、9N、9V、10A、11A、12、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22 、23F、および33F血清型の莢膜ポリサッカライドからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。８．２つ以上のハプテンを含む、請求項１に記載の組成物。９．キャリア抑制を誘導しない、請求項１に記載の組成物。１０．抗原性競合を誘導しない、請求項１に記載の組成物。１１．アジュバントをさらに含有する、請求項１に記載の組成物。１２．請求項１に記載の組成物を作製する方法であって、以下の工程：ａ）細菌性またはウイルス性ポリサッカライドを、得られるオリゴサッカライド上で免疫原性エピトープを保存するように、オリゴサッカライドに切断する工程；ｂ）サイズに基づいて、得られた該オリゴサッカライドを特定の反復単位に分離する工程；ｃ）免疫原性エピトープを含むこれらのサイズ分離されたオリゴサッカライドを選択する工程；ｄ）工程ｃ）で選択した１つ以上の該オリゴサッカライドを活性化する工程；およびｅ）該活性化したオリゴサッカライドを、被験体において胸腺依存性免疫応答を誘導するキャリアに直接的にカップリングする工程、を包含し、ここで、該得られた組成物が防御的に免疫原性である、方法。１３．前記切断が、酸加水分解を使用して実施される、請求項１２に記載の方法。１４．前記活性化が、陽イオンカラムにおける酸性化である、請求項１２に記載の方法。１５．前記カップリングが、1-エチル-3,3'-ジメチル(アミノプロピル)-カルボジイミドまたは過ヨウ素酸塩を使用して実施される、請求項１２に記載の方法。１６．前記カップリングが、ハプテンのキャリアに対する予測可能な比を提供する、請求項１２に記載の方法。１７．工程ａ）からｄ）を、少なくとも１つの追加の細菌性またはウイルス性ポリサッカライドを使用して繰り返し、２価または多価のコンジュゲートを生ずる、請求項１２に記載の方法。１８．前記細菌性ポリサッカライドが、S．pneumococcusの１、２、３、４、５、6B、７、7F、８、9N、9V、10A、11A、12、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A 、20、22、23F、および33F血清型の莢膜ポリサッカライドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。１９．細菌性病原体に対する防御免疫化を提供する方法であって、このような処置が必要な哺乳動物に有効量の請求項１に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。２０．前記投与が経口および非経口からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。２１．前記哺乳動物が、新生児である、請求項１９に記載の方法。２２．前記哺乳動物が、免疫抑制された哺乳動物および年配の哺乳動物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。２３．抗原に対する免疫応答を刺激するに有用な組成物であって、該免疫刺激性組成物は、決定された免疫原性エピトープを含むS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドおよび適切な薬学的賦形剤を含有し、ここで、該オリゴサッカライドは免疫刺激性効果を提供する、組成物。２４．前記オリゴサッカライドが、タンパク質キャリアにコンジュゲートされている、請求項２３に記載の組成物。２５．キャリア抑制を誘導しない、請求項２３に記載の組成物。２６．抗原性競合を誘導しない、請求項２３に記載の組成物。２７．細菌性病原体に対する防御免疫化を提供する方法であって、該方法は、このような処置が必要な哺乳動物に有効量の請求項２３の組成物を投与する工程を包含する、方法。２８．抗原に対する免疫原性応答を増大させる方法であって、決定された免疫原性エピトープを含むS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドを該抗原とともに投与する工程を包含する、方法。２９．前記投与が経口および非経口からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。３０．請求項２３に記載の組成物を作製する方法であって、以下の工程：ａ）S．pneumoniae ８血清型ポリサッカライドを、得られるオリゴサッカライド上で免疫原性エピトープを保存するように、オリゴサッカライドに切断する工程；ｂ）得られた該オリゴサッカライドをサイズに基づいて分離する工程；ｃ）免疫原性エピトープを含むこれらのオリゴサッカライドを選択する工程；およびｄ）該選択したオリゴサッカライドを適切な薬学的キャリアと混合する工程、を包含する、方法。３１．前記切断が、酸加水分解を使用して実施される、請求項３０に記載の方法。３２．工程ｄ）の前に、以下のさらなる工程：１）工程ｃ）で選択した前記オリゴサッカライドを活性化する工程；および２）該活性化したオリゴサッカライドを精製キャリアにカップリングさせる工程、を包含する、請求項３０に記載の方法。３３．前記活性化が、陽イオンカラムにおける酸性化である、請求項３２に記載の方法。３４．前記カップリングが、1-エチル-3,3'-ジメチル(アミノプロピル)-カルボジイミドまたは過ヨウ素酸塩を使用して実施される、請求項３２に記載の方法。３５．前記カップリングが、ハプテンのキャリアに対する予測可能な比を提供する、請求項３２に記載の方法。３６．哺乳動物において、抗原の免疫原性を増強する方法であって、該方法は、決定された免疫原性エピトープを含むS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドを、該抗原と共に投与する工程を包含し、ここで、該オリゴサッカライドは免疫原性効果を増強する、方法。３７．前記オリゴサッカライドがキャリアにコンジュゲートしたS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドである、請求項３６に記載の方法。３８．前記オリゴサッカライドが薬学的処方物またはワクチン処方物への混合物として投与される、S．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドである、請求項３６に記載の方法。３９．前記投与が経口および非経口からなる群から選択される、請求項３６、３７、および３８に記載の方法。４０．構造β-グルコース(1-4)β-グルコース(1-4)α-ガラクトース(1-4)α-グルコン酸を含むS．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドを哺乳動物細胞に投与することにより、該哺乳動物細胞を特異的または非特異的に刺激する、方法。４１．前記オリゴサッカライドが、キャリアにコンジュゲートされる、請求項４０に記載の方法。４２．前記オリゴサッカライドが薬学的処方物またはワクチン処方物への混合物として投与される、請求項４１に記載の方法。４３．前記投与が経口および非経口からなる群から選択される、請求項４０、４１、または４２に記載の方法。４４．アジュバントを哺乳動物に投与する方法であって、該方法は、構造β-グルコース(1-4)β-グルコース(1-4)α-ガラクトース(1-4)α-グルコン酸を含むS ．pneumoniae ８血清型のオリゴサッカライドを該動物に投与する工程を包含する、方法。４５．前記オリゴサッカライドが、キャリアにコンジュゲートされる、請求項４４に記載の方法。４６．前記オリゴサッカライドが薬学的処方物またはワクチン処方物への混合物として投与される、請求項４４に記載の方法。４７．前記投与が経口および非経口からなる群から選択される、請求項４４、４５、または４６に記載の方法。