JPH01500561A

JPH01500561A - 細菌抗原、抗体、ワクチン及びその製造方法

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Publication number: JPH01500561A
Application number: JP62502728A
Authority: JP
Inventors: エル．カスパー，デニス; ジェニングズ，ハロルド　ジェイ．; レビー，ナンシー　ジェイ．; ウェセルズ，マイケル　アール．
Original assignee: ザ　ブリガム　アンド　ウィメンズ　ホスピタル，インコーポレイテッド
Priority date: 1986-04-16
Filing date: 1987-04-14
Publication date: 1989-03-01
Anticipated expiration: 2013-05-20
Also published as: EP0302887A1; EP0302887A4; CA1305918C; ATE107703T1; JP2754000B2; EP0302887B1; DK656687D0; WO1987006267A1; DK656687A; DE3750139D1; DK175487B1; JPH08277298A; DE3750139T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細菌抗原、抗体、ワクチン及びその製造方法発明の背景本発明は、ＢｇＹのストレプトコッカス細菌の免疫決定子を有する抗原、これら細菌に対し保護するワクチン、この種のワクチンの製造方法、並びに細菌多糖類からのオリゴ糖の製造方法に関するものでおる。本明細書に使用するＢ群のストレプトコッカス（すなわちＧＢＳ）細菌という用語は、特にランスフィールド、ジャーナル・エキスペリメンタル・メジメン、第１０８巻、第３２９〜３４１頁（１９３８）　、並びにＢ群の血清型を特性化するその後の研究、たとえばラッセルージョンズ、ジャーナル・エキスペリメンタル・メジメン、第１６０巻、第１４７６頁（１９８４）を参照して当業者により理解されているように用いられる。特にこの用語は、分類学的にストレプトコッカス・アガラクチ７　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）と命名された細菌を包含する。

ＧＢＳは、幼児における菌血症及び（又は）脳膜炎、並びに成人における感染症に対する認められた病因学的薬剤である［ベーカー、「Ｂ群のストレプトコッカス感染」、アトパンシス・イン・インターナル・メジメン、第２５巻、第４７５〜５００頁（１９８０）　］。したがって、ＧＢＳ感染を診断するための迅速かつ明確な分析法並びに特に幼児及び汚染された個人におけるＧＢＳに対する保護の発生方法を開発することが重要で必る。

ＣＢＳカプセル状多糖類は、ＧＢＳ毒性及び免疫に対し重要であることが知られている［ベーカー、上記］。ざらに、認められたＧＢＳ型及び亜型は化学的に相関するが抗原的にトトース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチル−ノイラミン（シアリン）酸で構成された反復構造を有する［ベーカー、上記］６■型ＧＢＳカプセル状多糖類は、第１図に示したような分枝した五糖類の反復単位で構成された骨格を有する［ジェニングス等、キャナディアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第５８巻、第１１２〜１２０頁（１９８０）　］。

■型ＧＢＳ多糖類に関する１つの研究は、天然の免疫決定子部位が側鎖−骨格の接合部に位置することを示唆している［ジエニングス等、バイオケミストリー、第２０巻、第４５１１〜４５１８頁（１９８１）　］。側鎖の末端Ｎ−アセチル −ノイラミン酸残塁の存在は、免疫決定子の発坦に対し臨界的であると報告されている。

さらに、ＧＢＳ蛋白免疫性の研究も報告されている。ランスフィールド等［ジャーナル・エキスペリメンタル・メジメン、第１４２巻、第１６５〜１７９頁（１９７５）　］は、ＧＢＳのいわゆるＣ蛋白は免疫原として存在すれば全生物に対し保護抗体を誘発することができると報告している。「Ｃ蛋白」という命名は、ヘンリツクセン等によりインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー、第３４巻、第５００頁（１９８４）に定義されているように用いられ、この用語は従来Ｉｂｃ蛋白と命名された蛋白を包含する。

Ｃ蛋白の分子に対する研究が示すところでは、これらの物質は種々の分子量を有する蛋白の複雑な群を構成する［ウィルキンソン等、インフエクション・イミュノロジー、第４巻、第５９６〜６０４頁（１９７１）　：ベバンガー等、アクタ・バンロンカル・マイクロバイオロジー・スカンジナビャ、セクションＢ１第８７巻、第５１〜５４頁（１９７９）　：ラッセルージョーンズ等、ジャーナル・エキスペリメンタル・メジメン、第１６０巻、第１４７６〜１４８４頁（１９８４）　：ベバンガー等、アクタ・バンロンカル・マイクロバイオロジー・スカンジナビャ・セクションＢ、第８９巻、第２０５〜２０９頁（１９８１）コ。

ウィルキンソン等は、全ＩＣ型ＧＢＳの熱酸抽出物が種々異なる分子寸法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定）を有しかつＩｃ型抗血清に対し寒天ゲルにおいて血清学的反応性を有する１３種の蛋白を与えることを開示している。

ベバンガー等（１９７９）は、９種のトリプシン感受性蛋白と５種のトリプシン耐性であるがペプチン感受性の蛋白とを含有するＧＢＳ酸抽酸物出物示している。ベバンガー等（１９８１）は、部分精製された酸抽出蛋白の免疫性を開示している。ラッセル−ジョーンズ等は、２０．０００〜１３０．０００の範囲で分子量が変化する３０種までの蛋白を含有する抽出物を開示しており、１３０ｋｄの蛋白が主体である。ざらにラッセル−ジョーンズ等は、多数の蛋白が単一のモノクローナル抗体に対し免疫（ウェスタン）プロットにより反応したと報告しており、このことは成る種の蛋白が他の蛋白の分解生成物であったことを示唆している。他のモノクローナル抗体を用いて、１３０．０００　ＭＷの蛋白及び１０．０００〜１２０，０００　ＭＷの範囲の１２種の他の蛋白は共通のエピトープを有すると思われる。

インセル及びアンプルセン、ジャーナル・エキスペリメンタル・メジメン、第１６３巻、第２６２頁（１９８６）は、ヘモフィルス・インフレンザ（１−１ａｅｍｏｐ１−１ａｅ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　）カプセル状多糖類を蛋白キャリヤに結合させて、このカプセルをより胸腺依存性の免疫原に変換する試みを開示している。

発明の要点今回、ｍ型８群のストレプトコッカス（ＩＩＩ−ＧＢＳ）多糖類カプセルの反復五糖類単位（及び単一の単位だけでも）のオリゴマーが抗原性を示すことを突き止めた。この単位を含む抗原、特に反復単位を石層る抗原は、ＩＩＩ−ＧＢＳワクチンの成分として使用することができる。したがって、本発明の一面は、ｍ型８群のストレプトコッカス（Ｉ［ＩＧＢＳ）細菌に対し選択的免疫反応性である抗体を生成することができがっ［式中、ｎ＝１〜５０であり、ＧＩＣＮＡＣｐはＮ−アセチ−アセチル−ノイラミン（シアリン）酸を示す］を有する精製オリゴ糖からなる抗１京を特徴とする。

「精製」という用語は、オリゴ糖と共に天然に存在する種・々の蛋白、脂質及び炭水化物成分から実質的に分離されることを意味する。特に、精製オリゴ糖は完全ＩＩＩＧＢＳ多糖類カプセル又は１００．０００以上の分子量を有するその断片を実質的に含まない。微量の外来成分が精製オリゴ糖に存在したとしても、この精製物質をワクチンに使用したり或いは抗原として使用することを妨げない。

「精製」という用語は、人工的な合成を伴なう合成オリゴ糖調製物を排除することを意図せず、またこの用語は調製物が再現性のあるオリゴ糖特性データ、たとえば分子量、糖残部含有量、糖結合、クロマトグラフ反応及び免疫学的挙動を示す限り若干の不純物を含むような調製物を排除することを意味するものでもない。

第二面において本発明は、ＩＧＢＳに対し保護を示すことができかつ医薬上許容しうるベヒクルと必要に応じキャリヤに結合された上記抗原とからなるワクチンを特徴とする。

本発明の第三の面は上記抗原の製造方法を特徴とし、この方法は：　（１）［［ −ＧＢＳＩ［８菌を適当な培地で培養し：（２）培地又は細菌細胞から多糖類を回収し：（３）この多糖類を結合Ｓ１　（１−３）−β−ｇａ！　（１−４＞３２　［式中、Ｓｌ及びＳ２は独立してグルコニス、グルコサミン又はＮ−アセチル−グルコサミンから選択される］の開裂につき特異性でおるエンド−β−ガラクトシダーゼによって切断し：かつ（５）培地又は細菌からオリゴ糖抗原を回収することがらなっている。必要に応じ、オリゴ糖は下記するようにキャリヤに結合される。

前記３種の局面の好適具体例において、オリゴ糖抗原は、上記結合に対し特異性のエンド−β−ガラクトシダーゼを用いてＩ［ＩＧＢＳカプセル状多糖煩多糖類加水分解して生成される。この種の１種のエンド−β−ガラクトシダーゼはフラボバクテリウム・ケラトリチフス（Ｆ’ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｋｅｒａｔｏｌ　−ｙｔｉｃｕｓ＞に見出される。さらに好ましくは、オリゴ糖は細菌免疫決定子部位を有するたとえば蛋白、特に細菌トキソイド又は細菌表面蛋白のようなキャリヤに共有結合される（たとえば第２アミン結合を介する）。

第四の而において、一般に本発明はざらに上記結合を有する細菌多糖類の酵素開裂を特徴とし、すなわち精製オリゴ糖の製造方法に関し、この方法は特に表面多糖類（たとえば多糖類カプセル若しくは膜）を有する細菌を培養しかっこの多糖類を抽出し、次いでこれを上記酵素で切断し、ざらにオリゴ糖を回収する。好ましくは、細菌はダラム陽性菌、たとえばＩＩＩ型ＧＢＳである。或いは、この細菌はたとえば１４型ストレプトコツカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏ　−ｎｉａｅ）　（たとえばＡＴＣＣＮα６３１４）のような表面カプセル状多糖類を有する菌種とすることができる。

第五の面において、本発明はＩ　ａ／ｃ型Ｂ群のストレプトコッカスの実質的に精製されたトリプシン耐性のＣ表面蛋白を特徴とし、この蛋白は約１４．０００の分子量を有しかつ８群のストレプトコッカス細菌多糖類に対し非交差免疫反応性であるが、Ｉ　ａ／Ｃ型ＧＢＳに対し交差免疫性を有する。他の局面において、上記蛋白はＩ　ａ／ｃ型（及びＩ　ｂ／ｃ型）ＧＢＳに対し保護を示ずワクチンに使用され、このワクチンは蛋白（必要に応じ、たとえば上記した■型ＧＢＳオリゴ糖のようなオリゴ糖に結合される）と医薬上許容しつるキャリヤとからなっている。得られる結合体はＧＢＳに対し広範な保護を与え、ＩＩＩＧＢＳ及びＣ蛋白を有するＧＢＳに対し保護を示す。

ざらに他の局面において、本発明はＧＢＳに対し受働保護を与えうるγグロブリンフラクションを特徴とし、このフラクションは哺乳動物を上記ワクチンの１種で免疫化することにより生成される。次いで、このフラクションを個人に投与して、ＧＢＳ感染に対し保護を与えるか又は進行中の感染を処置する。

最後に、本発明は抗ＧＢＳ抗体に関する試料の分析方法を特徴とし、この方法は試料へ上記オリゴ糖又は蛋白抗原を添加し、次いで免疫複合体の生成を検出することからなっている。或いは、試料をＧＢＳ免疫決定子の存在につき分析し、その際オリゴ糖若しくは蛋白抗原に対する抗体を生成させ、この抗体を試料に添ｈａし、かつ免疫複合体の生成を検出する。

骨格グリコシド結合の酵素選択／Ｊ口氷水分解、単純／よ酸加水分解よりも優れている。何故なら、後者の技術は側鎖シアリン酸残塁の損失を伴い、かつ結合を非選択的に切断して免疫性の減少した不均質混合物を生成するからである。これに対し、酵素切断法はシアリン酸残基を保持し、かつ前略反復単位につき一旦生ずるとｇａｌ−β１−４−ｑＩ　ｃ結合においてのみ骨格の切断をもたらす。

本発明の他の特徴及び利点は、好適具体例に関する以下の説明から明らかとなるであろう。

好適具体例の説明以下、本発明の好適具体例につき説明し、先ず最初に図面につき簡単に説明する。

■、鳳厘第１図はＩ［ＩＧＢＳカプセル状多糖煩多糖類五糖類の図面で上記特定の五糖類は、■型ＧＢＳを培養しかつ多糖類カプセルを上澄ブロスから又は細菌細胞からジェニングス等の一般的方法［キャナディアン・ジャーヤル・バイオケミストリー、第５８巻、第１１２〜１２０頁（ｉ９８０）　］により抽出してｊｑられる。多糖類抽出物を、構造：Ｓｌ　（１→３）βｇａｌ　（１→４）βＳ２［ここで８１及びＳ２は独立してグルコース、グルコサミン又はＮ−アセチル−グルコサミンから選択される］を特異的に切断するエンド−β−ガラクトシダーゼによって切断する。

上記構造は■型ＧＢＳ多糖類カプセルの反復単位１個につき一回発生し、かつ得られた切断生成物は１個若しくはそれ以上の上記五糖類反復単位を有するオリゴ糖である。

酵素は、必須の特異的切断を触媒する酵素を産生することが知られた細菌から得られる。この種の好適な１種の細菌はフラボバクテリウム・ケラトリチフスである。必須の特異的活性を有する酵素を産生すると思われる他の細菌は、バクブロイデス・フラギリス（ＢａＣｔｅｒＯｉｄｅＳ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）である。キタミカデス等［下記］は、エツシエルキャ・フロインディ（［：５ＣｈｅｒｉＣｈ！ａ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）　、シュードモナス−ｓｐ、（ｐｓ　−ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）及び１１バチルス−ｓｐ、（Ｃｏｃｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、）にも硫酸グラタン上で誘発させれば必須のエンド−β−ガラクトシダーゼ活性が存在することを報告している［ナカガワ等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５０巻、第９１２〜９１７頁：及びヒラメ等、コネクテイブ・ティシュ−・リザーチ、第２巻、第１〜１０頁］。適するＦ。

ケラトリチフスは日本国、大阪在、＆’ｌＩ？研究所（Ｉ　ＦＯ）からＩ　ＦＯＮｏ、　１４０８７として得ることができる。エンド−β−ガラクトシダーゼを作成するための適する一般的方法は、キタミカド等によりジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２巻、第３９０６〜３９０９頁（１９８１）に示されている。

上記のように作成した抽出■型ＧＢＳ多糖類カプセルを緩衝酵素調製物に添り口しかつ培養する（たとえば、３７℃、４８時間）。切断後、オリゴ糖をゲル濾過クロマトグラフィー、たとえばセファデックスＧ７５（ファルマシア社）により分子量で分離し、かつ陰イオン交換クロマ−トゲラフイー、たとえば陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、モノＱ（ファルマシア社）又はＱＡＥセファデックス（ファルマシア社）によって精製する。

約１〜５０個（特に好ましくは約２〜３０個）の五糖類単位からなる精製されたオリゴ糖をクロマトグラフ群から選択し、次いでこれをワクチンに使用するための蛋白に結合させる。

この蛋白は不活性キャリヤとすることができ、或いはそれ自身にて保護を与えるよう、特に他の種類のＧＢＳ又は他の細菌に対し保護を誘発することによりオリゴ糖で誘発される保護を補完して保護を与えるよう選択することができる。非毒性のジフテリャ毒素同族体（ＣＲＭ　１９７）を、インセル等（１９８６）によりジャーナル・エキスペリメンタル・メジメン、第１６３巻、第２６２頁及びアンプルセン等、ジャーナル・クリニカル・インベスチグーション、第７６巻、第５２頁（１９８５）に記載されたように使用することもできる。使用しうる他のトキソイドは、７９ヂユーセツツ州、ジャマイカ・プレイン、サウスストリート在、マサチューセッツ州立ラボラトリ−から入手しうる破傷風毒素又は標準的ジフテリア毒素を包含する。

蛋白−オリゴ糖結合体は、たとえばシュワルツ及びグレーの一般的方法［アーキテクチャ−・バイオケミカル・バイオフィジオロジ−（１９７７）　、第１８１巻、第５４２頁］のようなカップリング反応によって得られ、この方法は還元糖を蛋白へ直接に結合させる。脱アミン化によって生成されたオリゴ糖断片を、シアノ硼水素化物を介してキャリヤ蛋白へ直接に結合させることができる。ＩＧＢＳの場合、蛋白における窒素とオリゴ糖の脱アミン化により生成された２、５− アンヒドロマンノースにおけるアルデヒド基との間の結合によって第２アミンが生成される。このアルデヒドは、シアン硼水素化物を用いる直接的カップリングによって得られる。

得られたオリゴ糖−蛋白結合体を、発熱物質を含有しない塩水又は他の任意の生理学上許容しうる無毒性ベヒクル若しくは媒体に懸濁させ、これらの媒体は任意慣用の安定化剤又は他の添加剤を所望に応じて含有することができる。抗原の濃度は臨界的でなく広範囲に変化しうるが、多くの目的には１０〜１ｏｏｏｕ９／ｓの範囲が便利かつ好適である。この形態において、４℃にて長期間貯蔵する際に安定となり、ざらにフッド・アンド・ドラッグ・アトミニストレージョン・レジスレージョン（第２１節、第６１０．１１〜６１０．１３項）に記載サレタような動物試験にかけた際無菌、無毒かつ非発熱性である。

上記塩水懸濁物の適する容量（たとえば約０．５ｍ１）を投与して（たとえば皮下注射により）　、Ｉ［ＩＧＢＳ保護を誘発させる。

さらに、本発明は特に幼児又は汚染した成人に使用される受働免疫法を特徴とし、この方法はＡリボ糖−蛋白結合体のワクチンをヒトに注射して高タイターで抗体を発生せしめ、抗血清をヒトの血液から分離し、かつ抗血清を分画して受働免疫に使用しうる抗体を含んだγグロブリンフラクションを生成させる。受働免疫のための供与体を作成するこの方法は、免疫化されていないヒト成人がイ重めで高レベルのタイプ特異性Ｇ　Ｂ　Ｓ抗体をその血清中に有するが、充分高いタイターのグロブリンフラクションを受働免疫に使用すべく白票を貯蔵しうる個体を選択するには極めて多数の試料をスクリーニングする必要があるので有用である。免疫化されてない成人からの幾種かの貯蔵とトＴグロブリンのロットを抗−Ｉａ及びＩＣ型、抗−■型及び抗−■型子糖類抗体につき分析して、僅か５〜２０ｔｔｓ／ｄ！の血清を含有することが判明した。このような低タイターのグロブリンの静脈内注射による免疫化は、恐らく逆反応の危険性を伴う多量の投与量を必要とする。

受働免疫化には、上記結合多糖類ワクチンでワクチン接種した選択個人からのヒト血清保存物を濃縮しかつ常法により分画して、タイプ特異性抗体の大部分及び充分高い活性を有するグロブリンフラクションを与えることができ・、この高灸疫グロブリンはたとえば規定濃度の塩水のような適当な生理学上許容しうるキャリヤにて静脈内又は筋肉内投与する際０．３〜１ｄ、好ましくは約０．５ｒｎｌという少投与量にて有効である。キャリヤ中のグロブリンの濃度は５〜２０重量％とすることができる。この高免疫グロブリンは、出産前の妊娠した婦人、新生児又は免疫学的に汚染した個人に投与して受働免疫又は治療を与えることができる。

■、オリゴ糖抗体一般に、オリゴ糖は細菌多糖類のエンド−β−ガラクトシダーゼ切断によって回収することができる。上記説明はｌＧ３５オリゴ糖並びにワクチンにおけるその使用に関するものであるが、ざらにオリゴ糖はたとえば哺乳動物にオリゴ糖−蛋白結合体を注射しかつ得られた抗体を回収することにより哺乳動物を処理して、実験哺乳動物中に抗体を発生させるべく使用することもできる。ざらに、標準技術によってモノクローナル抗体を発生させることもできる。得られる抗体は、たとえばＧＢＳ或いは特にＩＩＩＧＢＳに対する免疫分析に有用である。たとえば、オリゴ糖に対する抗体を、当業界で知られた競合若しくはサンドインチ免疫分析のような免疫分析に使用することもできる。

以下の実施例によりオリゴ糖抗原、オリゴ糖の分離方法、ワクチン及び受働免疫化法につき説明する。

例　１：エンドルβ−ガラクトシダーゼの作成Ｆ、ケラトリチクスを１晩培養し、かつこれを使用して改変トリブチカーゼペプトンブロス（８Ｂ１マイクロバイオロジー・システムス社、ミズーリー州、コツヶ、イスビル在からの３％のトリブチカーゼペプトン）　：　０．１％酵母抽出物（ジフコ・ラボラドリース社、ミシガン州、デトロイト在）二０．２％ＮａＣｌ、　ｐ）−ｆ　７．０に接種した。このブロスを１８時間培養しくフランス国、ラフイツト在、ビオラツイツチ・フッメンタ）、その間通気（１５ｆ　／ｍｉｎ、　）　、撹拌（１５０ｒｐａＩ＞　、’ｇ度（２５℃）及びｐＨ（７，０＞を調節した。遠心分離によって細菌を除去し、そして上澄液を濃縮した（マサチューセッツ州、ベッドフォード在、ベリコン・カセット・システム、ミリポア・コーポレーション社）。固体の（ＮＨ４）２　ＳＯ４を７５％飽和まで添加しかつ溶液を４℃にて１晩静置した。

沈澱物を遠心分離によって除去しがっ１０ｄの酢酸ナトリウム（０，２Ｍ　Ｎａｃｚ、ｐＨ６，０）Ｑ溶解させた。この溶液を５ｘ９０ｃｍのセファデックスＧ　１００カラムにュージャジー州、ビス力タウエイ在、ファルマシア・ファイン・ケミ力）レス社）に充填し、かつ同じ緩衝液を用い４℃で４０Ｉ１１１／　ｈｒ、の速度にて溶出させた。活性フラクションをエンド−β−ガラクトシダーゼ活性につき分析して同定し、次いで貯蔵した。

特に、これらフラクションを牛角膜の硫酸グラタン（ミズーリ州、セントルイス在、シグマ・ケミカル・カンパニー社）と共に３７℃にて１晩培養した。還元糖の生成を、パーク及びジョンソン、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第１８１巻、第１４９〜１５１頁（１９４９）の一般的方法により測定した。

貯蔵した活性フラクションを透析し、凍結乾燥し、かつ緩ｉＭ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍ）ｌ　ＣａＣ２２、ｐＨｓ、ｏ＞　に溶解させた。この緩衝した酵素調製物を、上半分にＤＥＡＥセフ７セル（ファルマシア社）を含有しかつ下半分にどオレックス７０にューヨーク州、ロックビル・センター在、ビオラド・ラボラドリース社）を含有する２、５ｘ　１４ｃｍのカラムに充填した。この酵素を上記緩衝液２５０ｄで溶出させた。残留した結合蛋白を１．ＯＭ　ＮａＣｆｆ１で溶出させ、がっ活性貯蔵１う’ｙジョンを１０ｍＨｍｍｔトリウム、２ｍＭ　ｃａｃｔ２　（ｐＨ７、Ｏ）で透析しかつ凍結乾燥した。

例２：Ｗ」 ■型ＧＢＳ多糖類を上記ジエニングスの一般的技術（１９８０）によって抽出した。ＤＥＡＥセフ７セル／ビオレックス７０カラムの試験から得られた凍結乾燥したエンド−β−ガラクトシダーゼ調製物を１０ｒＩｉｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍ）！塩化化層ルシウムＤＨ７，０＞に溶解させ、かつ２乏の同じ緩衝液に対し４℃にて浴を１回交換して１晩透析した。２０ｍｇの精製された■型ＧＢＳカプセル多糖類を酵素調製物に添加した。この混合物を濾過滅菌し、かつ撹拌しながら３７℃で４８時間培養した。

例　３：オリゴ糖の精製及び特性化切断後、オリゴ糖を１２，０００〜１４，０００ダルトンの孔径の膜（カリホルニア州、ロスアンゼルス在、スペクトラム・メジカル・インダストリーズ社）を介しての水に対する透析により大分子量と小分子量との貯蔵物に分離した。１個（五糖類）及び２個（十糖類）の反復単位に対応するオリゴ糖を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。少量のオリゴ糖（１ｍ（ｌ若しくはそれ以下）は、陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（１−ｔＰＬｃ）により精製することができる。

５００ｕ９の切断混合物（小分子量貯蔵物）を５ｘ５０ｍｍのモノＱカラム（ファルマシア社）に充填し、かつ１個及び２個の反復単位のオリゴ糖を２０ｍＨトリスＨＣ４緩衝液（ｐＨ７，２）によって平等に溶出させた。より大きいオリゴ糖は、より高い塩濃度で溶出させることができる。多量のオリゴ糖を精製するため、ＱＡＥセファデックスＡ３０（ファルマシア社）を充填した１、２ｘ　１０ｃｍのカラムを用いた。２〜８ＩＩ１ｇの試料を、２０ｍ）ｌＮ−メチルジェタノールアミンアセテート（ｐＨ９，６）の出発緩衝液にてこのカラムに充填した。カラムを３０ＩＩＩｉの出発緩衝液で１ｍｌ／ｍｉｎ、の速度にて洗浄し、次いで単一反復単位のオリゴ糖を５（７の１５ｍ）ｌ酢酸ナトリウムを含有する出発緩衝液で溶出させた。２ｄのフラクションを集め、１Ｍ酢酸で中和しかつ薄層クロマトグラフィー（ＴＬＧ＞によって分析した。単一反復単位のオリゴ糖を含有するフラクションを集め、凍結乾燥し、２Ｉｄの水に溶解させ、かつセフ１デツクスＧ１５（ファルマシア社）を含有する１、６ｘ　２５ｃｍのカラムで脱塩した。

主たる切断生成物は四糖類と十糖類との標準間で移動するバンドに対応し、第１図の五糖類単位につき予測される物質に適合した分子寸法を有する。このバンドのジフェニルアミン及びレゾルシノール染色はシアリル化された糖類に一致した。メチル化分析は、この構造が完全に五類反復単位であることを確認した。

１個及び２個の反復単位オリゴ糖を陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析した。陰イオン交換ＨＰＬＣは、少量のオリゴ糖（１〜２１１Ｉｇ若しくはそれ以下）を精製するための迅速かつ便利な方法である。単一反復単位のオリゴ糖はボイド空間に溶出し、２個反復単位のオリゴ糖は平等相中にその後に溶出する。

より大きいオリゴ糖又は天然多糖類は平等相に保持されるが、０．５Ｍ塩化ナトリウムによりこのカラムから容易に溶出される。この方法を用いて、放射性抗体結合分析（ＲＡＢＡ＞研究に使用するためのトリチウム化された１個及び２個の反復単位のオリゴ糖を精製することができる［シフェルレ（１９８５）　、ジャーナル・イミュノロジー、第１３５巻、第４１６４頁参照］。多量の単一反復単位のオリゴ糖を精製するため、開放陰イオン交換カラムを用いて、より大きい結合容量を与えることができる。このＱＡＥセファデックスＡ５０カラムを用いて、単−反復単位並びにそれより大きいｉリボ糖を出発緩衝液に保持した。より大きいオリゴ糖を含まない単一反復単位を、１５ｍ）ｌ酢酸ナトリウムを含有する出発緩衝液で溶出させた。より大きいオリゴ糖は結合状態に維持され、かつ塩濃度を増加させて溶出することができる。２０ｍｇの■型天然多糖類の切断物から、６Ｉ＋１ｇの精製された単一反復単位のオリゴ糖が得られた。ＴＬＣ上にて単一反復単位から離間移動する少量バンドに対応するオリゴ糖も、陰イオン交換カラムにより若干多量に維持された。調製試験では完全分離が達成されないが、このように精製した単一反復単位のオリゴ糖はＴＬＣ及びメチル化分析により純度９５％であると推定される。ざらに、より大きいオリゴ糖をクロマトグラフィー、たとえばセファデックス（３７５カラムによって分画した。

例　４：オリゴ糖に対する結合分析クロマトグラム結合分析を用いて、天然多糖類に指向した抗体を結合するＴＬＣにより可使化されるオリゴ糖バンドの能力を直接に検査した。単一反復単位のバンドに結合する抗体が明らかに証明された。この分析は定量的でないが、放射能写真におけるバンドの相対強度から天然多糖類はより効率的に抗体を結合することが明らかである。この分析は天然■型子糖類につき極めて特異性であり、交差反応は脱シアリル化されたコア多糖類、Ｂ群多糖類或いは他のＧＢＳ血清型からのカプセル多糖類については見られない。

上記オリゴ糖抗原を次いで上記のように蛋白に結合させ、かつ発熱物質を含まない塩水溶液に上記と同様に懸濁させてワクチンを作成した。

単一反復単位の五糖類（第１図）は放剣性抗体結合分析、阻止ＴＬＣ結合分析及び直接的放射性抗体結合分析を用いて弱い抗原性であった。オリゴ糖寸法を２反復単位まで増大すると、抗原結合において８倍の増加を示した。特に好ましくは、免疫原は２〜５０単位を有する。

ＩＶ、ＧＢＳ蛋白抗原抗原性ＧＢＳ　Ｃ蛋白をＩＣ型ＧＢＳの培養上澄液から次の例に示すように分離した。この蛋白はＰ１０ＧＢＳ蛋白フラクション、すなわちｉｏ、ｏｏｏ〜３０．０００のＭＷの蛋白を含むフラクションに対する抗血清（たとえばネズミ抗血清）に対し免疫学的に反応性である。精製された蛋白は、ｉｂ型ＧＢＳでの処理に対しネズミを保護するウサギ抗血清を発生する。

この保護能力は、ＧＢＳ多糖類と共に培養しても影響されない。

例　５：蛋白抗原の産生及び精製Ｉ　ａ／ｃ型ＧＢＳ　（たとえばニューヨーク州、チャニング・ラボラトリ−・ストレインＡ９０９、ロックフェラー大学、ニューヨーク、ＡＴＣＣ２７５９１）を、トッド・へベット・プロス（ミラガン類、デトロイト在、ジフコ・ラボラドリース゛社、Ｔ　ＨＢ　）の透析物にａ−３ける後期対数増殖期まで培養し、次いでレビー等、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ−Ｄｉｓ、第１４９巻、第８５１〜８６８頁（１９８４）の一般的方法により０．１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４＞における０、３％ホルマリンに再懸濁させた。

Ｉｃ型の対数増殖期の培養物１２を１簀のＴｌ−１８の透析物（１０，ＯＯＯＭＷの排析膜で透析）に添加し、１０％グルコースを補添し、かつ滴定により中性ｐＨを維持しながら醗酵装置にュージャジー州、プリンストン在、ＬＳＬビオラフィッテ・インコーポレーション社、ビオラフィッテＢＬ２０．２型）で後期対数増殖期まで増殖させた。１０．　ｏｏｏｇにてベレット化させることにより細菌を除去した後、上澄液を１０．０００Ｍ　Ｗの排析膜を備えたベリコン装置（マサチューセッツ州、ベッドフォード在、ミリポア・コーポレーション社）にて１００ｄまで濃縮し、徹底的に８２０で透析しかつ一２０’Ｃにて凍結させた。

培養上澄液を、限外濾過により大凡の分子寸法によって分離した。２種のフラクションが得られ、一方のフラクションはＰＭ３０膜（Ｐ　３０　：　３０．０００Ｍ　Ｗより大）によって保持されかつ他方のフラクションはＰＭＩＯ膜により保持されるがＰＭ３０では保持されない（Ｐ　１０　：　１０．０００Ｍ　Ｗより大かつ３０．０００Ｍ　Ｗより小）、ＰＩＯを００１５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｇを含む０．０５　Ｍ燐酸すトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）にて透析し、かつセファデックスＧ−７５カラム（１，６ｘ８２ｃｍ＞　（ファルマシア社）で分画した。

これらフラクションの蛋白含有量をラウリー分析［ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第１９３巻、第２６５〜２７５頁（１９５１）　］にて７５０ｎｍにおける吸収により監視した。

例　６　：５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロット試料をレムリの方法（ネイチャー、第２２７巻、第６８０〜６８４頁（１９７０）　］にしたがって５ＤＳ −ＰＡＧＥにより分析した。蛋白の分子量に応じて、５〜１５％又は１０〜２０％のいずれかの濃度勾配のゲルを用いた。電気泳動用の試料を、０．１Ｍトリス（ｐＨ８）と１％ＳＤＳと４Ｍ尿素と６０ｍＭ　＊−ドアセタミドとを最終濃度として含有する緩衝液にて希釈した。

これら試料の還元を必要とする場合は、５０ｍＮジチオスレイトールを緩衝液に含ませた。１００Ｋｊの蛋白を含有する１ｏｏｉ！ｌの試料を各穴部に入れた。

電気泳動の後、これら蛋白をクーマシー・ブリリアント青染色によって可視化させた。

免疫反応性抗原を同定するため、ウェスタンプロットを用いた。蛋白を先ず最初に電気泳動にかけ、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを０．０２Ｍトリス緩酎緩衝液Ｈ８，５＞と０．１５Ｍグリシン及び２０％メタノールとで構成された緩衝液Ａで洗浄した。

これら蛋白をニトロセルロースシートにューハンプシャー州、キーン在、シュライヒャ・アンド・シュニル社）に移して緩衝液Ａで電気泳動しく１５０ｍＡ　、２０ｈ　＞　、かつ０．０１　Ｍトリスｔ−ｊＪｉ液（ｐＨ７，４）と０．５Ｍ　ＮａＣｌ！及び０．１％ブリッグ５８（緩衝液Ｂ）で洗浄した。次いで、このシートを抗血清と共に２２℃にて２Ｐｊ！１間培養し、かつ緩衝液Ｂで洗浄した。

１１２５蛋白Ａと共に２２℃にて３０分間培養した後、このシートを緩衝液Ｂで洗浄し、乾燥プロットし、かつコダックＸＡＲ５番フィルムに露出した。

例　７：ネズミ保護試験体重２２〜２４ｆＪの異系交配された雄ＣＤ−１ネズミを、チャールス・リバー・ブリージング・ラボラドリース（マサチューセッツ州、ウイルミントン在）から入手した。このネズミから得られた血清は、ＲＡＢＡにより試験してＩａ／ｃ型ＧＢＳ多糖類抗原に対する検出可能な抗体を含有しなかった。

各実験群は５〜１０匹の動物を含んだ。ネズミ保護試験のため、これらネズミに１ｍｌのネズミ若しくはウサギ抗血清を腹腔内注躬し、か９２４時間後にＩ　ｂ／ｃ型Ｇ　Ｂ　Ｓの１ｘ１０６ＣＦＵを腹腔内接種した。比較として、予備免疫ウサギ若しくはネズミ血清を用いた。これらのネズミを２４時間毎に検査し、生存するネズミの個数を細菌接種してから４８時間後に計締した。

抗血清からの保護抗体を吸収するため、Ｍ当り１ｍｑの濃度にてＧＢＳ多糖類又は蛋白フラクションを用いた。１ｍｌの抗血清及び１ｄの多糖類若しくは蛋白を３７℃にて２時間培養し、次いで４℃にて１晩培養した。次いで、この混合物を１３．０００ｇにて３分間ペレット化させ、かつ上澄液を保護研究用として０．ｔ５Ｍ　ＮａＣｅで希釈した。

カラムクロマトグラフィーによって部分精製した後、１４、０００Ｍ　Ｗの蛋白を調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから再分離し、かつこれを用いウサギ中に抗血清を発生させた。ネズミ保護試験において、このウサギ抗血清はＩ　ａ、”ｃ型ＧＢＳ接種に対しネズミを８９％保護した。

Ｐ１０フラクションが異質ＧＢＳ株に対しネズミ保護抗体を発生しうるかどうかを検討するため、ネズミをＩａ／ｃ型Ｐ１０フラクシヨンで免疫化した。次いで、免疫後の抗血清を集後にＩ　ｂ／ｃ型株を接種した。血清の保護能ツノは、１：８０の白酒希釈率にて消失し始めた。したがって、これらの実験には１：４０の最適希釈率にて血清を使用した。ネズミ保護試験型ＧＢＳでの接種に対しネズミを受働保護した。

国際調査報告ｌ＋瞳＋ｎａｌ暉ｓｌ＾６叶ｖ１喝”””ＰＣＴ／Ｌ］ＳＢ？１００８４５ＡｔｔａＣ？１ｒｎｅｎｔ　セＯＦｏｒｍ　ＰＣＴ／工ＳＡ／２１０；　Ｐａｒ”　 ”ＪＩ。

２．　Ｃｌａｉｍｓ　２０−２２．　ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ａｎｄｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｕｓｅ；　Ｃ１ａｓｓ　４２４，５ｕｂｃｌａｓｓ　９２゜３＋　Ｃｌａｉｍ　２３．ａ　ｂａａセｅｒｉａｌｌｙ　１ｎｄｕｃｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｃ１ａｓｓ　４２４，５ｕｂｃｌａｓｓ　８７゜

Claims

【特許請求の範囲】１．ＩＩＩ型Ｂ群のストレプトコツカス（ＩＩＩＧＢＳ）細菌に対し選択免疫反応性である抗体を生ぜしめる抗原にむいて、▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｎ＝１〜５０であり、ＧｌｃＮＡＣＰはＮ−アセチルグルコサミン（ビラノース型）を示し、ＧａｌＰはガラクトート、（ビラノース型）を示し、Ｇｌｃｐはグルコース（ビラノース型）を示しかつα−Ｄ−ＮｅＵＮＡＣはＮ−アセチルノイラミン（シアリン）酸を示す］を有する精製オリゴ糖からなることを特徴とする抗原。２．オリゴ糖が、結合： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここでＳ１及びＳ２は独立してグルコース、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンから選択される］の開裂につき特異性であるエンド−β−ガラクトシダーゼを用いるＩＩＩＧＢＳ多糖類カプセルの酵素加水分解によって得られる請求の範囲第１項記載の抗原。３．エント−β−ガラクトシダーゼがフラボバクテリウム・ケラトリテクスから得られる請求の範囲第２項記載の抗原。４．オリゴ糖が蛋白に共有結合している請求の範囲第１項記載の抗原。５．蛋白がオリゴ糖に対し第２アミン機能によって結合されている請求の範囲第４項記載の抗原。６．蛋白が細菌表面蛋白からなる請求の範囲第４項記載の抗原。７．蛋白が細菌トキゾイトからなる請求の範囲第４項記載の抗原。８．１００，０００より大きい分子量を有する完全ＩＩＩＧＢＳ多糖類カプセル又はその断片を実質的に含まない請求の範囲第１項記載の抗原。９．（ａ）ＩＩＩ型Ｂ群のストレプトコッカス細菌を培養し、（ｂ）培地又は細菌細胞中における多糖類を回収し、（ｃ）前記多糖類を結合：　▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｓ１及びＳ２は独立してグルコース、グルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンから選択される］の開裂に対し特異性であるエンド−β−ガラクトシダーゼによって切断し、（ｄ）オリゴ糖を回収し、かつ必要に応じ（ｅ）前記オリゴ糖をキャリヤに結合させることを特徴とする請求の範囲第１項記載の抗原の作成方法。１０．エンド−β−ガラクトシダーゼがフラボバクテリウム・ケラトリテクスから得られる請求の範囲第９項記載の方法。１１．オリゴ糖を蛋白に共有結合させる請求の範囲第９項記載の方法。１２．蛋白を第２アミン機能によってオリゴ糖に結合させる請求の範囲第１１項記載の方法。１３．蛋白が細菌表面蛋白からなる請求の範囲第１１項記載の方法。１４．蛋白が細菌トキソイドからなる請求の範囲第１１項記載の方法。１５．ＩＩＩ型Ｂ群のストレプトコッカス細菌に対し保護を与えるワクチンにおいて、医薬上許容しうるベヒクルと請求の範囲第１項記載の抗原とからなるワクチン。１６．少なくとも１個の結合： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｓ１及びＳ２は独立してグルコース、グルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンから選択される］を有する表面多糖類を含む細菌を培養し、前記表面多糖類を抽出し、この多糖類を前記結合に対し特異性であるエンド−β−ガラクトシダーゼによって切断し、かつ精製オリゴ糖を回収することを特徴とする精製オリゴ糖の製造方法。１７．細菌がグラム陽性細菌であり、かつ表面多糖類がカプセル状多糖類である請求の範囲第１６項記載の方法。１７．細菌がＩＩＩ型Ｂ群のストレプトコッカス細菌である請求の範囲第１７項記載の方法。１９．細菌が１４型ストレプトコッカス・ニューモニアである請求の範囲第１６項記載の方法。２０．Ｉｃ型Ｂ群のストレプトコッカス細菌における実質的に精製されたトリプシン耐性のＣ表面蛋白において、Ｉｂ／ｃ型Ｂ群及びＩａ／ｃ型Ｂ群のストレプトコッカス細菌に対し保護を与え、約１４，０００の分子量を有し、Ｂ群のストレプトコツカス細菌多糖類に対し非交差免疫反応性であり、Ｉｂ／ｃ型Ｂ群のストレプトコッカス細菌に対し交差免疫反応性であることを特徴とする蛋白。２１．Ｉａ／ｃ型Ｂ群のストレプトコッカス細菌に対し保護を与えるワクチンにおいて、医薬上許容しうるベヒクルと請求の範囲第２０項記載の蛋白又はその免疫決定子を含む断片からなる免疫原とを含み、前記蛋白若しくは断片が必要に応じキャリヤに結合されてなるワクチン。２２．哺乳動物を請求の範囲第１５項又は第２１項記載のワクチンで免疫化し、この免疫化した哺乳動物から血清のγグロブリンフラクションを回収し、かつこのγグロブリンフラクションを個体に投与することを特徴とするＧＢＳ感染に対する個体の保護方法。２３．哺乳動物を請求の範囲第１５項又は第２１項記載のワクチンで免疫化しかつ個体からγグロブリンを回収することにより生成されてなる、ＧＢＳに対し受働保護を与えうるγグロブリンフラクション。