JPH0565300A - 肺炎連鎖球菌多糖結合体ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 免疫原性担体タンパク質と、それに結合した
ストレプトコッカス ニューモニエ菌（肺炎球菌、Ｐ
ｎ）の部分的に加水分解された高純度莢膜多糖（ｐｓ）
を包含している新規な結合体ワクチンを新規な方法で製
造する。 【効果】 この結合体は肺炎球菌感染症の予防に有用で
ある。１〜１０種の異種肺炎球菌多糖−免疫原性タンパ
ク質（Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ）結合体の混合物を包含して
いるワクチンは多糖成分が由来した同種病原体に対して
広範囲な防御受容体免疫応答を誘発する。通常Ｐｎ−Ｐ
ｓ単独に対して防御免疫応答を起こすことができない子
供や２才以下の乳児にこれらのＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合
体を予防接種すると防御免疫応答を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ストレプトコッカス ニューモニエ(Strep
tococcus pneumoniae)（肺炎連鎖球菌又は肺炎双球菌
（以下肺炎球菌と称する）Ｐｎ）として分類される病原
菌は微生物の莢膜多糖（Ｐｎ−Ｐｓ）に基づいて８４抗
原血清型に細分されている。これらの微生物に起因する
疾病としては肺炎、髄膜炎、中耳炎、菌血症及び慢性気
管支炎の急性再発、副鼻腔炎、関節炎及び結膜炎があ
る。しかしながらこれらの疾病の主要なものは既知の８
４単離物の限られた部分集合によるものである。従って
最も感染性が強く、病因となる微生物の単離株からのＰ
ｎ−Ｐｓを含有する多価ワクチンは最も頻繁に報告され
るこの種の病原菌の大部分を防御することができる。成
人の肺炎球菌に対して防御免疫応答を高めるのに効能が
ある多価ワクチンが生産されている。例えば“ＰＮＥＵ
ＭＯＶＡＸ（登録商標）２３”（肺炎球菌多価ワクチ
ン、ＭＳＤ １９９０年度版、１４３１頁ＰＤＲ参照）
は各々の２３異種非結合肺炎球菌多糖類５０μg/mlを含
有する液状組成物であり、これらの全てがＡＴＣＣに寄
託されており、本発明の出発物質の１つとすることがで
きる。“ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ２３”は肺炎球菌血中単離
株の９０％を占める次の遊離即ち非結合多糖類１，２，
３，４，５，６Ｂ，７Ｆ，８，９Ｎ，９Ｖ，１０Ａ，１
１Ａ，１２Ｆ，１４，１５Ｂ，１７Ｆ，１８Ｃ，１９
Ｆ，１９Ａ，２０，２２Ｆ，２３Ｆ及び３３Ｆの各々を
包含している。しかしながらこのようなワクチンは肺炎
球菌感染症に最もかかる集団区分であるＢ細胞免疫無防
備な人、免疫防御をＴ細胞応答に依存する年長者及び２
才以下の乳児には効果がほとんどない。非結合多糖類は
Ｔ細胞免疫応答の誘発物質として不十分であるからＰｎ
−ＰｓをＴ細胞応答を誘発させることができる免疫原に
変換することが、この標的集団に十分な防御を与えるカ
ギとなる。しかしながらこの人々の集団に使用が制限さ
れるものではない。新規な結合体の１種以上を包含して
いるワクチンを妊娠前又は妊娠中の雌の哺乳類に投与す
ると母親の抗体を高めワクチンは胎児又は乳児に直接投
与されないが発育中の胎児及び哺乳児を受動的に防御す
ることができる。このような結合体ワクチンはまた新生
児又は感染した人の兄弟のようなかかり易い集団の究極
的受動防御用の抗体を誘導するにも有用となるに違いな
い。

【０００２】それ自体では免疫原性が不十分であると見
られる多糖類は免疫原性タンパク質ＰＲＯに結合させる
と極めて良好な免疫原であることが示されている［マー
バーグ等、米国特許第４，６９５，６２４号、シュニア
ソン等、「人及び家畜用ワクチンの新展開」７７〜９４
頁（１９８０年）シュニアソン等ジャーナルオブエクス
ペリメンタルメディシン第１５２巻、３６１頁（１９８
０年）、アンダーソンインフェクションアンドイムニテ
ィ第３９巻、２３３頁（１９８３年）(Marburget al.US
Patent No.４，６９５，６２４；Schneerson et al.Ne
w Dev.with Hum.& Vet.Vaccines. ７７−９４（１９８
０）；Schneerson. et al.J.Exptl.Med.１５２、３６１
（１９８０）；Anderson.Infection and Immunity.３
９、２３３（１９８３））］。しかしながらこのような
結合体の製造で主要な問題点は多糖出発物質の粘性及び
非均一性であって結合体生成物を化学的に定義する困難
さである。従って出発物質を出来るだけ十分に限定し、
合成経路の各工程で生成した中間体について分析できる
方法を必要とする。本明細書で開示される方法はＰｎ−
Ｐｓ由来の同種病原菌に対して高い免疫原性結合体免疫
原を提供することによってこの要求に応じている。これ
らの結合体は２才以下の乳児に有用である。

【０００３】マーバーグ等[J.Am.Chem.Soc. 第１０８
巻、５２８２頁（１９８６年）及び米国特許第４，６９
５，６２４号、同第４，８３０，８５２号、同第４，８
８２，３１７号］はビジェネリックスペーサーを介して
多糖類と免疫原性タンパク質を結合する手段を開示して
いる。ＰＲＯを誘導化してペンダント求核又は親電子基
（ＰＲＯ^* ）を示す一方、パートナーのＰｓは逆の反応
性を有するペンダント基（Ｐｓ^* ）を示すように官能基
化されている。Ｐｓ^* とＰＲＯ^* を結合させる際にビジ
ェネリックスペーサーが生成されＰｓをＰＲＯに共有結
合的に結合させる。酸加水分解によりビフェネリックス
ペーサーは一般的でないアミノ酸として遊離されアミノ
酸分析によって定量されて共有原子価を証明する手段と
なる。

【０００４】本発明は米国特許第４，６９５，６２４
号、同第４，８３０，８５２号、同第４，８８２，３１
７号で開示された方法を改良した方法を開示する。改良
点は、粗製のＰｎ−Ｐｓ調製物よりも特異的かつ再現性
に優れ、扱いやすい物理的性質（溶解性、濾過性の増
大、純度の増加（群特異的Ｃ多糖（Ｃ−Ｐｓ）の混入の
減少）、分子量、多分散性、粘度の低下を含む）を有す
るＰｎ−Ｐｓ出発物質を調製することを包含する。本明
細書で開示される得られた結合体はコンシステンシーの
増大及び調製の容易さ抗原性の改良及び最終生成物の純
度の改良の点で第４，６９５，６２４号の方法より改良
されている。特に第４，６９５，６２４号特許における
結合前のＰｓ調製物に比較して結合前のＰｎ−Ｐｓの群
特異的Ｃ多糖及びペプチドグリカン量が３〜２０倍低下
していることが顕著である。混入Ｃ多糖（Ｃ−Ｐｓ）の
存在は型特異的抗原に対する免疫応答を妨害しないが、
Ｃ−Ｐｓは結合体作成反応において型特異Ｐｓに対する
特異性を低下させ制御しにくくする。更にその上抗Ｃ多
糖抗体の生産はいくつかの解決されない肺炎球菌感染症
に見られる組織破壊と関係している可能性がある。

【０００５】新規な結合体生成物のほかに本発明は部分
加水分解された高純度肺炎球菌多糖中間体の新規な製造
方法、１〜１０種の異種結合体を包含している新規な組
成物及び本発明の使用方法を開示する。“ＰＮＥＵＭＯ
ＶＡＸ２３”（肺炎球菌多価ワクチンＭＳＤ、１９９０
年度版１４３１頁ＰＤＲ参照）に含まれる莢膜多糖類が
特に興味深い。最も好ましい組合せはストレプトコッカ
ス ニューモニエ亜型６Ｂ，２３Ｆ，１９Ｆ，１４，１
８Ｃ，４及び９Ｖの莢膜多糖類であるがこの肺炎球菌亜
型の小グループは乳児及び子供の肺炎球菌感染症の７５
〜８５％に関与していると推定される。本明細書で提供
される方法は広い範囲の肺炎球菌及び他の細菌の多糖類
に適用することができる。

【０００６】本発明を要約すると、高度に化学的に定義
される肺炎球菌多糖（Ｐｎ−Ｐｓ）を、粗Ｐｎ−Ｐｓ調
製物を所定の終末点まで部分加水分解してＰｎ−Ｐｓの
抗原性を維持することによって製造する。部分加水分解
されたＰｎ−Ｐｓは実質的に精製され、Ｐｎ−Ｐｓ免疫
原タンパク質（ＰＲＯ）結合体（Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ）
の製造に有用である。流行性肺炎球菌単離株からの部分
加水分解された高純度Ｐｎ−Ｐｓ中間体に共有結合的に
結合したナイセリアメニンギチジスｂ(Neisseria menin
gitidis b)外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）又はその
組換え体又はその精製サブユニット例えばＭＩＥＰ又は
他の免疫原性担体タンパク質を包含している本発明の新
規な高抗原性Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体は哺乳類に於け
る肺炎球菌感染症の予防に有用である。これらの結合体
はＴ細胞応答を誘発するので、哺乳類、特にＢ細胞免疫
無防備状態の人、年長者及び２才以下のヒト乳児に於て
抗肺炎球菌免疫応答を促進するワクチン組成物として特
に有用である。Ｐｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ及びＰｎ−Ｐｓ−
ＭＩＥＰ結合体はストレプトコッカス・ニューモニエ
（肺炎球菌、Ｐｎ）の培養物から莢膜Ｐｓを単離し、Ｐ
ｎ−Ｐｓを部分加水分解又は物理的に剪断し、該Ｐｎ−
Ｐｓを分画して、分子サイズ、多分散性、粘性の低減し
たＰｎ−Ｐｓ生成物を得、次いでＰｎ−ＰｓをＯＭＰＣ
又はＭＩＥＰに共有結合的に結合させる工程を包含して
いる方法によって製造される。

【０００７】本発明の目的はＰｎ−Ｐｓと免疫原性タン
パク質のＴ細胞依存性結合体の製造に於て中間体として
有用で新規な部分加水分解され高純度な抗原的に型特異
的肺炎球菌莢膜多糖類（Ｐｎ−Ｐｓ）を提供するもので
ある。別の目的は特に２才以下の乳児及びＢ細胞免疫無
防備状態の人々に於て肺炎球菌感染症を予防するワクチ
ン組成物に有用なＰｎ−Ｐｓと免疫原性タンパク質のＴ
細胞依存結合体を提供するものである。別の目的は肺炎
球菌多糖−免疫原性タンパク質共有結合的結合体（Ｐｎ
−Ｐｓ−Ｐｒｏ）の生成に米国特許第４，６９５，６２
４号より改良された方法を提供するものであり、改良点
は、出発Ｐｎ−Ｐｓ、中間体および最終産物が非常に化
学的に限定され、純度が高いこと、及びコンシステンシ
ーの増加及び方法を実施するのが容易な点である。別の
目的は特に２才以下の乳児や免疫無防備状態の人に於て
病原肺炎球菌に対して防御血清抗体を誘発するのに有用
な、Ｔ細胞依存性を示し、改良方法による化学的に限定
されたＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯを提供するものである。別の
目的はこれらの結合体を免疫学的有効量でワクチン製剤
として使用して中耳炎、髄膜炎、肺炎、菌血症、及び慢
性関節炎、副鼻腔炎、気管支炎や結膜炎の急性再発など
の肺炎球菌性疾患を予防する治療方法を提供するもので
ある。

【０００８】以下本発明を詳細に説明する。 Ａ．新規なＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体及び多糖中間体 本発明のＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体生成物はＰＲＯに対
するＰｎ−Ｐｓ比０．０５〜０．５mg多糖／mgタンパク
質、高い共有原子価、最少に抑えた混入遊離Ｐｎ−Ｐ
ｓ、新規な構成多糖類によって付与されるユニークな物
理的及び化学的特性を有する。結合体はスペーサーを介
して新規な部分加水分解された高純度肺炎球菌莢膜多糖
（Ｐｎ−Ｐｓ）に共有結合的に結合した免疫原性タンパ
ク質（ＰＲＯ）を包含する。免疫原性タンパク質はナイ
セリア・メニンギチジスｂの培養物由来の外膜タンパク
質複合体（ＯＭＰＣ）が好ましい。ＯＭＰＣの１調製方
法は実質的に米国特許第４，２７１，１４７号及び実施
例１に示される通りである。またＯＭＰＣの解離又はそ
の組換え発現によって産生されたＭＩＥＰのようなＯＭ
ＰＣのサブユニットも好ましい。この目的物を得る１方
法は米国特許出願第５５５，９７８号、同第５５５，３
２９号及び同第５５５，２０４号（出願日１９９０年７
月１９日）及び実施例２、１６〜２３に示される。

【０００９】新規な部分加水分解された高純度肺炎球菌
莢膜多糖（Ｐｎ−Ｐｓ）は肺炎球菌亜型の１種を培養し
て得られる抗原性多糖の調製物である（新規な結合方法
を記載する項及び実施例３〜１０で後述される）。Ｐｎ
−Ｐｓは平均分子量約１×１０⁵ 〜１×１０⁶ ダルト
ン、分子当り平均約１０００未満の繰り返し単位、Ｃ多
糖混入レベル約３％未満及び抗原性指数０．４〜１．
１、好ましくは０．７〜１．１を有する。この最後のパ
ラメーターはＡＴＣＣに寄託されている粗Ｐｎ−Ｐｓと
比較した、新規なＰｎ−Ｐｓの単位質量当たりに示され
る抗肺炎球菌型特異抗体結合の相対量である。更にその
上、新規なＰｎ−Ｐｓは、本発明のＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ
生成物を作るにあたり免疫原性タンパク質との結合性が
高い。２つの異るＰｎ６Ｂ−Ｐｓ及び２つの異るＰｎ２
３Ｆ−Ｐｓ調製物の物理的及び化学的特性を以下の表Ｉ
に示すが後の記述はそれらの特性を測定する方法を示す
ものである。以下に開示される方法は広範囲の肺炎球菌
亜型を用いたＰｎ−Ｐｓ中間体及びＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ
の製造方法であり、種々の肺炎球菌亜型は１，２，３，
４，５，６Ｂ，７Ｆ，８，９Ｎ，９Ｖ，１０Ａ，１１
Ａ，１２Ｆ，１４，１５Ｂ，１７Ｆ，１８Ｃ，１９Ｆ，
１９Ａ，２０，２２Ｆ，２３Ｆ及び３３Ｆから選択され
るものを含むがこれに限定されない。上述の通り肺炎球
菌多糖類の好ましい組合せは肺炎球菌亜型４，６Ｂ，９
Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆ及び２３Ｆ由来である。これ
らの多糖類のほかに又は代わりに感染が問題の集団の必
要に応じて他のものに置き換えることができる。従って
Ｐｎ１−Ｐｓ及びＰｎ５−Ｐｓはナイセリア・メニンギ
チジスＢ、Ｃ又はＢ群レンサ球菌多糖類でもできるのと
同様に、Ｐｎ４−Ｐｓ又はＰｎ９Ｖ−Ｐｓのように処理
することができ、Ｐｎ７Ｆ−Ｐｓは以下に記載するよう
にＰｎ１４−Ｐｓのように処理することができ、多価ワ
クチンに含まれることができる。またＰｎ６Ｂ−Ｐｓの
包含によってＰｎ６Ａに対する防御が交差反応性抗体に
よって生じることは当業者に明白であろう。これはまた
多くの他の肺炎球菌亜型にも当てはまる。多価ワクチン
は各々一定のＰｎ−Ｐｓ亜型で別々に調製された異種Ｐ
ｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体の混合物を包含するものであ
る。更に多価ワクチンは数種の異るＰｎ−Ｐｓ亜型が全
て一定のＰＲＯに一度で又は連続して結合されるもので
ある。

【００１０】1.新規な多糖中間体の確認 部分加水分解された精製肺炎球菌莢膜多糖中間体の物理
的及び化学的特性は由来した肺炎球菌亜型及び本明細書
に開示される方法に従って行なう操作に依存する。一般
にＰｎ−Ｐｓ中間体は粗製細菌培養物由来多糖と比較し
た場合分子サイズ及び多分散性が２〜１０倍小さい。サ
イズが小さくなることにより、結合中及び結合後の遊離
Ｐｎ−Ｐｓの除去中の多糖の取扱い性が改善され、より
高いＰｎ−Ｐｓ純度（均一性）、より低いＰｎ−Ｐｓ分
子サイズ多分散性及び実質的に変化のない抗原性を与え
る。これらの新規なＰｎ−Ｐｓ特性は高度に限定され、
高度に型特異的抗原Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ生成物を一貫し
て作成するのに著しく寄与する。

【００１１】ｉ．Ｐｎ−Ｐｓ分子量及び多分散性 拡散、沈降又はクロマトグラフィー手段により重量平均
分子量Ｍ_W を粘度、凍氷点降下又は沸点上昇により数平
均分子量Ｍ_N を測定することによってＰｎ−Ｐｓ調製物
の多分散性がＭ_W ／Ｍ_N として得られる。この数が１に
近づくほど多糖調製物は均一になる。多数のＰｎ−Ｐｓ
調製物の多分散性が本明細書に示され、この増大した均
一性を得る好ましい方法も開示される。

【００１２】各々の粗製及び部分加水分解されたＰｎ−
Ｐｓ調製物の分配係数 Ｋｄ＝Ｖｅ−Ｖｏ／Ｖｉ−Ｖｏ Ｖｏ＝カラム空隙容量 Ｖｉ＝全浸透容量 Ｖｅ＝試料の溶出容量 Ｋｄ＝試料の分配係数 は多糖の１部についてのサイズ排除クロマトグラフィー
（ＳＥＣ）又は高性能サイズ排除クロマトグラフィー
（ＨＰＳＥＣ）により当業界で既知の方法に従って測定
される。こうして得たＫｄは多糖調製物の平均流体動容
量の尺度である。Ｐｎ−Ｐｓの分子サイズが開示された
方法に従って物理的剪断又は熱又は音波加水分解により
小さくなるにつれてＰｎ−Ｐｓの溶出容量Ｖｅは増加
し、従ってＫ_D も増加する。

【００１３】この目的の好ましいカラムマトリックスは
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂゲル（ファルマシアNo.
１７−０１２０−０１）である。カラム空隙容量（Ｖ
ｏ）はブルーデキストラン２０００（ファルマシアNo.
１７−０３６０−０１）により全浸透容量（Ｖｉ）は塩
化ナトリウム塩ピークから定量する。方法の１つによれ
ばＰｎ−Ｐｓ試料を蒸留水に２．５mg/ml で調製し１ml
注入量を用いる。Ｖｏ／Ｖｉ比は０．３２〜０．３７に
すべきである。デキストランＴ５００（ファーマシアN
o. １７−０３２０−０１）のＫｄは０．３７〜０．４
９にすべきである。好ましいＨＰＳＥＣ系は５０℃に加
熱した７．５×６００mm ＴＳＫ Ｇ６０００PWカラム
を含む。

【００１４】非常に好ましい方法ではＳＥＣ又はＨＰＳ
ＥＣを、溶出容量の関数として相対分析物濃度を監視す
る示差屈折計と、溶出容量の関数として分析物の比粘度
を監視する示差粘度計と組合せる。普遍的検定曲線［保
持容量に対するlog （固有粘度×分子量）］は一連の単
分散酸化ポリエチレン標準の分析から作成する。濃度と
比粘度を用いて試料の溶出容量に対する分子量を計算す
ることができ、またこれを用いてＭn 及びＭ_W 値を計算
しこれから多分散指数（Ｍ_W ／Ｍn ）を計算する［ヤウ
(Yau) 、Ｗ．Ｗ．及びリメンター(Rementer)、 Ｓ．Ｗ．
Ｊ．Liq.Chromatog.第１３巻６２７〜６７５頁（１９９
０年）、ナギー(Nagy)、Ｊ．Liq.Chrom.第１３巻６７７
〜６９１頁（１９９０年）、ベノイト(Benoit)等Ｊ．C
h.Phys.Tome. 第６３巻１５０７〜１５１４頁（１９６
６年）］。本発明に於て固有粘度は０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液pH７．２中で測定した。

【００１５】Ｐｎ−Ｐｓ調製物の平均分子量が決定され
れば繰り返し単位／分子の平均数は重合体分子量を繰り
返し単位の分子量で割ることによって容易に決定される
（表II参照）。

【００１６】ii．Ｐｎ−Ｐｓ型特異抗原性の保持 物理的剪断又は化学的、熱的、音波処理又は酵素加水分
解を行った各粗Ｐｎ−Ｐｓに対して抗原性統一性が消散
し始める終末点を決定することは重要である。この終末
点は粘度を当業界で既知の多くの免疫試験のいずれかと
関係づけることによって決定するのが便利である。好ま
しい方法では多糖溶液の一部をオキタロニー二重免疫拡
散検定により肺炎球菌亜型特異抗体を用いて測定する。
拡散後隣接のウェルに入れた粗Ｐｎ−Ｐｓの試料の沈降
バンドと融合する寒天中白色沈降バンドの出現は反応物
の定性的一致であり多糖の抗原としての統一性がそのま
ま保たれているということである。より定量的免疫検定
は速度比濁分析又はＲＩＡによって得られる。

【００１７】速度比濁分析は抗原−抗体複合体の生成中
に散乱する光強度の変化又は変化速度を測定する。反応
は光線が通過する反応セル中で行なわれる。本願では特
異抗体（Ａｂ）が特異抗原（Ａｇ）即ちＰｎ−Ｐｓと反
応するとき溶液中で生じる免疫沈降反応によって複合体
が生成される。Ａｇ−Ａｂ複合体の生成は最適比率のＡ
ｇ及びＡｂ分子の存在に依存するために一定量のＡｂに
対する複合体生成の程度は最大レベルまでのＡｇ量まで
増加しそれ以上多量のＡｇは複合体生成量が減少する結
果となる。従って一定レベルのＡｂを維持しＡｇ濃度の
増加による光散乱を測定することにより標準曲線が生じ
る。試料をその特異Ａｂと標準曲線を展開するために用
いた同様の条件下で反応させる場合Ｐｓ（又は誘導化Ｐ
ｓ）調製物のＡｇ濃度を計算することが可能である。

【００１８】速度比濁分析により免疫学的に計算した濃
度と化学的又は物理的に得られる濃度（比色分析、屈折
率又は単糖類の全加水分析及び定量による--以下参照）
との比較はＰｓ試料の抗原性指数を与える。多糖類の乾
燥重量分析は粉末調製物の揮発性含有量が既知の場合に
のみ適当である。多糖類は吸湿性であることが周知であ
り、揮発分を５〜３０重量％で含有する可能性がある。
そのような場合その乾燥重量は特に信頼できない。かな
り正確に多糖濃度を定量するために用いられる１方法は
比色検定でありこの検定は問題の多糖標準液で検定す
る。例えばＰｎ６Ｂ−Ｐｓ、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ、Ｐｎ１
９Ｆ−Ｐｓ及びＰｎ２３Ｆ−Ｐｓは全てディシュ(Disch
e)及びシェトルス(Shettles)［Ｊ．Biol.Chem.第１７５
巻、５９５〜６０３頁（１９４８年）］のメチルペント
ース検定によって定量することができる。Ｐｎ４−Ｐ
ｓ、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ、Ｐｎ１４−Ｐｓ及びＰｎ１９Ｆ−
Ｐｓはヘキソスアミン含有量によって定量しＰｎ９Ｖも
ウロン酸含有量によって定量することができる。フェノ
ール−硫酸検定［ズーボイス(Dubois)等、Anal.Chem.第
２８巻、３５０〜３５６頁（１９５６年）］は結合体調
製中の工程試験の一部としてこれらのＰｎ−Ｐｓ調製物
の全てを定量するのに有用である。使用される他の方法
は分析物質量の尺度として屈折率シグナルを用いるもの
でありこれも問題の多糖標準液で校正する。比色検定は
誘導化及び結合工程中に試料の多糖含有量を監視するた
めに用いられるがこの方法はＨＰＳＥＣ−万能検定分析
による多糖調製物の物理的確認及び抗原性指数の計算に
用いられる。出発粗Ｐｎ−Ｐｓは抗原性指数値１．０で
ある。相対抗原性指数は実験用試料に対して計算され
０．４〜１．１値が十分であると思われる。多糖が加水
分解及び分画工程中に著しく精製される場合には抗原性
指数１．０以上を得ることが可能である。またサイズ縮
小だけで多糖分子のフレキシビリティを高めて抗原エピ
トープの立体障害を減少させることにより調製物の抗原
性指数を増加させることができることは理論上可能であ
る。これらの測定は加水分解、分画及び誘導化Ｐｓ試料
の工程チェックとして行なわれる。相対抗原性＜０．４
を有する試料は除去する、即ち結合に用いない。肺炎球
菌多糖類を確認するのに有用である抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体標
品は入手可能である。抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体入手先としては
ヘルスリサーチ社アルバニーＮＹ及びステーテンセルン
インスチチュートがある。また型特異抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体
は免疫原として市販の粗Ｐｎ−Ｐｓを用いて当業界で既
知の方法に従ってこの目的に調製することができる［ベ
ーカー(Baker) 等、イムノロジー第２０巻、４６９頁
（１９７１年）、ブルック(Brooke)、Ｍ．Ｓ．Ｊ．Immu
nol.第９５巻、３５８頁（１９６６年）、カーニー(Kea
rney) 、Ｒ．及びハラデー(Halladay)、Ｗ．Ｊ．Aust.
Ｊ．Exp.Biol.Med.Sci．第４８巻、２２７頁（１９７０
年）、シュニアソン(Schneerson)、Ｒ．等、Prog. アレ
ルギー第３３巻、１４４頁（１９８３年）、ロビンス(R
obbins) 、Ｊ．Ｂ．Infect.Immun. 第２６巻、１１１６
頁（１９７９年）］。

【００１９】更に抗原性における完全性が保持されてい
ることの指標はＰｎ−Ｐｓ調製物の正しい化学組成が維
持されていることである。例えばＰｎ６Ｂ−Ｐｓは繰り
返し単位［α−Ｇａｌ（１−３）−α−Ｇｌｕ（１−
３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１−４）−Ｄ−リビトール−
５−ＰＯ₄₍₂₎］を有するので炭水化物成分リビトール：
ラムノース：ガラクトース：グルコースのモル比は約
１：１：１：１である。この割合は例えば多糖を３６％
フッ化水素酸で４５〜６５℃に於て約２時間次いで２Ｍ
トリフルオロ酢酸で１００℃に於て１０〜２０時間加水
分解し、パルス電流検出による高性能アニオン交換クロ
マトグラフィー処理することによって定量することがで
きる。従ってほぼ等モル量の炭水化物成分を示す４本の
ピークは全体性が維持されていることの指標である。実
質的に炭水化物成分の理論比は本発明の新規なＰｎ−Ｐ
ｓ化合物全てに約２０％以内で維持される。理論値から
のずれは主として方法技術の限界によるものである。従
って全加水分解により

【００２０】Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓはグリセロール：ラムノ
ース：ガラクトース：グルコース＝約１：２：１：１比
を有し、Ｐｎ１４−ＰｓはＮ−アセチル−グルコサミ
ン：ガラクトース：グルコース＝約１：２：１比を有
し、Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓはラムノース：Ｎ−アセチル−マ
ンノサミン：グルコース＝約１：１：１比を有し、Ｐｎ
１８Ｃ−Ｐｓはグルコース：ガラクトース：ラムノー
ス：グリセロール：アセテート＝約３：１：１：１：１
を有し、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓはグルコース：ガラクトース：
Ｎ−アセチル−マンノサミン：グルクロン酸：ガラクチ
ュロン酸：アセテート＝約２：１：１：１：１：１．７
比を有し、Ｐｎ４−ＰｓはＮ−アセチル−マンノサミ
ン：Ｎ−アセチル−フコサミン：ガラクトサミン：ガラ
クトース：ピルベート＝約１：１：１：１：１比を有す
る。更にＰｎ４−Ｐｓは最近Ｐｎ５−Ｐｓと同様に、Ｈ
ＰＬＣ分析で同定して２−アミノニューモサミン（２−
アミノ−２，６−ジデオキシタロース）であると思われ
る成分を含有することが見い出されている［バーカー(B
arker)等、炭水化物研究(Carbohydrate Res.) ２２４〜
２３３頁（１９６６年）］。Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓはもう１
つ別の成分恐らくヘキソサミンを有しこれは文献に報告
されておらず最終的同定はまだ未決定である。これらの
及び別の理論上の多糖繰り返し組成物は次の参考文献
Ｊ．Ｅ．Ｇ．バンダム(Van Dam) 等、Carbohyd.Res. 第
１８７巻、２６７頁（１９８８年）、Ｈ．Ｊ．ジェンニ
ングス(Jennings)、Adv.Carbohyd.Chem.第４１巻、１５
５頁（１９８３年）及びこの中の参考文献Ｊ．Ｃ．リチ
ャーズ(Richards)及びＭ．ペリー(Perry) 、Bio Chem.C
ell.Biol. 第６６巻、７５８頁（１９８８年）に報告さ
れている。炭水化物成分のほかに問題のＰｎ−Ｐｓのい
くつかにはホスフェート、アセテート及びピルベート側
鎖基があり、これらのあるものは免疫優性基である。こ
れらの成分それ自体をモニターすることもできる（実施
例３０参照）。単糖類の定量はまた試料の多糖濃度を定
量するのにも有用な手段である。

【００２１】更に主題の多糖類の抗原性に必要な要素
は、多糖類において“構造的エピトープ”と呼ばれてい
るものを保持することである［例えばウェセルス(Wesse
ls) 、Ｍ．Ｒ．及びカスパー(Kasper)、Ｄ．Ｌ．Ｊ．Ex
p.Med.第１６９巻、２１２１〜２１３１頁（１９８９
年）参照］。このレベルの抗原性は多糖の高分子量形で
のみ発現されると思われここに記載される方法はこの多
糖免疫原性レベルの保存にも向けられる。

【００２２】iii.最小のＣ多糖混入 もう１つの重要なパラメーターはＣ多糖混入レベルであ
る。この数値は多糖調製物を全酸加水分解し、加水分解
物のクロマトグラフィーを行ってコリンを電導度で検出
することによって示すことができる［ハーマンス(Herma
ns) 等、Recl.Trav.Chim.Pays-Bas,第１０７巻、６００
頁（１９８８年）］。また非加水分解多糖をＮＭＲによ
ってコリンを分析することができる。ＮＭＲ手法はＣ−
Ｐｓ含有量を計算するためにラムノースメチルシグナル
に対するコリンシグナル比（ラムノースを含有するＰｎ
−Ｐｓ用、他のＰｎ−Ｐｓでは異なったシグナル）を用
いる。クロマトグラフィー法では電導度検定によって定
量した多糖含有量又はＰｎ−Ｐｓ成分の１種に対するコ
リンシグナル比を用いてＣ−Ｐｓ含有量を計算する。い
ずれの方法でも既知濃度のコリン標準品からＣ−Ｐｓの
理論上の繰り返し構造を用い、多糖標品に存在するコリ
ンレベルを直接計算することができる（ハーマン等［上
記参考文献］）。Ｐｎ−Ｐｓ試料の多糖濃度は当業界で
既知の方法に従って測定される。例えば全多糖濃度は多
糖の全加水分解及び特異単糖濃度の測定によって求める
ことができる。Ｃ−Ｐｓ濃度を全多糖濃度と比較するこ
とによってＣ多糖混入度（ｗ／ｗ）が求められる。全多
糖の３％（ｗ／ｗ）以下のＣ多糖レベルならば容認でき
るが更に好ましいレベルは１％以下である。２ロットの
Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ及び２ロットのＰｎ２３Ｆ−Ｐｓの化学
的及び物理的性質を以下の表Ｉにまとめる。これらのデ
ータは本明細書に記載される新規な方法によって生じる
ロット間パラメーターの再現性を示す。

【００２３】 表Ｉ 加水分解して分画したＰｎ−Ｐｓの特徴 Ｐｎ−Ｐｓ調製物 ６Ｂ−１ ６Ｂ−２ ２３Ｆ−１ ２３Ｆ−２ 終末粘度 1.094 1.147 1.350 1.376 Kd（ＨＰＳＥＣ） 0.62 0.62 0.49 0.49 Kd（ＣＬ−２Ｂ） 0.64 0.60 0.41 Ｎ．Ｄ． 単糖 Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ 抗原性 オキタロニー Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ 比濁法 Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ （フェノール：硫酸） Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ ─────────── Ｓ：良好 ─────────── ， 以下の表IIには数種の粗肺炎球菌多糖類及び本発明
の対応する新規な加水分解して分画した(Hyd＋frac)化
合物の化学的及び物理的パラメーターを示す。表わされ
る数字は実験誤差と調製される複合多糖化合物の検出限
界内の近似値である。

【００２４】 表II 粗及び新規な加水分解＋分画Ｐｎ−Ｐｓ化合物の物理的及び化学的特性 Ｐｎ−Ｐｓ ピーク 固有粘度 重量平均 亜型 Kd 分子量(M_W) ４−crude ： 0.55±0.05 4.34±10％ 4.2×10⁵ ±20％ ４−hyd+frac ： 0.69±0.05 1.0 −3.0 1×10⁵ -5×10⁵ 6B−crude ： 0.40±0.05 2.67±10％ 1.4×10⁶ ±20％ 6B−hyd+frac ： 0.60±0.05 1.0 −2.0 3×10⁵ -7×10⁵ 9V−crude ： 0.53±0.05 2.29±10％ 1.1×10⁶ ±20％ 9V−hyd+frac ： 0.65±0.05 1.0 −2.0 3×10⁵ -7×10⁵ 14−crude ： 0.50±0.05 1.69±10％ 1.1×10⁶ ±20％ 14−hyd+frac ： 0.60±0.05 0.6 −1.6 4×10⁵ -1×10⁶ 18Ｃ−crude ： 0.50±0.05 5.20±10％ 8.7×10⁵ ±20％ 18Ｃ−hyd+frac ： 0.65±0.05 1.5 −3.0 2×10⁵ -6×10⁵ 19Ｆ−crude ： 0.44±0.05 2.95±10％ 1.0×10⁶ ±20％ 19Ｆ−hyd+frac ： 0.65±0.05 1.0 −2.0 2×10⁵ -6×10⁵ 23Ｆ−crude ： 0.36±0.05 4.15±10％ 2.2×10⁶ ±20％ 23Ｆ−hyd+frac ： 0.54±0.10 1.5 −3.0 4×10⁵ -8×10⁵ Ｐｎ−Ｐｓ 数平均 多分散性 繰り返し単位 Ｃ−Ｐｓ亜型 分子量(M_N) (M_w/M_N) 数／分子 ％ ４−crude ： 3.3×10⁵ ±20％ 1.2-1.6 ＞600 ＞３ ４−hyd+frac ： 2×10⁵ -4×10⁵ 1.0-1.4 ＜600 ＜３ 6B−crude ： 9×10⁵ ±20％ 1.5-2.5 ＞1000 ＞３ 6B−hyd+frac ： 3×10⁵ -6×10⁵ 1.0-1.4 ＜1000 ＜３ 9V−crude ： 9×10⁵ ±20％ 1.2-2.5 ＞800 ＞３ 9V−hyd+frac ： 3×10⁵ -6×10⁵ 1.0-1.4 ＜800 ＜３ 14−crude ： 7×10⁵ ±20％ 1.3-2.5 ＞1200 ＞３ 14−hyd+frac ： 3×10⁵ -8×10⁵ 1.0-1.4 ＜1200 ＜３ 18Ｃ−crude ： 6×10⁵ ±20％ 1.4-2.5 ＞700 ＞３ 18Ｃ−hyd+frac ： 2×10⁵ -6×10⁵ 1.0-1.4 ＜700 ＜３ 19Ｆ−crude ： 6×10⁵ ±20％ 1.8-2.5 ＞1000 ＞３ 19Ｆ−hyd+frac ： 2×10⁵ -6×10⁵ 1.0-1.4 ＜1000 ＜３ 23Ｆ−crude ： 1×10⁶ ±20％ 2.0-3.0 ＞1000 ＞３ 23Ｆ−hyd+frac ： 2×10⁵ -6×10⁵ 1.0-1.4 ＜1000 ＜３

【００２５】２．新規なＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＤ結合体の確
認 ｉ．Ｐｎ−Ｐｓの同定及び定量分析 抗原性（完全）を確かめ、Ｐｎ−Ｐｓ／ＰＲＯ比を計算
するために、最終結合体のＰｎ−Ｐｓの量及び化学的完
全さを、独立した手法で証明することは非常に有用であ
る。１方法としては、２ＭＴＦＡを用いて、１００℃に
於て、各々のＰｎ−Ｐｓに対する最適加水分解時間によ
る５〜１６時間で全加水分解するものである。同量のＰ
ｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体及びＰＲＯ加水分解物（ローリ
ータンパク質に基づく）をパルス電流検出による高性能
アニオン交換クロマトグラフィーで分析して単糖類分を
得る。ＰＲＯ分は、例えばＯＭＰＣに存在するリポ多糖
（ＬＰＳ）からＰＲＯに係る単糖類を修正するために、
ネルソンプログラムのような適当なコンピューターソフ
トウェアを用いてＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体分から“差
し引かれる”。次いで結合体のＰｎ−Ｐｓ量を既知量の
誘導化Ｐｎ−Ｐｓ加水分解物分と修正Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲ
Ｏ結合体分を比較することによって計算する。Ｐｎ−Ｐ
ｓ／ＰＲＯ比もまたこの方法で測定される。

【００２６】ii. 結合体を示す新規なアミノ酸及びキャ
ップ形成の分析 Ｐｎ−ＰｓをＰＲＯに結合した後、結合体試料を６Ｎ
ＨＣｌで加水分解し、アミノ酸分析にかける。この方法
はＳ−カルボキシメチル−ホモシステイン（Ｓ−ＣＭＨ
Ｃ）及びＳ−カルボキシメチルシステアミン（Ｓ−ＣＭ
ＣＡ）のようなユニークなアミノ酸の存在と量を検出す
る。前者のアミノ酸は以下の方法の項で記載される誘導
化Ｐｎ−ＰｓとＰＲＯの化学反応による化学結合の一部
として生成され誘導化Ｐｎ−ＰｓのＰＲＯへの共有結合
の決定的証拠として用いられる。このような共有結合の
生成は結合体ワクチンのＴ細胞免疫原性に不可欠であ
る。結合反応の完了後直ちに未反応ブロモアセタミド部
分がＮ−アセチルシステアミンでキャップされる。この
結合の加水分解により遊離Ｓ−カルボキシメチルシステ
アミン（Ｓ−ＣＭＣＡ）を生じこれもアミノ酸分析で検
出される。このアミノ酸の検出により反応性ブロモアセ
トミド基の良好なキャップ形成を確認して望ましくない
化学反応に使用させない。共有原子価及びキャップ形成
の容認できるレベルはＳ−ＣＭＨＣ／Ｌｙｓに対して約
１〜１５％及びＳ−ＣＭＣＡ／Ｌｙｓに対して約０〜５
％である。

【００２７】iii.水酸化アルミニウム吸着ワクチンの分
析 好ましい実施態様ではＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体をワク
チンに対する免疫応答の増強が生じる水酸化アルミニウ
ム（アルミナ、Ａｌ（ＯＨ）₃ ゲル（以下Ｃ項参照）に
吸着させる。他の可能なワクチン製剤としては生理的に
使用し得る希釈剤中の製剤及び他のアジュバント、イム
ノモジュレーター又は水酸化アルミニウムゲル以外の不
活性賦形剤の使用がある。このアルミナ吸着物質の分析
は次の通りである。アルミナ吸着Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯは
結合体をミョウバンから脱着させた後組成及び安定性を
分析することができる。これはアルミナ吸着Ｐｎ−Ｐｓ
−ＰＲＯを３％クエン酸ナトリウム溶液に室温で１６時
間透析することによって得られる。得られた可溶性クエ
ン酸アルミニウム塩は、透析膜から移動しＰｎ−Ｐｓ−
ＰＲＯを通過する。この方法は、正確な量のＰｎ−Ｐｓ
−ＰＲＯがアルミナ吸着製剤中にあることを確認するた
めに重要である。しかしながらＰｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰ
Ｃ及びＰｎ２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣのようないくつかの
製剤は以下の化学検出方法に良好な濃度１０，５，２及
び１mcg Ｐｎ−Ｐｓ／ml（以下のＣ項参照）を含有す
る。従って炭水化物組成分析を行なうために、吸着Ｐｎ
−Ｐｓ−ＯＭＰＣワクチンをまず沈降させて水性液除去
し、沈降物をクエン酸溶解の前にもとの容量の１／５に
浮遊させる。透析後可溶化Ｐｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣは５
０，２５，１０及び５mcg Ｐｎ−Ｐｓ／mlで存在する。
次いでこれらの濃度はＰｎ−Ｐｓ及びタンパク質両分析
を受けやすく投薬量レベルを確認する。クエン酸脱着試
料もまた可能な遊離Ｐｎ−Ｐｓの存在を分析し、この結
果は製造の免疫原性と粘稠度に重要である。この分析は
ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ−２Ｂ又はＳＥＰＨＡＣＲＹ
Ｌ Ｓ１０００ＳＦサイズカラムによるクロマトグラフ
ィーで行ないＰｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣをＰｎ−Ｐｓから分
離することができる。遊離Ｐｎ−Ｐｓの存在及び量は速
度比濁分析により抗原的に測定される。Ｐｎ−Ｐｓ−Ｏ
ＭＰＣの遊離Ｐｎ−Ｐｓによる混入レベルは存在する全
Ｐｎ−Ｐｓの１５％以下である。

【００２８】iv．発熱原テスト：著しい発熱原性の欠如 本発明の結合体生成物を温度上昇逆作用の欠如に対して
試験する。結合体生成物を本明細書で開示した方法に従
って製造し、発熱原性の使用し得るレベルを有すること
を見い出した。方法（Ｉ．Ｖ．） Ｐｎ−Ｐｓ結合体ワクチンを２１ ＣＦＲ、セクション
６１０、１３（ｂ）に記載される通り試験する。 １）方法（Ｉ．Ｍ．） 発熱原性の第２尺度はウサギＩＭテストである。このテ
ストは生成物の臨床に於ける使用をより密接に模擬し、
生成物の見掛けの内毒素力をより正確に反映すると思わ
れる。各ウサギにワクチン１．０mlを筋肉注射する。テ
ストは少なくとも３匹のウサギを用いて行なう。温度を
注射後５時間監視する。他のテスト方法は２１ ＣＦＲ
セクション６１０、１３（ｂ）に記載される通りであ
る。（テスト投与量は多糖濃度による）。

【００２９】Ｖ．共有結合的結合の種類 Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ、例えばＰｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ又は
Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合体は多糖とＰＲＯ、例えばＯ
ＭＰＣ又はＭＩＥＰと加水分解的に不安定な共有結合を
形成するチオエーテル基と第一アミンを含有するビジェ
ネリックスペーサーを介して結合させることができる。
本発明による好ましい結合体は式Ｐｎ−Ｐｓ−Ａ−Ｅ−
Ｓ−Ｂ−ＰＲＯ又はＰｎ−Ｐｓ−Ａ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’
−ＰＲＯによって表わすことができるものである。Ａ−
Ｅ−Ｓ−Ｂ及びＡ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’は、加水分解的に
安定な共有結合チオエーテル結合を含有し、高分子ＰＲ
Ｏ及びＰｎ−Ｐｓと共有結合（例えば加水分解的に不安
定なエステル又はアミド結合）を形成するビジェネリッ
クスペーサーを構成する。スペーサーＡ−Ｅ−Ｓ−Ｂに
於て、Ｓはイオウであり、Ｅはチオール基と反応させた
イオウ好性基の変換生成物であり、

【化３】 （ＲはＨ又はＣＨ₃ であり、ｐは１〜３である）で表わ
され、Ａは

【化４】 ｛ＷはＯ又はＮＨであり、ｍは０〜４であり、ｎは０〜
３であり、ＹはＣＨ₂ ，Ｏ，Ｓ，ＮＲ’又はＣＨＣＯ₂
Ｈ（Ｒ’はＨ又はＣ₁ −又はＣ₂ −アルキルである）で
あり但しＹがＣＨ₂ である場合には、ｍとｎは共にＯで
はなく、ＹがＯ又はＳである場合にはｍは１より大き
く、かつｎは１より大きい｝であり、Ｂは

【化５】 ｛ｑは０〜２であり、ＺはＮＨ₂ 、ＣＨＣ（＝Ｏ）Ｏ
Ｒ’、ＣＯＯＨ又はＨ（Ｒ’及びｐは上で定義した通り
である）であり、ＤはＣ（＝Ｏ）、ＮＲ’、又はＮ（−
Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ₂ ）₂ Ｃ（＝Ｏ）である｝であ
る。スペーサー、Ａ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’に於て、Ｓはイ
オウであり；Ａ’は−Ｃ（−Ｗ）ＮＨ（ＣＨ₂ ）_a Ｒ”
−（ａは１〜４であり、Ｒ”はＣＨ₂ 又はＮ（−Ｈ）Ｃ
（＝Ｏ）Ｃ（−Ｙ’）Ｈ（ＣＨ₂ ）_p であり、Ｙ’はＮ
Ｈ₂ 又はＮＨＣＯＲ’であり、またＷ、ｐ及びＲ’は上
で定義した通りである）であり、Ｅ’はチオール基と反
応させたイオウ好性基の変換生成物であり、かつ−Ｃ
（−Ｒ）Ｈ−（Ｒは上で定義した通りである）で表わさ
れ；Ｂ’は−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、又はＥ’が

【化６】 であり、またＢ’は−（ＣＨ₂ ）_p Ｃ（＝Ｏ）−（ｐは
１〜３である）である。更にビジェネリックスペーサ
ー、Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ及びＡ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’のＥ−Ｓ
−Ｂ及びＡ’−Ｓ−Ｅ’成分は決定及び定量でき、この
同定は共有結合変性多糖に由来するチオエーテルサルフ
ァ側を官能基化タンパク質に由来するスペーサー側と結
合する結合体結合の共有原子価を反映するものである。

【００３０】本発明による結合体、Ｐｎ−Ｐｓ−Ａ−Ｅ
−Ｓ−Ｂ−ＰＲＯは、その成分として特に二酸化炭素、
１，４−ブタンジアミンとＳ−カルボキシメチル−Ｎ−
アセチルホモシステイン；二酸化炭素、１，５−ペンタ
ンジアミンとＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモ
システイン；二酸化炭素、３−オキサ−１，５−ペンタ
ンジアミンとＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモ
システイン；二酸化炭素、１，４−ブタン−ジアミンと
Ｓ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルシステイン；二酸
化炭素、１，３−プロパンジアミンとＳ−カルボキシメ
チル−Ｎ−ベンゾイルホモシステイン；二酸化炭素、３
−アザ−１，５−ペンタンジアミンとＳ−カルボキシメ
チル−Ｎ−アセチルシステイン；二酸化炭素、１，２−
エタンジアミン、グリシンとＳ−（スクシン−２−イ
ル）−Ｎ−アセチルホモシステインの誘導体を含むスペ
ーサーを含有することができる。本発明による結合体、
Ｐｎ−Ｐｓ−Ａ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’−ＰＲＯは、その成
分として特に二酸化炭素とＳ−カルボキシメチルシステ
アミン；二酸化炭素とＳ−（α−カルボキシエチル）シ
ステアミン；二酸化炭素とＳ−カルボキシメチルホモシ
ステアミン；二酸化炭素、Ｓ−（スクシン−２−イル）
システアミンとグリシン；二酸化炭素とＳ−カルボキシ
メチルシステインの誘導体を含むスペーサーを含有する
ことができる。

【００３１】Ｂ．新規なＰｎ−Ｐｓ中間体及びＰｎ−Ｐ
ｓ−ＰＲＯ結合体の製造方法 この方法を開示するに際し、数段階が明白に記載され
る。 Ｉ．多糖の調製 ａ）粗肺炎球菌多糖Ｐｎ−Ｐｓを単離する ｂ）粗Ｐｎ−Ｐｓを部分加水分解又は機械的に剪断する ｃ）部分加水分解Ｐｎ−Ｐｓをサイズ及び純度に応じて
分画する II. 結合 ａ）分画Ｐｎ−Ｐｓを官能基化して親電子又は求核反応
基Ｐｎ−Ｐｓ^*を形成し、好ましくは約２１反応性ブロ
モアセチル基／１００ Ｐｎ−Ｐｓオリゴ糖繰り返し単
位を示す ｂ）免疫原性タンパク質（ＰＲＯ）好ましくはナイセリ
アメニンギチジスＢＯＭＰＣ又はそのサブユニットを単
離する ｃ）ＰＲＯを官能基化して求核又は親電子反応基ＰＲＯ
^* 、好ましくはＯＭＰＣ又はそのサブユニット例えばＭ
ＩＥＰを生成し、反応性スルフヒドリル部分を示す ｄ）工程（ａ）の多糖（Ｐｎ−Ｐｓ^* ）を工程（ｃ）の
タンパク質（ＰＲＯ^* ）と結合する ｅ）Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体をキャップ形成して残留
官能基を除去する ｆ）結合体生成物を単離する。

【００３２】Ｉ．ａ）粗肺炎球菌多糖Ｐｎ−Ｐｓの単離 肺炎球菌多糖類は一定の莢膜多糖血清型のオリゴ糖繰り
返し単位の組成及び結合により化学的に抗原的に異な
る。多糖類の単離は一定の多糖の物理的特徴に依存して
わずかに異なる系で進行させねばならない。しかしなが
ら一般に細菌を培養し、Ｐｎ−Ｐｓを既知の方法に従っ
て回収する［実施例３及びウィリアムス、Ｃ．Ａ．及び
チェース、Ｍ．Ｗ．、メソッズインイムノロジーアンド
イムノケミストリー第Ｉ巻、アカデミックプレス（１９
６７年）(Williams.C.A.and Chase.M.W.,Methods in Im
munology and Immunochemistry, Vol.Ｉ.Academic Pres
s （１９６７）］が、病原菌自体はＡＴＣＣから入手し
得る。簡単に言えば肺炎球菌の発育を支持する当業界で
既知の適当な栄養培地中細菌の大規模な培養後フェノー
ル又はトルエンのような殺菌剤を加えて細菌を不活化す
る（実施例３）。次いで多糖のアルコール分画は２段階
で行なわれる。第１段階では低アルコール濃度を用いて
細胞デブリと他の望ましくない不純物を沈降させるが粗
Ｐｎ−Ｐｓは溶液中に残る。次に水に混ざるアルコール
を所定の濃度まで加えると莢膜多糖類を沈降するが上清
に別の不純物が残る。水性媒質に再浮遊させ次いでヌク
レアーゼ又はタンパク質分解消化又は溶媒抽出のような
既知の方法によって混入タンパク質及び核酸を除去す
る。粗多糖をアルコール沈降及び乾燥によって回収して
粗Ｐｎ−Ｐｓ末を生成させる（実施例３）。

【００３３】Ｉ．ｂ）粗Ｐｎ−Ｐｓの部分加水分解又は
機械的剪断 実質的に上述の通り調製した粗多糖［以下の実施例３も
参照］は、成人及び２才以上の子供を使用目標とした肺
炎球菌ワクチンを処方するために非結合状態で用いられ
ている。次の処理工程は結合体ワクチンの製造に有用な
ユニークな定義の化学的及び物理的性質（表II参照）を
有する新規な部分加水分解された精製Ｐｎ−Ｐｓ生成物
を生成させる。粗Ｐｎ−Ｐｓのサイズ縮小は、高純度Ｐ
ｎ−Ｐｓ生成物を得るための次の精製工程の成功に効果
がある。更に結合体を調製するために用いる場合、本発
明の新規なＰｎ−Ｐｓを使用するときの結合は更に能率
がよい。これは粗多糖物質の水溶液が非常に粘性で可溶
性が不十分であり、その結合体が非常に不溶性でフィル
ターを通過することができないためである。結合方法は
これ自体実施が困難であり、低収率の結合体が生じる。
更に最終結合体からの非結合Ｐｎ−Ｐｓの除去は、前結
合Ｐｎ−Ｐｓがサイズの縮小、粘度の低下及び改良され
た溶解度を有する場合に容易である。これは結合体調製
物中の遊離Ｐｎ−Ｐｓの存在が、投与される結合体Ｐｎ
−Ｐｓの実際の投与量を推定することを困難にする点で
重要であり、著しいＴ細胞刺激作用を有する結合Ｐｎ−
Ｐｓであるほど、非結合Ｐｎ−Ｐｓの存在は免疫学的に
“適切”なＰｎ−Ｐｓの減少を示す。

【００３４】上記で調製した乾燥粗莢膜多糖は、またＰ
ｎ１４−Ｐｓとして実施例６に示される通り、部分加水
分解の前又は後に、例えばアニオン交換クロマトグラフ
ィー、又は他のクロマトグラフィー法で精製することが
できる。クロマトグラフィー吸着−脱着は、正あるいは
負として使用することができる。正の方法では、Ｐｎ−
Ｐｓを樹脂に吸着させて溶液中に不純物を残し、Ｐｎ−
Ｐｓ脱着前に洗い流す。負の方法では、不純物をＰｎ−
Ｐｓ溶液から吸着させて捨て、精製された状態の溶液中
Ｐｎ−Ｐｓを残す。またＰｎ−Ｐｓは、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ
として実施例４に示される通り、部分的熱加水分解又は
Ｐｎ１４−Ｐｓとして実施例６に示される通り音波加水
分解に直接かけることができる。他の加水分解手段、例
えば化学的、酵素的又は物理的（例えば高圧セル）手段
も既知である。部分加水分解は水性媒質中、好ましくは
５〜１１０℃で、約１〜４８時間限定熱処理によって達
成される。５秒から５分の限定高エネルギー音波処理
は、所望粘度又はkd終末点に達するのに必要な回数だ
け、冷却時間をおいて繰り返す。音波加水分解法は、熱
加水分解より好ましく、多糖類は複合構造を有する（以
下参照）。多糖類の部分加水分解を行なう本技術分野で
既知の他の適当な手段も利用することができる。例えば
酸による限定化学的加水分解、細胞内崩壊酵素処理又は
ブレンダーミルに於ける物理的剪断もまた平均Ｐｎ−Ｐ
ｓ鎖サイズを縮小するために使用することができる。好
ましい実施態様では、Ｐｎ−Ｐｓをホモジナイザーに所
定の温度約０〜３０℃、圧力約２，０００〜１５，００
０PSI で通過させて物理的剪断にかけてサイズ、多分散
性及び抗原性の望ましい特徴を有するＰｎ−Ｐｓ生成物
を得る（実施例１０参照）。

【００３５】溶液粘度又は高性能サイズ排除クロマトグ
ラフィーで都合よく測定される加水分解の標的終末点
は、多糖の抗原性が妨げられないようなパイロットスケ
ールで各々の多糖に対して予め決定される。上で述べた
ように抗肺炎球菌型特異抗体を結合する名目上の能力
は、同濃度の粗Ｐｎ−Ｐｓ出発物質に示される結合の７
０％以上であることが良好とみなされる。これは実質的
に低いＭ_N 、Ｍ_W 又は繰り返し単位数／分子（表II）を
有するＰｎ−Ｐｓが、この方法で生成させることができ
ず速度比濁検定の場合、上で決めた７０％以上のカット
オフを反応させることができないこのようなＰｎ−Ｐｓ
が結合により動物の免疫原性であることができることを
言うのではない。これは型特異抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体を結合
する著しい能力がないにもかかわらず、結合状態の低分
子量Ｐｎ−Ｐｓが哺乳類免疫系に認識され、良好な型特
異抗肺炎球菌応答を生じることができることを言うので
ある。この場合“抗原性”は一定のＰｎ−Ｐｓ調製物の
受容又は排除の操作基準としての“免疫原性”に置き換
わるべきである。しかしながら実際には方法制御として
生体内免疫原性パラメーターより試験管内抗原性を使用
することが最も便利である。

【００３６】一般に、同様のサイズ縮小方法はほとんど
の多糖類に応用することができる。しかしながらＰｎ６
Ｂ−Ｐｓは、広範囲の熱的サイズ縮小で抗原性を保持す
るが、Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓは構造上の統合性を失い（グリ
セロール−リン酸側鎖）、音波処理又は物理的剪断手段
によって達成し得る穏やかなサイズ縮小を必要とする。
例えば、ゴーリンホモジナイザーでの物理的剪断は、い
くつかの理由で好ましい方法である。まずこの方法は規
模を拡大することができる。第２に音波及び熱加水分解
は一般に多分散性１．０〜１．５を得るために加水分解
されたＰｎ−Ｐｓの追加分画を必要とする。しかしなが
ら物理的剪断方法は、一般に更に分画せずにこの範囲に
入る多分散性を有するＰｎ−Ｐｓ生成物を生じるが、必
要な場合には純度を更に高め、ＣＰｓ混入の減少を得る
ために分画を使用してもよい。第３に物理的剪断方法
は、熱又は音波加水分解手段と比較した場合、一定のＰ
ｎ−Ｐｓについて再現性が高いという長所がある。第４
に物理的剪断方法は、音波又は熱加水分解によって生成
した同一サイズのＰｎ−Ｐｓより一定のサイズに対して
高い抗原性を保持するというＰｎ−Ｐｓ生成物の生産に
於ける利点があると思われる。

【００３７】Ｐｎ−Ｐｓ平均分子量に関係する粘度は、
監視するのに便利な工程中のパラメーターであり、サイ
ズ縮小の程度を限定及び制御するために加水分解中に容
易に続けられる。Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ及びＰｎ２３Ｆ−Ｐｓ
の化学的及び物理的に区別できるロットは多糖を一致し
た標的終末粘度（上記表Ｉ参照）までサイズを縮小する
ことによって簡単に調製されている。このような工程中
の粘度測定の使用は、広範囲の粗多糖類に応用すること
ができ、得られたＰｎ−Ｐｓ抗原性の特徴を変化させず
に加水分解サイズを減少させる。上述した通り、抗原性
の保持は例えばウフタロニー二重拡散検定、速度比濁分
析又は当業界で既知の他の方法によって容易に確かめら
れる。０．９％塩化ナトリウム（食塩水）中数種のＰｎ
−Ｐｓ調製物の１mg／ml溶液の標的終末粘度を以下の表
IIIに示す。これらの数値は他の肺炎球菌亜型由来Ｐｎ
−Ｐｓに同様に適用することができる。 表 III 粗及び加水分解Ｐｎ−Ｐｓの溶液粘度 Ｐｎ−Ｐｓ亜型 粗Ｐｎ−Ｐｓの 標的終末 粘度 粘度 （センチストークス） （センチストークス） Ｐｎ４−Ｐｓ １．８ １．５−１．００ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ １．４ １．３−１．００ Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ １．４ １．３−１．００ Ｐｎ１４−Ｐｓ １．２ １．１−０．９５ Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ ２．０ １．５−１．００ Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ １．４ １．３−１．００ Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ １．６ １．５−１．００ ある肺炎球菌多糖類の場合には、部分加水分解の前又は
後にイオン交換工程のような別の精製工程を含むことが
有益である。Ｐｎ１４−Ｐｓの場合には、この工程は音
波部分加水分解の前にアニオン不純物のＷＨＡＴＭＡＭ
ＤＥ５２による吸着によって達成される。わずかに酸性
pHの処理で中性である多糖を加水分解に備えて上清画分
として回収する。

【００３８】Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ調製物の分子量値は、サイ
ズ縮小及び分画前は約９００キロダルトン(KD)、後は約
３００KDである。Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓの各数値は前が約１
０００KD以上後が約４００〜５００KDである。従って約
５００±約３００キロダルトンまでのＰｎ−Ｐｓサイズ
の縮小が各Ｐｎ−Ｐｓ亜型工程のこの相の適当な目標で
ある。部分加水分解された物質を、所定濃度のアルコー
ルで再沈降させると以下の（ｃ）項で記載される部分加
水分解されたＰｎ−Ｐｓを回収し更に精製することがで
きる。

【００３９】Ｉ．ｃ）サイズ及び純度による部分加水分
解Ｐｎ−Ｐｓの分画 Ｐｎ−Ｐｓ調製物の多分散性は、亜型特異Ｐｎ−Ｐｓ鎖
長の分散を示すばかりでなく、群特異Ｃ多糖並びに他の
混入物がＰｎ−Ｐｓ調製物に残存していることも示して
いる。上で述べた通り、残留Ｃ多糖の混入は有用ではな
く逆の免疫応答に関連することさえある。狭い範囲の多
糖平均分子サイズ（多分散性の低下）の選択は、サイズ
縮小後示差アルコール、例えばエタノール好ましくはイ
ソプロパノール（ＩＰＡ）溶解によって達成するのが便
利である。この選択の根拠は、一定のＰｎ−Ｐｓ調製物
に対してアルコール溶解度が鎖長に逆比例し、また分子
量に比例することである。従ってこの方法は、出発のサ
イズ縮小Ｐｎ−Ｐｓより著しく改良された均一性を有す
る一致した大きさの分子集団を量的に単離するのに良好
に適用されている。ＩＰＡ分画の工程中制御は、Ｐｎ−
Ｐｓが沈降するＩＰＡの範囲を予想するパイロット実験
を行なうことによるものである。抗体特定ネフェロース
検定は分画を監視するために使用して量的Ｐｎ−Ｐｓ回
収を確かめる。この改良により、多くの異種肺炎球菌単
離物に共通の、Ｃ多糖群特異多糖による混入は、粗Ｐｎ
−Ｐｓ調製物に見られるレベルより約３〜２０倍減少す
る。更にＰｎ−Ｐｓ調製物の分子サイズ多分散性は約
１．０〜１．４に付随して減少する。

【００４０】サイズ縮小Ｐｎ−ＰｓのＩＰＡ分画に対す
る別の方法は、適当なサイズ排除樹脂、例えばＣＬ−２
Ｂ樹脂又は２００〜１０００キロダルトン分子量範囲の
多糖を含み、分画することができる他の樹脂によるサイ
ズ縮小水性Ｐｎ−Ｐｓのクロマトグラフィーである。厳
密なサイズ排除マトリックスを用いるＨＰＳＥＣは、こ
の点で便利であり、分解能の遅れと増加を減少させる。
所定の粘度又は保持時間又はオンライン検出によるカラ
ムから溶離する画分の選択は、上で開示したサイズ、粘
度及び純度の望ましい特徴を有するＰｎ−Ｐｓ分子集団
を得る。ＩＰＡ又はクロマトグラフィー分画の別の工程
を用いたＰｎ−Ｐｓの調製物は、化学結合工程中、更に
一致して行動して再現性のある特徴を有する結合体を生
成させる。Ｐｓ−Ｐｓ純度の付随した著しい増加も得ら
れ、特にＣＰｓレベルは非常に低下する。上述の操作と
測定の結果としてＰｎ−Ｐｓ中間体の好ましい特徴は上
記表IIに示した通りである。

【００４１】II．ａ）親電子又は求核反応基Ｐｎ−Ｐｓ
^* を形成し、好ましくは約１０〜４０反応性ブロモアセ
チル基／１００Ｐｎ−Ｐｓモノマー単位を示す分画Ｐｎ
−Ｐｓの官能基化： 上記工程Ｉ（ｃ）で得たＰｎ−Ｐｓは十分均一であり結
合を受けやすいＰｎ−Ｐｓにする溶解度の改良及び粘度
の低下のような特性を有する。多糖類と他の部分の結合
体を調製するために多くの異なった計画が当業者に利用
できる。本明細書で開示される方法は結合体を生成する
ために本発明の新規な部分加水分解及び分画Ｐｎ−Ｐｓ
中間体を使用する単に可能な１経路であり、Ｐｎ−Ｐｓ
中間体を使用する排他的な方法と理解されるべきではな
い。

【００４２】マルブルグ．Ｓ．等［米国特許第４，６９
５，６２４号；Ｊ．Am.Chem.Soc.第１０８巻、５２８２
頁（１９８６年）］によって開示されるビジェネリック
スペーサー方法は分画及びサイズ縮小したＰｎ−Ｐｓを
免疫原性タンパク質に結合する好ましい方法である。Ｐ
ｎ−Ｐｓを官能基化して親電子又は求核基を示す。次い
で得られたＰｎ−Ｐｓ^* は反対に官能基化したタンパク
質、ＰＲＯ^* と反応させることができる。本発明の方法
はまた活性化多糖と反応させてペンダント親電子部位又
はペンダントチオール基を有する共有結合的に変性した
多糖を生成させる求核又は二求核基の選択を包含し、こ
れによって共有結合的変性多糖を共有結合的変性タンパ
ク質と反応させる前に更に二求核変性多糖を官能基化す
る必要がない。またタンパク質をいずれかの部分形に官
能基化することはこれらの工程で反応物を選択すること
により１工程以上で達成することができる。

【００４３】望ましい官能性のＰｎ−Ｐｓ^* でも、サイ
ズ縮小分画Ｐｎ−Ｐｓはまず官能基化方法を妨害しない
溶媒中で可溶化しなければならない。最も官能基化を受
けることができるのはＰｎ−Ｐｓのヒドロキシル基であ
るように最初の官能基化を行なうためにＰｎ−Ｐｓを水
から除去することは重要である。酸性Ｐｎ−Ｐｓの水素
をテトラ又はトリブチルアンモニウムのような疎水性の
カチオンで置き換えるとＰｎ−Ｐｓが非水性溶媒例えば
ＤＭＳＯ又はＤＭＦに可溶性になる。勿論中性であるＰ
ｎ−Ｐｓ（例えばＰｎ１４−Ｐｓ又はＰｎ７Ｆ−Ｐｓ）
ではこの置換を行なう必要はない。非水溶液中であれば
Ｐｎ−Ｐｓをカルボニルジイミダゾールのような二親電
子基と反応させてイミダゾイルジウレタンを生成させる
ことができる。官能基／１００Ｐｎ−Ｐｓモノマー単位
の数はこの点で１００Ｐｎ−Ｐｓモノマー単位のうち平
均約１０〜４０だけが誘導化されるようにモルを基準と
して全Ｐｎ−Ｐｓモノマーと比較した場合カルボニルジ
イミダゾールの約１／５の限定量を加えることによって
制御される。この化合物は、米国特許第４，６９５，６
２４号及びマルブルグ等、Ｊ．Am.Chem.Soc.第１０８巻
５２８２頁（１９８６年）に開示されるｉ）求核Ｐｎ−
Ｐｓ^* 誘導体を生成することができるシスタミン二塩酸
塩又はii）親電子Ｐｎ−Ｐｓ^* 誘導体を生成することが
できる１，４−ブタンジアミンのような試薬による求核
置換を受けやすい。

【００４４】最近Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ、Ｐｎ４−Ｐｓ、Ｐｎ
１−Ｐｓ、Ｐｎ５−Ｐｓ及びナイセリアメニンギチジス
Ｂ又はＣ多糖類のような酸性肺炎球菌多糖類が遊離カル
ボン酸基並びに遊離ヒドロキシル基を示すことから、こ
れらの多糖類の結合化学が中性多糖類又はポリリボシル
リビトールホスフェートのようにホスホジエステル結合
の存在によってアニオンである多糖類と比較した場合わ
ずかに異なる方法で進行することが発見された。一般に
カルボン酸遊離多糖類の結合化学は遊離多糖ヒドロキシ
ルをウレタン結合に変換することによって即ちＰｎ−Ｐ
ｓ−ＯＨから、Ｐｎ−Ｐｓ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ
^a （Ｒ^a はタンパク質に対する原子鎖結合多糖の残部を
表わす）へ進行する。しかしながらグルクロン酸基を含
有するＰｎ−９Ｖ−Ｐｓ又はピルビン酸基を含有するＰ
ｎ４−Ｐｓのようなカルボン酸含有多糖類の場合、化学
はＰｎ−Ｐｓ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨからＰｎ−Ｐｓ−Ｃ
（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ^a （Ｒ^a はタンパク質に対する原子
鎖結合多糖の残部を表わす）へ進行する。従って見られ
るのはウレタンのエステル官能基がカルボン酸含有多糖
に生成されないか又は更に簡単なアミド結合がこれらの
部位に生成されることである。結合化学はカルボン酸官
能性の存在のために速い速度で進行する。

【００４５】カルボン酸官能性がこの種のアニオン多糖
類の抗原性及び免疫原性に対する重要な寄与因子である
と考えられるため、結合化学はこれらの多糖類を注意し
て制御しなければならない。最終結合体に於けるタンパ
ク質に対する高多糖比の要求は抗原性を保持するための
要求とバランスをとらねばならない。この目的は開始カ
ルボニルジイミダゾール仲介活性化の量を限定すること
によって達成される。アミドが生成されればシスタミン
二塩酸塩又は１，４−ブタンジアミンを含む次の工程は
上述の通り更に以下で述べられる通り進行することがで
きる。また、カルボキシル基はトリメチルシリル又は後
に緩和なアルカリ性条件によって除去することができる
類似の保護基を用いて又は酸不安定である２，４−ジメ
トキシベンジルエステルを用いて可逆的に保護され次い
で脱保護される。この場合、結合化学は多糖ヒドロキシ
ル基により通常の方法で進行することができる。

【００４６】１．求核Ｐｎ−Ｐｓ^* の製造 上記で得たカルボニルジイミダゾール活性化サイズ縮小
分画Ｐｓは水性又は他の溶媒中で米国特許第４，６９
５，６２４号に開示されるような試薬と反応させること
ができる。好ましい試薬はシスタミン二塩酸塩である。
次いで過剰のシスタミンを除去し、ジチオトレイトール
又はジチオエリトリトールで還元して求核スルフヒドリ
ル官能基化Ｐｎ−Ｐｓを得る。このＰｎ−Ｐｓ^* 誘導体
は例えばタンパク質がペンダントブロモアセチル基を示
すように変性されている場合に親電子ＰＲＯ^* と反応さ
せることができる。

【００４７】２．親電子Ｐｎ−Ｐｓ^* の製造 上で得たカルボニルジイミダゾール活性化サイズ縮小分
画Ｐｎ−Ｐｓは水性又は他の溶媒中で第４，６９５，６
２４号特許に開示される試薬好ましくは１，４−ブタン
ジアミン（ＢｕＡ₂ ）と反応させることができる。次い
でＰｎ−Ｐｓ−ＢｕＡ₂ をｐ−ニトロフェニルブロモア
セテート又は類似の試薬でアシル化して求核ＰＲＯ^* 例
えばスルフヒドリル変性タンパク質と反応させることが
できる親電子Ｐｎ−Ｐｓ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ誘導体を
生成させる。誘導化の程度はこの点でＮＭＲ及び１，４
−ブタンジアミン数とラムノースのメチルのような便宜
上の単糖シグナルと比較して測定する。誘導化の程度は
１０〜４０％が好ましく、約２０％が最も好ましい。

【００４８】II．Ｂ）免疫原タンパク質（ＰＲＯ）、好
ましくはナイセリアメニンギチジスＢＯＭＰＣ又はその
サブユニットの単離 タンパク質部分は免疫エンハンサーとして行動すべきで
ある。タンパク質の選択に於て受容体免疫応答（反応原
性）の非特異活性化を生じるものを避けることが望まし
い。米国特許第４，６９５，６２４号ではマルブルグ等
はナイセリアメニンギチジス由来外膜タンパク質複合体
（ＯＭＰＣ）を用いて多糖タンパク質結合体を製造して
いる。ＯＭＰＣは本発明に適当であることは明らかであ
るが破傷風又はジフテリアトキソイド又はパータッシノ
ーゲン(pertussinogen) のような他の免疫原タンパク質
を使用することができる。

【００４９】グラム陰性菌由来ＯＭＰＣの種々の精製方
法は考えられている［フラッシュ(Frasch)等、Ｊ．Exp.
Med.第１４０巻、８７頁（１９７４年）、フラッシュ
等、Ｊ．Exp.Med.第１４７巻、６２９頁（１９７８
年）、ゾリンガー(Zollinger) 等、米国特許第４，７０
７，５４３号（１９８７年）、ヘルチング(Helting)
等、Actapath.Microbiol.Scand. Ｃ部第８９巻、６９頁
（１９８１年）、ヘルチング等、米国特許第４，２７
１，１４７号］。この中で用いられるＯＭＰＣは実施例
１に記載される通り製造された。更にＯＭＰＣの解離又
はＯＭＰＣ成分タンパク質特に主要膜タンパク質をコー
ドする物質の組換体発現によって単離したタンパク質サ
ブユニット（マイトジェン誘発タンパク質、ＭＩＰ又は
主要免疫エンハンシングタンパク質、ＭＩＥＰとも呼ば
れる）もまた好ましい。サブユニットタンパク質を得る
一つの方法は実施例２、１６〜２３及び米国特許出願第
５５５，９７８号、同第５５５，３２９号、同第５５
５，２０４号及び同第６３９，４５７号に開示される。

【００５０】II．Ｃ）求核又は親電子反応基ＰＲＯ^* 好
ましくはＯＭＰＣ又はそのサブユニットを生成し反応性
スルフヒドリル部分を示すためのＰＲＯの官能基化 上記II（ｂ）の通り単離したＰＲＯを次に官能基化する
と親電子又は求核基を示す。次いで得られたＰＲＯ^* は
上記II（ａ）で製造した反対に官能基化したＰｎ−Ｐｓ
^* と反応させることができる。

【００５１】１．親電子ＰＲＯ^* 誘導体の生成 単離したＰＲＯ例えばナイセリアのＯＭＰＣ又はＯＭＰ
ＣからのＭＩＥＰをＰＲＯのリシンのε−アミノ基と反
応させることができるＮ−（ブロモアセチル）−６−ア
ミノカプロン酸ｐ−ニトロフェニルエステルのような試
薬と反応させることが好ましい。得られたブロモアセチ
ル化ＰＲＯ^* は上記II（ａ）１で製造したＰｎ−Ｐｓ^*
の求核誘導体と反応させることができる。

【００５２】２．求核ＰＲＯ^* 誘導体の生成 単離したＰＲＯ、例えばナイセリアのＯＭＰＣ又はＭＩ
ＥＰをＮ−アセチルホモシステインチオラクトンのよう
な試薬と反応させてタンパク質のスルフヒドリル誘導体
を生成させる。この求核誘導体は上記II（ａ）２で製造
した親電子Ｐｎ−Ｐｓ^* と反応させることができる。こ
の工程相の典型的な結果としてはスルフヒドリル力価約
０．１〜０．３μモル／mgタンパク質を生じる。

【００５３】II．ｄ）工程II（ａ）の多糖（Ｐｎ−Ｐｓ
^*）と工程II（ｃ）のタンパク質（ＰＲＯ^* ）の結合 上記工程II（ａ）及びII（ｃ）に従い反応性基Ｐｎ−Ｐ
ｓ^* 及びＰＲＯ^* を生成させた際、反対に活性化した反
応パートナーを約１：１の質量比で互いに接触させる。
この反応混合物から空気を窒素によってパージし、密封
し、１７〜４０℃で約４日間室温で反応させる。このよ
うな反応の具体例としては

【化７】 （４−ブロモアセタミドブチルアミンと反応させた活性
多糖をＮ−アセチルホモシステインチオラクトンと反応
させたタンパク質と反応させて結合体を生成させる）及
び

【化８】 （Ｙ”はＣ₂ 〜Ｃ₈ アルキルラジカルである）、（活性
化マレイミド酸と反応させたアミノ誘導多糖をアミノチ
オールでアミノ化したカルボキシ活性タンパク質と反応
させて結合体を生成させる）を包含する。

【００５４】同様にペンダントチオール基を有する共有
結合的変性多糖類のいずれかをペンダント親電子中心を
有する細菌タンパク質ＯＭＰＣ又はＭＩＥＰと反応させ
て共有結合結合体を得ることができる。このような反応
の具体例は

【化９】 （アミノチオールと反応させた活性多糖をジアミンのモ
ノハロアセチル誘導体と反応させたカルボキシ活性タン
パク質と反応させて結合体を生成させる）である。本発
明による非常に好ましい結合は多糖ヒドロキシルを介し
て結合する場合式ＰＲＯ−ＮＨ−ＣＯＣＨ（−ＮＨＣＯ
ＣＨ₃ ）ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯＮＨ（ＣＨ₂ ）₄ Ｎ
ＨＣ（＝Ｏ）−Ｏ−ＰｎＰｓ又はカルボン酸基を有する
多糖類の場合には式 ＰＲＯ−ＮＨ−ＣＯＣＨ（−ＮＨＣＯＣＨ₃ ）ＣＨ₂ Ｃ
Ｈ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯＮＨ（ＣＨ₂ ）₄ ＮＨＣ（＝Ｏ）−Ｐ
ｎＰｓを有するスペーサーである。

【００５５】過剰のハロアセチル基の親電子活性を除去
する必要があるとしても結合体とＮ−アセチルシステア
ミンのような低分子量チオールとの反応によりこの目的
を達成する。この試薬Ｎ−アセチルシステアミンの使用
はまた、生成されるＳ−カルボキシメチルシステアミン
がスパックマン、ムーア及びスタイン法によってユニー
クに検出することができるため、使用されたハロアセチ
ル部分の確認をすることができる。

【００５６】II．ｅ）残留官能基を除去するためのＰｎ
−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体のキャップ形成 ＰＲＯ^* 又はＰｎ−Ｐｓ^* の残留親電子基を反応の終わ
りに、残留遊離スルフヒドリルをキャップするために低
分子量求核基例えばＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）又
は残留ブロモアセチル部分をキャップするために親電子
基例えばＮ−アセチルシステアミンを結合体の残留反応
性基より約２〜１０倍モル過剰量添加することによって
抑制する。

【００５７】II．ｆ）結合体生成物の単離 キャップした生成物結合体を超遠心分離又はダイアフィ
ルトレーションによって非結合ＰＲＯ、Ｐｎ−Ｐｓ及び
他の反応物から分離する。結合体ペレットを、０．５％
デオキシコリンのような洗浄剤処理及び０．１Ｍトリス
pH７〜９及び約１０mMＥＤＴＡのような塩を含んでもよ
い水性緩衝洗液に再懸濁させて残留発熱物質を除去し、
室温で１〜２５時間放置する。結合体を再沈降させ、洗
浄剤を含まない水性緩衝液に再懸濁させた後定角ロータ
ーを用いて約１００，０００xgに於て約１〜２０℃で約
２時間超遠心分離によって再ペレット化させるか又はＰ
ｓ、ＰＲＯを用いて非共有結合的結合多糖類及びタンパ
ク質を除去するダイアフィルトレーションゲル浸透、イ
オン交換クロマトグラフィー、勾配遠心分離又は他の示
差吸着クロマトグラフィー及び速度比濁分析検定並びに
所望の生物活性を伴う試験管内方法としてビジェネリッ
クスペーサーの共有原子価検定（以下参照）を含む種々
の精製方法にかける。

【００５８】更に試薬の分離はカラムのサイズ排除クロ
マトグラフィーで達成することができ、また非常に大き
な不溶性タンパク質の場合には分離は超遠心分離によっ
て達成することができる。結合体を滅菌水に再懸濁させ
４℃で約１日熟成して完全に可溶化させた後低速遠心分
離して不溶性粒子を除去する。上清は最終生成物を含有
し、これを滅菌濾過し、免疫学的に有効な投薬量レベル
でワクチン組成物に処方し、ビンに滅菌充填することが
できる。結合体の共有原子価従って安定性を確認するた
めの結合体の分析は結合体を加水分解（好ましくは６Ｎ
ＨＣｌで１１０℃に於て２０時間）し、次いでタンパク
質のチオエーテル結合及び構成アミノ酸を含有する加水
分解的に安定なスペーサーのユニークなアミノ酸を量的
に分析することによって達成される。タンパク質のアミ
ノ酸の寄与は必要があれば含まれるタンパク質の適当な
アミノ酸標準と比較して除く、このとき残りのアミノ酸
値が結合体の共有原子価を表わす、又はスペーサーのア
ミノ酸を分析に於てタンパク質のアミノ酸標準を除いて
現われるように配列することができる。共有原子価検定
はまた生物学的に活性な成分の濃度の増加をマークする
ために精製方法を監視するのに有用である。上記具体例
の場合Ｐｓ−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−ＰＲＯ分子のペプチド結
合及び他の加水分解的に不安定な結合での切断によって
ＰｓＣ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＮＨＣ
（＝Ｏ）ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ（−ＮＨＣＯＣＨ
₃ ）ＣＯＰＲＯの加水分解はＳ−カルボキシメチルホモ
システインＨＯ₂ ＣＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ（−ＮＨ
₂ ）ＣＯ₂ Ｈの遊離を生じ、

【化１０】 の加水分解はアミノジカルボン酸ＨＯ₂ ＣＣＨ₂ （ＨＯ
₂ Ｃ−）ＣＨＳＣＨ₂ ＣＨ₂ ＮＨ₂ の遊離を生じ、Ｐｓ
Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ
（ＣＨ₂ ）₄ ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｃ（＝Ｏ）Ｐ
ＲＯの加水分解はＳ−カルボキシメチルシステアミンＨ
₂ ＮＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＣＨ₂ ＣＯ₂ Ｈの遊離を生じる。次
いでスパックマン、ムーア及びスタインのようなクロマ
トグラフィー法を適用するのが便利であり、アミノ酸成
分比が決定される。

【００５９】ＩｇＧ抗体の最適な産生は興味の抗原に特
異性を有するＢ及びＴリンパ球の協調を必要とする。Ｔ
リンパ球は多糖類を認識することができないが多糖をＴ
細胞が認識することができるタンパク質に共有結合する
場合には抗多糖ＩｇＧ抗体応答を助けることができる。

【００６０】Ｃ．ワクチン製剤及び有用性 好ましい実施態様では結合体生成物を水酸化アルミニウ
ムゲルに吸着させる。これは例えばＰｎ−Ｐｓ２０μg/
mlの濃度に等価な結合体原液の調製によって達成され
る。一部を滅菌水で１：１、１：５及び１：１０に希釈
することができる。２０μg/ml原液の一部を含むこれら
の試料の各部分をＡｌ⁺³０．８５mg／ml、１．７％Ｎａ
Ｃｌ(w/v) 及びチメロソル(thimerosol)１００μg/mlを
含有する水酸化アルミニウム希釈剤で１：１に希釈す
る。溶液のpHを１Ｎ ＮａＯＨで約７．５に調整してＰ
ｎ−Ｐｓ濃度１０、５、２及び１μg/mlを有する溶液と
なる。これらの製剤の各々の投与量約０．１〜０．７５
mlが異なった年令及び体重の受容者に投与するのに適当
である。記載した通り処方したワクチンはＰｎ６Ｂ−Ｐ
ｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１４−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１９Ｆ
−Ｐｓ−ＯＭＰＣ及びＰｎ２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣに対
して２〜３ケ月の乳仔のサルに於て著しくサブタイプ特
異的抗肺炎球菌多糖免疫応答を高めることを見い出し
た。更にＰｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ結合体ワクチンが無胸腺
マウスに於てＴ細胞依存性であることを見い出した。

【００６１】この開示から本明細書で定義した特性を有
する他の多糖類及びそれらの特性を有するＰｓの製造方
法が部分加水分解分画肺炎球菌多糖類を包含しているも
の以外の結合体の製造に有用な応用を有することは明ら
かである。それからこれらの結合体は他の病原菌による
疾患を予防するために使用することができる。例えば群
Ｂ肺炎球菌、新生児髄膜炎の病原菌、ナイセリアメニン
ギチジスＢ又はＣ、乳児髄膜炎の病原菌又は大腸菌、尿
路感染及び他の日和見感染の重要な病原菌を多糖源とし
て使用することができる。これらの多糖類並びにＰｎ−
Ｐｓ及びその共有結合体もまた混合ワクチン製剤の重要
な成分となることができる。このような混合剤は例えば
免疫学的に有効な量のアジュバント例えばフロインド、
リビ又は免疫調節化合物例えばインターロイキン、イン
ターフェロン（具体的にはマーケットレター１９８７年
１１月３０日、２６〜２７頁に列挙される化合物；ジェ
ネティクエンジニアリングニュース、１９８８年１月、
第８巻、２３頁参照）又は別の免疫原を包含することが
できる。好ましい実施態様では、本発明の結合体の免疫
学的有効量を包含している組成物は肝炎Ｂ、肝炎Ａ、非
Ａ非Ｂ肝炎、エイズ、ジフテリア、百日咳、破傷風、麻
疹、おたふくかぜ、風疹、水痘、ポリオ又はヘモフィル
スインフルエンザｂに対するワクチンの１種以上と共に
包含する。ここで述べたものから選択される好ましいワ
クチンはPevax ＨＩＢ（商標）、RecombivaxＨＢ（商
標）、Ｍ−Ｍ−Ｒ（商標）及び三価のＤＴＰワクチンの
中から選択される。次の実施例は本発明を更に開示する
ものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべ
きではない。

【００６２】実施例１ナイセリア メニンジチディスＢ１１抗原型 ２ ＯＭ
ＰＣの調製 Ａ．発酵 １．ナイセリア メニンジチディスグル−プＢ１１ ナイセリア メニンジチディスの凍結乾燥培養物を含む
管（ドクタ− エムア−テンシュタイン（Dr. M. Arten
stein)、 ワルタ− リ−ド ア−ミ− インスティテュ
−ト オブ リサ−チ（Walter Reed Army Institute o
f Research (WRAIR)、ワシントンＤ．Ｃ．）を開封し、
ユ−ゴンブロス（Eugonbroth(BBL))を添加した。培養物
をミュエラ−ヒントン(MuellerHinton)寒天の斜面に画
線培養し、５％ＣＯ₂ 下３７℃で３６時間インキュベ−
トし、この時に、この増殖物を１０％スキムミルク培地
（Difco)中へ採収し、一部分を−７０℃で凍結した。こ
の微生物の同定はWRAIR により提供される特異的抗血清
との凝集及びDifco により提供される血清の型を検査す
ることにより確認した。第２通路からの培養物のビンを
解凍しコロンビア羊血寒天プレ−ト(CBAB-BBL)上に画線
培養した。このプレ−トを５％ＣＯ₂ 下３７℃で１８時
間インキュベ−トし、この後、この増殖物を１０％スキ
ムミルク培地１００ml中へ採収し、一部分を０．５ml量
採り−７０℃で凍結した。この微生物は特異的抗血清と
の凝集、糖化発酵及びグラム染色によりプラスであると
同定した。この通路からの培養物のビンを解凍し、ミュ
エラ−ヒントンブロスで希釈し４０ミュエラ−ヒントン
寒天プレ−ト上に画線培養した。このプレ−トを６％Ｃ
Ｏ₂ 下３７℃で１８時間インキュベ−トし、この後、こ
の増殖物を１０％スキムミルク培地１７ml中へ採収し、
一部分を０．３ml量採り−７０℃で凍結した。この微生
物はグラム染色、特異的抗血清との凝集及びオキシダ−
ゼ試験によりプラスであると同定した。

【００６３】２．発酵及び細胞ペ−ストの採集 ａ．接種原発育 接種原をナイセリア メニンジチディ
スグル−プＢ、上記からのＢ−１１（通路４）の一つの
凍結ビンから発育させた。１０個のミュエラ−ヒントン
寒天斜面に接種し、約１８時間後に６個を採集し、ｐＨ
６．３５のゴットシュリッヒ酵母透析培地の３Ｘ２５０
mlフラスコに対する接種原として使用した。ＯＤ₆₆₀ を
０．１８に調整しＯＤ₆₆₀ が１〜１．８の間になるまで
インキュベ−トした。この培養物１mlを５Ｘ２リッタ
−、エルレンメイヤ−フラスコ（各々１リッタ−の培養
液を含む；下記参照）の接種に使用し振盪機中２００rp
m 、３７℃でインキュベ−トした。このＯ．Ｄ．を接種
後一時間毎にモニタ−した。４リッタ−のブロス培養物
は、ＯＤ₆₆₀ が１．２８であった。 ７０リッタ−種子発酵槽 約４リッタ−の種子培養物を約４０リッタ−の完全産生
培地（下記参照）を含む滅菌７０リッタ−発酵槽の接種
に使用した。７０リッタ−発酵の条件は、３７℃、毎分
１０リッタ−での空気散布１８５rpm 、ｐＨ約７．０の
一定ｐＨ下、約２時間であった。このバッチに対する最
終ＯＤ₆₆₀ は２時間後で０．７３２であった。 ８００リッタ−産生発酵槽 約４０リッタ−の種子培養物を５６８．２リッタ−の完
全産生培地（下記参照）を含む滅菌８００リッタ−発酵
槽の接種に使用した。このバッチを、３７℃、毎分６０
リッタ−での空気散布１００rpm 、ｐＨ７．０の一定ｐ
Ｈ下でインキュベ−トした。このバッチに対する最終Ｏ
Ｄは接種後１３時間で５．５８であった。

【００６４】３．エルレンメイヤ−フラスコ、７０−及
び８００−リッタ−発酵槽に対する完全培地 ────────────────────── 画分Ａ ｇ／リッタ− ────────────────────── Ｌ−グルタミン酸 １．５ ＮａＣｌ ６．０ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ （無水） ２．５ ＮＨ₄ Ｃｌ １．２５ ＫＣｌ ０．０９ Ｌ−システインＨＣｌ ０．０２ ────────────────────── 画分Ｂ（ゴットシュリッヒ酵母透析物） １２８０ｇのディフコ酵母エキスを６．４リッタ−の蒸
留水に溶解した。この溶液を３個のＨ１０ＳＭカ−トリ
ッジを有する２アミコンＤＣ−３０ホロ−ファイバ−透
析機で透析した。３８４ｇＭｇＳＯ₄ ７Ｈ₂ Ｏ及び３２
００ｇデキストロ−スをこの透析物に溶解させ、全容量
を蒸留水で１５リッタ−にした。このｐＨをＮａＯＨで
７．４に調整し、０．２２μフィルタ−に通過させて滅
菌し、画分Ａを含む発酵槽に移した。エルレンメイヤ−
フラスコ：１リッタ−の画分Ａ及び２５ｍｌの画分Ｂを
添加し、このｐＨをＮａＯＨで７．０〜７．２に調整し
た。７０リッタ−発酵槽：４１．８リッタ−の画分Ａ及
び９００ｍｌの画分Ｂを添加し、このｐＨをＮａＯＨで
７．０〜７．２に調整した。８００リッタ−発酵槽：５
５３リッタ−の画分Ａ及び１５．０リッタ−の画分Ｂを
添加し、このｐＨをＮａＯＨで７．１〜７．２に調整し
た。 ｂ．採収及び不活性化 発酵終了後、フェノ−ルを別の容器に添加し、そこへ細
胞ブロスを移し、最終フェノ−ル濃度を約０．５％にし
た。培養物がもはや生育しなくなるまで（約２４時間）
この物質を弱く撹拌しながら室温に保持した。 ｅ．遠心分離 ４℃で約２４時間後、６１４．４リッタ−の不活性培養
液をシャ−プレス継続流動遠心機で遠心分離した。フェ
ノ−ル処理後の細胞ペ−ストの重量は３．８７５ｋｇで
あった。更にフェノ−ルで中和した発酵ブロスは以下に
記載する透析濾過により採収した。

【００６５】Ｂ．ＯＭＰＣ分離工程１． 濃縮及び透析濾過 フェノ−ルで不活性化した培養物を約３０リッタ−に濃
縮し０．２μｍホロ−ファイバ−フィルタ−（ＥＮＫ
Ａ）を使用して滅菌蒸留水で透析濾過を行った。工程２． 抽出 等量の２Ｘ ＴＥＤ緩衝液（０．１Ｍ トリス、０．０
１Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．５、０．５％ナトリウ
ム デオキシコレ−ト）を濃縮した透析濾過細胞に添加
した。この懸濁物をＯＭＰＣ抽出用の温度制御したタン
クに５６℃で撹拌しながら３０分にわたり移した。この
抽出物をシャ−プレス継続流動遠心機で流速約８０ml／
分、約４℃、約１８０００rpm で遠心分離した。次い
で、粘性の上清液を集め４℃で保存した。この抽出した
細胞ペレットを前記したようにＴＥＤ緩衝液で再抽出し
た。上清液を合わせ４℃で保存した。工程３． 限外濾
過による濃縮 合わせた抽出物をＡＧ−Ｔｅｃｈ０．１μｍポリスルホ
ンフィルタ−に取り付けた温度制御した容器に移した。
抽出物の温度は濃縮工程において容器中２５℃に保っ
た。この試料を平均膜内外圧１１〜２４psi の間で１０
倍濃縮した。工程４． ＯＭＰＣの採集及び洗浄 工程３からの保有物を流速３００〜５００ml／分の間で
継続流動遠心機で約１６００００ｘｇ（３５０００rpm
）、約７０℃で遠心分離し上清液を捨てた。このＯＭ
ＰＣペレットをＴＥＤ緩衝液（１９０ml緩衝液；２０ml
／ｇペレット）に懸濁させ、工程２及び工程４を２回繰
り返した（工程３省略）。工程５． ＯＭＰＣ産生物の回収 工程４からの洗浄したペレットを１００ml蒸留水に懸濁
させガラス棒及びダウンスホモゲナイザ−（Dounce hom
ogenizer) で完全な懸濁物とした。次いでこの水性ＯＭ
ＰＣ浮遊物を０．２２μｍフィルタ−を通過させること
によりフィルタ−滅菌し、０．１μｍホロ−ファイバ−
フィルタ−を使用して滅菌蒸留水にさらす透析濾過によ
ってＴＥＤ緩衝液を水で置換した。

【００６６】実施例２ＯＭＰＣのサブユニットの精製 ポリアクリルアミドゲルによるＯＭＰＣあるいはリコン
ビナント細胞からの精製ＭＩＥＰの調製 アクリルアミド／ＢＩＳ（３７．５：１）ゲル、１８ｘ
１４cm、３mm厚を使用した。スタッキングゲルは４％ポ
リアクリルアミドであり、分離ゲルは１２％ポリアクリ
ルアミドであった。約５μｇのＯＭＰＣ蛋白あるいはリ
コンビナント宿主細胞蛋白をゲル当り使用した。１mlの
ＯＭＰＣに試料緩衝液（４％グリセロ−ル、３００mMＤ
ＴＴ、１００mMトリス、０．００１％ブロモフェノ−ル
ブル−、ｐＨ７．０）０．５mlを添加した。この混合物
を２０分間１０５℃に加熱し、ゲルに載せる前に室温に
冷却した。ブロモフェノ−ルブル−がゲルの底部に到達
するまで、冷却しながら２００〜４００ミリアンプでゲ
ルを作動させた。ゲルの垂直片を切り出し（約１−２cm
幅）コマッシ−／酢酸銅（０．１％）で染色した。ＭＩ
ＥＰバンド（約３８ＫＤ）が見えるまでその切片から汚
れを取り除いた。次いでその切片を元のゲル位置に置き
ＭＩＥＰ領域をゲルの残部からメスで摘出した。 この
摘出領域を正方形に切り（約５mm）、０．０１Ｍトリス
緩衝液、ｐＨ８．１で溶出させた。溶出の２サイクル
後、溶出物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。この
溶出物を溶出物の共通プ−ルと合わせ４８時間６０mMア
ンモニア−蟻酸、ｐＨ１０で透析した。別法として、溶
出した蛋白は水中の５０％酢酸で透析することができ
る。透析後溶出した蛋白を蒸発乾固した。この物質をＰ
Ｄ１０サイズカラム（ファルマシア、ピスキャタウエ
イ、ニュ−ジャ−シ−州）に通過させて更に精製し、室
温で保存した。

【００６７】実施例３ ストレプトコッカス ニュ−モニアエ サブタイプの培
養及び粗製Ｐｎ−Ｐｓの単離 Ｉ．ニュ−モコッシの培養 ニュ−モコッシの培養方法は当業界で公知である（Chas
e,M.W.,Methods of Immunology and Immunochemistry
1, 52(1967)) 。ニュ−モコッカル サブタイプの単離
物はＡＴＣＣから入手可能である。この微生物は被包
性、非運動性、グラム陽性、ランセット形の血液寒天上
でα溶血性である双球菌として同定されている。サブタ
イプは特異的抗血清を使用するクエリング（Quelling)
反応に基づき区別されている。主及び貯蔵種子培養物は
凍結されているかあるいは８℃以下にすることが好まし
い。好ましい培養方法においては、貯蔵培養物をハ−ト
インフユ−ジョン ブロス（Heart Infusion Broth)
でもとに戻し、１０％脱フィブリン化したウサギ血液を
含む、ハ−ト インフユ−ジョン寒天上で培養し、３７
±２℃で約１８時間インキュベ−トする。このプレ−ト
上の増殖物をハ−ト インフユ−ジョン ブロスに再浮
遊させ、この再浮遊した増殖物の一部を１０％脱フィブ
リン化したウサギ血液を含むハ−ト インフユ−ジョン
ブロス１００mlに接種し、３７±２℃で約１８時間固
定培養としてインキュベ−トする。１００mlの液化培養
物（処理種子(working seed)）の純度をグラム染色した
点及びハ−ト インフユ−ジョン血液寒天プレ−ト上の
増殖に対する顕微鏡観察により調べる。この処理種子を
１４日迄の間２−８℃で保存して、すぐに使用する。デ
キストロ−ス（２５ｇ／リッタ−）を含むニュ−モコッ
カス接種原培養基（ＹＵＦ）を含む２リッタ−エルレン
メイヤ−フラスコあるいは適当な容器に処理種子を接種
し、３７±２℃で約８〜２４時間固定インキュベ−トさ
せる。インキュベ−ション時間は特に発育するストレプ
トコッカス ニュ−モニアエのタイプに依存して変わ
る。発酵のｐＨは光学密度１．５〜４．０に到達する迄
１２％炭酸水素ナトリウム溶液の断続的な添加により目
標ｐＨ範囲６．０〜７．２を維持するように調整する。
光学密度は６６０nmでモニタ−する。増殖物の試料を顕
微鏡学的に観察し、血清学上の凝集反応を純度のチェッ
クのために行う。この段階の増殖物を蒸留水、ニュ−モ
コッカス種子培地に対する成分の乾燥充填物（ＹＵ
Ｆ）、酵母エキス限外濾過物、ＵＣＯＮ、及びデキスト
ロ−ス（約２５ｇ／リッタ−）の成分からなる４０リッ
タ−のニュ−モコッカス発酵培地を含む種子発酵槽に移
す。培養物を３７±２℃で温和な撹拌下約２−１２時間
インキュベ−トする。このｐＨを水酸化ナトリウム溶液
の断続的な添加により６．０〜７．２に制御する。蒸留
水、ニュ−モコッカス産生培地に対する成分の乾燥充填
物（ＹＵＦ）、酵母エキス限外濾過物、ＵＣＯＮ及びデ
キストロ−ス（約２５ｇ／リッタ−）の成分からなる５
２５リッタ−のニュ−モコッカス発酵培地を含む発酵槽
を約５０リッタ−の一つの２−１２時間種子培養物で接
種する。培養物を３７±２℃で温和な撹拌下６−３０時
間（この時間は発育のタイプに依存する）インキュベ−
トさせる。このｐＨを水酸化ナトリウム溶液の断続的な
添加により６．０〜７．２に制御する。この発酵の光学
密度を決定し、デキストロ−スがもはやｐＨを変化させ
ないように完全に利用された時に発酵を終了させる。発
酵終了後病原性微生物をすぐに中和する。この中和は約
１％の濃縮物にフェノ−ルを添加させ、周囲温度で２−
１２時間進行させることにより達成される。

【００６８】ＩＩ．粗製Ｐｎ−Ｐｓの単離 細胞破片及び核酸が浮遊するに十分な量で変性アルコ−
ルを中和した培養物に添加し、遠心分離により取り除
く。次いで粗製ポリサッカライドを更なる変性エタノ−
ルの添加により上清液から浮遊させる。この固形物を遠
心分離により集め上清液を捨てる。核酸の混入はポリサ
ッカライドの中性水性溶液、例えば１−５％酢酸ナトリ
ウム、あるいは０．０５Ｍリン酸緩衝液、への可溶化を
減少させるのでヌクレア−ゼ及び０．０１Ｍ塩化マグネ
シウムを添加する。約３６℃で約６０−１２０分後、ｐ
Ｈを約８．０に調整し、トリプシンのようなプロテア−
ゼを蛋白質混入物の消化のために添加する。変性アルコ
−ルあるいはイソプロパノ−ルを使用する酢酸ナトリウ
ム中のポリサッカライドの再浮遊、続く蒸留水での再可
溶化により更なる不純物を除去する。約８℃でのセトリ
モニウム臭化物の添加により不純物を浮遊させ遠心分離
により除去する。酢酸ナトリウム及び一部分の変性アル
コ−ルあるいはイソプロパノ−ルの添加は更なる不純物
を除去させる。ポリサッカライドは更なるアルコ−ルの
添加及び遠心分離により回収される。この浮遊物を白色
粉末が得られるまで無水エタノ−ルで洗浄する。このポ
リサッカライドを濾過によって集め、無水エタノ−ル及
びアセトン洗浄、真空下での乾燥により粗製Ｐｎ−Ｐｓ
を粉末として得る。

【００６９】実施例４部分的に加水分解され、精製されたＰｎ６Ｂ−Ｐｓの調
製 （１）熱加水分解：粗製Ｐｎ６Ｎ−Ｐｓ粉末の３．０ｇ
部分を撹拌しながら室温で約４時間１２００mlの生理食
塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶解させ、４℃で一晩保存
した。次いでこの溶液をコ−ルドフィンガ−（cold-fin
ger)還流冷却器中１００℃で２４時間加水分解し、室温
まで冷却した。酢酸ナトリウム試薬（５９．７ｇ）を最
終濃度３％（ｗ／ｖ）になるように添加した。 （２）血清学的プロ−ブ：試料１０ml部分につき、イソ
プロパノ−ル（ＩＰＡ）分別予備研究及び抗体指示終点
ネフェロ−ゼ検定を行ったところ、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓは４
０−５０％ＩＰＡで浮遊することを示した。 （３）第一ＩＰＡ添加：加水分解した試料（容量１２１
０ml、上記工程１から）を９３２mlＩＰＡの添加（室温
で撹拌しながらの滴下）により４３．５％ＩＰＡにし
た。この試料を１５−３０分間撹拌させ、次いで１１０
００ｘｇで３０分間遠心分離（ベックマンＪＡ−１０ロ
−タ−；８０００rpm ；２０℃）した。この不毛のペレ
ットを２５０mlオムニミックスジャ−(Omnimix jar) 中
無水エタノ−ルで摩砕し、次いで６０ml燒結ガラス漏斗
上で集めた。この浮遊物を直接漏斗上で無水エタノ−
ル、次いでアセトンで洗浄し、ＣａＣｌ₂ 上室温で真空
乾燥して分析用試料を調製した。 （４）第二ＩＰＡ添加及び産生物回収：４３．５％ＩＰ
Ａ上清液（容量２０２０ml、上記工程３から）を室温で
撹拌しながら９３．５mlＩＰＡ滴下により４６．０％Ｉ
ＰＡにした。この試料を熟成し、上記工程３でのように
遠心分離した。このペレットを上記工程３でのように摩
砕、採集、洗浄、乾燥した。このＰｎ６Ｂ−Ｐｓは１６
５０mgであり、Ｋｄは０．６２であり、３．３％のリン
を含んでいた。

【００７０】実施例５Ｓ．ニュ−モニアエ６Ｂ−ＯＭＰＣを接合したＰｎ６Ｂ
−Ｐｓ−ＯＭＰＣ Ａ．ダウエックス５０Ｘ２テトラブチルアンンモニウム
樹脂（ダウエックス５０（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ））の調製 ダウエックス５０Ｘ２（２００−４００メッシュ）Ｈ⁺
型（７２ｇ）を水にスラリ−させ、カラムに充填し、
水、６ＮＨＣｌの順で洗浄し、次いで流出液がｐＨ紙で
中性になるまで水で洗浄した。水酸化テトラブチルアン
モニウムの１０％水溶液を流出液が強アルカリになるま
でカラムに通した。最後に、流出液が再び中性になるま
で水をカラムに通過させた。

【００７１】Ｂ．Ｐｎ６Ｂ（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ） サイズが減少し、分別したＰｎ６Ｂ−Ｐｓ（６００ｍ
ｇ）（物理特性に対する表ＩＰｎ６Ｂ−Ｐｓロット１参
照）を滅菌蒸留水（６０ml）に溶解し、この溶液を全て
の固体が溶液になるまで（１．５時間）電磁的に撹拌し
た。このポリサッカライド溶液を洗浄した樹脂に載せ重
力により通過させた（４．５時間）。このカラムを水
（１０−１２ml）洗浄し、合わせた流出液を凍結乾燥し
て６４０mgの乾燥Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓテトラ−ｎ−ブチルア
ンモニウム塩、Ｐｎ６Ｂ（ｎ−Ｂｕ₄Ｎ⁺ ）を得た。

【００７２】Ｃ．Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂ Ｐｎ６Ｂ（ｎ−Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）（６４０mg）をジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）（２４ml）に溶解し、電磁的に
３０分間撹拌させて全ての固体が溶液になった。この混
合物に１，１’−カルボニルジイミダゾ−ル（４４．２
mg）を添加し、反応物を室温で撹拌した（６０分）。別
のフラスコにおいて、水（１６ml）中のブタンジアミン
ニ塩酸塩（ＢｕＡ₂ ２ＨＣｌ，１．０２２ｇ）の溶液を
１０ＮＮａＯＨの添加により塩基性にした（ｐＨ１０．
２）。この溶液を０．２μｍ滅菌フィルタ−に通過さ
せ、氷浴中で冷却した。活性化ポリサッカライドを含む
熟成したＤＭＳＯ混合物を冷却ＢｕＡ₂ ２ＨＣｌ溶液
に、ゆっくり一定の流れで加え、得られた溶液を０℃で
撹拌した（１５分）。この反応混合物を室温まで暖め、
更に１時間撹拌し、その後透析管に移して以下の条件で
透析した（４℃）：１）１５リッタ−、０．１Ｍ、ｐＨ
７．０、りん酸ナトリウム緩衝液、６時間；２）１５リ
ッタ−、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０、りん酸ナトリウム緩
衝液、１２時間；３）１５リッタ−、０．０１Ｍ、ｐＨ
７．０、りん酸ナトリウム緩衝液、９時間；４）１５リ
ッタ−、蒸留水、１７．５時間；透析管の内容物を凍結
乾燥して２２２mgのＰｎ６Ｂ−１，４−ブタンジアミン
（Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂ ）を得た。この物質約５mgのＮＭ
Ｒ（３００MHz ，Ｄ₂ Ｏ）は、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓのブタン
ジアミンメチレン及びラムノ−スメチルプロトンの共鳴
の積分を比較することにより、１００Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ繰
り返しモノマ−単位当り２２ジアミン残基を載せている
ことを示した。

【００７３】Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂ （２１０mg）をｐＨ９．０４、０．
１Ｍコルトホッフホウ酸−りん酸緩衝液（２１ml）に溶
解し、この混合物を溶液になるまで３０分間電磁的に撹
拌した。この水溶液にアセトニトリル（２．６ml) 中の
ｐ−ニトロフェニルブロモアセテ−ト（２１０mg）から
なる混合物を添加し、反応物を一晩撹拌した（２０時
間、４℃）。この溶液を透析管に移して以下の条件で透
析した（４℃）：１）１５リッタ−、滅菌蒸留水、１
２．３時間；２）１５リッタ−、滅菌蒸留水、８．２５
時間；３）１５リッタ−、滅菌蒸留水、５．５時間；こ
の内容物から１．７mlを検定（ＮＭＲ及びＨＰＳＥＣ−
ユニバ−サル口径測定あるいは分子サイズ分析）のため
に取り出し、次いで乾燥したｐＨ８のりん酸ナトリウム
緩衝塩（０．１Ｍ，ｐＨ８のりん酸ナトリウム溶液の凍
結乾燥により調製）０．４４９ｇを加えた。完全に溶解
した後（３０分）、この溶液を０．２μｍ滅菌フィルタ
−に通過させてＰｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃのｐＨ８
溶液を得た。

【００７４】Ｐｎ６Ｂ−ＯＭＰＣ 滅菌ＯＭＰＣ（４０ml，４．５mg/ml)を４個の１０ml遠
心管中での超遠心分離( ４℃，４３Ｋrpm ，２時間）に
より小球化させた。各々のペレットを３mlの滅菌フィル
タ−（０．２２μｍ）したチオ−ル化混合物（ｐＨ１
１．０９、Ｎａ₂Ｂ₄ Ｏ₇ 緩衝液（３０ml）中のＮ−ア
セチルホモシステインチオラクトン塩酸塩（１６４m
g）、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩（２
５５mg）及びジチオトレイト−ル（５３mg）からなる）
に再懸濁させた。この再懸濁ペレットをホモゲナイズし
（ダウンス）、合わせ、容器を脱気して窒素で被い、一
晩（１９時間）室温で熟成させた。この溶液を３個の超
遠心管に分け、１ＭＫＨ₂ ＰＯ₄を加え、蛋白質を小球
化した( ４℃，４３Ｋrpm ，２時間）。このペレットを
０．１Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ８緩衝液（３０ml）に
再懸濁させ、ホモゲナイズし（ダウンス）、再小球化し
た( ４℃，４３Ｋrpm ，２時間）。この滅菌蛋白質ペレ
ットを濾過したＰｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ溶液中で
の再懸濁に使用した。エルマン(Ellman)試験をすぐに行
い、ＳＨ価は３４μmol を示した。この反応混合物を脱
気して、窒素で被い、９１時間室温で熟成させた。この
蛋白質をｐＨ８．０、０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液
５ml中のＮ−エチルマレイミド（７５mg）からなる
（０．２２μｍ滅菌フィルタ−）溶液１mlの添加により
キャップ化した。この混合物を室温で４時間熟成し、そ
の後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．２２μｍ滅菌フ
ィルタ−化）３００μｌを添加し、この溶液を更に１
９．５時間熟成した。この滅菌キャップ化接合体を４個
の遠心管に分け、０．１Ｍ、ｐＨ７りん酸ナトリウム緩
衝液を加え、超遠心分離( ４℃，４３Ｋrpm ，２時間）
により小球化した。次いで滅菌ｐＨ７、０．１Ｍ Ｎａ
ＰＯ₄ 緩衝液（４２ml）中で再懸濁させ、ホモゲナイズ
（ダウンス）した。前記したような再遠心分離の後、こ
のペレットを滅菌蒸留水全量５０ml中ダウンスホモゲナ
イザ−で再懸濁させた。４℃で１７時間熟成後、接合調
製物をＴＪ−６遠心機ＴＨ４ロ−タ−で１０００rpm 、
３．５分間遠心分離して、少量の沈降物を除去した。こ
の最終生成接合浮遊物を蛋白質（ロ−リ−）、Ｐｎ６Ｂ
−ポリサッカライド（フェノ−ル／硫酸）、非接合ポリ
サッカライド（サイズ排除クロマトグラフィ−−速度ネ
フェロメトリ−）及びアミノ酸（アミノ酸分析）に対し
て検定した。その結果は以下の様であった。 Ｐｎ６Ｂ−ポリサッカライド ０．３３mg/ml 蛋白質 ２．２mg/ml Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ／ＯＭＰＣ ０．１５ フリ−Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ ＜５領域％ Ｓ−カルボキシメチルホモシステイン／リジン ７．７％ Ｓ−カルボキシメチルシステアミン／リジン １．６％

【００７５】実施例６部分的に加水分解され、精製されたＰｎ１４−Ｐｓの調
製 （１）陰イオン交換樹脂での処理：Ｐｎ１４−Ｐｓ粉末
の２．８１ｇ部分を撹拌しながら室温で約４時間１１２
４mlの蒸留水に可溶化させ、次いで４℃で一晩保存し
た。この溶液を蒸留水中約１５時間予備膨張させたＤＥ
５２（ワットマン、ジエチルアミノ−エチルセルロ−
ス）ｐＨ約５−６、６０ｇに加えた。このスラリ−をプ
ラットホ−ムシェイカ−上室温で約１５時間優しく振動
させた。その後、ベックマンＪＡ−１０ロ−タ−で５０
００rpm 、２０℃、１５分間遠心分離した。更にこの上
清を焼結ガラス漏斗（１５０ml、培地孔）に通して清涼
化し２リッタ−のサイドア−ムフラスコに集めた。 （２）超音波加水分解：ＤＥ５２処理Ｐｎ１４−Ｐｓ
（容量１１００ml、上記工程１から）を氷浴上プラスチ
ックビ−カ−中ブランソン超音波機（１．５インチプロ
−ブ、８にセット）で２分間超音波をあてて分解させ
た。粘度を測定しながらこの試料を約１５分間冷却し、
次いで更に１分間隔で超音波をあてて分解した。最終超
音波処理後には粘度の終点は１．０９６センチストロ−
クに達した。この加水分解した試料を室温にし酢酸ナト
リウム試薬（１８．０ｇ）を加えて最終濃度１％（ｗ／
ｖ）にした。 （３）血清学的プロ−ブ：試料１０ml部分につき、イソ
プロパノ−ル（ＩＰＡ）分別予備研究及び抗体指示終点
ネフェロ−ゼ検定を行ったところ、Ｐｎ１４−Ｐｓは３
５−４５％ＩＰＡの間で浮遊することを示した。 （４）第一ＩＰＡ添加：加水分解した試料（容量１０９
０ml、上記工程２から）を７０６mlＩＰＡの添加（室温
で撹拌しながらの滴下）により３９．３％ＩＰＡにし
た。この試料を１５−３０分間撹拌させ、次いで１１０
００ｘｇで３０分間遠心分離（ベックマンＪＡ−１０ロ
−タ−；８０００rpm ；２０℃）し、上清を捨てた。こ
の不毛のペレットを２５０mlオムニミックスジャ−中無
水エタノ−ルで摩砕し、次いで６０ml焼結ガラス漏斗上
で集めた。この浮遊物を直接漏斗上で無水エタノ−ル、
次いでアセトンで洗浄し、ＣａＣｌ₂ 上室温で真空乾燥
し分析用試料を調製した。 （５）第二ＩＰＡ添加及び産生物回収：３９．３％ＩＰ
Ａ上清液（容量１７１２ml、上記工程４から）を室温で
撹拌しながら７３．５mlＩＰＡ滴下により４１．８％Ｉ
ＰＡにした。この試料を熟成し、上記工程４でのように
遠心分離した。このペレットを上記工程４でのように摩
砕、採集、洗浄、乾燥した。このＰｎ１４−Ｐｓ産生物
は１３９９mgであった。 （６）透析及び凍結乾燥：上記工程５からの試料の一部
分（１３８５．６mg）を５５４ml蒸留水中室温で２−３
時間可溶化させた。この溶液（２．５mg/ml ）を透析管
（１２０００ＭＷ切断物；４５mm）に移し、蒸留水を２
回変えながら蒸留水で２７時間透析した。次いでこの透
析試料を凍結乾燥フラスコに移し、ドライアイス／メタ
ノ−ル浴で外側を凍結させ、乾燥するまで２−１／２日
間バ−チス（フリ−ズモ−ビル）凍結乾燥機で凍結乾燥
した。最終Ｐｎ１４−Ｐｓ生成物の回収率は１３２６．
８mgであり、Ｋｄは０．５６であった。 この開示から、他の中性Ｐｎ−Ｐｓサブタイプ、例えば
Ｐｎ７Ｆ−Ｐｓはここで開示した方法によって調製する
ことができ、また中性ポリサッカライドでもあるＰｎ１
４−Ｐｓに関して接合できることは当業者にとって明ら
かであろう。

【００７６】実施例７ 外膜蛋白複合体とニューモコッカル１４多糖との結合Ｐｎ１４−Ｐｓ−ＯＭＰＣ： ａ．Ｐｎ１４−Ｐｓの１，４−ブタンジアミン誘導体
（Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂)の製造：Ｐ₂ Ｏ₅ 上で３時間真空
下においたＰｎ１４−Ｐｓの４１０mgをジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）２６mlで被い、０．７５時間攪拌し
て溶解した。これにカルボニルジイミダゾール６２mgを
加え、得られた溶液を室温にて８０分間攪拌した。Ｈ₂
Ｏ ３８．５ml中に１，４−ブタンジアミンジヒドロク
ロリド（ＢｕＡ₂・２ＨＣｌ）１．０６７ｇを含む溶液
を調製し、そのpHを２．５ＮのＮａＯＨで１０．２０に
調節した。この溶液をＭｉｌｌｅｘ０．２μm ＧＶフィ
ルターを通して濾過し、氷浴中で冷却した。上記熟成Ｄ
ＭＳＯ溶液を上記冷却ＢｕＡ₂ 溶液に加え、そのまま氷
浴中でさらに１０分間攪拌した。次いで、室温にて５０
分間静置し、その後に溶液を長さ１２インチのSpectrap
or２透析チューブ２本に入れ、液面より１cm上をクリッ
プでとめて、１）pH７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液１５リットルで１６．５時間、２）pH７．０の
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１５リットルで８時
間、３）pH７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１
５リットルで８時間、４）Ｈ₂ Ｏ １５リットルで１
７．５時間透析を行った。次いで、これを凍結乾燥し、
Ｐｎ１４−Ｐｓの１，４−ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ
１４−ＢｕＡ₂ ）２１０mgを得た。試料約５mgのＮＭＲ
スペクトルは、多糖１００繰返し単位当り約３１個のブ
タンジアミン残基が”負荷”されていることを示し、こ
れはブタンジアミンメチレンおよび（Ｐｎ１４−Ｐｓ
の）Ｎ−アセチルメチルの共鳴の積分値の比較によって
特徴づけられた。 ｂ．Ｐｎ１４−Ｐｓのブロモアセチル化ブタンジアミン
誘導体（Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ）の製造：Ｐｎ
１４−ＢｕＡ₂ （２１０mg）をpH９．０の０．１Ｍホウ
酸塩−リン酸塩緩衝液３６ミリリットルで被い、２．５
時間攪拌して溶液を得た。次に、アセトニトリル４ミリ
リットル中ｐ−ニトロフェニルブロモアセテート１９５
mgを加えた。得られた混合物を４℃で２１時間攪拌し
た。次いで、これをSpectrapor２チューブ中で、１）蒸
留水１５リットルで６時間、２）蒸留水１５リットルで
１４．５時間、３）蒸留水１５リットルで６時間透析し
た。バッグの透析物から２．０ミリリットルを取って分
析用に供し、次いで乾燥したpH８．０リン酸塩緩衝塩４
９２mg（pH８．０の０．１Ｍリン酸ナトリウムを凍結乾
燥して調製）を加えた。溶液を２つの０．２μm Cornin
g フィルターで濾過し、pH８．０のＰｎ１４−ＢｕＡ₂
−ＢｒＡｃ水溶液（４３ミリリットル）を得た。 ｃ．ＯＭＰＣのＰｎ１４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ−Ｐｓへ
の結合：ＯＭＰＣ（濃度３．２mg/ ミリリットル）１５
ミリリットルを５本の１０ミリリットル遠心チューブに
入れ、Beckman ８０Ｔｉローター中、４３，０００rpm
（４３Ｋ）、４℃にて２時間遠心した。Ｎａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇
緩衝液（pH１１．０）３０ミリリットル中にＥＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）３５０mgお
よびジチオトレイトール（ＤＴＴ）６４mgを溶解してチ
オール化混合物を得た。Ｎ−アセチルホモシステインチ
オラクトン３４６mgを加え、溶液を０．２μm Corning
フィルター（カップ型）で濾過した。上記遠心からの各
ペレットを濾過したチオール化混合物３ミリリットルで
それぞれ取り出し（全量１５ミリリットル）、Dounceホ
モジナイザーに移して再び懸濁させた。チューブにはチ
オール化溶液をさらに５ミリリットル用いて順に移すこ
とにより洗浄した。この洗浄工程をさらに５ミリリット
ルのチオール化溶液をさらに５ミリリットル用いて順に
移すことにより洗浄した。この洗浄工程をさらに５ミリ
リットルのチオール化溶液を用いて繰り返した。合わせ
た洗浄液はDounceに入れてホモジナイズし、再懸濁物
（２５ミリリットル）を全量１００ミリリットル丸底フ
ラスコに移した。隔膜でシールし、Firestone バルブを
用いて空気をＮ₂ で置換した後、反応混合物を２１時間
静置した。次いで、反応混合物２５ミリリットルを３本
の遠心チューブに分け、それぞれの上に１ＭのＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ （水溶液）を入れて４３Ｋrpm および４℃にて２時
間遠心した。上澄液を除去し、ペレットをpH８．０の
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した（再懸濁
液の最終体積は全量で３０ミリリットル）。次に、第２
の超遠心（２時間、４℃、４３Ｋrpm ）を行った。上澄
液を除去した後、ペレットを上記で調製した濾過された
Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ溶液中にDounce法により
再懸濁した。この時点でのEllman検定は全部で２３マイ
クロモルのチオールを示した。Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂ −Ｂ
ｒＡｃ溶液の濾過はチオール化蛋白質の再懸濁の直前に
行うことに注意する必要がある。生じた反応（すなわち
Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃとチオール化ＯＭＰＣと
の反応）はＮ₂ 箱中で（脱気して）Ｎ₂ 下、室温にて１
１４時間静置した。次いで反応を次のようにして封止(c
ap) した（すなわちＰｎ１４−ＰｓおよびＯＭＰＣの反
応部位を不活性化した）。pH８．０の０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液５ミリリットル中Ｎ−エチルマレイミド
（ＮＥＭ）７５mgを含む溶液を加え、混合物をさらに２
２．５時間静置した。封止した反応混合物（３５ミリリ
ットル）を４本の遠心チューブに分けて遠心した（４３
Ｋ、２時間、４℃）。ペレットを４０ミリリットルＴＥ
Ｄ緩衝液（０．１Ｍトリス、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、
０．５％ＤＯＣ、pH８．５）中に再懸濁させ、室温にて
１９時間静置した。次いで、溶液を遠心した（４３Ｋ、
２時間、４℃）。ペレットをpH８の０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液４０ミリリットルに再懸濁し、その後再び
遠心した（４３Ｋ、２時間、４℃）。これらのペレット
を蒸留水４４ミリリットル中に再懸濁し、４℃にて１７
時間静置した。低速遠心（１０００rpm 、３．５分）で
小さなペレットが得られ、これを捨てた。上澄液を除去
するとバルクの結合体が４３ミリリットル得られ、これ
は次のような分析特性を有していた。 試 験 結 果 ────────────────────────────────── ａ． Ｐｓ含量 ３８７mcg/mL ｂ． 蛋白質 １３００mcg/mL Ｐｓ／蛋白質比（計算値） ０．３０ ｃ． 遊離Ｐｓ ＜５面積％ ｄ． アミノ酸分析 ＳＣＭＨＣ／リシン ９．８％ ＳＣＭＣ／リシン ３．５％

【００７７】実施例８Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ中間体の製造： （１）超音波加水分解：Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ粉末の３．０
ｇを室温で約４時間攪拌して食塩水（０．９％ＮａＣ
ｌ）１２００mLに溶解した。次いで溶液を氷溶中のプラ
スチックビーカー内でBranson Sonifier（１．５インチ
プローブ、設定８）を用いて３分間隔で合計１５分間超
音波処理した。各間隔ごとに粘度をチェックした。１５
分間の後、さらに５分間超音波処理を行って最終粘度
１．２０６センチストークスを得た。加水分解した試料
を室温に戻し、酢酸ナトリウム試薬（５８．４ｇ）を最
終濃度３％(w/v) まで加えた。 （２）血清学的プローブ：イソプロパノール（ＩＰＡ）
分別試験および抗体指示終点Nephelose 検定(antibody-
directed end-point Nephelose assay)を試料の１０mL
について行い、Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓは３５〜４５％ＩＰＡ
で沈殿することが示された。 （３）第１のＩＰＡ添加：加水分解した試料［体積＝１
１６５ml、上記工程（１）からのもの］にＩＰＡ８１０
mLを加えて（室温にて攪拌しながら滴下）４１．０％Ｉ
ＰＡとした。試料を１５〜３０分間攪拌し、次いで１
１，０００xgで３０分間遠心した(Beckman ＪＡ−１０
ローター；８，０００rpm ；２０℃）。排出ペレットを
２５０mLのOmnimix ジャー中にて無水エタノールで摩砕
し、次いで６０mL焼結ガラスファネル上に捕集した。こ
の沈殿を直接ファネル上にて無水エタノール、次いでア
セトンで洗浄し、室温にてＣａＣｌ₂ 上で減圧乾燥して
分析用に供した。 （４）第２のＩＰＡ添加および生成物の回収：上記の４
１．０％ＩＰＡ上澄液［体積＝１９２５mL、上記工程
（３）からのもの］に室温で攪拌しながらＩＰＡ８５．
０mLを滴下して４３．５％ＩＰＡとした。工程（３）と
同様にして試料を攪拌し遠心した。さらに工程（３）と
同様にしてペレットを摩砕し、捕集し、洗浄し、乾燥し
た。Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ生成物は１７９５mgであった。 （５）透析および凍結乾燥：上記工程（４）からのＰｎ
−Ｐｓ試料の一部（１７７９mg）を室温にて３〜４時間
かけて蒸留水７１２mLに溶解した。溶液（２．５mg/mL
）を透析チューブ（分画分子量１２，０００；４５m
m）に移し、４℃にて２７時間蒸留水で透析した。この
間に蒸留水は２回交換した。次いで試料を凍結乾燥フラ
スコに移し、ドライアイス：メタノール浴中でシェル凍
結し、Virtis(Freezemobile)凍結乾燥器上で２〜３日凍
結乾燥した。最終Ｐｓ生成物の回収量は１７０３mgであ
った。最終生成物はＫ_d ＝０．６０を有していた。

【００７８】実施例９外膜蛋白質複合体とＰｎ２３Ｆ−Ｐｓ中間体との結合 ａ． Dowex ５０Ｘ２（２００−４００メッシュ）テト
ラブチルアンモニウム形樹脂[Dowex５０（Ｂｕ₄ Ｎ
⁺ ）］の製造：Ｈ⁺ 形のDowex ５０Ｘ２（２００−４０
０メッシュ）７２ｇを水でスラリーとし（この過程で用
いた水はすべてパイロジェンフリーの無菌蒸留水であ
る）、カラムに充填し、順に１］Ｈ₂ Ｏ ８００mL、
２］６Ｎ ＨＣｌ４００mL、３］Ｈ₂ Ｏ ３００mL（流
出液がpH試験紙で中性になるまで）、４］１０％水酸化
テトラブチルアンモニウム水溶液（流出液がpH試験紙で
強アルカリ性になるまで）、５］Ｈ₂ Ｏ ７５０mLで洗
浄した。 ｂ． Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓテトラブチルアンモニウム形
［Ｐｎ２３Ｆ（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）］の製造：Dowex ５０Ｘ２
（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）の３４mLカラムをＨ₂ Ｏ ７０mLで洗浄
した。サイズをそろえたＰｎ２３Ｆ−Ｐｓの４５０mgを
Ｈ₂ Ｏ ５０mLで被い、０．５時間攪拌した。この溶液
をカラムに加え、重力で通過させた（約２時間）。ここ
で真空をカラムの底にかけて、さらに１時間（真空下
で）流出を続けた。カラムをＨ₂ Ｏ ２５mLで洗浄し、
合わせた流出液を凍結乾燥して、Ｐｎ２３Ｆ（Ｂｕ₄ Ｎ
⁺ ）塩０．５g を得た。これを真空デシケーター中Ｐ₂
Ｏ₅ 上で約１７時間保存した。 ｃ． Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓの１，４−ブタンジアミン誘導
体（Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂ ）の製造：上記工程ｂからの
Ｐｎ２３Ｆ（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）０．５ｇをジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）２５mLで被い、１５分間攪拌して溶解
した。これにカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）２２
mgを加え、得られた液を室温で０．５時間攪拌した。Ｈ
₂ Ｏ ３２mL中に１，４−ブタンジアミンジヒドロクロ
リド（ＢｕＡ₂ ・２ＨＣｌ）５０７mgを含む溶液を調製
し、pHを２．５Ｎ ＮａＯＨで１０．２３に調節した。
この溶液をＭｉｌｌｅｘ０．２μm ＧＶフィルターで濾
過し、氷浴中で冷却した。静置しておいた上記ＤＭＳＯ
溶液を冷ＢｕＡ₂ 溶液に加え、さらに１時間氷浴中で攪
拌した。次いでこれを室温で１時間静置した後、溶液を
１２インチのSpectrapor透析チューブ２本に入れ、液面
から上に１cmのところをクリップでとめて、１）pH７．
０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１５Ｌで１６時
間、２）pH７．０の０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
１５Ｌで１０．５時間、３）pH７．０の０．０１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液で１２．５時間、４）Ｈ₂ Ｏ １５
Ｌで１０．５時間の順に透析を行った。次いでこれを凍
結乾燥してＰｎ２３Ｆ−Ｐｓの１，４−ブタンジアミン
誘導体（Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂ ）２２０mgを得た。約
６．９mgのＮＭＲスペクトルは多糖１００繰返し単位当
り約２３．５個のブタンジアミン残基の”負荷”を示
し、これはブタンジアミンメチレンおよび（Ｐｎ２３Ｆ
の）ラムノースメチルの共鳴の積分値の比較により特徴
づけられた。 ｄ． Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓのブロモアセチル化ブタンジア
ミン誘導体（Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ）の製
造：Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂ （２１４mg）をpH９．０の
０．１Ｍホウ酸塩−リン酸塩緩衝液２３mLで被い、３０
分間攪拌して溶液を得た。次に、アセトニトリル６ｍＬ
中のｐ−ニトロフェニルブロモアセテート２３０ｍｇを
加えた。得られた混合物を４℃で２３時間攪拌した。次
いで、Spectrapor２チューブ内で、１）Ｈ₂ Ｏ １５Ｌ
で８時間、２）Ｈ₂ Ｏ １５Ｌで１２時間、３）Ｈ₂ Ｏ
１５Ｌで６時間透析した。透析後のバッグ内容物から
１．５mLを評価用にとっておき、pH８．０のリン酸塩緩
衝塩乾燥物（pH８．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液
を凍結乾燥して調製）４９０mgを加えた。溶解には約１
５分間を要し、その後０．２μm Corning フィルターで
濾過してpH８．０のＰｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ水
溶液を得た。 ｅ． ＯＭＰＣとＰｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ−Ｐ
ｓとの結合：ＯＭＰＣ（３．１mg/mL ）６０mLを１０mL
遠心チューブ６本に入れ、Beckman８０Ｔｉローター中
にて４３，０００rpm（４３Ｋ）、４℃で２時間遠心し
た。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
塩）２６０mgおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）５２
mgをＮａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇ 緩衝液３０mLに溶解してチオール化
混合物を調製し、チオラクトンを加えた後に溶液を０．
２μm Corning フィルター（カップ型）で濾過した。 上記遠心からの各ペレットを濾過したチオール化混合物
３mLを用いてそれぞれ取り出し（全量２０mL）、Dounce
ホモジナイザーに移して再懸濁した。各チューブにさら
に６mLのチオール化溶液を順に移動させてそれらを洗浄
した。この洗浄法をさらに４mLのチオール化溶液を用い
て繰り返した。合わせた洗浄物をDounceでホモジナイズ
し、再懸濁物の全量（２８mL）を１００mL丸底フラスコ
に移した。隔膜でシールし、Firestone バルブを用いて
空気をＮ₂ で置換した後、反応混合物を１９時間静置し
た。この反応混合物２８mLを３本の遠心チューブに分
け、それぞれの上に１Ｍリン酸カリウム（水溶液）を加
えて、Beckman ８０Ｔｉローター中、４３Ｋrpm および
４℃で２時間遠心した。上澄液を除去し、ペレットをpH
８．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した
（最終再懸濁物の全量は３０mL）。第２の超遠心（２時
間、４℃、４３Ｋrpm ）を次に行った。上澄液を除去し
た後、Dounce法によりペレットを濾過したＰｎ２３Ｆ−
ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ溶液（７．Ｉ．Ｃ．３ｄ．で調整し
たもの）中に再懸濁した。この時点でのEllman検定は、
得られた溶液中に全部で約２８マイクロモルのチオール
が存在することを示した。Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂ −Ｂｒ
Ａｃ溶液の濾過はチオール化蛋白の再懸濁の直前に行っ
ている点に注意されたい。生ずる反応（すなわちＰｎ２
３Ｆ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃとチオール化ＯＭＰＣとの反
応）はＮ₂ ボックス内、Ｎ₂ 下（脱気）、室温にて１１
７時間エージングした。次いで反応を以下のように封止
した（すなわちＰｎ２３Ｆ−ＰｓおよびＯＭＰＣ上の反
応部位を不活性化する）。pH８．０の０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液５mL中にＮ−エチルマレイド（ＮＥＭ）
７５mgを含む溶液を０．２２μm フィルターで濾過し、
反応物に加え、１８時間エージングした。封止した結合
体混合物の全量は３８．５mLであり、pH８．０の１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液１．５mLを加えて全量を４０mLと
した。この溶液３５mLを１０mL遠心チューブ４本に均等
に入れ、それぞれの上にpH８の０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液を加えた。これらを４３Ｋrpm 、２時間、４℃
で遠心した。上澄液を除去し、各ペレットをＴＥＤ緩衝
液（１Ｍトリス、pH８．５、０．０１ＭＥＤＴＡ、０．
５％Ｎａデオキシコレート）８mLで取り出し、Dounceホ
モジナイザーに移した。遠心チューブをさらに８mLのＴ
ＥＤ緩衝液で順に洗浄し、ペレットを再懸濁させて（全
量４０mL）、室温にて２０時間静置した。静置したもの
を１０mLチューブ４本に入れ、４３Ｋ、２時間、４℃で
（上記と同様に）遠心した。上記と同様にして、各ペレ
ットをＴＥＤ緩衝液８mLで取り出し、チューブをＴＥＤ
緩衝液８mLで順に洗浄し、再懸濁し、遠心した。これら
のペレットをpH７の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液全
量４０mLに再懸濁し、上記のように遠心した。得られた
ペレットを水全量４４mLに再懸濁し、４℃で１７時間静
置した。少量の不溶物を低速遠心（１０００rpm 、３．
５分）で除去して上澄液中に生成物を得た。得られた上
澄液が薬物のバルク結合体ワクチンである。この結合体
は次のような分析特性を有していた。 試 験 結 果 ────────────────────────────────── ａ． Ｐｓ含量 ２８４mcg/mL ｂ． 蛋白質 ２０２５mcg/mL Ｐｓ／蛋白質比（計算値） ０．１４ ｃ． 遊離Ｐｓ ＜５面積％ ｄ． アミノ酸分析 ＳＣＭＨＣ／リシン ６．７％ ＳＣＭＣ／リシン １．６％

【００７９】実施例１０GaulinホモジナイゼーションによるＰｎ−Ｐｓの製造：
粗ニューモコッカル粉末を水中１．５mg/mL 濃度で４℃
にて一晩混合することにより溶解した。より濃縮したＰ
ｎ−Ｐｓ溶液も１０mg/mL で調製した。５０mMＣａＣｌ
₂ の添加により、１０mg/mL 溶液の粘度を１．５mg/mL
溶液の粘度まで有効に低下させることができた。次い
で、溶解したＰｎ−Ｐｓを、４種類の圧力設定２００
０、５０００、１００００あるいは１５０００ＰＳＩの
うちの１つに設定されたGaulinホモジナイザーに通し
た。剪断されたＰｎ−Ｐｓを６０％イソプロパノールの
添加により捕集し、ＣａＣｌ₂ （２Ｍストックからのも
の）中５０mMとした。ペレットをオムニミキサー中１０
０％エタノールで洗浄し、濾過して沈殿したＰｎ−Ｐｓ
を回収した。Ｐｎ−Ｐｓはフィルター上にてアセトンで
洗浄し、ＣａＳＯ₄ （ドライヤライト）上で乾燥し、分
析するまで−７０℃で保存した。剪断されたＰｎ−Ｐｓ
を少量ずつ分取して約１mg/mL で再懸濁させ、分子サイ
ズおよび多分散度についてはＨＰＳＥＣ−ユニバーサル
キャリブレーション、抗原性指数についてはレート比濁
法(rate nephelometry) で分析した。 Ｐｎ−Ｐｓ 抗原性が低下 多分散度 サブタイプ し始めるＭＷ ────────────────────────────────── ６Ｂ ５００，０００ １．１９ １４ ３００，０００ １．１５ １９Ｆ ２５０，０００ １．０９ ２３Ｆ ２５０，０００ １．１５

【００８０】実施例１１マウスＴ細胞刺激： この試験は、Ｐｎ−Ｐｓ結合体ワク
チンのマウスにおけるＴ細胞依存性／免疫原性を確立す
るために行った。このモデルを採用したのは、２歳未満
の子供はＴ依存性抗原に通常よく応答するからである。
無胸腺マウスは異常な胸腺上皮を有し、それゆえＴ依存
性抗原に対するそれらの応答は、正常な同属同腹子より
も著しく低い。ワクチンを１回で希釈して多糖の投与量
０．５μg としたものを、アダルト無胸腺マウス群（ｎ
ｎ／ｎｎ）およびそれらの同属対照同腹子群（ｎｎ／
＋）に対して、０日目、７日目、２８日目に腹膜内注射
した。マウスは１週間後に採血し、それぞれの血清につ
いてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で抗体応答を調べ
た。ＲＩＡにおいて、各マウス血清をＣ¹⁴で標識したＰ
ｎ−Ｐｓと合わせた。次いで、生成した抗原抗体複合体
は飽和硫酸アンモニウムを添加して沈殿させた。処理し
た試料のそれぞれについてベータカウンターで１分間計
数した。本発明のＰｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１４
−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ
２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ、およびＰ
ｎ４−Ｐｓ結合体をこのようにして試験し、Ｎｕ／＋マ
ウスにおいて良好なＴ細胞刺激を引きおこすことがわか
った。

【００８１】実施例１２アカゲザル幼獣におけるＰｎ−Ｐｓ結合体の免疫原性：
この試験は、Ｐｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣまたはＰｎ−Ｐｓ−
ＭＩＥＰ結合体ワクチンのバルク結合体または容器充填
物の幼猿における免疫原性を確立するために行う。この
幼猿モデルはPedvaxＨＩＢ（商標）結合体ワクチンのた
めのすぐれた臨床予測資料であることが示されており
［Vella ら、Pediatrics（小児科学）、４月５日補、６
６８−６７５頁（１９９０年）］、そのためＰｎ−Ｐｓ
結合体ワクチンの評価のためのモデルとして選ばれたも
のである。投与量のワクチンを月令２箇月ないし３箇月
の幼猿に０日目および２８日目に筋肉内注射する（０．
２５mLずつ２箇所）。猿は０日目、２８日目および４２
日目に採血し、それぞれの血清についてラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）で抗体応答を調べる。ＲＩＡにおい
て、それぞれの猿血清はＣ¹⁴で標識したＰｎ−Ｐｓと合
わせる。生成した抗原抗体複合体は、次いで飽和硫酸ア
ンモニウムを加えて沈殿させる。それぞれ処理した試料
はベータカウンターで１分間計数する。ワクチンに対す
る免疫原性応答は、もし試験動物の少なくとも５０％が
２回のワクチンの投与を受けた後に少なくとも１μg 抗
体応答を有すれば満足できるものである。Ｐｎ６Ｂ−Ｐ
ｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１９
Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐ
ｎ４−Ｐｓ−ＯＭＰＣおよびＰｎ１４−Ｐｓ−ＯＭＰＣ
は、強い抗型特異性抗体応答をひき起こすことがわかっ
た。加えて、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ２３Ｆ−
Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣおよびＰ
ｎ１４−Ｐｓ−ＯＭＰＣから成る４価組成物は、４種の
血清型すべてに対して良好な抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体応答を示
した。

【００８２】実施例１３チンチラにおけるニューモコッカル結合体の保護的効
果： 各チンチラに対し、Ａｌ（ＯＨ）₃ に吸着させた０
μg 、０．２５μg 、１．０μg または４．０μg のＰ
ｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰＣを皮下もしくは筋肉内注射し
た。チンチラは０週目、２週目、４週目、６週目および
８週目に採血した。注射の８週間後にこれらの動物に対
してストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcu
s pnenmomiae) ６Ｂを攻撃させ、検耳法（otoscopy) と
鼓室測定(tympanometry)で１〜３日ごとにモニターし
た。中耳浸出液を吸引して培養し、攻撃２週間後に動物
を殺した。殺した動物について中耳の組織病理分析を行
った。結合体を受けていない動物の致死率は６０％であ
ったのに対し、最低投与量の場合でも致死率は０％であ
った。結合体を受けていない動物における化膿性中耳炎
に対しては保護はなかったのに対し、結合体を受けたも
のはすべての投与範囲にわたって６０ないし１００％の
水準で保護された。

【００８３】実施例１４２〜５歳の子供における抗ニューモコッカル免疫応答 Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓを０．５μg または５μg ずつ２回投与
した２〜５歳の子供について、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ
により抗Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ抗体の産生を調べた。抗Ｐｎ６
Ｂ−Ｐｓ抗体の著しい上昇が観察された。

【００８４】実施例１５ニューモコッカル多糖のレート比濁測定 この検定の目的は、遊離Ｐｎ−Ｐｓおよび結合体調製物
の多糖含量および抗原性指数を、レート比濁法を用いて
測定することである。レート比濁法の標準曲線の範囲
は、単位Ｐｎ−Ｐｓ質量当りの応答として種々のＰｎ−
Ｐｓについて異なり、またＰｎ−Ｐｓ抗原濃度プロフィ
ールに対する応答の直線部分はそれぞれのＰｎＰｓにつ
いて異なる。ここに例示する手法はＰｎ６Ｂ結合体につ
いてのものであり、他のＰｎ−Ｐｓ型結合体には必ずし
も適用できるわけではない。また、アルミに吸着した試
料およびそれらについての各標準物は、以下に示すよう
な０．９％ＮａＣｌではなく３％クエン酸ナトリウムで
希釈される。水性の結合体および標準物（すなわちアル
ミ上のものでないもの）は０．９％ＮａＣｌで希釈し、
さらに標準曲線の限界内にあると予想される所定濃度ま
で希釈される。 Ａ）試薬 食塩水：０．９％ＮａＣｌ水溶液 抗Ｐｎ−Ｐｓ血清：抗血清（Health Research,Inc., Al
bany,NY ）を食塩水で３０倍に希釈する。 標準物：１．０、１．５ 、２．０、２．５、３．０お
よび４．０mcg/mLのＰｎ−Ｐｓ結合体標準物を３８７μ
g/mLのストック溶液から調製する。ストック溶液の濃度
は多糖に対するフェノール硫酸検定で測定した。 試験用試料：クエン酸ナトリウムストック液においてク
エン酸ナトリウムの濃度が最終的に３％となるように調
製し、試験用試料の順に希釈して１．０、２．０および
３．０mcg/mLのＰｎ−Ｐｓ理論濃度とする。 Ｂ）操作 すべての試料および標準物をBeckman ＩＣＳレート比濁
計を用いて重複測定により検定する。標準曲線から試料
中の濃度を定める。試料濃度に希釈率を乗じ、各試料に
ついて値を平均する。上記したように、この方法で抗原
性指数が７０％より低いとわかったものは結合体形成か
ら除外し、用いられるＰｎ−Ｐｓが所望の免疫学的特性
を有するようにする。

【００８５】実施例１６ＭＩＥＰをコードするゲノムＤＮＡのクローニング フェノールで不活化したＮ．メニンギチジス(meningiti
dis)細胞（実施例１参照）を約０．１ｇ新しいチューブ
にとる。このフェノールで不活化した細胞をＴＥ緩衝液
［１０mMＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０］
５６７μL に再懸濁する。この再懸濁した細胞群に１０
％ＳＤＳを３０μL 、および２０mg／mLのプロティナー
ゼＫ(Sigma) を３μL 加えた。細胞群を混合し、３７℃
で約１時間培養した後、５Ｍ Ｎａｃｌを１００μL 加
えて十分に混合した。次いで０．７Ｍ ＮａＣｌ中の１
％臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を８
０μL 加えて十分に混合し、６５℃で１０分間培養し
た。等体積（約０．７〜０．８mL）のクロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２４：１）を加えて十分に混合
し、約１０，０００xgで約５分間遠心した。水性相（上
層）を新しいチューブに移し、有機相を廃棄した。等体
積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（２５：２４：１）を上記水性相に加えて十分に混合
し、１０，０００xgで約５分間遠心した。水性相（上
層）を新しいチューブに移し、０．６体積（約４２０μ
L ）のイソプロピルアルコールを加えて十分に混合し、
沈殿したＤＮＡを１０，０００xgで１０分間遠心した。
上澄液を廃棄し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し
た。このＤＮＡペレットを乾燥し、ＴＥ緩衝液１００μ
L に再懸濁した。これはＮ．メニンギチジス(meningiti
dis)のゲノムＤＮＡである。ＭＩＥＰ遺伝子の５’末端
およびＭＩＥＰ遺伝子の３’未満に対応する２つのＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドを合成した［Murakami,E.C. ら、
（１９８９）、Infectionand Immnnity（感染と免
疫）、５７、２３１８−２３頁］。ＭＩＥＰ遺伝子の
５’末端に特徴的なＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は ５’−ＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧ−３’ であり、ＭＩＥＰ遺伝子の３’末端に特徴的な配列は ５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴ−３’ であった。これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、１０
ナノグラムのＮ．メニンギチジス(meningitidis)のゲノ
ムＤＮＡを用いるＭＩＥＰ遺伝子のポリメラーゼ鎖伸長
反応（ＰＣＲ）増幅のためのプライマーとして用いた。
ＰＣＲ増幅工程はメーカー(Perkin Elmer)による操作手
順に従って行った。増幅したＭＩＥＰ ＤＮＡを次に制
限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ＭＩＥＰ
を完全にコードする領域を含む１．３キロベース（kb)
ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル上の電気泳動で単
離し、電気溶出(electroelution)でゲルから回収した
［Current Protocols in Molecular Biology（分子生物
学における最近の方法）、（１９８７）、Ausubel,R.
M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Smith,J.A.,Se
idman,J.G.およびStruhl,K著、Greene Publishing Asso
c.］。プラスミドベクターｐＵＣ−１９をＳｐｅＩおよ
びＥｃｏＲＩで消化した。ゲル精製したＳｐｅＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ ＭＩＥＰ ＤＮＡをＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩｐＵ
Ｃ−１９ベクターに連結し、これを用いてＥ．コリ(col
i)ＤＨ５株の形質転換を行った。ｐＵＣ−１９ベクター
と１．３kbp ＭＩＥＰ ＤＮＡを含む形質転換体は制限
酵素地図により同定し、ＭＩＥＰ ＤＮＡの配列決定に
よりその同一性を保証した。

【００８６】実施例１７ｐＣ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔベクター
の構成 Ｇａｌ １０プロモーターを、Ｓａｕ３Ａ及びHind III
での切断後に得られた０．５キロ塩素対(kbp) をゲル精
製することによってプラスミドＹＥｐ５２［Broach等、
（１９８３）遺伝子発現の実験操作(Experimental Mani
pulation of Gene Expression,イノウエ(Inouye),M(Ed)
Academic Press ８３〜１１７ページ］から分離した。
ＡＤＨ１ターミネーターを、Hind III及びＳｐｅＩでの
切断によって得られた０．３５kbp 断片をゲル精製する
ことによってベクターｐＧＡＰ．ｔＡＤＨ２［Kniskern
等、（１９８６）、遺伝子、第４６巻、１３５〜１４１
ページ］から分離した。２つの断片を、親ベクターｐＧ
ａｌ １０−ｔＡＤＨ１を造るためにＢａｍＨＩ及びＳ
ｐｈＩで切断されたゲル精製ｐＶＣ１８ΔHind IIIベク
ター（Hind IIIでｐＵＣ１８を切断し、Ｅ．coli ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ断片でブラントエンドにし
そしてＴ４ＤＮＡリガーゼで結合することによって、ヒ
ンドIII サイトを除去した）にＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合した。これは、Ｇａｌ １０ｐ．ＡＤＨ１ｔ接合部に
唯一のHind IIIクローニングサイトを持っている。

【００８７】そのｐＧａｌ １０．ｔＡＤＨ１の唯一の
Hind IIIクローニングサイトを、Hind IIIでｐＧａｌ
１０．ｔＡＤＨ１を切断し、そのカットＤＮＡをゲル精
製し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して次のHind I
II−ＢａｍＨＩリンカーに結合することによって唯一の
ＢａｍＨＩクローニングサイトに変えた。 ５’−ＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’ ３’−ＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡ−５’ 得られたプラスミドｐＧａｌ １０（Ｂ）ｔＡＤＨ１は
Hind IIIサイトが除去され、唯一のＢａｍＨＩクローニ
ングサイトを生じた。

【００８８】そのＧａｌ １０ｐ．ｔＡＤＨ１断片を、
ＳｍａＩ及びＳｐｈＩでの切断によってｐＧａｌ １０
（Ｂ）ｔＡＤＨ１から分離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
でブラントエンドにし、そしてゲル精製した。酵母シャ
トルベクターｐＣ１／１［Brake 等、（１９８４）、Pr
oc.Nat'1.Acad.Sci.USA,第８１巻、４６４２〜４６４６
ページ］をＳｐｈＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
でブラントエンドにし、そして精製した。この断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼでベクターに結合した。次に、この結
合反応混合物を使用してＥ．coli ＨＢ１０１細胞をア
ンピシリン耐性に形質転換し、形質転換体を、³²ｐでラ
ベルしたHind III−ＢａｍＨＩリンカーの一本鎖へのハ
イブリット形成によってスクリーニングした。この新し
いベクターの構成ｐＣ１／１、Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）Ａ
ＤＨ１ｔはHind III及びＢａｍＨＩでの切断によって確
認された。

【００８９】実施例１８ＭＩＥＰ＋リーダーＤＮＡ配列を有する酵母ＭＩＥＰ発
現ベクターの構成 ＭＩＥＰの完全なコード域を含むＤＮＡ断片を、Ｓｐｅ
Ｉ及びＥｃｏＲＩでのｐＵＣ１９．ＭＩＥＰ＃７の切断
によって生成し、そのＭＩＥＰ ＤＮＡをゲル精製し、
そしてＴ４ＤＮＡでブラントエンドにした。酵母内発現
ベクターｐＣ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔ
をＢａｍＨＩで切断し、子ウシ腸アルカリホスファター
ゼで脱リン酸し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼでブラ
ントエンドにした。そのＤＮＡを、末切断ベクターを除
去するためにゲル精製した。

【００９０】ＭＩＥＰの１．１kbp ブラントエンド断片
をブラントエンドｐＣ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）Ａ
ＤＨ１ｔベクターに結合し、その結合反応混合物を用い
てコンピテントなＥ．coli ＤＨ５細胞アンピシリン耐
性に形質転換した。形質転換体を³²ｐでラベルしたＤＮ
Ａオリゴヌクレオチド（５’--- ＡＡＧＣＴＣＧＧＡＴ
ＣＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧ--- ３’）へのハイブリッ
ド形成によってスクリーニングした。このオリゴヌクレ
オチドはＭＩＥＰベクター結合部に重なる配列と相同す
るようにデザインされている。ＤＮＡの調製物をハイブ
リッド形成が陽性の形質転換体から作り、ＫｐｎＩ及び
ＳａｌＩで切断してＭＩＥＰ断片がＧａｌ １０プロモ
ーターから、発現のための正しい配向にあることを確認
した。さらに、Ｇａｌ １０プロモーターからＭＩＥＰ
コード域へのジデオキシ配列決定によってＤＮＡ構成の
確証を得た。

【００９１】形質転換体によるＭＩＥＰの発現をウエス
タンブロットによって検出した。形質転換体において産
生された組換え型のＭＩＥＰは、ポリアクリルアミドゲ
ル上をＯＭＰＣベシクルから精製されたＭＩＥＰと共に
移動した、そしてＭＩＥＰに対して特異的な抗体と免疫
学的に反応性であった。

【００９２】実施例１９５’−修飾ＭＩＥＰ ＤＮＡ配列を有する酵母ＭＩＥＰ
発現ベクターの構成 Hind IIIサイト、保存酵母５’非翻訳リーダー（ＮＴ
Ｌ）、メチオニンスタートコドン（ＡＴＧ）、成熟ＭＩ
ＥＰの最初の８９個のコドン（位置＋２０でＡｓｐによ
って始まる）及びＫｐｎＩサイト（位置＋８９）を含む
ＤＮＡオリゴヌクレオチドをポリメラーゼチェインリア
クション（ＰＣＲ）を利用して生成した。このＰＣＲは
プラスミドｐＵＣ１９ＭＩＥＰ４２＃７を鋳型としてか
つ次のオリゴマーをプライマーとして用いて、製造業者
(Perkin Elmer Cetus)によって説明されたように行なわ
れた。 ５’ＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＡＣＧ ＧＴＡＣＡＡＴＴ３’、及び ５’ＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＴＴＣＡＡＧ３’．

【００９３】ＭＩＥＰクローンの５’域を除去するため
に、プラスミドｐＵＣ１９ＭＩＥＰ４２＃７をＫｐｎＩ
及びHind IIIで切断し、３．４kbp ベクター断片をアガ
ロースゲル精製した。２８０bpＰＣＲ断片をＫｐｎＩ及
びHind IIIで切断し、アガロースゲル精製し、そして
３．４kbp ベクター断片と結合した。Ｅ．coli ＨＢ１
０１（ＢＲＬ）の形質転換体をＤＮＡオリゴヌクレオチ
ドハイブリッド形成によってスクリーニングし、陽性の
形質転換体からのＤＮＡを制限酵素切断によって分析し
た。変異がＰＣＲ工程の際に導入されていないことを確
かめるために、陽性形質転換体の２８０bpのＰＣＲで生
成されたＤＮＡを配列決定した。得られたプラスミド
は、酵母ＮＴＬ、ＡＴＧコドン、及びＡｓｐコドン（ア
ミノ酸＋２０）で始まるＭＩＥＰの全オープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）からなるHindIII−ＥｃｏＲＩ
挿入断片を含む。

【００９４】酵母ＭＩＥＰ発現ベクターは次のように構
成された。ｐＧＡＬ１０／ｐＣ１／１及びｐＧＡＰ／ｐ
Ｃ１／１ベクター［Vlasuk,G.P. 等、（１９８９）J.B.
C.,第２６４巻、１２，１０６〜１２，１１２頁］をＢ
ａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断
片でフラッシュエンドにし、そして子ウシ腸アルカリホ
スファターゼで脱リン酸した。これらの直鎖ベクター
を、処理したクレノウ及びゲル精製した上記Hind III−
ＥｃｏＲＩ断片（ｐＧａｌ １０／ｐＣ１／１−ＭＩＥ
Ｐ及びｐＧＡＰ／ｐＣ１／１−ＭＩＥＰを形成する酵母
ＮＴＬ、ＡＴＧ及びＭＩＥＰのＯＲＦを含む）と結合し
た。

【００９５】サッカロミセス セレビシアエ(Sacckarom
yces cerevisiae)株Ｕ９（ｇａｌ１０ｐｇａｌ ４−）
をプラスミドｐＧａｌ １０／ｐＣ１／１で形質転換し
た。組換え型クローンを分離し、ＭＩＥＰの発現につい
て試験した。クローンを、３７℃で約６．０のＯ．Ｄ．
６６０まで２％グルコース（w/v)を含む合成培地中で振
とうしながら成育した。次に、ガラクトースを２％（w/
v)に加えてＧａｌ１０プロモーターからのＭＩＥＰ発現
を誘発した。細胞を、約９．０のＯ．Ｄ．６００までの
ガラクトース誘発に次いでさらに４５時間成育した。そ
の後、細胞を遠心によって収集した。細胞ペレットを蒸
留水で洗浄し、凍結した。

【００９６】組換え型ＭＩＥＰのウエスタンブロット 酵母がＭＩＥＰを発現しているか否か調べるために、ウ
エスタンブロット分析を行った。１２パーセント、１m
m、１０〜１５ウェルNovex Laemmli ゲルを使用した。
酵母細胞を、水中でガラスビーズを用いて破砕した（ナ
トリウム、ドデシルサルフェート（ＳＤＳ）を破砕工程
に２％で使用することができる）。細胞破片を、１分間
１０，０００xgで遠心することによって除去した。

【００９７】上清を、ＭＩＥＰのポリアクリルアミドゲ
ル精製について説明したように、サンプルランニングバ
ッファと混合した。サンプルを、３５mAで、ＯＭＰＣを
参照対照として使用して、ブロモフェノールブルーダイ
マーカーがゲルを流れ出るまで流した。タンパク質を、
ＮＯＶＥＸ転写装置を使用して、０．４５μポアサイズ
ニトロセルロース紙上に転写した。転写後、ニトロセル
ロース紙を、リン酸塩で緩衝した塩類液中５％ウシ血清
アルブミンで１時間ブロックし、その後、ラビット抗−
ＭＩＥＰ抗血清（標準手順を使用するゲル精製ＭＩＥＰ
での免疫化によって生成された）の１：１０００希釈液
の１５mlを加えた。室温で一晩中インキュベートした
後、アルカリホスファターゼ複合ヤギ抗ラビットＩｇＧ
の１：１０００希釈液の１５mlを加えた。２時間インキ
ュベートした後、ＦＡＳＴ ＲＥＤ ＴＲＳＡＬＴ(Sig
ma) 及びナフトール−ＡＳ−ＭＸホスフェート(Sigma)
を用いてブロットを顕出させた。

【００９８】実施例２０組換え型ＭＩＥＰの微生物発現 １．３キロ塩基対ＭＩＥＰ遺伝子挿入断片を含むプラス
ミドｐＵＣ１９−ＭＩＥＰを、制限エンドヌクレアーゼ
ＳｐｅＩ and ＥｃｏＲＩで切断した。当業界において
既知の標準的な方法を用いて１．１kbp 断片を分離し、
アガロースゲルにおいて精製した。プラスミドｐＴＡＣ
ＳＤ（２つのシストロンＴＡＣプロモーター及び唯一の
ＥｃｏＲＩサイトを含んでいる）をＥｃｏＲＩで切断し
た。製造業者の指示に従ってＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(B
oehringer Mannheim) を使用して、１．３kbp ＭＩＥＰ
ＤＮＡ及びｐＴＡＣＳＤベクターの両方にブラントエ
ンドを形成した。ブラントエンドにした１．３kbp ＭＩ
ＥＰ ＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ(Boehringer Mannheim) を用いてブラントエンド
にしたベクターに結合した。結合されたＤＮＡを使用し
て、製造業者の指示に従ってＥ．coli株ＤＨ５ａＩＱＭ
ＡＸ（ＢＲＬ）を形質転換した。形質転換細胞を、２５
μg カナマイシン／ml及び５０μg ペニシリン／mlを含
むアガー皿の上に塗布し、３７℃で約１５時間インキュ
ベートした。ＭＩＥＰと相同する配列を有するＤＮＡオ
リゴヌクレオチドを³²ｐでラベルし、そして標準的なＤ
ＮＡハイブリッド形成技術を用いて形質転換体の皿から
溶解した変性コロニーを含むニトロセルロースフィルタ
ーをスクリーニングするために使用した。ハイブリッド
形成によって陽性であったコロニーについて、制限エン
ドヌクレアーゼを用いて遺伝子地図上で位置を決めてＭ
ＩＥＰ遺伝子の配向を決定した。

【００９９】形質転換体によるＭＩＥＰの発現はウエス
タンブロット分析によって検出された。形質転換体にお
いて産出された組換え型ＭＩＥＰはポリアクリルアミド
ゲル上をＯＭＰＣベシクルから精製されたＭＩＥＰと共
に移動した、そしてＭＩＥＰに対して特異的な抗体と免
疫学的に反応性であった。

【０１００】実施例２１Ｎ．メニンギチジス(meningitidis)ＭＩＥＰへのＰｎ−
Ｐｓの結合 化学的結合が、米国特許第４，８８２，３１７に開示さ
れている方法に従って行なわれた。０．１Ｍホウ酸塩バ
ッファ（pH１１．５）３ml中のＭＩＥＰの１０mgをエチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ，Sigma
Chemicals)の１０mg及びジチオトレイトール(Sigma Che
micals) の４mgと混合する。タンパク質溶液をＮ₂で十
分にフラッシュする。Ｎ−アセチルホモシステインチオ
ラクトン(Aldrich Chemicals) をＭＩＥＰ溶液に加え、
混合物を室温で１６時間インキュベートする。次に、そ
れを、窒素下で４mMＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸塩バ
ッファ（pH９．５）の２リットルに対して２４時間室温
で２回透析する。次に、チオール化タンパク質をエルマ
ン(Ellman's)試薬(Sigma Chemicals) によってチオール
含量についてアッセイし、タンパク質濃度をブラドフォ
ード(Bradford)試薬(Pierce Chemicals)によって測定す
る。Ｐｎ−ＰｓへのＭＩＥＰの結合のために、１．５倍
過剰(wt ／wt) のブロモアセチル化Ｐｎ−ＰｓをＭＩＥ
Ｐ溶液に加え、pHを１ＮＮａＯＨで９〜９．５に調節す
る。反応時間の終りにＮ−アセチルシステアミン(Chemi
cal Dynamics) の２５μl をその混合物に加え、窒素下
室温で１８時間放置する。結合体溶液を１Ｎ ＨＣｌで
pH３〜４の間まで酸性にし、１０，０００xgで１０分間
遠心を行う。上清流体の１mlを、ＦＰＬＣSuperose６Ｂ
（１．６×５０cm、Pharmacia ）のカラムに直接かけ
て、結合体をＰＢＳで溶出する。ポリサッカライド−タ
ンパク質結合体（Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ）を含む空隙率
ピークをプールする。次に、結合体溶液を滅菌のために
０．２２μm フィルターを通して濾過する。

【０１０１】実施例２２Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合体の免疫原性の証明 免疫化：雄Bal ｂ／ｃマウス(Charles River,Wilmingto
n,MA) を、前もって形成したミョウバン０．５ml中の
２．５μg Ｐｎ−Ｐｓを使用してＭＩＥＰへ共有結合さ
れたＰｎ−Ｐｓで腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫する。対照
マウスを、Ｐｎ−Ｐｓ−ＣＲＭ［Anderson, Ｍ．Ｅ．
等、（１９８５）、Ｊ．Pediatrics、第１０７巻、３４
６〜３５１ページ］（２．５μg Ｐｎ−Ｐｓ／６．２５
μg ＣＲＭ；ヒト用量の１／４）、Ｐｎ−Ｐｓ−ＤＴ
（２．５μg Ｐｎ−Ｐｓ／１．８μg ＤＴ；一定量のＰ
ｎ−Ｐｓを複数回使用するようなヒト用量の１／１
０）、及びＰｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ（２．５μg Ｐｎ−Ｐ
ｓ／３５μg ＯＭＰＣ；ヒト用量の１／４）として与え
られた当量のＰｎ−Ｐｓで免疫する。

【０１０２】Infant Rhesus サル（６〜１３．５週令）
を、ミョウバンに吸着されたＰｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合
体で免疫する。各々のサルは０．５mlの全用量について
０．２５mlの結合体を二つの別の場所の注射で受ける。
サルを、０、２８、及び３０日に免疫して、血液サンプ
ルを２〜４週間毎に取る。抗体応答を、免疫グロブリン
応答のクラスとサブクラスを区別するＥＬＩＳＡによっ
て測定する。総抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体を定量するＲＩＡも使
用してサル応答を評価する。

【０１０３】Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合体は、ＩｇＧ抗
Ｐｎ−Ｐｓ抗体からなるマウスの免疫応答及び記憶応答
を発生させることができる。これは、測定可能な抗Ｐｎ
−Ｐｓ抗体を顕在化させないＰｎ−Ｐｓ−ＣＲＭ及びＰ
ｎ−Ｐｓ−ＤＴと対照的である。このように、ＭＩＥＰ
はＰｎ−Ｐｓのための免疫学的キャリヤータンパク質と
して機能し、Ｐｎ−Ｐｓ抗原へ共有結合した場合、抗Ｐ
ｎ−Ｐｓ抗体応答を発生させることができる。従って、
精製ＭＩＥＰは微生物ポリサッカライド結合体ワクチン
の構成において異種ＯＭＰＣを置換する効果的な免疫学
的キャリヤータンパク質である。

【０１０４】実施例２３Ｐｎ−Ｐｓ調製物中のＣ−ポリサッカライド含有量の定
量測定 ＮＭＲ、酵素又はクロマトグラフによる方法に基づいて
いくつかのシステムがＣ−ポリサッカライドの定量のた
めに開発されている。この場合においては、加水分解さ
れたＰｎ−Ｐｓのサンプルからの塩素（Ｃ−Ｐｓの成
分）のクロマトグラフ分離を利用し、これらの他の方法
と比較した。塩素を下位伝導度検出(suppressed conduc
tivity detection) と組合せたカチオン交換カラムにお
いて分離した。Ｐｎ−Ｐｓのサンプルを、４５〜６５℃
で２時間３６％フッ化水素酸で処理した後、１００℃で
１６時間２Ｍトリフルオロ酢酸で処理することによって
完全に加水分解する。加水分解に次いで、２００〜３０
０μg のサンプルをDionex BioＬＣクロマトグラフィー
システムに注入した。このシステムはOmnipac ＰＣＸ−
５００分析及びガードカラム、Ｉｏｎ Ｐａｃ ＣＴＣ
−１カチオントラップカラム、ＣＭＭＳ−２ミクロメン
ブランサプレッサー（５０mMテトラブチルアンモニウム
ハイドロオキサイド（１０ml／min ）で再生された）、
及び１μジーメン(Siemen)の感度にセットされた伝導度
検出計を持っている。５％２００mMＨＣｌ、５％２０％
アセトニトリル、８５％Milli Ｑ water（逆浸透水）、
５％２０mMジアミノプロピオン酸を平等に使用してサン
プルを溶出した。塩素は、約１０分後にシャープなピー
クとして溶出した。

【０１０５】精製Ｃ−Ｐｓ（Statens Serum Institutか
ら得られた）を、この方法を使用して塩素含有量につい
て分析し、５．４重量％塩素の値を得た。この値はＣ−
Ｐｓの塩素含有量の公表された報告と一致している。こ
のファクターを使用して、ＨＰＬＣによって得られた塩
素のナノモル量を質量値に換えることによってＰｎ−Ｐ
ｓ調製物の種々なサンプル中のＣ−Ｐｓ濃度を計算し
た。重量で５．４％塩素の変換を利用して、Ｃ−Ｐｓの
質量を重量で計算した。３％を越えるＣ−Ｐｓ濃度を有
するサンプルは結合のために許容できないので排除し
た。次の表はＮＭＲ及び酵素による方法とこの方法の相
互関係を示し、そして純度が変化するＰｎ−Ｐｓ調製物
の典型的なＣ−Ｐｓ汚染水準を示す。 サンプル ＮＭＲ 酵素 ＨＰＬＣ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ ２０％ Ｎ．Ｄ． １８．４％ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ １．６％ ０．３−１．０％ １．２％ Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ Ｎ．Ｄ． ２．８％ ３．７％ Ｐｎ１４−Ｐｓ ２．９％ ２．４％ ３．２％ Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ ２．７％ ２．６％ ２．６％

【０１０６】実施例２４部分的に加水分解された精製Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓの調製 （１）音波加水分解：Ｐｎ１８Ｃ Ｐｓ粉末の３．０ｇ
分を、室温で約３〜４時攪拌しながら１２００ml塩類液
（０．９％ＮａＣｌ）中で可溶性にした後、カバーをし
て、一晩中４℃で保存した。次に、この溶液を、２０分
（５分間バーストにおいて）の間隔で全部で４０分まで
Branson Sonifier（１／２インチプローブ、設定８）を
用いて氷浴中のプラスチックビーカーの中で音波処理し
た。各間隔の後に、粘度を調べた。４０分間後に、さら
に１０分間の音波処理を行い、１．２１８センチストー
クスの粘度終点を得た。加水分解されたサンプル（体積
１１８８ml）を室温にし、酢酸ナトリウム試薬（５９．
２ｇ）を３％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで加えた。

【０１０７】（２）血清プローブ：イソプロパノール
（ＩＰＡ）分別プローブ及び抗体指示終点比濁(Nephelo
se) アッセイ（サンプルの１０ml分について行った）
は、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓが４０〜５０％の間のＩＰＡで沈
澱することを示した。

【０１０８】（３）１回目ＩＰＡ添加：加水分解された
サンプル［体積＝１２００ml（上記工程１からのも
の）］を、８９４mlＩＰＡの添加（室温で攪拌しながら
一滴づつ加えた）によって４２．７％ＩＰＡにした。サ
ンプルを１５〜３０分間攪拌した後、３０分間１１，０
００xgで遠心した（Beckman ＪＡ−１０ローター；８，
０００rpm ；２０℃）。廃物のペレットを２５０ml Omn
imixジャーの中で無水ＥｔＯＨと磨砕し、次に６０ml焼
結ガラスロウ斗に集めた。沈澱物を、ロウ斗上で直接無
水ＥｔＯＨ、次にアセトンで洗浄し、分析の用意に真
空、ＣａＳＯ₄ (Drierite)上、室温で乾燥した。

【０１０９】（４）２回目ＩＰＡ添加及び中間生成物回
収：４２．７％ＩＰＡ上澄み流体［体積＝２０１６ml
（上記工程３から）］を、室温で攪拌しながら９２．０
mlＩＰＡを一滴づつ加えることによって４５．２％にし
た。サンプルを熟成し、上記工程３と同様な遠心を行っ
た。上記工程３と同様に磨砕し、集め、洗浄しそして乾
燥した。Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ中間体生成物の重量は１．６
０９mgであった。

【０１１０】（５）透析及び凍結乾燥：上記工程４から
のサンプルの一部分（１６１２．５mg）を、室温で約２
時間６４５mlの蒸留水中で可溶性にした。この溶液
（２．５mg／ml）を、透析チューブ（１２，０００ＭＷ
カットオフ；４５mm）に移し、蒸留水に対して４℃で３
０時間透析した、このとき蒸留水を２回別のものに取り
替えた。次に、サンプルを凍結乾燥フラスコへ移し、ド
ライアイス：メタノール浴中でシェル凍結し、そしてVi
rtis(Freezemobile)凍結乾燥機において２〜３日間凍結
乾燥した。最終Ｐｓ生成物の回収は１４８７mgであっ
た。

【０１１１】実施例２５ Ｓ．ニューモニアエ(Pneumoniae)１８Ｃ−ＯＭＰＣ結合
体、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ Ａ．Dowex ５０×２（２００〜４００メッシュ）テトラ
ブチルアンモニウム型樹脂［Dowex ５０（Ｂｕ₄ Ｎ
⁺ ）］の調製：Dowex ５０×２（２００〜４００メッシ
ュ）Ｈ⁺ 型（５００ｇ）をＨ₂ Ｏ中でスラリーにし、カ
ラムに充填し、１）６００mlの水；２）１０００mlの６
Ｎ ＨＣｌ；３）４００mlのＨ₂ Ｏ（流出液がpH紙に対
して中性になるまで）；４）７２ｇの１０％水性テトラ
ブチルアンモニウムハイドロオキサイド溶液（流出液が
pH紙に対して強アルカリになるまで）；５）１０００ml
のＨ₂ Ｏ（中性まで）の順序で洗浄した。

【０１１２】Ｂ．Ｓ．ニューモニアエタイプ１８Ｃポリ
サッカライドテトラアンモニウム型［Ｐｎ１８Ｃ（Ｂｕ
₄ Ｎ⁺ ）］の調製：Dowex ５０×２（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）の６
０mlカラムを２５０mlのＨ₂ Ｏで洗浄した。Ｐｎ１８Ｃ
−ポリサッカライド（還元ｍ．ｗ．（６５０mg））を６
５mlのＨ₂Ｏでカバーし、１時間攪拌した（その時点で
すべてが溶液状であるように見えた）。この溶液をカラ
ムにかけて重力によって浸透させた（２時間、次に真空
下で１時間）。カラムを１５０mlのＨ₂ Ｏで洗浄し、一
緒に合せた溶出液を凍結乾燥して６５５mgの１８Ｃ（Ｂ
ｕ₄ Ｎ⁺ ）塩を得た。２５mgをＮＭＲ分析及び保留材料
用に取り出した。

【０１１３】Ｃ．１８Ｃの１，４−ブタンジアミン誘導
体（１８Ｃ−ＢｕＡ₂ ）の調製：１８Ｃ（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）
（６３０mg）を１４３mlのＤＭＳＯ（ジメチルスルフォ
キシド）でカバーし、３．２５時間攪拌した。この時点
ですべての固形物が溶解された、そして１mlを水含有量
についてのカールフィッシャー滴定用に取り出した。Ｈ
₂ Ｏ／mlの値は２８．２マイクロモルであることが分っ
た（全部で４ミリモル）。この溶液に１６５．１mgのカ
ルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を加え、得られた溶
液を室温で２．０時間攪拌した。４０mlのＨ₂Ｏ中に
１．２６０ｇの１，４−ブタンジアミンジヒドロクロリ
ド（ＢｕＡ₂ ・２ＨＣｌ）を含む溶液を調製し、そのpH
を２．５Ｎ ＮａＯＨで１０．２０に調節した。この溶
液を氷浴中で冷却した。熟成ＤＭＳＯ溶液を冷ＢｕＡ₂
溶液に徐々に加え、氷浴中でさらに１０分間攪拌した。
次に、それを室温で５０分間攪拌した後、その溶液をＳ
ＰＥＣＴＲＡＰＯＲ２透析チューブに充填し、液の上部
から１／２”を切り取り、そして次のように透析した：
１）１３．０時間pH７．０ ０．１Ｍ ＮａＰＯ₄ バッ
ファの１５リットルに対して；２）１１時間pH７．０
０．０１Ｍ ＮａＰＯ₄ バッファの１５リットルに対し
て；３）１０．８時間pH７．０ ０．０１Ｍ ＮａＰＯ
₄ バッファの１５リットルに対して；４）９．５時間Ｈ
₂ Ｏの１５リットルに対して。この時点で体積は１９０
mlであった。７．５mlアリコートを取り出し、ＮＭＲア
ッセイ用に別に凍結乾燥した。残りの１８２．５mlを、
１８Ｃの１，４−ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ１８Ｃ−
ＢｕＡ₂ ）の４１６mgに凍結乾燥した。約５mgのＮＭＲ
スペクトルは、ブタンジアミン内部メチレン及びラムノ
ースメチル（１８Ｃの）共鳴の積分を比較することによ
って明確にされたポリサッカライドの１００くり返し単
量体単位当り１０ブタンジアミン残基の“負荷(loadin
g) ”を示した。

【０１１４】Ｄ．１８Ｃのブロモアセチル化ブタンジア
ミン誘導体（Ｐｎ１８Ｃ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ）の調
製：１８Ｃ−ＢｕＡ₂ （４１６mg）を、０．１Ｍ pH
９．０４バッファ(Kolthoffホウ酸塩−リン酸塩）の３
６mlでカバーし、攪拌して溶液を作った。次に、４．４
８mlのアセトニトリル中の２５６mgｐ−ニトロフェニル
ブロモアセテートを加えた。得られた混合物を４℃で２
０時間攪拌した。それをＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ２チュー
ブにおいて次のように透析した：１）６時間１５リット
ルＨ₂ Ｏに対して；２）６時間１５リットルＨ₂ Ｏに対
して；３）６時間１５リットルＨ₂ Ｏに対して。この時
点で６０mlの体積があり、それから１．７mlをアッセイ
（ＮＭＲ，Ouchterlony 及びViscotek) のために取り出
した後、２．４２ｇの乾燥pH８リン酸塩バッファ塩
（０．１Ｍ pH８ ＮａＰＯ₄ 溶液を凍結乾燥すること
によって調製した）を加えた。溶解した後、それを０．
２ミクロンＣＯＲＮＩＮＧフィルターを通して濾過し
て、１８Ｃ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃの水性pH８溶液を得
た。濾過はゆっくりであり、４カップフィルターを必要
とした。

【０１１５】Ｅ．Ｐｎ１８Ｃ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃへの
ＯＭＰＣ（Ｎ．メニンギチジス）の結合：外膜タンパク
質複合体（Ｎ．メニンギチジス、ＯＭＰＣ３．２mg／m
l、８０ml）を４つの２５ml遠心チューブに充填し、４
℃で２時間６０Ｔｉローターにおいて４３，０００rpm
（４３Ｋ）で遠心した。チオール化混合物を、４０mlの
pH１１．０９ Ｎａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇ バッファに６８０mgのＥ
ＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）及び
１２０mgのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を溶解するこ
とによって調製した。３２０mgのＮ−アセチルホモシス
テインチオラクトンを加え、次にこの溶液を０．２μコ
ーニングフィルター（カップタイプ）を通して濾過し
た。上記遠心からのペレットを濾過されたチオール化混
合物（全部で２０ml）の５mlで取り出し、ＤＯＵＮＣＥ
ホモジナイザーへ移し、再懸濁させた。チューブを、チ
オール化溶液の別の２／１０mlを連続的に移すことによ
ってすすいだ。一緒に合せた溶液をＤＯＵＮＣＥ中でホ
モジナイズし、全再懸濁物質（４０ml）を１００ml丸底
フラスコへ移した。ガラス器具をチオール化溶液の別の
２０mlですすぎ、反応フラスコに加えた。フラスコを隔
膜でシールしそしてＦＩＲＥＳＴＯＮＥバルブを用いて
空気をＮ₂ で置換した後、反応混合物を１８．５時間熟
成した。次に、６０mlを４つの遠心チューブに分け、そ
の各々に１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄ （水性）をのせて、４３
Ｋ、４℃で２時間遠心した。上清を除き、ペレットを
０．１Ｍ ＮａＰＯ₄pH８バッファ中に再懸濁した（全
量４０mlが最終再懸濁液体積であった）。この溶液を２
つの２５ml遠心チューブ（ポリカーボネート）へ等しく
移し、ガラス器具（ＤＯＵＮＣＥ等）を約１０mlのpH８
リン酸塩バッファですすぎ、遠心チューブの仕上げをす
るために使用した。次に、２回目の超遠心（２時間、４
℃、４３Ｋ）を行った。ペレットを３０mlのpH８、０．
１ＭＰＯ₄ バッファ中に再懸濁した。Ellmanアッセイは
全部で２４マイクロモルのＳＨ又は約１００ナノモル／
mgのＯＭＰＣを示した。チオール化タンパク質を１００
ml丸底フラスコへ移し、それに濾過された１８Ｃ−Ｂｕ
Ａ₂ −ＢｒＡｃ溶液を加えた。得られた反応物（すなわ
ち、チオール化ＯＭＰＣを有する１８Ｃ−ＢｕＡ₂ −Ｂ
ｒＡｃ）を室温で８９時間Ｎ₂ ボックス中のＮ₂ 下で
（ガス抜きしながら）熟成した。

【０１１６】反応物を次のように仕上げた：５mlのpH
８、０．１ＭＮａＰＯ₄ バッファ中に７５mgＮ−エチル
マレイミド（ＮＥＭ）を含む溶液を０．２２ミクロンフ
ィルターを通して濾過し、上記反応混合物に２mlを加え
て４時間熟成した。２．５mlの０．１Ｍ pH８ ＰＯ₄
バッファ中のＮ−アセチルシステアミンの０．５mlを
０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、この溶液
の１．０mlを反応物に加えて２２．５時間熟成した。

【０１１７】完成された生成物を４つの２５ml遠心チュ
ーブに等しく充填し、全部で８mlのpH８ ０．１Ｍ Ｐ
Ｏ₄ バッファをのせて、４３Ｋ、４℃で２時間遠心し
た。上清を除去した後、ペレットをＤＯＵＮＣＥホモジ
ナイザーにおいて全部で４０mlのＴＥＤバッファ中に再
懸濁し、ガラス器具をＴＥＤバッファの別の１０mlです
すぎ、その溶液を２つの２５mlチューブに移した。これ
らのチューブを室温で１５．２５時間保存した後、４３
Ｋ rpm、２４℃で２時間遠心した。得られたペレットを
ＤＯＵＮＣＥホモジナイザーにおいて全部で３０mlのＴ
ＥＤバッファ中に再懸濁し、２つの２５ml遠心チューブ
に移し、ガラス器具をＴＥＤバッファの別の２０mlです
すぎ、そして４３Ｋ、４℃で２時間再遠心した。ペレッ
トを５０mlのpH７リン酸塩バッファ中に再懸濁し、３回
目の遠心に４３Ｋ、４℃で２時間かけた。ペレットを８
２mlの水に再懸濁し、２０．５ml部分において２つの５
０mlプラスチック無菌（ＦＡＬＣＯＮ）遠心チューブへ
移した。４℃で１８時間熟成した後、結合体調製物をＴ
Ｊ−６遠心機のＴＨローターにおいて１０００rpm で
３．５分間遠心した。最終生成物結合体懸濁液を、タン
パク質（Lowry)、１８Ｃポリサッカライド（フェノール
／硫酸）、非結合ポリサッカライド（サイズ排除クロマ
トグラフィー−速度ネフェロメトリー(rate Nephelomet
ry) ）及びアミノ酸（ＳＰＩＮＣＯ）についてアッセイ
した。

【０１１８】ポリサッカライド＝３３９マイクログラム
／ml タンパク質＝２．５７mg／ml 遊離ポリサッカライド：＜５％（実験誤差の限界） Ｓ−カルボキシメチルホモシステイン／リシン＝０．０
２５ Ｓ−カルボキシメチルシステアミン／リシン＝０．００
５

【０１１９】実施例 ２６Ｐｎ４−Ｐｓ中間体の作成 （１）音波加水分解 Ｐｎ４−Ｐｓ粉末の０．１ｇを４００ｍｌの食塩水
（０．９％ＮａＣｌ）に入れ、室温で約４時間攪拌して
溶解した。この溶液をプラスチックビーカー中氷浴上
で、ブランソン音波発生機（Branson Sonifier, １．５
インチプローブ、セッティングＢ）を用いて１０分間
隔、全部で２０分間音波処理した。一区切りごとに粘度
をチェックした。２０分後には粘度は１．２６７センチ
ストロークとなった。加水分解産物を室温に戻してか
ら、酢酸ナトリウム試薬（１８．７ｇ）を加えて終濃度
を３％（ｗ／ｖ）とした。 （２）血清学的プローブ サンプルの１０ｍｌを用いて、イソプロパノール（ＩＰ
Ａ）分画の予備試験と抗体による終点比濁アッセイを行
なうと、Ｐｎ４−Ｐｓは４５−５５％ＩＰＡで沈殿する
ことが分かった。

【０１２０】（３）第一回ＩＰＡ添加 加水分解したサンプル（液量 ３８５ｍｌ、上記工程
（１）で得られたもの）に３７９ｍｌのＩＰＡを室温で
攪拌しながら滴下して加え、ＩＰＡ濃度を４９．７％と
した。サンプルは１５−３０分攪拌を続けた後、１１，
０００×ｇで３０分間遠心した（ベックマンＪＡ−１０
ローター、８，０００ｒｐｍ，２０℃）。ペレットは
純ＥｔＯＨとともに２５０ｍｌ容のオムニミックスジャ
ー（OmnimixJar)中で摩砕し、６０ｍｌ容焼結ガラスロ
ート上に集めた。析出物はロート上で直接純ＥｔＯＨ、
アセトンの順で洗浄し、真空下、室温、ＣａＣｌ₂ で乾
燥して分析用に供した。 （４）第二回目のＩＰＡ添加と生成物の回収 ４９．７％ＩＰＡ上清液（液量７２７ｍｌ、上記工程
（３）から得られたもの）に３８ｍｌのＩＰＡを室温で
攪拌しながら加えることにより、ＩＰＡ濃度を５２．２
％とした。サンプルは熟成後、工程（３）と同様に遠心
した。工程（３）と同様にペレットを摩砕し、回収し、
洗浄し、乾燥した。Ｐｎ４−Ｐｓ生成物の重量は５１６
ｍｇであった。

【０１２１】（５）透析と凍結乾燥 工程（４）で得られたＰｎ４−Ｐｓサンプルの一部（５
００ｍｇ）を２００ｍｌの蒸留水に室温で２−３時間か
けて溶解した。この溶液（２．５ｍｇ/ ｍｌ）を透析チ
ューブ（分画分子量１２，０００、４５ｍｍ）に移し、
蒸留水に対して、４℃、２７時間透析した。途中で２回
蒸留水を交換した。ついでサンプルを凍結乾燥用の容器
に移し、ドライアイス：メタノール浴中で薄く凍らせ、
Virtis( Freezemobile) 凍結乾燥機で２−３日間凍結乾
燥した。回収されたＰｎ４−Ｐｓの最終製品は４９１ｍ
ｇで、Ｋ_d は０．６９であった。この開示から、当業者
にとって他のカルボキシル基を含むＰｎ−Ｐｓのサブタ
イプ、たとえばＰｎ１−Ｐｓ、Ｐｎ５−Ｐｓもここに示
した方法により調製でき、おなじく酸性多糖であるＰｎ
４−ＰｓあるいはＰｎ９Ｖ−Ｐｓと同様に結合体とする
ことができることは自明のことである。

【０１２２】実施例 ２７S. pneumoniae type４−ＯＭＰＣ結合体であるＰｎ４−
Ｐｓ−ＯＭＰＣ Ａ．ダウエックス５０ｘ２（２００−４００メッシュ）
のテトラブチルアンモニウム型樹脂の調製［ダウエック
ス ５０（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）］ ダウエックス５０ｘ２（２００−４００メッシュ）のＨ
⁺ 型（５００ｇ）をＨ₂ Ｏ中でスラリーとし（ＣＭ−６
６）、カラムに充填して順番に、１）Ｈ₂ Ｏ６００ｍ
ｌ、２）６Ｎ ＨＣｌ １０００ｍｌ、３）Ｈ₂ Ｏ ４
００ｍｌ（流出液がｐＨ試験紙で中性になるまで）、
４）１０％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶
液７２ｇ（流出液がｐＨ試験紙で強アルカリになるま
で）、５）Ｈ₂ Ｏ １０００ｍｌ（中性になるまで）で
洗浄した。 Ｂ．Pneumoniae type 4 多糖のテトラブチルアンモニ
ウム型［Pn4(Bu₄N⁺ ）］の調製 ダウエックス５０×２（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）の６５ｍｌのカラ
ムを５２０ｍｌのＨ₂ Ｏで洗浄した。Ｐｎ４−多糖
（ｍ．ｗ．還元型４００ｍｇ）を３５ｍｌのＨ₂ Ｏで覆
い、全部が水面下にあるように気を付けながら２０分間
攪拌した（攪拌は１晩継続した）。この溶液をカラムに
のせ、重力により浸透させ、カラムを１５０ｍｌのＨ₂
Ｏで洗浄した。溶出液を合し、凍結乾燥して５０４ｍｇ
のＰｎ４（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）塩を得た。

【０１２３】Ｃ．Ｐｎ４の１，４−ブタンジアミン誘導
体（Ｐｎ４−ＢｕＡ₂ ）の調製 Ｐｎ４（Ｂｕ₄ Ｎ⁺ ）（９７ｍｇ）を１６ｍｇのＤＭＳ
Ｏ（ジメチルスルホキシド）で覆い、溶液となるまで５
２℃で１５分かけて攪拌した。この時点で固体はすべて
溶解し、この溶液を室温まで冷却した。この溶液に、１
６０μＬのＤＭＳＯに溶解した２ｍｇのカルボニルジイ
ミダゾール（ＣＤＩ）を加え、できた溶液を室温で１．
０時間攪拌した。５ｍｌのＨ₂Ｏに０．５００ｇの１，
４−ブタンジアミンジヒドロクロリド（ＢｕＡ₂ ・２Ｈ
Ｃ１）を溶解した液を調製し、ｐＨを５．０Ｎ ＮａＯ
Ｈで１０．２０に調節した。この溶液を氷浴中で冷却
し、熟成させたＤＭＳＯ溶液を冷ＢｕＡ₂ 溶液に徐々に
加え氷浴中でさらに５分間攪拌した。ついでこれを室温
で１時間攪拌し、その後溶液をスペクトロポア−２の透
析チューブに入れ、液の上面から２分の１インチのとこ
ろをクリップでとめ、以下のように透析した。１）ｐＨ
７．０の０．１Ｍ ＮａＰＯ₄ 緩衝液４リットル、１
５．０時間、２）ｐＨ７．０の０．０１Ｍ ＮａＰＯ₄
緩衝液４リットル、９時間、３）Ｈ７．０の０．０１Ｍ
ＮａＰＯ₄ 緩衝液４リットル、２１時間、４）Ｈ₂ Ｏ
４リットル、２０時間。ついで溶液を凍結乾燥して、７
０ｍｇのＰｎ４の１，４−ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ
４−ＢｕＡ₂ ）を得た。約５ｍｇのサンプルについての
ＮＭＲスペクトルから、１００個の多糖繰り返し単位あ
たり、２２個のブタンジアミン残基が付加されたこと
が、ブタンジアミン内部のメチレンと（Ｐｎ４の）Ｎ−
アセチルメチル基との共鳴の積分を比較することにより
求められた。

【０１２４】Ｄ．Ｐｎ４のブロモアセチル化ブタンジア
ミン誘導体（Ｐｎ４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ）の調製 Ｐｎ４−ＢｕＡ₂ （５４ｍｇ）を、５．５ｍｌの０．１
ＭｐＨ９．０４緩衝液（コルトフのホウ酸−リン酸）で
覆い、溶液となるまで攪拌した。１．０ｍｌのアセトニ
トリル中の５５ｍｇのｐ−ニトロフェニルブロモアセテ
ートをこれに加え、生じた混液を１７時間４℃で攪拌し
た。これをスペクトロポア−２の透析チューブ中で以下
の様に透析した。１）１６リットルの水に対して２４時
間、２）１６リットルの水に対して８時間、３）１６リ
ットルの水にたいして２３時間。この時点で容積は１
２．５ｍｌであり、これから１．０ｍｌをとって分析に
供し（ＮＭＲ、オキタクロニー、ビスコテック）、残り
に２７５ｍｇの乾燥ｐＨ７リン酸緩衝塩（０．１Ｍのｐ
Ｈ８ＮａＰＯ₄ 溶液を凍結乾燥して調製）を加えた。溶
解させた後、０．２ミクロンのコーニングフィルターで
濾過すると、Ｐｎ４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃのｐＨ８溶液
が得られた。

【０１２５】Ｅ．ＯＭＰＣ（N. meningitidis)のＰｎ４
−ＢｕＡ_2-ＢｒＡｃへの結合 外膜蛋白複合体（N. meningitidis, ＯＭＰＣ、 ４．
３４ｍｇ/ ｍｌ）（５ｍｌ）を８０Ｔｉローター中４
３，０００ｒｐｍ（４３Ｋ）で４℃、２時間遠心した。
チオール化用混合液は８５ｍｇのＥＤＴＡ（エチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウム塩）と１５ｍｇのジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）を１０ｍｌのｐＨ１１．０９Ｎａ₂
Ｂ₄ Ｏ₇緩衝液に溶解して調製した。５０ｍｇのＮ−ア
セチルホモシステインチオラクトンを加え、溶液を０．
２ミクロンフィルターで濾過した。上述した遠心のペレ
ットを５ｍｌの濾過したチオール化用混液ではがし、ド
ーンスホモジナイザーに移して再懸濁させた。再懸濁液
を遠心管に移し、蓋をしてファイアストンバルブを用い
て空気を窒素に置換した。反応混液を１９時間熟成さ
せ、遠心管に移し、１ＭＫＨ₂ ＰＯ₄ 水溶液を上層して
２時間４℃４３Ｋで遠心した。上清を除き、ペレットを
１０ｍｌの０．１ＭＮａＰＯ₄ ｐＨ８緩衝液に再懸濁し
た。この液を遠心管に移し、２回目の超遠心を行なった
（２時間、４℃、４３Ｋ）。ペレットをセクションＤで
調製した１１．５ｍｌのＰｎ４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃに
再懸濁した。エルマン検定から合計３．４４マイクロモ
ルのＳＨすなわち約１５８ナノモルのＳＨ/ ｍｇのＯＭ
ＰＣであった。得られた反応物（チオール化ＯＭＰＣと
Ｐｎ４−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ）は窒素下で（脱気して）
Ｎ₂ ボックス中室温で６６時間熟成させた。

【０１２６】反応物は以下のようにキャップ化した：５
ｍｇのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を１ｍｌのｐＨ
８、０．１ＭＮａＰＯ₄ 緩衝液に溶解したものを０．２
２ミクロンのフィルターで濾過し、上記の反応混液に加
え、混液を５時間熟成させた。ついで０．１ｍｌのＮ−
アセチルシステアミンを０．４ｍｌの０．１ＭｐＨ８リ
ン酸緩衝液に加えたものを０．２２ミクロンのフィルタ
ーで濾過し、この液を反応混液に加えて１４．５時間熟
成させた。反応混液を４３Ｋ、４℃、２時間遠心し、ペ
レットを８ｍｌの１×ＴＥＤ緩衝液に再懸濁した。この
液を室温で一晩熟成させ、ついで４３Ｋ、４℃、２時間
遠心した。ペレットを８ｍｌのＴＥＤ緩衝液に再懸濁
し、直ちに４３Ｋ、４℃、２時間の再遠心を行なった。
ペレットを１０ｍｌのｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩
衝液に再懸濁し、４３Ｋ、４℃、２時間の再遠心を行な
った。最終ペレットは７．５ｍｌの水に懸濁した。４℃
で一晩熟成させたのち、懸濁液を１０００ｒｐｍで３分
遠心し上清を最終結合体として回収した。 分析：ローリー法による蛋白質：０．９２０ｍｇ/ ｍｌ フェノール−硫酸法：０．２１２ｍｇ/ ｍｌ Ｐｓ／Ｐｒｏ＝０．２３ ＳＣＭＨＣ／ｌｙｓ＝０．０３１ ＳＣＭＣ／ｌｙｓ＝０．０２２ この結合体をマウスあるいはアフリカミドリザルに投与
すると、高力価の抗Ｐｎ４−Ｐｓ抗体が誘導された（Ｐ
ｎ４−Ｐｓ特異的ＥＬＩＺＡ検定で測定）。

【０１２７】実施例２８Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ中間体の作成 （１）音波加水分解 Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ粉末の０．１ｇを４００ｍｌの食塩水
（０．９％ＮａＣｌ）に入れ、室温で約４時間攪拌して
溶解した。この溶液をプラスチックビーカー中氷浴上
で、ブランソン音波発生機（Branson Sonifier, １．５
インチプローブ、セッティングＢ）を用いて３分間音波
処理した。このあと粘度をチェックした。１３分後、も
う一分音波処理すると粘度は１．１１７センチストロー
クとなった。加水分解産物を室温に戻してから、酢酸ナ
トリウム試薬（１９．５ｇ）を加えて終濃度を３％（ｗ
／ｖ）とした。 （２）血清学的プローブ サンプルの１０ｍｌを用いて、イソプロパノール（ＩＰ
Ａ）分画の予備試験と抗体による終点比濁アッセイを行
なうと、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓは４０−４５％ＩＰＡで沈殿す
ることが分かった。 （３）第一回ＩＰＡ添加 加水分解したサンプル（液量 ３９１ｍｌ、上記工程
（１）で得られたもの）に２８１ｍｌのＩＰＡを室温で
攪拌しながら滴下して加え、ＩＰＡ濃度を４１．８％と
した。サンプルは１５−３０分攪拌を続けた後、１１，
０００×ｇで３０分間遠心した（ベックマンＪＡ−１０
ローター、８，０００ｒｐｍ，２０℃）。ペレットは
純ＥｔＯＨとともに２５０ｍｌ容のオムニミックスジャ
ー（OmnimixJar)中で摩砕し、６０ｍｌ容焼結ガラスロ
ート上に集めた。析出物はロート上で直接純ＥｔＯＨ、
アセトンの順で洗浄し、真空下、室温、ＣａＣｌ₂ で乾
燥して分析用に供した。 （４）第二回目のＩＰＡ添加と生成物の回収 ４１．８％ＩＰＡ上清液（液量６３７ｍｌ、上記工程
（３）から得られたもの）に２８．６ｍｌのＩＰＡを室
温で攪拌しながら加えることにより、ＩＰＡ濃度を４
４．３％とした。サンプルは熟成後、工程（３）と同様
に遠心した。工程（３）と同様にペレットを摩砕し、回
収し、洗浄し、乾燥した。Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ標品の重量は
３４２．２ｍｇであった。 （５）透析と凍結乾燥 工程（４）で得られたＰｎ９Ｖ−Ｐｓサンプルの一部
（３４７ｍｇ）を１３９ｍｌの蒸留水に室温で４−５時
間かけて溶解した。この溶液（２．５ｍｇ/ ｍｌ）を透
析チューブ（分画分子量１２，０００、４５ｍｍ）に移
し、蒸留水に対して、４℃、２５時間透析した。途中で
２回蒸留水を交換した。ついでサンプルを凍結乾燥用の
容器に移し、ドライアイス：メタノール浴中で薄く凍ら
せ、Virtis(Freezemobile) 凍結乾燥機で２−３日間凍
結乾燥した。回収されたＰｎ９Ｖ−Ｐｓの最終製品は３
０３．５ｍｇ、Ｋ_d ＝０．６０であった。 （６）第三回目のＩＰＡ添加と生成物の回収 ４４．３％ＩＰＡ上清液（液量６５５ｍｌ、上記工程
（４）から得られたもの）に３０．８ｍｌのＩＰＡを室
温で攪拌しながら加えることにより、ＩＰＡ濃度を４
６．８％とした。サンプルは熟成後、工程（３）と同様
に遠心した。工程（３）と同様にペレットを摩砕し、回
収し、洗浄し、乾燥した。Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ生成物の重量
は４１０．８ｍｇであった。 （７）透析と凍結乾燥 工程（６）で得られたＰｎ９Ｖ−Ｐｓサンプルの一部
（４２０．４ｍｇ）を１６８ｍｌの蒸留水に室温で４−
５時間かけて溶解した。この溶液（２．５ｍｇ/ｍｌ）
を透析チューブ（分画分子量１２，０００、４５ｍｍ）
に移し、蒸留水に対して、４℃、２５時間透析した。途
中で２回蒸留水を交換した。ついでサンプルを凍結乾燥
用の容器に移し、ドライアイス：メタノール浴中で薄く
凍らせ、Virtis( Freezemobile) 凍結乾燥機で２−３日
間凍結乾燥した。回収されたＰｎ９Ｖ−Ｐｓの最終製品
は３４２．５ｍｇ，Ｋ_d ＝０．６５であった。 （８）当業者にとって工程（４）および（６）の標品が
各サブフラクションの加重平均特性的分析特性を有する
単一標品として、より多量のＩＰＡを加えて一緒に回収
し、ついで透析、凍結乾燥を行なえるものであることは
あきらかである。また当業者にとってＰｎ１−Ｐｓ、Ｐ
ｎ５−ＰｓもＰｎ４−ＰｓあるいはＰｎ９Ｖ−Ｐｓと同
様に調製できることは自明のことである。

【０１２８】実施例 ２９Ｐｎ９Ｖ−ＰｓとＯＭＰＣの結合 実施例２８で調製したＰｎ９Ｖ−Ｐｓは実施例２７にし
めしたＰｎ４−Ｐｓと同様の方法で結合体とした。

【０１２９】実施例３０ Pn9V/18C-Ps 中のアセテート及びPn4-Ps中のピルベート
の量的決定 肺炎双球菌(Pn)のカプセル状ポリサッカライド(Ps)の製
造の間にPn4-Ps中のＯ−ピルベート並びにPn9V-Ps 及び
Pn18C-Ps中のＯ−アセテート基の残留量の量を測るため
一つの方法が開発された。Ｏ−アセチル若しくはＯ−ピ
ルベート基は加水分解により最初に放出され、それか
ら、抑制された伝導性で連結された高効率陰イオン交換
クロマトグラフィを利用して、PnPs水解物中のアセテー
トとピルベートは同定され計量された。

【０１３０】未処置の及び処置されたPn4, Pn9V,及びPn
18C のサンプルはこの方法で分析された。予備的な結果
は、未処置の及びサイズ化されたPn4 に対して各Ps繰り
返し単位に対するピルベートが約１：１及び０．８：１
のモル比を示した。Pn18C-Psにおける各Ps繰り返し単位
に対するアセテートのモル比は、未処置のそしてサイズ
化されたサンプルに対して各々１：１及び０．８：１、
そして未処置のそしてサイズ化されたPn9Vに対して各々
１．７：１及び１．５：１であることが発見された。Pn
18C-Ps-OMPC 結合水性バルクのサンプルは又各Ps繰り返
し単位に対するＯ−アセテートのモル比について分析さ
れ、約０．５：１であることが見いだされた。

【０１３１】ピルベート基は第４型カプセル状ポリサッ
カライドにおける有力な免疫検出物であり、その除去は
免疫学的特性において特徴づけられた変化を生じさせる
いうことが報告されている[Heidelberger, M., Dudman,
W.F., 及びNimmich, W., 'Immunochemical relations
hips of certain capsular polysaccharides of Klebsi
ella, pneumococci,及びRhizobia' J. Immunol., 104:1
321-1328, (1970); Higginbotham, J.D., Heidelberge
r, M., 及びGotschlich, E., 'Degradation ofa pneUmo
coccal type-specific polysaccharide with exposure
of group-spicificity.' Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
67:138-142, (1970)]。同様に、型Pn18C-Psポリサッカ
ライドにおけるＯ−アセテート基の除去はその免疫学的
特性を破棄する［Estrada-Parra, S., 及びHeidelberg
er,M., 'The specific polysaccharide of type XVIII
pneumococcus' Biochemistry, 2:1288-1294 (1963)]。
従って、Pn18C-Ps及びPn4 におけるアセテートとピルベ
ートの決定のための量的な方法を開発することが必須で
あった。デ−Ｏ−アセチレート化されたPn9Vは比濁計測
定によって決定されるような抗原反応性を有しなかった
ことから、Pn9VにおけるＯ−アセチル基はまたPn9Vの免
疫学的構造における重要な役割をも演ずることができ
る。

【０１３２】我々は、Ｏ−アセテートはアルカリ条件(p
H11)下４℃においてPn9V及びPn18C-Psから容易に放出さ
れること及びＯ−ピルベートは６５℃で加熱の上でPn4
から容易に放出されることを発見した。我々はアセテー
トとピルベートは0.98mM NaOH の１ml/minの流量及び移
動相として2% MeOH でOmniPac PAX500カラムを用いて加
水分解されたPnPs試料から分離できることを発見した。
検出は再生試薬として10ml/minの流量で25mM H₂SO₄を用
いる被抑制伝導性検出(suppressed conductivity detec
tion) によって成された。各々Pn18C-Ps、9V 及びPn4 か
らのＯ−アセテート及びＯ−ピルベートの量的ＨＰＬＣ
分析のための最も望ましい加水分解条件は、この例中に
開示される。

【０１３３】装置編成 Dionex BioLCがOmniPac PAX-500 ガード、及び分析カラ
ム(4.6x250mm) とともに用意された。被抑制伝導性検出
は再生試薬として25mN硫酸を用いて成された。流量はDi
onexオートレジェンユニットで10ml/minに設定された。
加水分解されたPnPsの試料からアセテートとピルベート
を分離するための移動相及び勾配プログラムは以下の表
に示される： 緩衝液１ − １mM水酸化ナトリウム 緩衝液２ − 100% メタノール 緩衝液３ − 200mM 水酸化ナトリウム 緩衝液４ − 水 時間 緩衝液１/% 緩衝液２/% 緩衝液３/% 緩衝液４/% 流量／(ml/min) 0 98 2 0 0 1 12.5 98 2 0 0 1 12.6 58 2 0 40 1.5 20.0 58 2 0 40 1.5 20.1 98 2 0 0 1.5 30.0 98 2 0 0 1.5 30.1 98 2 0 0 1 50.0 98 2 0 0 1 これらの条件と３μジーメンスの感度の検出器を用い
て、およそ5.2 及び9.5分の保持時間で溶出するアセテ
ート及びピルベートの各々４nmolが、それぞれ容易に検
出された。 試料調製 メルク社製造部門からの精製されたPnPs試料を、Aquast
ar V3000容積測定式水分滴定計を用いることによってカ
ール・フィッシャー滴定に付し、残余量のH₂Oを含むと
決定された。それからmlあたり1.0mg 乾量の濃度でMill
i-Q H₂O 中に溶解させた。試料（100 μｇ/ml ）が室温
で16時間2mM NaOH中にて処理され、Pn9V-Ps 及びPn18C-
Ps試料からＯ−アセテートが分離された。Pn4-Ps試料は
Pb4 からのＯ−ピルベートの分離のため65℃で16時間１
mM HCl中で加水分解された。サイズ化されたPn9V及びPn
18C-Ps及びPn18C-Ps-OMPC 結合水性バルクの試料もまた
高pH陰イオン交換クロマトグラフィーによってモノサッ
カライド構成分析及びパルス電流滴定検出に付された。
モノサッカライド構成分析は、サイズ化され水性結合大
の試料中のPnPsの正確な濃度を得るために行われた。ア
セテート、ピルベート及びＮ−アセチルマンノスアミン
標準物はMilli-Q H₂O 中に200nmol/mlの濃度で溶解され
た。

【０１３４】試料及び標準の加水分解 Pn18C-Psのデ−Ｏ−アセチルアクションが、四つのNaOH
濃度（1,2,5,及び50mM) 、種々の温度（4,25,45,及び65
℃) 及び種々の時間（3,5,及び16時間）でPn18C-Psを処
理することで検討された。アセテート、ピルベート及び
Ｎ−アセチルマンノスアミンの標準溶液も、デ−Ｏ−ア
セチレーションのために必要な条件はまたアセテート／
ピルベートの減成に若しくはＮ−アセチル基の損失に帰
着するかどうかを決定する研究中に含まれた。種々の濃
度（1,10,100mM) 、時間(3,5, 及び16時間）、そして温
度(65, 85,及び100 ℃) における水酸化ナトリウム（50
mM/100℃/16h) 若しくは塩酸での処理を続けてPn4から
のピルベートの分離が研究された。

【０１３５】比濁計 デ−Ｏ−アセチレーション若しくはデ−Ｏ−ピルビレー
ション前後のPn9V-Ps、Pn18C-Ps、及びPn4-Psの比濁分
析的活性が測定された。試料は1, 1.5, 5, 及び2.5 μ
ｇ/mlに希釈された。

【０１３６】高効率サイズ排除クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＳＥＣ） デ−Ｏ−アセチレーションまたはデ−Ｏ−ピルビレーシ
ョン前後のPn9V-Ps 、Pn18C-Ps及びPn4 のＨＰＳＥＣが
測定された。流量制限器を装備した7.5x600mmTSKG6000P
Wカラムが50℃、800-1000psi で加熱され0.2M酢酸ナト
リウム0.3ml/min で平衡にさせた。試料60μg ( １mg/m
l)をカラムに注入し、移動速度0.3ml/min で溶出した。
カラム溶離剤は0.5ml/min の流速で0.5M NaOH の後カラ
ム追加物と混合し、Dionexパルス電流滴定検出器でモニ
ターして、Ｋｄを測定した。

【０１３７】アッセイ感受性及び線型性 検出器線の線型性及び感受性がピルベート及びアセテー
トの両方に対して３μジーメンスで決定された。ピルベ
ート及びアセテートは低い方の限界として0.125 nmolま
で検出可能であった。双方の成分の検出器応答はピルベ
ート及びアセテートにつき各々0.9999及び0.9992の相関
係数で２nmolを通じて線型である。

【０１３８】Pn18C-Psから分離されるＯ−アセテートの
オムティミゼーション 時間進行加水分解P18C-Ps の予備的研究は、低温でのア
ルカリ加水分解に対するＯ−アセチル基の不安定性を明
らかにした。2mM 水酸化ナトリウムは16時間の培養で P
n18C-Ps を完全にデ−Ｏ−アセチレートへ十分であっ
た。より高い温度(>25℃) 処理がPn9V Ｏ−アセテート
の測定を妨げるＮ−アセチルマンノスアミンからのＮ−
アセテートを放出することが見いだされた。PnPsからの
Ｏ−アセテートの除去のための最も望ましい加水分解条
件は４℃で16時間であることが見いだされた。１％以下
のアセテートが室温で16時間２mM NaOHで処理されたＮ
−アセチルマンノスアミンの標準から分離されることが
見いだされた。

【０１３９】Pn4 から除去するＯ−ピルベートのオプテ
ィミゼーション Pn4 の加水分解研究は当初水酸化ナトリウム加水分解を
用いることによって請け負われた。水酸化ナトリウムが
用いられたときピルベートは殆ど回収されなかったとい
うことが速やかに発見された。初期の制御研究で、ピル
ベートは100 ℃でH₂O 中のPn4 から分裂されたというこ
とを明らかにされた。この情報で、上昇温度でのHCl 加
水分解を用いてPn4 からのＯ−ピルベート放出のオプテ
ィミゼーション研究を行うことが決定された。ピルベー
トの幾らかの減成がより高い温度で見られた。これはPn
4 同様の条件の下で加水分解されたピルベート標準の例
で明示できる。65℃で16時間１mM HCl 中で加水分解が
行われたときピルベートの最大の回収が生じた。

【０１４０】PnPs試料でのＯ−アセテート及びＯ−ピル
ベートの分析 出発PnPs、サイズ化されたPnPsそして一つのPn18C-Ps-O
MPC 結合物を代表する種々の試料が、Pn9V-Ps/18C 中の
Ｏ−アセテートを放出するため室温下２mM NaOH 中での
若しくはPn4-Ps中のＯ−ピルベートを放出するため65℃
下１mMHCl中での加水分解の後上述されたＨＰＬＣ法に
よってＯ−アセテート／ピルベートに関して分析され
た。この研究の結果を以下に示す： 試料 各Ps繰り返し単位に対するピルベート／アセテートの比 Pn4 、試料１ 1.0 Pn4 、試料２ 0.8 Pn9V、試料１ 1.7 Pn9v、試料２ 1.5 Pn18C-Ps、試料１ 1.0 Pn18C-Ps、試料２ 0.8 Pn18C-Ps-OMPC 水性大 0.5

【０１４１】結果は、サイズ化されたPnPs中の側鎖基の
保持はPn9V-Ps に関しておよそ９０％、そしてＰｎ４
及び18C に関して80% であった。Pn18C-Ps-OMPC 接合水
性大におけるＯ−アセテートの保持はおよそ50% であっ
た。Pn18C-PsとPn4 の理論的な値はPs繰り返し単位１mo
l 当たりアセテート若しくはピルベート１mol でありPn
9Vに対してその比が2:1 である。[ Jansson, P-E., Lin
dberg, B.,及びLindquist, U. 'Structural studies of
the capsular polysaccharides from Streptococcuspn
eumoniae Type 4.' Carbohyd. Pes., 95:73-80, (1981)
。Lugrowski, C. 及びJennings, H. J. 'Structural d
etermination of thecapsular polysaccharide of Stre
ptococcus pneumoniae Type 18C.' Carbohyd.Pes. 131:
119-129, (1984)。Perry, M. B., Daoust, V., 及びCar
los, D. J. 'The specific capsularpolysaccharide of
Streptococcus pneumoniae Type 9V.' Can. J. Bioche
m. 59:524-533, (1981)]。Pn18C-Ps-OMPC 接合物におい
て見出されるＯ−アセテートのより低い保持は、低温で
のアルカリ条件に対してのＯ−アセチル基加水分解の感
受性から予想される。

【０１４２】試料Pn4 、Pn9V、及びPn18C-Ps及びデ−Ｏ
−ピルビレート化された若しくはデ−Ｏ−アセチレート
化された試料の比濁計的活性が測定された。結果は、た
とえ未処理試料のＫｄでも比濁活性はこれらの側鎖基の
除去の後には完全に失われた、ということを示した。Ｋ
ｄのは上述したＨＰＳＥＣ法によって得られた。しかし
ながら、穏やかな酸加水分解によるデ−Ｏ−ピルビレー
ション後のPn4 のＫｄは0.60から0.68に上昇し、その出
現はその塩の体積に近い。Pn4 及びPn18C-Psのための抗
原性日数は、肺炎双球菌ポリサッカライド免疫学的反応
性におけるこれらの側鎖基の重要性に関して他の調査者
の仕事を支持する。Pn9Vに関する結果はグルクロン酸に
加えて、この分子のＯ−アセチル基が同様に重要な免疫
学的決定因であることを示唆している。

【０１４３】以上のように、この方法によって、Pn4 中
のＯ−ピルビルケタール並びにPn9V及びPn18C-Ps中のＯ
−アセテートの量的分析のための、迅速で敏感な手段が
開発された。この手段はPn4 、Pn9V、及びPn18C-Psとい
うポリサッカライドの抗原的構造を残すためにそれらの
サイズ化と結合のための正しい過程を定義することにお
いて有意義である。

【０１４４】実施例３１ Pn6B-Ps-MIEP結合物の単離 １． ２つの結合反応混合物試料（一つは他方のH₂O 透
析された試料を表わす）が使用されるまで３−８℃で保
存された。 ２． 0.2MOPS pH7.2 緩衝剤が該試料に加えられ、約７
mMという最終濃度が得られた。固体GuHCl が該試料に加
えられ、4.2Mという最終の濃度が達成された（註：GuHC
l1.42g/ 試料mlが、固体のGuHCl の添加のために体積の
増加を補償するために加えられなければならない。同様
に、体積増加を勘案するために緩衝剤添加が調整されな
ければならない。その結果試料組成がカラム溶出液組成
により接近する。あるいは、試料はクロマトグラフィに
付す前にカラム溶出液に対し透析されることができよ
う）。 ３． 試料の2.8ml （ローリープロテインアッセイ(low
ry protein assay) に基づいたプロテイン約１mgを含有
する）を、0.6ml/min の流速で６mGuHCl 10mM MOPS pH
7.2において平衡に達したセパクリル（sephacryl)Ｓ−1
000の12.6x96 cmカラムに注入した。カラム溶出液が280
nM で連続的にモニター（perkin Elmer LC235 ダイオー
ドアレイ検出器）され、3ml のフラクションが収集され
た。 ４． プロテイン分配はA280に基づいており（スペクト
ルと同じく）そしてPn6B-Ps 分配はPn6B-Ps 特定のRIA
アッセイに基づいている。Pn6B-Ps-BrAc単独の溶出部分
に基づいて、そして不活性化されたMIEPとの物理的な混
合物において、PSとプロテインの両方を含む断片溜を作
成し、該Pn6B-Ps-BrAcについて観察される位置から明確
に溶出したものがPn6B-Ps-MIEP結合物として推定に基づ
いて明示された。 ５． 溜はYM-30 膜を用いての限外ろ過によって濃縮さ
れ、Milli-Q H₂O を用いてろ過された。プロテインとPn
6B-Ps内容量は量的組成研究から見積もられた。SCMHC
はアミノ酸分析によって検出された。

【０１４５】実施例３２ 肺炎双球菌ポリサッカライドPn18C-Ps直接ＲＩＡアッセ
イ このアッセイは肺炎双球菌ポリサッカライド型18C の計
量のために用いられる。それは多層サンドイッチＲＩＡ
アッセイである。ラビット(Rabbit)anti-Pn18C-Ps がポ
リスチレンビーズにヒートされる。ビーズはPn18C-Psを
含有する試料溶液中にて培養される。培養後、ビーズは
洗浄され、Pn18C-OMPCに対するマウス抗体を含有する第
二溶液中で再培養される。この培養後、ビーズは洗浄さ
れ¹²⁵I−ヤギ抗マウスIgG を含有する溶液中で３回培養
する。プレートは再度洗浄され、その後ビーズは計量の
ためプラスチックチューブに移される。P18C-Ps の未知
の試料は計量のため標準曲線に比較される。

【０１４６】装置 １． ＲＩＡキット： Abbot Labs、診断法部門、カタ
ログNo.6171-10 ２． クイックウォッシュシステム、Abbot Labs、診断
法部門 ３． 可調整ピペット及び使い捨てピベットチップ（エ
ッペンドルフデジタルを参照）。 ４． ガンマカウンター（Abbott Autologic参照） ５． 鏡面仕上げの1/4"ポリスチレンビーズ、Precisio
n Plastic Ball Co., 3000 N, Cicero Ave., Chicago,
Illinois 60641。

【０１４７】試薬 １． ニューヨーク州公共医療施設 Anti-Pn18C-Ps抗体
ロットR18-44若しくはその等価物。 ２． マウスanti-Pn18C-Ps OMPCアンチセラ (pool 11
260-235 若しくはその等価物）。 ３． ゴート、アンチ−マウスIgG ¹²⁵I- ラベルされた
アンチセラ：MA02118 、ボストン、アルバニーストリー
ト549 、ニューイングランドヌクレアー、ＮＥＸ１５９ ４． インキュベーション緩衝剤：次のものを含有する
ＲＣＭ８ 1.0% BSA Sigma A2153 0.1% アジド Sigma S2002 ５． 希釈液 胎児牛血清 ８部 Sigma F3885 ヤギ血清 １部 Sigma G6767 ウサギ血清 １部 Sigma R4505 ＴＷＥＥＮ ２０ 0.05% Sigma P1379 アジド 0.1% Sigma S2002

【０１４８】３． anti-Pn18C-Ps コートされたビーズ
１個を試料若しくは標準物を含むプレートの各ウェルに
加え、全てのビーズが完全に緩衝物で覆われることを請
け合うために穏やかに浸透する。 ４． プレートをＲＩＡキットで供給された粘着性の裏
張で覆い、６時間室温にてプレートを培養する。 ５． プレートをクイックウォッシュ（Qwik Wash ）装
置と脱イオン水を用いて洗浄する。 ６． マウスanti-18C抗体を希釈液中1:1000に希釈す
る。 ７． この溶液200 μl をビーズ一個を含む各ウェルに
加える。 ８． プレートを覆い、室温で一晩培養する。 ９． プレートをクイックウォッシュ装置と脱イオン水
を用いて洗浄する。 １０． ¹²⁵I- ラベルされたヤギ、アンチ−マウス抗体
を希釈液に15000cpm/10μl まで希釈( 〜1:160 希釈）
する。 １１． この溶液20μｌをビーズ一個を含む各ウェルに
加える。 １２． プレートを覆い、37℃で２時間培養する。 １３． プレートをクイックウォッシュ装置と脱イオン
水を用いて洗浄する。 １４． ＲＩＡキットで供給されるプラスチックチュー
ブにビーズを移し、好適なガンマカウンターでカウント
する。

【０１４９】計算 １． 各サンプル、標準、及び培養緩衝コントロールの
それぞれについて平均を得るために複数の測定を共に合
わせる。全ての標準及び試料から培養緩衝コントロール
を基礎とする。 ２． 統計的な計算のために用意された計算機を使用し
て、標準線のためのデータを入力する。そして相関係数
と線の勾配を計算する。 ３． 好適な標準線を使用して（自由部分は自由部分
に、結合部分は結合部分に）、試料の応答を計算し、希
釈のために調製する。

【０１５０】上述した同様の手段は置換型の特定の試薬
によって他のPn-Ps 種のいかなるものに対しても適用可
能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ 7432−4Ｂ 21/00 Ａ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:36） (72)発明者 アーピ ハゴピアン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴアニ ア，ランスデール，ハートレイ ドライヴ 771 (72)発明者 ウイリアム ジエー．ミラー アメリカ合衆国，19454 ペンシルヴアニ ア，ノース ウエールズ，オールド チヤ ーチ ロード 232 (72)発明者 シヤーロツテ シー．イプ アメリカ合衆国，19422 ペンシルヴアニ ア，ブルー ベル，チヤドウイツク プレ イス 1665 (72)発明者 ジヨン ピー．ヘネシー，ジユニア アメリカ合衆国，18917 ペンシルヴアニ ア，ダブリン，フオツクス ホロー ロー ド 114 (72)発明者 デニス ジエー．キユベク アメリカ合衆国，26426 ウエスト ヴア ージニア，セイレム，キヤロライナ アヴ エニユー 76 (72)発明者 パメラ デー．バーク アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴアニ ア，ランスデール，ヨークタウン ストリ ート 862 (72)発明者 ステフエン マルブルグ アメリカ合衆国，08840 ニユージヤーシ イ，メチユチエン，コンコード アヴエニ ユー 50 (72)発明者 リチヤード エル．トルマン アメリカ合衆国，07059 ニユージヤーシ イ，ウオーレン，アツパー ウオーレン ウエイ 29

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレプトコッカス ニューモニエの１
   種以上の亜型由来の多糖に共有結合的に結合した免疫原
   性タンパク質を包含している結合体であって、該多糖は
   平均して１分子当り約１２００未満の繰り返し単位を有
   し、分子量約１×１０⁵ 〜１×１０⁶ 、多分散性１．０
   〜１．４及び肺炎連鎖球菌群特異的Ｃ多糖の混入レベル
   が型特異的多糖の３．０％以下である。
2. 【請求項２】 該多糖が抗原性指数０．７〜１．１及び
   固有粘度０．６〜３．０dL/gを有する請求項１記載の結
   合体。
3. 【請求項３】 該多糖が１，２，３，４，５，６Ｂ，７
   Ｆ，８，９Ｎ，９Ｖ，１０Ａ，１１Ａ，１２Ｆ，１４，
   １５Ｂ，１７Ｆ，１８Ｃ，１９Ｆ，１９Ａ，２０，２２
   Ｆ，２３Ｆ及び３３Ｆから選択されるストレプトコッカ
   ス ニューモニエ亜型のいずれかに由来する請求項２記
   載の結合体。
4. 【請求項４】 該多糖がサイズ多分散性１．０〜１．
   ４、型特異的多糖と比較した場合のＣ多糖混入レベル３
   ％未満であって、以下の１）〜７）の多糖、１）ストレ
   プトコッカス ニューモニエ６Ｂ：該多糖は (a)Ｍ_N 約３×１０⁵ 〜６×１０⁵ (b)Ｋｄ（ピーク）約０．６０±０．０５ (c)Ｍ_W 約３×１０⁵ 〜７×１０⁵ (d)０．１Ｍリン酸ナトリウムpH７．２中の固有粘度
   １．０〜２．０及び (e)平均して１分子当り約１０００未満の繰り返し単位
   を有する ２）ストレプトコッカス ニューモニエ１４：該多糖は (a)Ｍ_N 約３×１０⁵ 〜８×１０⁵ (b)Ｋｄ（ピーク）約０．６０±０．０５ (c)Ｍ_W 約４×１０⁵ 〜１×１０^６ (d)０．１Ｍリン酸ナトリウムpH７．２中の固有粘度
   ０．６〜１．６及び (e)平均して１分子当り約１２００未満の繰り返し単位
   を有する ３）ストレプトコッカス ニューモニエ１９Ｆ：該多糖
   は (a)Ｍ_N 約２×１０⁵ 〜６×１０⁵ (b)Ｋｄ（ピーク）約０．６５±０．０５ (c)Ｍ_W 約２×１０⁵ 〜６×１０⁵ (d)０．１Ｍリン酸ナトリウムpH７．２中の固有粘度
   １．０〜２．０及び (e)平均して１分子当り約１０００未満のモノマー繰り
   返し単位を有する ４）ストレプトコッカス ニューモニエ２３Ｆ：該多糖
   は (a)Ｍ_N 約２×１０⁵ 〜６×１０⁵ (b)Ｋd （ピーク）約０．５４±０．０５ (c)Ｍ_W 約４×１０⁵ 〜８×１０⁵ (d)０．１Ｍリン酸ナトリウムpH７．２中の固有粘度
   １．５〜３．０及び (e)平均して１分子当り約１０００未満のモノマー繰り
   返し単位を有する ５）ストレプトコッカス ニューモニエ４：該多糖は (a)Ｍ_N 約２×１０⁵ 〜４×１０⁵ (b)Ｋd （ピーク）約０．６５±０．０５ (c)Ｍ_W 約２×１０⁵ 〜５×１０⁵ (d)０．１Ｍリン酸ナトリウムpH７．２中の固有粘度
   １．０〜３．０及び (e)平均して１分子当り約６００未満のモノマー繰り返
   し単位を有する ６）ストレプトコッカス ニューモニエ９Ｖ：該多糖は (a)Ｍ_N 約３×１０⁵ 〜６×１０⁵ (b)Ｋd （ピーク）約０．６５±０．０５ (c)Ｍ_W 約３×１０⁵ 〜７×１０⁵ (d)０．１Ｍリン酸ナトリウムpH７．２中の固有粘度
   １．０〜２．０及び (e)平均して１分子当り約８００未満のモノマー繰り返
   し単位を有する ７）ストレプトコッカス ニューモニエ１８Ｃ：該多糖
   は (a)Ｍ_N 約２×１０⁵ 〜６×１０⁵ (b)Ｋd （ピーク）約０．６５±０．０５ (c)Ｍw 約２×１０⁵ 〜６×１０⁵ (d)０．１Ｍリン酸ナトリウムpH７．２中の固有粘度
   １．５〜３．０及び (e)平均して１分子当り約７００未満の繰り返し単位を
   有する 又はこれらの多糖類の混合物に由来し、該多糖がナイセ
   リアメニンギチジスｂの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰ
   Ｃ）又はそのＭＩＥＰサブユニットに結合される請求項
   ３記載の結合体。
5. 【請求項５】 ＯＭＰＣ又はＭＩＥＰとＰｎ−Ｐｓが多
   糖ヒドロキシルで結合する場合には式 【化１】 で、カルボン酸基を有する多糖類の場合には 【化２】 であらわされるようにスペーサーを介して結合され（式
   中ＰＲＯはＯＭＰＣ又はＭＩＥＰを表わしＰｎ−Ｐｓは
   肺炎連鎖球菌多糖を表わす）、結合体がＰｎ−Ｐｓ：Ｏ
   ＭＰＣ又はＰｎ−Ｐｓ：ＭＩＥＰ質量比約０．０５〜
   ０．５を有し、加水分解及びアミノ酸分析によるＳＣＭ
   ＨＣ／Ｌｙｓ比が０．０１〜０．１５である請求項４記
   載の共有結合的結合体。
6. 【請求項６】 （ａ）肺炎連鎖球菌を培養して粗製肺炎
   連鎖球菌多糖を単離するか又は肺炎連鎖球菌多糖末を可
   溶化する。 （ｂ）工程（ａ）の多糖を所定の点まで精製及び部分加
   水分解して工程（ａ）の粗製多糖と比較した場合、多糖
   の型特異抗原性が３０％以上は低下していない、結合を
   受けやすい多糖を生成させる。 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を免疫原性タンパク質と結合
   させるが、但し工程（ａ）で培養した肺炎連鎖球菌は亜
   型４，６Ｂ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆ及び２３Ｆの
   １種以上から選択され、Ｐｎ−Ｐｓは抗−Ｐｎ−Ｐｓ型
   特異抗体を用いるオキタロニー二重免疫拡散又は速度比
   濁検定により測定した場合その抗原性を保持し、結合前
   の該Ｐｎ−Ｐｓは次の通り各々列挙したＰｎ−Ｐｓ亜型
   に対する０．９Ｍ塩化ナトリウム中１mg/ml 溶液の粘度
   又はＫｄ（ピーク）終点まで約２０００〜１５０００Ｐ
   ＳＩ圧力下ゴーリンプレスで剪断するか又は１００℃で
   ２４時間加熱又は音波処理によって加水分解されたもの
   であり、 Ｐｎ−Ｐｓ亜型 標的終末 標的終末 粘度 Ｋｄ（ピ−ク） （センチストークス） Ｐｎ４−Ｐｓ １．５−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ １．３−１．００ ０．６０±０．０５ Ｐｎ９ｖ−Ｐｓ １．３−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ１４−Ｐｓ １．１−０．９５ ０．６０±０．０５ Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ １．５−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ １．３−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ １．５−１．００ ０．５４±０．０５ 次いで場合によってはクロマトグラフィー処理又はアル
   コール分画して多分散性１．４以下を有する物質を選択
   したものである：方法によって製造される肺炎球菌多糖
   −免疫原タンパク質結合体。
7. 【請求項７】 ａ）粗製肺炎連鎖球菌多糖Ｐｎ−Ｐｓを
   単離する： ｂ）ｉ−任意により不純物をイオン交換吸着することに
   よって粗Ｐｎ−Ｐｓを精製する ii−粗Ｐｎ−Ｐｓを部分加水分解又は機械的に剪断す
   る： ｃ）任意によりサイズ及び純度に応じて部分加水分解Ｐ
   ｎ−Ｐｓを分画する： ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）により分画した１種以上の肺炎
   連鎖球菌亜型に由来するＰｎ−Ｐｓを誘導化してペンダ
   ント求核又は親電子部分を示させる： ｅ）ナイセリアメニンギチジスｂ ＯＭＰＣ又はそのサ
   ブユニットを単離する： ｆ）ＯＭＰＣ又はそのサブユニットを官能基化して反応
   性親電子又は求核部分を示させる： ｇ）工程（ｄ）の多糖を工程（ｆ）のタンパク質と結合
   させる： ｈ）結合体をキャップ形成して残留官能基を除去する： ｉ）結合体生成物を単離する： ことを特徴とするＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ結合体の製造方
   法。
8. 【請求項８】 請求項７における工程（ｂ）及び（ｃ）
   が（ｂ）１−場合により溶液pH約５においてアニオン不
   純物をワットマンＤＥ５２に吸着させる ２−溶液としたＰｎ−Ｐｓを 1. ５０〜１５０℃で１〜４８時間加熱する又は 2. 音波処理プロープの粉末条件により５秒〜５分間音
   波処理し、次いで冷却し、更に音波処理する又は 3. 約２０００〜１５０００ＰＳＩ圧力下ゴーリンプレ
   スで剪断することによって、所定の粘度まで部分加水分
   解して、抗肺炎連鎖球菌型特異的抗体に対する結合を粗
   Ｐｎ−Ｐｓと比較した場合３０％以上は減少させない： （ｃ）加水分解Ｐｎ−Ｐｓを分画し分子量１×１０⁵ 〜
   １×１０⁶ を有する画分を ｉ−所定濃度のイソプロパノールを用いて分別アルコー
   ル沈澱して所望のＰｎ−Ｐｓサイズを沈降させる又は ii−５×１０⁴ 〜１×１０⁶ サイズの多糖類を取りこみ
   かつ分画することができる分子ふるい液体クロマトグラ
   フィーカラムによる分画によって選択することを特徴と
   し、表に挙げた多糖それぞれの加水分解又は剪断の終末
   点は、その亜型Ｐｎ−Ｐｓの終末点に従い０．１％リン
   酸ナトリウム１mg/ml 溶液pH７．２の粘度又はクロマト
   グラフィーによって定量される： Ｐｎ−Ｐｓ亜型 標的終末 標的終末 粘度 Ｋｄ（ピ−ク） （センチストークス） Ｐｎ４−Ｐｓ １．５−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ １．３−１．００ ０．６０±０．０５ Ｐｎ９ｖ−Ｐｓ １．３−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ１４−Ｐｓ １．１−０．９５ ０．６０±０．０５ Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ １．５−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ １．３−１．００ ０．６５±０．０５ Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ １．５−１．００ ０．５４±０．０５ ことを包含している請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 該結合体の免疫学的有効量を哺乳類に投
   与することを特徴とする請求項１記載の結合体の使用方
   法。
10. 【請求項１０】 請求項１の結合体と不活性担体を包含
    し、任意にアジュバント又は免疫調節化合物又は別の免
    疫原の免疫学的有効量を包含し、該不活性担体が水酸化
    アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバンであ
    り、該別の免疫原が肝炎Ｂ、肝炎Ａ、非Ａ−非Ｂ肝炎、
    エイズ、ジフテリア−百日咳−破傷風、麻疹、おたふく
    かぜ、風疹、水痘、ポリオ及びヘモフィルスインフルエ
    ンザｂに対するワクチンの１種以上の中から選択され、
    結合体がＰｎ４−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ−Ｏ
    ＭＰＣ、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１４−Ｐｓ−
    ＯＭＰＣ、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１９Ｆ−
    Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１
    −Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ５−Ｐｓ−ＯＭＰＣ及びＰｎ７
    Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣから選択される結合体の１種以上を
    包含しているワクチン組成物。