KR100243958B1 - 뉴모코커스 다당류 결합체 백신 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

면역원성 담체 단백질에 결합된, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 세균(뉴모코커스, Pn)으로부터의 부분적으로 가수분해되고, 고도로 정제된 캡슐형 다당류(Ps)를 포함하는 신규한 결합체 백신이 신규한 방법에 의해 제조된다. 본 발명의 결합체는 뉴모코커스 감염의 예방에 유용하다. 1개 내지 10개의 상이한 뉴모코커스 다당류-면역원성 단백질(Pn-Ps-PRO)로부터의 혼합물을 포함하는 백신은, 다당류 성분이 유도되는 동원(cognate) 병원체에 대한 광범위하게 예방적인 수령자 면역 반응을 유도한다. 통상적으로 단독의 Pn-Ps에 대해 예방적 면역 반응을 가질 수 없는 어린이 및 2세미만의 유아가 본 발명의 Pn-Ps-PRO 결합체로 예방접종되는 경우 예방적 면역 반응을 나타낸다.

Description

뉴모코커스 다당류 결합체 백신 및 이의 제조방법

스트랩토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae : 뉴모코커스, Pn)로 분류되는 병원성 세균은 유기체의 캡슐형 다당류 (Pn-Ps)를 근거로 하여 84개의 항원성 혈청형으로 세분된다. 상기 유기체로 인한 질병 상태는 폐염, 수막염, 중이염, 균혈증, 및 만성 기관지염, 정맥동염, 관절염 및 결막염의 급성 재발병을 포함한다. 그러나, 상기 질별들의 우열성은 84개의 공지된 분리물의 제한된 부집합에 의해 야기된다. 따라서 유기체의 가장 우세한 병원성 분리물로부터의 Pn-Ps를 함유하는 다가 백신은 매우 높은 퍼센트의 가장 빈번히 보고되는 이러한 부류의 병원균에 대한 예방을 제공할 수 있다.

성인에 있어서의 뉴모코커스에 대한 예방적 면역 반응을 야기시키는데 있어서 효험이 있는 다가 백신이 제조되었다. 예를 들어, "PNEUMOVAX 23" (뉴모코커스 다가 백신. MSD, 참조: PDR, 1990 edition, p 1431)은 23개의 상이한 비결합된 뉴모코커스 다당류(이들은 모두 ATCC에 기탁되어 있으며 본 발명을 위한 출발 물질중 하나의 가능한 공급원을 제공한다)를 각각 50㎍/㎖ 함유하는 액체 조성물이다. "PNEUMOVAX 23"은 각각 하기의 유리 다당류, 즉 비결합된 다당류: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F를 포함하는데, 이것은 뉴모코커스 혈액 분리물의 약 90%를 나타내는 것이다. 그러나, 이러한 백신은 뉴모코커스 감염의 위험이 가장 큰 집단, 즉 면역예방을 위해서 T 세포 반응에 의존하는 B 세포 면역 약화된(B cellimmunocompromised) 사람, 노인 및 2세 미만의 유아 집단 부분에서는 가장 덜 효과적이다. 비결합된 다당류가 T-세포 면역 반응의 불량한 유도제이기 때문에, T-세포 반응을 유도할 수 있는 면역원으로의 Pn-Ps의 전환은 이러한 표적 집단(target population)에서 적당한 예방을 제공하는데에 가장 중요하다. 그러나, 이의 용도는 이러한 개별적 그룹으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 신규한 결합체를 포함하는 백신을 임신전 또는 임신동안 포유동물의 암컷에게 투여하는 것은 백신이 태아 또는 유아에게 직접 투여되지 않았음에도 불구하고 자라나는 태아 및 젖먹이 유아를 수동적으로 예방할 수 있는 항체를 모체내에서 발생시킨다. 이러한 결합체 백신은 또한 위험군 집단, 예를 들어, 신생아 또는 감염된 환자들의 형제와 같은 집단의 궁극적인 수동적 예방을 위한 항체를 유출시키기에 유용한 것으로 판명되어야 한다.

그 자체로는 면역완성이 불량한 것으로 밝혀진 다당류는 일단 면역완성 단백질인 PRO에 결합되면 매우 양호한 임뮤노겐(immunogen)이 되는 것으로 나타났다 [참조: Marburg et al.. 미합중국 특허 제4,695,624호: Schneerson et al.. New dev.. with Hum. ＆ Vet. Vaccines. 77-94 (1980): Schneerson et al.. J. Exptl. Med..152, 361 (1980): Anderson, infection and immunity, 39, 233 (1983)]. 그러나, 이러한 결합체의 제조에 있어서의 주요한 문제는 다당류 출발물질의 점성 및 비-균질 특성으로 인하여 결합체 생성물을 화학적 규명하는데 어려움이 있다는 것이다. 따라서, 출발 물질이 가능한 잘 규명되고 합성 경로의 각 단계가 형성되는 중간체에 대해 분석가능한 방법이 요구된다. 본원에 기술된 방법은 Pn-Ps가 유도되는 동종 병원균(cognate pathogen)에 대한 고도의 면역원성 결합체 임뮤노겐을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다. 결합체는 2세 미만의 유아에게 유용하다.

Marburg 등 [참조: J. Am. Chem. Soc., 108, 5282(1986) 및 미합중국 특허 제4,695,624호; 제4,830,852호: 제4,882,317호]은 이속성 스페이서(bigeneric spacer)를 통한 다당류와 면역원성 단백질을 결합시키는 방법을 기술하고 있다. PRO는 펜던트(pendant) 친핵성 또는 친전자성 그룹(PRO")을 나타내도록 유도화되는 반면, 파트너 Ps는 반대쪽 반응성의 펜던트 그룹(Ps")을 나타내도록 작용화된다. Ps"를 PRO"와 결합시키는 동안, Ps를 PRO에 공유적으로 결합(Ps-PRO)시키는 이속성 스페이서가 형성된다. 산 가수분해동안, 이속성 스페이서는 이상한 아미노산으로서 방출되고, 아미노산 분석에 의해 정량되어 고유성을 증명하는 방법을 제공한다.

본 발명은 미합중국 특허 제4,695,624호; 제4,830,852호 및 제4,882,317호에 기술되어 있는 방법을 능가하는 개선된 방법을 기술하고 있다. 개선된 방법은 조 Pn-Ps 제제에 의해 제공되는 것보다 더 특이적이고 재생가능하고 다루기 쉬운 물리적 특성, 즉 증가된 용해도, 증가된 여과도, 증가된 순도 그룹 특이적 C 다당류 (C-Ps)에 의한 오염의 감소], 감소된 분자량, 다중 분산도 및 점도를 포함하는 물리적 특성을 갖는 Pn-Ps 출발 물질의 제조를 포함한다. 본원에 기술된 생성된 결합체는 증가된 일관성 및 제조의 용이성, 최종 생성물의 개선된 항원성 및 개선된 순도의 관점에서 미합중국 특허 제4,695,624호에 기술된 방법에 의해 제공되는 것보다 개선되어 있다.. 미합중국 특허 제4,695,624호에서의 예비-결합 Ps 제제와 비교하여 예비-결합 Pn-Ps에서의 그룹 특이적인 C-다당류 및 펩티도글리칸의 3 내지 20배 감소는 특히 중요하다. C-다당류 오염물의 존재가 타입 특이적 항원에 대한 면역 반응을 방해하지 못함에도 불구하고, C-Ps는 덜 특이적으로 되는 결합 반응에 참여하여 타입-특이적 Ps를 위해 조절될 수 있다. 더욱이, 항-C-다당류 항체의 제조는 몇몇 해결되지 않은 뉴모커커스 감염에서 관찰되는 조직 파괴와 관련될 수 있다.

신규한 결합체 생성물외에, 본 발명은 부분적으로 가수분해되고, 고도로 정제된 뉴모코커스 다당류 중간체를 제조하는 신규한 방법, 1 내지 10개의 상이한 결합체를 포함하는 신규한 조성물 및 본 발명을 이용하는 방법을 기술하고 있다. 이중에서도 특히 중요한 관심의 대상은 "PNEUMOVAX 23" (뉴모코커스 다가 백신, MSD; 참조: PDR, 1990 edition, P. 1431)에 포함된 캡슐형 다당류이다. 가장 바람직한 부집합은 스트랩토코커스 뉴모니애 아형 6B, 23F, 19F, 14, 18C, 4 및 9V의 캡슐형 다당류인데, 왜냐면 상기 소 그룹의 뉴모코커스 아형이 유아 및 어린에서 75 내지 85%의 뉴모코커스 감염에 관여한다고 평가되어 있기 때문이다. 본원에서 제공되는 방법은 뉴모코커스 및 기타 세균성 다당류의 광범위한 수집에 적용시킬 수 있다.

고도로 화학적으로 규명된 뉴모코커스 다당류 (Pn-Ps)는 조 Pn-Ps 제제를 Pn-Ps의 항원적 보존성을 유지하기 위해 예정된 종점으로 부분적으로 가수분해시킴에 의해 제조된다. 부분적으로 가수분해된 Pn-Ps는 실질적으로 정제되며 Pn-Ps-면역원성 단백질(PRO) 결합체(Pn-Ps-PRO)의 제조에 유용하다.

외막 단백질 복합체(OMPC) 또는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) b, 또는 이의 재조합체 또는 정제된 아단위(예: MIEP) 또는 우세한 뉴모코커스 분리물로부터 부분적으로 가수분해되고 고도로 정제된 Pn-Ps 중간체에 공유적으로 결합된 기타 면역원성 담체 단백질을 포함하는, 본 발명의 신규하고 고도의 항원성인 Pn-Ps-PRO 결합체는 포유동물에서 뉴모코커스 감염의 예방을 위해 유용하다. 결합체는 T-세포 반응을 유도하기 때문에, 포유 동물, 특히 B-세포 면역 약화된 사람, 노인 및 2세 미만의 유아에서 항-뉴모코커스 면역 반응을 자극하기 위한 백신 조성물에 특히 유용하다. Pn-Ps-OMPC 및 Pn-Ps-MIEP 결합체는 스트랩토코커스 뉴모니애(뉴모코커스, Pn)의 배양물로부터 캡슐형 Ps를 분리하는 단계, Pn-Ps를 부분적으로 가수분해하거나 물리적으로 절단시킨 다음, 상기 Pn-Ps를 분별하여 감소된 분자 크기, 다중분산도 및 점도를 갖는 Pn-Ps 생성물을 수득하는 단계, 및 이 Pn-Ps를 OMPC 또는 MIEP에 공유적으로 결합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.

본 발명의 목적은 Pn-Ps 및 면역원성 단백질의 T-세포 의존성 결합체의 제조에서 중간체로서 유용한, 신규하고 부분적으로 가수분해되고 고도로 정제된 항원적으로 타입-특이적인 뉴모코커스 캡슐형 다당류(Pn-Ps)를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 특히, 2세 미만의 유아 및 B-세포 면역 약화된 사람들에서 뉴모코커스 감염을 예방하기 위한 백신 조성물에 유용한 Pn-Ps 및 면역원성 단백질의 T-세포 의존성 결합체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 공유결합성 뉴모코커스 다당류-면역원성 단백질 결합체(Pn-Ps-PRO)의 형성을 위해, 미합중국 특허 제4,695,624호에서 제공된 방법보다 개선된 방법을 제공하는 것인데, 개선점은 출발물질 Pn-Ps, 중간체, 최종 생성물의 우수한 화학적 규명 및 순도, 증가된 일관성 및 이 방법을 수행하는데 있어서의 용이성으로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 목적은 특히 2세 미만의 유아 및 면역 약화된 사람에서 병원성 뉴모코커스에 대한 예방적 혈청 항체를 유도하기에 유용한, T-세포 의존성을 증명하는, 개선된 방법에 따른 화학적으로 규명된 Pn-Ps-PRO 결합체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 백신 제형에서 면역학적 유효량이 상기 결합체를 사용하여, 뉴모코커스로 인해 유발된 질병, 예를 들어, 중이염, 수막염, 폐염, 균혈증, 및 만성 관절염, 정맥동염, 기관지염 및 결막염의 급성 재발병을 예방하기 위한 치료 방법을 제공하는 것이다.

A. 신규한 Pn-Ps-PRO 결합체 및 다당류 중간체:

본 발명의 Pn-Ps-PRO 결합체 생성물은 Pn-Ps 대 PRO의 비가 0.05 내지 0.5mg 다당류/단백질 mg이며, 높은 공유도를 가지며, 유리 Pn-Ps에 의한 결합체의 오염 수준이 최소이며, 신규한 성분의 다당류에 의해 부여되는 독특한 물리적 및 화학적 특성을 갖는다.

결합체는 신규하고 부분적으로 가수분해되고 고도로 정제된 뉴모코커스 캡슐형 다당류 (Pn-Ps)에 스페이서를 통해 공유적으로 커플링되어 있는 면역원성 단백질(PRO)을 포함한다. 면역원성 단백질은 바람직하게는 나이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitdis) b의 배양물로부터 유도된 외막 단백질 복합체(OMPC)이다. OMPC를 제조하기 위한 한가지 방법은 미합중국 특허 제4,271,147ghdml 실시예 1에 제공되어 있는 것과 본질적으로 같다. 달리는, OMPC의 해리에 의하거나 이의 재조합체 발현에 의해 생성되는, MIEP와 같은 OMPC의 아단위가 또한 바람직하다. 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 방법이 미합중국 특허원 제555,978호; 제555,329호 및 제555,204호(Merek Case # 18110, 18159 및 18160, 1990년 7월 19일 출원)의 실시예 2, 16 내지 23에 제공되어 있다.

신규하고 부분적으로 가수분해되고 고도로 정재된 뉴모코커스 캡슐형 다당류(Pn-Ps)는 (하기에서 신규한 결합 공정을 기술하는 단락 및 실시예 3 내지 10에서 기술된 바와 같이) 뉴모코커스 아형중 하나의 배양물로부터 기원한 항원성 다당류의 제제이다. Pn-Ps는 평균 분자량이 약 1 x 106 D이며, 평균적으로 분자당 약 1000개 미만의 반복 단위를 가지며, C-다당류 오염 수준이 약 3% 미만이며, 항원성 지수가 0.4 내지 1.1, 바람직하게는 0.7 내지 1.1이다. 항원성 지수는 ATCC에 기탁된 조 Pn-Ps와 비교하여 신규한 Pn-Ps의 단위 질량당 나타나는 항-뉴모코커스 타입-특이적 항체 결합의 상대량이다. 더욱이, 신규한 Pn-Ps는 면역원성 단백질과 결합하여 본 발명의 Pn-Ps-PRO 생성물을 생성시킨다. 2개의 상이한 Pn6B-Ps 및 2개의 상이한 Pn23F-Ps 제제의 몇몇 물리적 및 화학적 특징이 하기 표Ⅰ에 주어져 있는 반면, 하기 설명은 이러한 특징을 측정하는 방법을 보여준다. 하기 기술된 방법은 매우 다양한 뉴모코커스 아형, 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7f, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 10, 22F, 23F 및 33F 중에서 선택된 아형을 포함하지만 이로써 제한되지 않는 각종의 뉴모코커스 아형을 사용하여, Pn-Ps 중간체 및 Pn-Ps-PRO 결합체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 언급한 바와 같이, 뉴모코커스 다당류의 바람직한 부집합은 뉴모코커스 아형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 중에서 기원한 것들이다. 따라서, Pn1-Ps 및 Pn5-Ps 는 나이세리아 메닝기티디스 B, C 또는 그룹 B 스트렙토코커스 다당류에서 처럼, Pn4-Ps 또는 Pn9V-Ps와 유사하게 처리될 수 있는 반면 Pn7F-Ps는 추가로 하기에 기술되는 바와 같이 Pn14-Ps와 유사하게 처리될 수 있으며 다가 백신에 포함될 수 있다. 또한 Pn6B-Ps의 포함에 의한 Pn6A에 대한 예방은 가교 반응성 항체에 의해 제공될 수 있음이 당해분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이것은 또한 많은 기타 뉴모코커스 아형에 대해서도 가능하다.

다가 백신은 각각 주어진 Pn-Ps 아형으로 별개 제조된 상이한 Pn-Ps-PRO 결합체의 혼합물을 포함하는 것들이다. 또한, 다가 백신은 몇몇 상이한 Pn-Ps 아형이 1회에 또는 연속적으로 주어진 PRO에 모두 결합되는 것들이다.

1. 신규한 다당류 중간체의 특징:

부분적으로 가수분해되고 정제된 뉴모코커스 캡슐형 다당류 중간체의 물리적 및 화학적 특징은 이들이 기원한 뉴모코커스 아형에 의존적이며 이들의 조작은 본 원에 기술된 방법에 따라 수행한다. 일반적으로, Pn-Ps 중간체는 조 세균 배양물에서 기원한 다당류와 비교하여 2 내지 10배 적은 분자 크기 및 다중분산도를 갖는다. 감소된 크기의 유리 Pn-Ps의 결합 및 후 결합 제거동안 다당류 처리의 개선, 높은 Pn-Ps 순도/균질성, 낮은 Pn=Ps 분자-그기의 다중분산도 및 본질적으로 변형되지 않은 항원성을 가능하게 한다. 이들 신규한 Pn-Ps-PRO 생성물의 일관된 형성에 중요하게 기여한다.

ⅰ. Pn-Ps 분자량 및 다중분산도:

중량-평균 분자량MW를 확산, 침강 또는 크로마토그래피 방법으로 측정하고, 수-평균-분자량 MN을 점도, 빙점 강하 또는 비점 상승과 같은 총괄적인 특성에 의해 측정함으로써, Pn-Ps 제제의 다중분산도를 MW/MN 비로서 수득한다. 이 수가 일관될수록, 다당류 제제는 더 균질하다. 다수의 Pn-Ps 제제의 다중분산도가 본원에 주어져 있으며 상기 향상된 균질성을 달성하기 위한 바람직한 방법이 또한 기술되어 있다.

당해 분야에 공지된 방법에 따라, 각각 조악하고 부분적으로 가수분해된 Pn-Ps 제제의 분할 계수=식(Vo= 컬럼 공극 용적; Vi= 총 투과 용적; Ve= 샘플의 용출 용적; Kd= 샘플의 분할 계수)는 다당류의 분취량의 크기-배출 크로마토그래피(SEC) 또는 고 성능 크기-배출 크로마토그래피(HPSEC)에 의해 당해 분야에 공지된 방법에 따라 측정한다. 이렇게 수득된 Kd는 다당류 제제의 평균 유체역학 용적의 측정치이다. Pn-Ps의 분자 크기는 기술된 방법에 따른 물리적 절단, 또는 열 또는 초음파 가수분해에 의해 감소되기 때문에, Pn-Ps의 용출 용적 Ve는 증가되고 Kd 값도 증가된다.

상기 목적을 위해 바람직한 컬럼 매트릭스는 SEPHAROSE CL2B 겔 (Pharmacia No. 17-0120-01)이다. 컬럼 공극 용적(Vo)은 Blue Dextran 2000 (Pharmacia No. 17-0360-01)을 사용하여 염화나트륨 염 피이크로부터의 총 투과 용적(Vi)으로 측정한다. 하나의 방법에 따라, Pn-Ps 샘플은 증류수중에 2.5mg/ml의 농도로 제조하고 1ml들이 주입 용적을 사용한다. Vo/Vi 비는 0.32 내지 0.37의 범위내에 있어야 한다. Dextran T500 (pharmacia No. 17-0320-01)에 대한 Kd는 0.37 내지 0.49이어야 한다. 바람직한 HPSEC 시스템은 50℃로 가열되는 7.5 x 600mm TSK G6000 PW 컬럼을 포함한다.

매우 바람직한 방법에서, SEC 또는 HPSEC는 용줄 용적의 함수로서 상대적 분석물 농도를 모니터링하는 차동 굴절계와 연결시킨다. 일반적 검량 곡선[log(고유 점도 x 분자량)/보유용적]은 일련의 단독 분산물인 폴리에틸렌 옥사이드 표준물의 분석으로부터 작성한다. 농도 및 특이적 점도 프로파일은 샘플에 대한 분자량/용출 용적 프로파일을 계산하기 위해 사용될 수 있으며, 이어서 Mn 및 Mw에 대한 값을 계산하고, 이로부터 다중분산도 지수(MW/Mn)를 계산하기 위해 사용될 수 있다[참조: Yau. W. W. 및 Rementer, S. W., J. Liq. Chromatog., 13. 677-691 (1990); Benoit, et al., J. Ch. Phys. Jome., 63, 1507-1514 (1966)]. 본 발명에서 고유 점도는 0.1M 인산나트륨 완충액 (pH 7.2)중에서 측정한다.

일단 Pn-Ps 제제의 평균 분자량이 측정되면, 분자당 반복 단위의 평균 수는 중합체 분자량을 반복 단위의 분자량으로 나눔으로써 용이하게 측정된다(표 2 참조).

ⅱ. Pn-Ps-타입의 특이적 항원성 보존성

각각의 조 Pn-Ps를 물리적 절단, 또는 화학적, 열, 초음파 또는 효소적 가수분해에 적용시키는 경우 항원성 통합이 소산되기 시작하는 종점을 확립하도록 하는 것이 중요하다. 이 종점은 당해 분야에 공지된 여러 면역학적 시험중 어떤 것과 점도를 상호관련시킴으로써 편리하게 확립한다. 바람직한 방법에서, 다당류 용액의 분취량은 뉴모코커스 아형 특이적 항체를 사용하여 오우크터로니 (Ouchterlony) 이중 면역확산 검정법으로 측정한다. 확산후 인접한 웰에 잇는 조 Pn-Ps의 샘플의 침전 밴드와 결합하는 백색 침전 밴드의 한천에서의 출현은 반응물의 정성적 동일성 및 다당류의 항원적 통합이 온전하게 보전된다는 증거를 제공해준다. 더욱 정량적인 면역학적 검정은 비탁도 검정법(rate nephelometry analysis) 또는 RIA로 달성된다.

비탁도 측정은 항원-항체 복합체의 형성동안 산란되는 빛의 강도에서의 변화 또는 변화 속도를 측정하는 것이다. 반응은 빛의 빔이 통과하는 반응 세포에서 수행한다. 본 경우에서, 복합체, 즉 Pn-Ps는 특이적 항체(Ab)가 이의 특이적 항원(Ag)과 반응하는 경우 용액에서 발생되는 면역침전 반응에 의해 형성된다. Ag-Ab 복합체의 형성은 적정 비율에서 Ag 및 Ab 분자의 존재량에 의존적이기 때문에, Ab의 일정량에 대한 복합체 형성의 정도는 Ag의 양을 최대 수준까지 사용하면 증가되고; 그보다 더 많은 양의 Ag는 복합체가 덜 형성되게 한다. 따라서, Ab의 일정 수준을 유지하고 증가된 농도의 Ag를 사용하여 빛 산란을 측정함으로써, 표준 곡선을 수득한다. 표준 곡선을 수득하기 위해 사용된 동일한 조건하에서 샘플을 이의 특이적 Ab와 반응시키는 경우, Ps(또는 유도체화된 Ps)에 대한 Ag 농도를 계산할 수 있다.

비탁도에 의해 면역학적으로 계산된 농도와 (색도계, 굴절 지수 또는 총 가수분해 및 단당류의 정량에 의해 하기 참조) 화학적 또는 물리적으로 수득된 농도의 비교는 Ps 샘플에 대한 항원성의 지수로서 수득된다. 다당류의 건조중량 분석은 분말 제제의 휘발성 물질 함량이 공지되어 있는 경우에만 적당하다. 다당류는 매우 흡습성이며, 5 내지 30중량%의 휘발성 물질 어느것이나 함유할 수 있다. 이와 같이, 다당류 자체의 건조 중량 측정값은 특히 믿을 수 없다. 합리적인 정확성을 갖는 다당류 농도를 측정하기 위해 사용되는 하나의 방법은 색도계 검정법에 의한 것이며, 이 검정법은 중요한 다당류의 표준 용액을 사용하여 검량한다. 예를 들어, Pn6B-Ps, Pn18c-Ps, Pn19F-Ps 및 Pn23F-Ps는 Dische 및 Shettles[참조: J. Biol. Chem., 175, 595-603 (1948)]의 메틸 펜토즈 검정에 의해 모두 정량할 수 있다. Pn4-Ps, Pn9V-Ps, Pn14-Ps 및 Pn19F-Ps는 헥소스아민 함량에 의해 정량할 수 있으며 Pn9V는 또한 우론산 함량에 의해 정량할 수 있다. 페놀-황산 검정[참조: Dubois et al., Anal. Chem., 28, 350-356(1956)]은 결합체 제조동안 과정둥에 시험되는 부분으로서 모든 이들 Pn-Ps 제제를 정량하는데 유용하다. 사용되는 기타 방법은 분석물 질량의 측정값으로 굴절 지수 시그날을 사용하는 것이며, 또한 중요한 다당류의 표준 용액을 사용하여 검량한다. 색도계 검정을 유도체화 및 결합 과정동안 샘플중 다당류 함량을 모니터링하기 위해 사용할 수 있음에도 불구하고, 이 방법은 HPSEC 공통의 검량 분석에 의한 다당류 제제의 물리적 특징화 동안 및 항원성 지수 계산에 사용한다. 출발 조 Pn-Ps의 항원성 지디 값은 1.0으로 할당한다. 항원성의 상대 지수는 실험 샘플에 대해 계산하며, 0.4 내지 1.1의 값이 만족할만한 것으로 생각된다. 다당류가 가수분해 및 분별 단계동안 극도로 정제되는 경우 1.0 초과의 항원성 지수를 얻는 것이 가능하다. 크기의 감소 만으로도 다당류 분자의 가요성을 증가시켜 항원성 에피토프 주위의 입체 간섭을 감소시킴으로써 제제의 항원성 지수를 증가시킬 수 있다는 것이 또한 이론적으로 가능하다. 상기 측정들은 가수분해되고 분별되고 유도체화된 Ps 샘플을 위해 공정중 체크함으로써 수행한다. 0.4 미만의 상대적 항원성을 갖는 샘플은 거부되는데, 즉 결합되지 않는다. 뉴모코커스 다당류를 특징화하는데 있어서 유용한 항-Pn-Ps 항체 제제가 획득가능하다. 항-Pn-Ps 항체의 공급체에는 헬스 리서치 인코포레이티드(Health Research, Inc., Albany. NY.) 및 스테이턴 세런 인스티튜트(Staten Serun Institute)가 포함된다. 달리는, 타입-특이적 항-Pn-Ps 항체가 당해 분야에 공지된 방법에 따라 상기 목적을 위해 면역원으로서의 시판용 조 Pn-Ps를 사용하여 제조될 수 있다[참조: Baker et al., Immunology 20, 469 (1971); Brooke, M. S., J. Immunol., 95, 358(1966): Kearney, R. and Halladay, W. J., Aust. J. Exp. biol. Med. Sci, 48, 227 (1970); Schneerson, R. et al., Prog. Allergy, 33, 144(1983); Robbins, J. B. Infect. Immum., 26 1116 (1979)].

보유된 항원적 보존성의 추가의 징후는 Pn-Ps 제제의 정확한 화학적 조성의 유지이다. 예를 들어, Pn6B-Ps는 반복 단위[α-Gal(1-3)-α-Glu(1-3)-α-L-Rhap(1-4)-D-리비톨-5-PO4(2)]를 함유함으로써 탄수화물 성분인 리비톨:람노즈:갈락토즈:글루코즈의 몰비가 약 1:1:1:1이 되도록 한다. 이러한 비는 약 2시간 동안 45 내지 65℃에서 36% 불화수소산을 사용하고 이어서 10 내지 20시간 동안 100℃에서 2M 트리플루오로아세트산을 사용하여 다당류를 가수분해하고 펄스된 전류 적정 검출을 사용하여 고 성능 음이온 교환 크로마토그래피하는 동안 측정될 수 있다. 따라서, 대략 동몰량의 탄화수소 성분을 나타내는 4개의 피이크는 유지된 보존성의 징후이다. 본질적으로 탄수화물 성분의 이론적 비는 약 20% 이내로 본 발명의 모든 신규한 Pn-Ps 성분을 유지한다. 이론적 값으로부터의 이탈은 본 방법의 분야에서의 제한점에 주로 기인한다. 따라서, 총 가수분해 동안: Pn23F-Ps는 글리세롤:람노즈:갈락토즈:글루토즈의 비가 약 1:2:1:1이며, Pn14-Ps는 N-아세릴-글루코스아민:갈락토즈:그루코즈의 비가 약 1:2:1이며; Pn19F-Ps는 람노즈:N-아셀린-만노스아민:글루코즈의 비가 약 1:1:1이고; Pn18C-Ps는 글루코즈:갈락토즈:람노즈:글리세롤:아세테이트의 비가 약 3:1:1:1:1이며; Pn9V-Ps는 글루코즈:갈락토즈:N-아세틸-만소스아민:글루투론산:갈락투론산: 아세테이트의 비가 약 2:1:1:1:1:1.7이며; Pn4-Ps는 N-아세틸-만노스아민:N-아세틸-푸코스아민:갈락토스아민:갈락토즈:피루베이트의 비가 약 1:1:1:1:1이다. 또한 최근에 Pn4-Ps가 추가의 성분을 함유한다는 것이 밝혀졌는데, 이것은 HPLC 분석에 의해 확인되었으며, Pn5-Ps에서와 마친가지로 2-아미노뉴모스아민(2-아미노-2.6-디데옥시탈로즈)인 것으로 나타났다[참조: Barker e al., Carbohydrate Res.,224-233 (1966)]. 또한 Pn19F-Ps도 추가의 성분을 가지는데, 아마도 헥소스아민을 가지는 것 같으며, 이러한 사실은 문헌에 보고되어 있지는 않고 정확한 동정은 여전히 진행중이다. 상기 및 추가의 이론적 다당류 반복 조성물은 문헌[참조: J. E. G. van Dam et al., Carbohyd. Res. 187,267 (1988): H. J. Jennings, Adv. Carbohyd. Chem. 41., 155(1983)과 내부 참조 문헌, 및 J. C. Richards 및 M. Perry, Biochem. cell. Biol, 66, 758 (1988)]에 보고되어 있다. 탄수화물 성분이외에, 중요한 몇몇 Pn-Ps 에는 포스페이트, 아세테이트 및 피루베이트 부 그룹이 존재하며, 이들중 몇몇은 면역적으로 우세한 특성을 나타낸다. 이와 같이, 상기 성분들도 또한 모니터링될 수 있다 (실시예 30 참조). 또한 단당류의 정량은 샘플중 다당류 농도를 정량하기 위한 유용한 수단이다.

대상 다당류의 항원성에 있어서 추가의 요소는 다당류에서 "구조적 에피토프(conformational epitope)"라고 불리는 것의 유지이다[참조: Wessels, M. R. 및 Kasper. D. L., J. Exp. Med.,169, 2121-2131 (1989)]. 항원성의 이러한 수준은 당류의 고분자량 형태에서만 발현되는 것으로 나타나며, 본원에 기술된 방법들은 또한 다당류 면역원성의 이러한 수준의 예방에서 유도된다.

ⅲ. C-다당류에 의한 최소 오염 수준

또 하나의 중요한 매개변수는 C-다당류 불순물의 수준이다. 이 값은 다당류 제제의 종 산 가수분해, 가수분해물의 크로마토그래피 및 콜린의 전도도 검출에 의해 보여질 수 있다[참조: Hermans et al. Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 107, 600 (1988)]. 달리는, 비-가수분해된 다당류는 콜린에 대한 NMR에 의해 분석할 수 있다. NMR 기술은 C-Ps 함량을 계산하기 위해 (기타 Pn-Ps에 대한 상이한 시그날인 람노즈를 함유하는 Pn-Ps에 대하여) 람노즈 메틸 시그날에 대한 콜린 시그날의 비를 사용한다. 크로마토그래피 방법은 C-Ps 함량을 계산하기 위해, 전도도 검정에 의해 측정되는 다당류 함량에 대한 또는 Pn-Ps 성분 피이크중 하나에 대한 콜린 시그날의 비를 사용한다. 두 가지중 어느 방법에서도, 표준의 공지된 콜린 농도가 C-Ps 이론적 반복 구조를 사용하여 다당류 제제에 존재하는 콜린의 수준을 직접 계산할 수 있으므로 (Herman et al, 상기 참조), 다당류 제제에서 C-Ps의 농도가 측정된다. Pn-Ps 샘플의 다당류 농도는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 측정한다. 예를 들어, 총 다당류 농도는 다당류의 총 가수분해 및 특이적 단당류의 농도의 측정에 의해 측정될 수 있다. C-Ps 농도를 총 다당류 농도에 비교함으로써, C-다당류 오염도(W/W)를 측정한다. 총 다당류중 3% (W/W) 미만의 C-다당류 수준이 허용되는 것으로 생각되지만 더욱 바람직하게는 1% 미만의 수준이다.

2개 로트의 Pn6B-Ps 및 2개 로트의 Pn23F-Ps의 화학적 및 물리적 특성은 하기 표 1에 요약되어 있다. 이들 데이터는 본원에 기술된 신규한 방법으로부터 생성된 로트 대 로트 파라메터의 재생성을 보여준다.

[표 1]

하기 표 2에서, 수개의 조 뉴모코커스 다당류 및 상응하는 가수분해되고 분별된 (Hyd + frac) 본 발명의 신규 화합물의 화학적 및 물리적 파라메터가 나타나있다. 기재되어 있는 수는 제조될 복합체 다당류 화합물을 검출하기 위한 실험적 오차 및 한계내에 접근됨을 나타낸다.

[표 2]

2. 신규한 Pn-Ps-PRO 결합체의 특징:

ⅰ. Pn-Ps의 동정 및 양의 분석:

항원성(보존성)을 확인하고 Pn-Ps-PRO 비를 계산하기 위해서는 독립적 기술에 의해 최종 결합체에서 Pn-Ps의 양 및 화학적 보존성을 증명하는 것이 매우 유용하다. 하나의 방법은 2M TFA를 사용하여 100℃에서 각각 특정한 Pn-Ps를 위한 적정 가수분해 시간에 따라 5 내지 16시간 동안 총 가수분해하는 것을 포함한다. 동량의 Pn-Ps-PRO 결합체 및 PRO 가수분해물(Lowry 단백질계)을 펄스된 전류계적 검출을 사용한 고 성능 음이온 교환 크로마토그래피로 분석하여 단당류 프로파일을 수득한다. PRO에 대한 프로파일은 예를 들어, OMPC 중에 존재하는 지방다당류(LPS)로부터의 PRO에 의해 공여된 단당류를 보정하기 위해, Nelson 프로그램과 같은 적당한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 Pn-Ps-PRO 결합체의 프로파일로부터 "삭제"한다. 그 다음에 결합체중 Pn-Ps의 양을, 공지된 양의 유도체화된 Pn-Ps 가수분해물 및 보정된 Pn-Ps-PRO 결합체의 프로파일을 비교하여 계산한다. 또한 Pn-Ps-PRO 비는 상기 방법으로 측정한다.

ⅱ. 결합 및 캐핑(capping)을 나타내는 신규한 아미노산의 분석:

Pn-Ps의 PRO로의 결합에 이어서, 결합체의 샘플을 6N HC1 중에서 가수분해하고 아미노산 분석을 수행한다. 이 방법은 S-카복시메틸-호모시스테인(S-CMHC) 및 S-카복시메틸 시스테아민(S-CMCA)과 같은 독특한 아미노산의 존재 및 양을 검출한다. 상기 아미노산 S-카복시메틸-호모시스테인(S-CMHC)은 하기 방법에서 기술되는 바와 같이 유도체화된 Pn-Ps와 PRO사이의 화학적 반응에 의해 화학적 결합 일부로서 만들어지며 유도체화된 Pn-Ps의 PRO로의 공유결합의 명확한 증거로서 채택된다. 이러한 공유 결합의 형성은 결합체 백신의 T-세포 면역원성에 필수적이다. 결합 반응을 완결한 직 후, 미반응된 브로모아세트아미드 잔기를 N-아세틸 시스테아민으로 캐핑시킨다. 이러한 결합의 가수분해는 S-카복시메틸 시스테아민(S-CMCA)의 방출을 초래하며, 이것은 또한 아미노산 분석에서 검출된다. 상기 아미노산의 검출은 반응성 브로모아세트아미드 그룹의 성공적 캐핑을 확인시켜 주므로, 목적하지 않은 화학적 반응을 위해서 이들이 이용가능하지 않도록 한다. 공유성 및 캐핑의 허용되는 수준은 S-CMHC/Lys에 대해서는 약 1 내지 15%이고 S-CMCA/Lys에 대해서는 약 0 내지 5%이다.

ⅲ. 수산화알루미늄-흡착된 백신의 분석:

바람직한 양태에서, Pn-Ps-Pro 결합체는 수산화알루미늄-[알루미나,AL(OH)3]겔에 흡착(하기 C 참조)되어 백신에 대한 면역 반응의 가능성을 초래한다. 기타 가능한 백신 제형은 생리학적으로 혀용되는 희석제중의 제형 및 수산화알루미늄 겔 외에 기타 보조제, 면역조절제 또는 불활성 부형제의 사용을 포함한다. 이러한 알루미나-흡착된 물질의 분석은 하기와 같이 제공된다.

알루미나 흡착된 Pn-Ps-PRO는 명반으로부터 결합체의 탈착에 따라 조성 및 안정성에 대해 분석될 수 있다. 이것은 알루미나-흡착된 Pn-Ps-PRO를 3% 나트륨 시트레이트 용액에 대해 16시간 동안 실온에서 투석시킴으로써 달성된다. 생성된 가용성 알루미늄 시트레이트 염은 투석막으로부터 이동해 나오고 Pn-Ps-PRO 만이 남아있게 된다. 이 방법은 Pn-Ps-PRO의 보정양이 알루미나-흡착된 체형내에 있다는 것을 확인하는데 중요한다. 그러나, 일부의 제형, 예를 들어 Pn6B-Ps-OMPC 및 Pn23F-Ps-OMPC는 10, 5, 2 및 1mg의 Pn-Ps/ml(하기 C 참조)을 함유하여 농도는 화학적 검출 방법보다 훨씬 낮다. 따라서, 탄수화물 조성 분석을 수행하기 위해서는 먼저 흡착된 Pn-Ps-OMPC 백신을 펠렛화하여 수성 유체를 제거하고 이 펠렛을 시트레이트 용해 이전의 최초 용적의 1/5에 재현탁시킨다. 투석후, 용해된 Pn-Ps-OMPC는 50, 25, 10 및 5mg Pn-Ps/ml로 존재한다. 그후 이 농도들은 투여량 수준을 확증하기 위한 Pn-Ps 및 단백질 분석 모두에서 신용할만하다.

또한 시트레이트-탈착 샘플을 유리 Pn-Ps의 존재가능성에 대해 분석하는데, 이는 면역원성 및 제조의 일관성에 중요하다. 이 분석은, Pn-Ps-OMPC가 Pn-Ps로부터 분리될 수 있는 SEPHAROSE CL-2B 또는 SEPHACRYL S1000SF 크기 분류 컬럼상에서 크로마토그래피로 수행한다. 유리 Pn-Ps의 존재 및 양은 비탁도 측정에 의해 항원적으로 측정한다. 유리 Pn-Ps에 의한 Pn-Ps-OMPC의 오염 수준은 존재하는 종 Pn-Ps의 15% 미만이다.

ⅳ. 발열물질 시험: 상당한 발열성(pyrogenicity)의 부재

본 발명의 결합체 생성물을 역 승온 효과의 부재에 대해 시험한다. 결합체 생성물은 본원중 기술된 방법으로 제조되고 허용가능한 수준의 발열성을 지니는 것으로 밝혀졌다.

방법(Ⅰ.Ⅴ.)

Pn-Ps 결합체 백신을 문헌[참조: 21 CFR, Section 610. 13(b)]에 기술된 바와 같이 시험한다.

1) 방법 (I.M.)

발열성의 두 번째 측정은 래빗 IM 시험이다. 이 시험은 생성물의 임상적 사용을 보다 근접하게 모사하고 생성물의 명백한 내독소 역할을 더욱 정확히 반영하는 것으로 감지된다.

각각의 토끼에게 근육을 주사로 백신 1.0ml를 투여한다. 시험은 3마리 이상의 토끼로 수행한다. 온도를 주사후 5시간 동안 모니터링 한다. 다른 시험 방법은 문헌[참조: 21 CFR Section 610. 13(b)]중에 기술되어 있다(시험 투여량은 다당류 농도를 기준으로 한다).

V. 공유 결합의 특성

Pn-Ps-OMPC 또는 Pn-Ps-MIEP와 같은 Pn-Ps-PRO 결합체는 티오에테르 그룹 및 1급 아민을 함유하는 이속성 스페이서를 통해 커플링되어, OMPC 또는 MIEP와 같은 PRO 및 다당류와 가수분해적으로 불안정한 공유 결합을 형성하게 된다. 본 발명에 따른 바람직한 결합체는 일반식 Pn-Ps-A-E-S-B-PRO 또는 Pn-Ps-A'-S-E'-B'-PRO로 나타낼 수 있는 것들이다. A-E-S-B 및 A'-S-E'-B'는 가수분해-안정성 공유 티오에테르 결합을 함유하고 거대분자 PRO 및 Pn-Ps와 (가수분해적으로 불안정한 에스테르 또는 아미드 결합과 같은) 공유결합을 형성하는 이속성 스페이서를 구성한다. 스페이서 A-E-S-B에서, S는 황이고; E는 티올 그룹과 반응하는 친티올성 그룹의 그룹의 변형 생성물로서 일반식화학식 또는화학식(여기서, R은 H 또는 CH3이고, p는 1 내지 3이다)이며; A는 일반식[여기서, W는 O 또는 NH이고, m은 0 내지 4이며, n은 0 내지 3이고, Y는 CH2, O, S, NR' 또는 CHCO2H (여기서, R'는 H 또는 C1- 또는 C2-알킬이다)로서, 만일 Y가 CH2인 경우 m 및 n은 모두 0 일 수 없고, Y가 0또는 S인 경우, m 및 n은 1초과이다]이고;B는 일반식(여기서, q는 0 내지 2이고, Z는 NH2,, COOH, 또는 H이며, R' 및 p는 상기 정의한 바와 같고, D는, NR' 또는이다)로 표현된다. 스페이서 A'-S-E'B'에서, S는 황이고; A'는 일반식[여기서, a는 1 내지 4이고, R"는 CH2 또는(여기서, Y'는 NH2 또는 NHCOR'이다)이며, W, p 및 R'는 상기 정의한 바와 같다]이며; E'는 티올그룹과 반응하는 친티올성 그룹의 변형 생성물로서(여기서, R은 상기 정의한 바와 같다)로 표현되고; B'는이거나, E'는이고, B'는(여기서, p는 1내지 3이다)이다. 추가로, 이속성 스페이서 A-E-S-B 및 A'-S-E'-B' 중에서, E-S-B 및 A'-S-E' 성분은 측정가능하고 측량가능하며, 이러한 동정으로써, 공유적으로 변형된 다당류로부터 기원하는 티오에테르황의 측면을 작용화된 단백질로부터 기원하는 스페이서의 측면과 결합시키는 결합체 결합의 공유성을 반영한다.

본 발명에 따른 결합체인 Pn-Ps-A-E-S-B-PRO는 이의 성분이 하기 유도체를 포함하는 스페이서를 함유할 수 있다: 이산화탄소, 1,4-부탄디아민 및 S-카복시메틸-N-아세틸호모시스테인: 이산화탄소, 1,5-펜탄디아민 및 S-카복시메틸-N-아세틸호모시스테인: 이산화탄소, 3-옥사-1,5-펜탄디아민 및 S-카복시메틸 -N-아세틸호모시스테인: 이산화탄소. 1.4-부탄-디아민 및 S-카복시메틸-N-아세틸시스테인; 이산화탄소, 1.3-프로판디아민 및 S-카복시메틸-N-벤조일호모시스테인; 이산화타소, 3-아자-1.5-펜탄디아민 및 S-카복시메틸-N-아세틸시스테인; 이산화탄소, 1,2-에탄디아민. 글리신 및 S-(석신-2-일)-N-아세틸시스테인. 본 발명에 따른 결합체인 Pn-Ps-A'-S-E'-B-PRO는 이의 성분이 하기의 유도체를 포함하는 스페이서를 함유할 수 있다: 이산화탄소 및 S-카복시메틸시스테아민; 이산화탄소 및 S-(α-카복시에틸)시스테아민; 이산화탄소 및 S-카복시메틸호모 시스테아민; 이산화탄소, S-(석신-2-일)시스테아민 및 그리신; 이산화탄소 및 S-카복시메틸시스테인.

B. 신규한 Pn-Ps 중간체 및 Pn-Ps-PRO 결합체의 제조방법.

이러한 방법을 기술하는데 있어, 몇몇 단계를 명백히 기술할 수 있다;

Ⅰ. 다당류 제조

a) 조 뉴모코커스 다당류 Pn-Ps의 분리;

b) 조 Pn-Ps 부분-가수분해 또는 기계적 절단;

c) 크기 및 순도에 따라 부분-가수분해된 Pn-Ps의 분별;

Ⅱ. 결합

a) 분별된 Pn-Ps를 작용화하여, 바람직하게는 100개의 Pn-Ps 올리고당류 반복 단위당 약 21개의 반응성 브로모아세틸 그룹이 나타나도록 친전자성 또는 친핵성 반응물 Pn-Ps*를 형성;

b) 면역원성 단백질(PRO), 바람직하게는 나이세리아 메닝기티디스 B OMPC 또는 이의 아단위의 분리;

c) PRO를 작용화하여 반응성 설프하이드릴 잔기를 나타내도록 친핵성 또는 친전자성 반응물 PRO*, 바람직하게는 OMPC 또는 MIEP와 같은 이의 아단위를 생성;

d) 단계(a)의 다당류 (Pn-Ps*)를 단계(c)의 단백질(PRO*)와 결합;

e) Pn-Ps-PRO 결합체를 캐핑하여 잔여 작용성 그룹을 제거;

f) 결합체 생성물을 분리.

Ⅰ. a) 조 뉴모코커스 다당류 Pn-Ps의 분리

뉴모코커스 캡슐형 다당류는 주어진 캡슐형 다당류 혈청형의 올리고당류 반복 단위의 조성 및 결합으로 인해 화학적 및 항원적으로 상이하다. 다당류의 분리는 주어진 다당류의 물리적 특성에 의존하여 다소 상이하게 진행되어야 한다. 하지만, 통상적으로, 세균을 배양하고 문헌[참조; Example 3, Williams, C. A., and Chase, M. W., Methhods in Immunology and Immunochemistry, Vol. I. Academic Press (1967)]에 공지되니 방법에 따라 Pn-Ps를 회수하는 반면, 병원균 자체는 ATCC로부터 입수한다. 간단히, 당해 분야에 공지된 적절한 영양 배지내에서 세균을 대규모 배양하여 뉴모코커스 성장을 지지한 후, 페놀 또는 톨루엔과 같은 살균제를 가해 유기체를 사멸시킨다(실시예 3).

그런 다음 다당류의 알콜 분별을 2 단계로 수행한다. 제1단계에서 저 농도의 알콜을 사용하여 세포 파편 및 기타 바람직하지 않는 불순물을 침전시키는데 조 Pn-Ps는 용액내에 잔류하게 된다. 이어서 예정된 농도의 수-혼화성 알콜을 가해 상증액 중에 추가의 불순물을 잔류시키면서 캡슐형 다당류를 침전시킨다. 수성배지내에서 재현탁시킨 후 뉴클레아제 또는 단백질 분해 또는 용매 추출과 같은 공지의 방법으로 오염 단백질 및 핵산을 제거한다. 알콜 침전시켜 조 다당류를 회수하고 건조시켜 조 Pn-Ps 분말을 형성한다(실시예 3).

Ⅰ. b) 조 Pn-Ps의 부분-가수분해 또는 기계적 절단

실질적으로 상기한 바와 같이 제조된 조 다당류(하기 실시예 3 참조)를 비결합 상태로 사용하여 성인 및 2세 이상의 아동에서 사용하기 위한 뉴모코커스 백신을 제형화한다. 수반하는 공정 단계로 결합체 백신 제제에 유용한 특정하고 규명된 화학적 및 물리적 특성을 지닌, 신규하고, 부분적으로 가수분해되고, 정제된 Pn-Ps 생성물을 수득한다(표 2). 조 Pn-Ps의 크기 감소로 연속되는 정제 단계를 수행케 하여 고도로 정제된 Pn-Ps 생성물을 수득한다. 추가로, 결합체를 제조하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 신규한 Pn-Ps가 사용될 때 결합이 보다 효율적이다. 이는 조 다당류 물질의 수용액이 매우 점성이고, 거의 용해되지 않으며, 이의 결합체가 매우 비-가용성이고 비-여과성이기 때문이다. 결합 공정 자체는 수행이 어려워 결합체의 수율은 낮아진다. 추가로, 최종 결합체로부터 비결합된 Pn-Ps의 제거는 예비-결합시 Pn-Ps가 크기 및 점도가 감소되어 있고 용해도가 증진된다. 이러한 사실은 결합체 제제에서 유리 Pn-Ps의 존재가 투여되는 결합체 Pn-Ps의 실질 투여량의 측정을 어렵게 하므로 중요하고 이는 중용한 T-세포 자극 효과를 갖는 결합된 Pn-Ps이므로, 비결합된 Pn-Ps의 존재는 면역적으로 "연관된" Pn-Ps의 감소를 나타낸다.

Pn14-Ps에 대해서 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 상기 제조된 조 무수 캡슐형 다당류는 또한 부분 가수분해 전 또는 후 음이온-교환 크로마토그래피 또는 다른 크로마토그래피 방법으로 정제할 수 있다. 이 크로마토그래피 흡착-탈착은 포지티브 또는 네가티브적으로 사용될 수 있다. 포지티브 양태에서, Pn-Ps는 Pn-Ps 탈착전 세척되는 용액중 불순물이 잔존하는 수지에 흡착된다. 네가티브 양태에서, 불순물은 Pn-Ps 용액으로부터 흡착되어 버려지며 용액중 Pn-Ps는 정제된 상태로 잔존한다. 달리는, Pn-Ps를 Pn6B-Ps에 대해 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 부분적열 가수분해 또는 Pn14-Ps에 대해 실시예 6에서 나타낸 바와 같이 초음파 가수분해에 직접 적용시킬 수 있다. 화학적, 효소적 또는 물리적(예 고압 세포) 방법과 같은 다른 가수분해 방법이 또한 알려져 있다.

부분적 가수분해는 수성 배지중에서 제한된 열처리, 바람직하게는 50 내지 110℃에서 약 1 내지 약 48시간 동안 처리하여 달성한다. 달리는, 5초 내지 5분의 제한된 고에너지 초음파 처리를 냉각기관과 함께 필요한 경우 다수 반복하여 목적하는 점도 또는 Kd 종점에 이르도록 한다. 초음파 가수분해 방법이 복합한 구조를 가지는 다당류를 사용하는 열 가수분해에 바람직하다(하기 참조). 다당류의 부분적 가수분해를 수행하기 위한 당해 분야의 공지된 다른 적절한 방법 또한 적용된다. 예를 들어, 산을 사용하는 제한된 화학적 가수분해, 내분해성(endolytic) 효소 처리 또는 혼합기내에서의 물리적 절단 및 분쇄를 또한 사용하여 평균 Pn-Ps 쇄 크기를 감소시킨다.

바람직한 양태에서, 목적하는 크기, 다중분산도 및 항원성의 특성을 지니는 Pn-Ps 생성물을 수득하기 위해 예정된 약 0 내지 30℃의 온도 및 약 2,000 내지 15,000 PSI와 압력에서 균질화기를 통과시키는 물리적 절단에 Pn-Ps를 적용시킨다(참조 실시예 10).

용액 점도 또는 고 성능 크기 배출 크로마토그래피에 의해 편리하게 측정되는, 가수분해의 목적하는 종점은 다당류의 항원성이 폐기되지 않도록 하는 파일롯 규모(pilot scale) 상에서 각각의 다당류에 대해 예정된다. 상기에 기술한 바와 같이 조 Pn-Ps 출발물질의 동일한 농도에 대해 나타낸 결합의 70% 미만인 항-뉴모코커스 타입 특이적 항체를 결합시키는 공칭 능력은 만족할만하다. 이것은 실질적으로 낮은 MN. MW 또는 분자당 반복 단위수의 Pn-Ps가 이 방법에 의해 생성될 수 없고 비탁도 검정에 대해 상기 확립된 70% 이상 차단 반응할 수 없는 Pn-Ps가 결합시 동물에서 면역원성을 지니게 됨을 의미하지 않는다. 이것은 즉 타입-특이적 항-Pn-ps 항체에 결합할 수 있는 적절한 능력이 부재함에도 불구하고 결합된 상태의 저 분자량 Pn-Ps가 포유동물 면역계에 의해 인지되어 우수한 타입 특이적 항-뉴모코커스 반응이 생성될 수 있음을 의미한다. 이 경우에, "항원성"이라는 용어는 주어진 Pn-Ps 제제의 허용 또는 거부에 대한 작동적 범주에 의해 "면역원성"이란 용어로 교체되어야 한다. 그러나 실제로는 공정 조절로써 생체내 면역원성 파라메타 대신 실험관내 항원성 파라메타를 이용하는 것이 가장 편리하다.

일반적으로, 동일한 크기 감소 방법을 대부분의 다당류에 적용한다. 그러나, Pn6B-Ps가 연장된 열 크기 감소시 항원성을 보유하는 반면, Pn23F-Ps는 초음파 또는 물리적 절단 방법으로 달성가능한 보다 온화한 크기 감소에 요구되는 구조적 보존성(글리세롤-포스페이트 측쇄의 제거)을 상실할 수 있다. 예를 들어, 가울린 균질화기(Gaulin homogenizer)내 물리적-절단 방법이 여러 이유로 인해 바람직하다. 첫째로 이 방법은 규모를 확장시키는 것이 가능하다. 둘째로, 초음파- 및 열-가수분해 방법으로는 1.0 내지 1.5범위의 다중분산도를 달성하기 위해 가수분해된 Pn-Ps를 추가로 분별하는 것이 필요하다. 그러나 물리적-절단 방법으로는 일반적으로, 필요에 따라서 추가적인 순도의 증가 및 CP 오염 감소를 이루기 위해 분별이 사용될 수 있다해도 추가의 분별없이 이 범위에 이르는 다중분산도를 가진 Pn-Ps 생성물을 수득한다. 세번째로, 물리적 절단 방법으로는 열 또는 초음파 가수분해 방법과 비교하여 주어진 어떠한 Pn-Ps에 대헤 큰 재생성을 가질 수 있다. 넷째로, 물리적 절단 방법은 초음파 또는 열 가수분해에 의해 생성된 동일한 크기에서의 Pn-Ps 보다 주어진 크기에서 더욱 항원성을 보유하는 Pn-Ps 생성물을 제조할 수 있는 잇점이 있다.

Pn-Ps 평균 분자량과 관련된 점도는 방법중 파라메터를 모니터링하는데 유리하여 연이은 가수분해 동안 크기 감소도를 제한 및 조절하기가 용이하다. 화학적 및 물리적으로 구별불가능한 다수의 Pn6B-Ps 및 Pn23F-Ps는 일정하고 목적하는 점도 종점에 이르기까지 다당류를 크기 감소시킴으로써 간단히 제조되어 왔다(참조: 상기 표 1). 방법중 점도 측정에 있어 이와 같은 용도는 수득되는 Pn-Ps의 항원 특성의 변형없이도 이들의 가수분해 크기 감소를 허용하면서, 광범위한 조 다당류에 적용 가능하다. 상기 기술한 바와 같이, 항원성 보유는 예를 들어 오우크터로니 이중-확산 검정, 비탁도 또는 당해 분야에 공지된 기타의 방법에 의해 달성된다.

0.9% 염화나트룸(염수)중 몇가지 Pn-Ps 제제의 1mg/ml 용액에 대해 목적하는 점도 종점은 하기 표 3에 나타낸다. 이들 값은 다른 뉴모코커스 아형으로부터 기원한 Pn-Ps에 유사하게 적용가능하다.

[표 3]

몇몇의 뉴모코커스 다당류의 경우에, 부분적 가수분해 전 후에 이온-교환 단계와 같은 추가의 정제 단계를 포함시키는 것이 유리하다. Pn14-Ps의 경우, 이 단계는 부분적인 초음파 가수분해전 음이온성 불순물의 WHATMAN DE 52 수지에 의한 배취 흡착(batch adsorption)으로 달성된다. 약간의 산성 pH의 처리에서 중성인 다당류는 가수분해 판독시 상층 분획으로 회수된다.

Pn6B-Ps 제제에 대한 분자량 값은 크기 감소 및 분별전 약 900 kD이고 크기감소 및 분별후 약 300kD이다. Pn23F-Ps에 있어서, 각각의 값은 크기 감소 및 분별전 약 1000KD 이상이고; 크기 감소 및 분별후 약 400 내지 500KD 이다. 즉, 약 500 약 300kD에 이르는 Pn-Ps 크기 감소는 각각의 Pn-Ps 아형에 대한 방법의 이러한 상을 위해 적절한 목표이다.

예정된 알콜 농도를 지닌 부분적 가수분해된 물질의 재침전은 하기 단락(c)에서 가술한 바와 같이, 부분적으로 가수분해된 Pn-Ps를 회수 및 추가 정제시킬 수 있다.

Ⅰ. c) 크기 및 순도에 따라 부분적으로-가수분해된 Pn-Ps의 분별:

Pn-Ps 제제의 다중분산도는 아형 특이적인 Pn-Ps 쇄 길이의 변형만을 나타내는 것이 아니라, 또한 그룹-특이적인 C-다당류와 다른 오염물질이 Pn-Ps 제제에 잔류함을 나타낸다. 상기 나타낸 바와 같은 잔여 C-다당류 오염물은 유용하지 않으며 심지어 역 면역 반응과 관련이 있다.

협소한 범위의 평균 다당류 분자 크기(감소된 다중분산도)의 선택은 크기 감소후 에탄올 및 바람직하게 이소프로판올(IPA)와 같은 분별 알콜에 의해 유리하게 달성된다. 선택 기준은 주어진 Pn-Ps 제제에 대해, 이 알콜 용해도가 쇄 길이에 반비례하며, 결국 분자량에 비례한다는 사실이다. 즉, 이 공정은 크기가 감소된 출발 Pn-Ps 보다 현저히 증가된 균질성을 지닌 일정하게 크기 분류된 분자 집단을 정량적으로 분리하는데 성공적으로 적용되어 왔다. 방법중 IPA 분별의 조절은 Pn-Ps가 침천된 IPA 범위를 예기하기 위한 파일롯 실험 수행으로 제공된다. 항체-지시된 네페로즈 검정은 정량적인 Pn-Ps 회수가 보증되는 분별을 모니터링하는데 사용한다. 이것이 증가한다해도, C-다당류인 많은 상잉한 뉴모코커스 분리물에 대해 일반적인 그룹-특이적인 다당류에 의한 오염은 조 Pn-Ps 제제중 발견되는 수준보다 약 3 내지 20배 이상 감소된다. 게다가, Pn-Ps 제제의 분자 크기 다중분산도는 약 1.0 내지 1.4 사이에서 동시에 감소된다.

크기-감소된 Pn-Ps의 IPA 분별로의 다른 접근은 적절한 크기-배출 수지 예를 들면, CL-2B 수지 또는 200 내지 1000 kD 분자량 범위로 다당류를 포함하고 분별시킬 수 있는 어떠한 다른 수지를 통과시키는 크기가 감소된 수성 Pn-Ps의 크로마토그래피이다. 강성 크기-배출 매트릭스를 사용하는 HPSEC는 지연도를 감소시키고 애상도를 증가시키므로 유리하다. 예정된 점도 또는 보유 시간을 가진 컬럼으로부터 용출되는 분획의 선택 또는 온-라인 검출에 의한 선택으로 상기 기록된 크기, 점도 및 순도의 바람직한 특성을 지닌 Pn-Ps 분자 집단이 수득된다.

IPA의 추가적 단계 또는 크로마토그래피 분별을 통하여 수득된 Pn-Ps 제제는 화학적 커플링 단계동안 더욱 일관되게 작용하므로 재생적 특성을 지닌 결합체가 생성된다. Pn-Ps 순도에 있어서는 동시에 현저하게 증가되고, 특히 CP 수준으로 크게 감소된다.

상기 기술된 처리 및 측정 방법의 결과로써, Pn-Ps 중간체에 대한 바람직한 특성을 상기 표 2에 요약한다.

Ⅱ. a) 100개의 Pn-Ps 단량체 단위당 약 10 내지 40개의 반응성 브로모아세틸 그룹을 바람직하게 나타내는 친전자성 또는 친핵성 반응물 Pn-Ps*를 형성하기 위한 분별된 Pn-Ps 의 작용화

상기한 단계 Ⅰ.(c)의 Pn-Ps 는 충분히 균질하고 개선된 용해도 및 감소된 점도와 같은 특성을 지님으로써 Pn-Ps를 결합시킬 수 있다. 다당류와 다른 잔기의 결합체를 제조하기 위한 각종의 상이한 도식이 당해 분야의 전문가들에 의해 이용 되어져 왔다. 본원의 방법은 단지 본 발명의 부분적으로 가수분해되고 분별된 신규한 Pn-Ps 중간체를 이용하여 결합치를 형성하는 경로만이 기재되어 있으나, Pn-Ps 중간체를 이용하는 배타적 양태로 이해해서는 안된다.

하기 문헌에 기술되어 있는 이속성 스페이서 방법은 분별되고 크기가 감소된 Pn-Ps를 면역원성 단백질에 결합시키는 바람직한 방법이다[참조: 미합중국 특허 제4,695,624호 (Marburg, S. 등): J. Am. CHem. SOC. 108. 5282 (1986)]. Pn-Ps는 작용화되어 친핵성 또는 친전자성 그룹을 나타낸다. 생성된 Pn-Ps*는 역작용화된 단백질인 PRO*와 반응할 수 있다. 본 발명 방법은 또한 활성화된 다당류와 반응하여, 펜던트 친전자성 부위 또는 펜던트 티올 그룹으로 공유적으로 변형된 다당류를 형성하는 친핵체 또는 비스-친핵체를 선택함으로써 공유적으로 변형된 다당류를 공유적으로 변형된 단백질과 반응시키기 전에 비스-친핵체-변형된 다당류를 추가로 작용화시킬 필요가 없는 방법을 포함함을 특징으로 한다. 또한, 단백질을 잔기 형태로 작용화시키는 방법을 상기한 단계들 중에서 반응물을 선택함에 따른 하나 이상의 단계로 수행할 수 있다.

크기가 감소되고 분별된 Pn-Ps인 Pn-Ps*의 목적 작용기는 작용화 공정에 간섭하지 않는 용매중에서 우선 용해되어야 한다. 가장 작용화되기 쉬운 것이 Pn-Ps의 하이드록실 그룹이기 때문에, 초기 작용화를 수행하기 위해 물로부터 Pn-Ps를 제거하는 것이 중요하다. 산성의 Pn-Ps 수소를 테트라-또는 트리부틸암모늄과 같은 소수성 양이온으로 치환시키면, Pn-Ps는 DMSO 또는 DMF와 같은 비-수성 용매에 용해된다. 일반적으로, 상기 치환 반응은 중성인 Pn-Ps (예: Pn14-Ps 또는 Pn7F-Ps) 중에서 수행할 필요는 없다. 원래, 비-수성 용액중에서, Pn-Ps는 카보닐디이미다졸과 같은 비스-친전자체와 반응하여 이미다조일우디우레탄을 형성할 수 있다. 100개의 Pn-Ps 단량체성 단위당 작용성 그룹의 수는 평균적으로 100개의 Pn-Ps 단량체 단위의 약 10 내지 40만이 유도체화되도록, 몰 기준으로 하여, 총 Pn-Ps 단량제에 비해 카보닐디이미다졸 시약의 약 1/5의 제한량을 가함으로써 조절한다. 상기 종은, 하기 문헌에 기재되어 있는 ⅰ) 친핵성 Pn-Ps* 유도체를 형성시키는 시스트아민 디하이드로클로라이도 또는 (ⅱ) 친전자성 Pn-Ps* 유도체를 형성시키는 1.4-부탄디아민과 같은 시약을 사용하여 친핵성 치환시킬 수 있다[참조: 미합중국 특허 제4,695,624호; 및 Marburg et al., J. Am. Chem. Soc., 108, 5282(1986)].

Pn9V-Ps, Pn4-Ps, Pn1-Ps, Pn5-Ps 및 나이세리아 메닝기티디스 B 또는 C 다당류와 같은 산성의 뉴모코커스 다당류 일부는 유리 카복실산 그룹 및 유리 하이드록시 그룹을 나타내므로, 상기한 다당류의 결합 화학은 폴리리보실리비톨포스페이트에서와 같이 포스포디에스테르 결합의 존재 자체에 의해 음이온성인 다당류 또는 중성 다당류와는 약간 다른 방법으로 수행되는 사실이 최근에 밝혀졌다. 일반적으로, 카복실레이트-유리 다당류의 결합 화학은 유리 다당류 하이드록실을 우레탄 결합으로 전환시킴으로써, 즉, Pn-Ps-OH로부터(여기서,Ra는 다당류를 단백질에 결합시키는 원자-쇄 잔기이다)로 전환시킴으로써 수행한다. 그러나 글루쿠로네이트를 함유하는 Pn-9V-Ps 또는 피루베이트 그룹을 함유하는 Pn4-Ps 와 같은 카복실산-함유 다당류에 있어서, 화학적 변화는로부터(여기서, Ra는 다당류를 단백질에 결합시키는 원자-쇄의 잔기이다)로 수행된다. 따라서, 우레탄의 에스테르 작용기가 카복실산-함유 다당류 중에서는 형성되지 않거나, 또한 간단한 아미드 결합이 상기한 부위에서 형성된다는 사실이 밝혀졌다. 상기한 결합 화학은 카복실산 작용기의 존재로 인하여 신속한 속도로 수행된다.

카복실산 작용기는 상기한 부류의 음이온성 다당류의 항원성 및 면역원성에 중요한 기여를 하는 것으로 생각되므로, 결합 화학은 상기한 다당류에 대해 주의깊게 조작되어야 한다. 최종 결합체에 있어서의 단백질에 대한 다당류의 비율이 높아야 하는 요구는 항원성을 보존시켜야 하는 요구와 균형이 이루어져야 한다. 이러한 목적은 초기 카보닐디이미다졸 매개된 활성화량을 제한함으로써 수행된다. 일단, 아미드가 형성되면, 시스트아민 디하이드로클로하이드 또는 1.4-부탄 디아민을 포함하는 다음 단계를 상기한 바와 같이 추가로 후술될 바와 같이 수행할 수 있다.

또는, 카복실 그룹을 역보호한 후, 트리메틸실릴, 또는 이후에 온화한 알칼리성 조건하에서 제거될 수 있는, 유사 보호 그룹을 사용하거나 산에 대해 불안정한 2.4-디메톡시벤질 에스테르를 사용함으로써 탈보호시킬 수 있다. 상기한 경우에 있어서, 결합 화학은 다당류 하이드록실 그룹을 통해 통상의 방법으로 수행할 수 있다.

1. 친핵성 Pn-Ps*의 제조

상기한 바와 같이 수득된, 카보닐디이미다졸-활성화되고 크기가 감소되고 분별된 Ps는, 수성 또는 기타 용매중에서 미합중국 특어 제4,695,624호에 기술된 바와 같은 시약과 반응시킬 수 있다. 바람직한 시약은 시스트아민 디하이드로클로라이드이다. 과량의 시스트아민을 계속해서 제거하고 디티오트레이톨 또는 디티오에리트레이톨을 사용하여 환원시켜 친핵성 설프하이드릴-작용화된 Pn-Ps를 수득한다. 상기한 Pn-Ps* 유도체는, 예를 들어 단백질이 변형된 경우, 친전자성 PRO*와 반응하여 팬던트 브로모아세틸 그룹을 나타낼 수 있다.

2. 친전자성 Pn-Ps*의 제조

상기한 바와 같이 수득된, 카보닐디이미다졸-활성화되고 크기가 감소되고 분별된 Pn-Ps는, 수성 또는 기타 용매중에서, 미합중국 특허 제4,695,624호에 기술된 바와 같은 시약, 바람직하게는 1.4-부탄디아민 (BuA2)과 반응시킬 수 있다. Pn-Ps-BuA2를 p-니트로페닐 브로모 아세테이트 또는 유사 시약으로 계속해서 아실화 시키면, 설프하이드릴-변형된 단백질과 같은 친핵성 PRO*와 반응할 수 있는 친전자성 Pn-Ps-BrAc2-BrAc 유도체가 생성된다. 유도체화도는 NMR에 의해 상기 시점에서 측정하고, 1.4-부탄디아민을 람노즈의 메틸 시그날과 같은 통상의 단당류 시그날로 적분하여 비교한다. 유도체화도는바람직하게는 10 내지 40%, 가장 바람직하게는 약 20%이다.

Ⅱ. B) 면역원성 단백질(PRO), 바람직하게는 나이세리아 메닝키티디스 B OMPC 또는 이의 아단위의 분리

단백질 잔기는 면역 증강제로서 작용해야 한다. 단백질의 선택시, 수혈자의 면역 반응(반응원성)을 비특이적으로 활성화시키는 단백질을 피한다. 미합중국 특허 제4,695,624호에서, Marburg 등은 다당류-단백질 결합체를 제조하기 위해 나이세리아 메닝기키디스로부터 기원한 외막 단백질 복합체(OMPC)를 사용했다. 테타누스 또는 디프테리아 독소 또는 퍼투시노겐과 같은 기타 면역원성 단백질을 사용할 수 있음에도 불구하고, OMPS가 본 발명에서 사용하기에 적합한 것으로 밝혀졌다.

그램 음성 세균으로부터 OMPC를 정제하는 각종 방법이 하기 문헌에 기술되어 있다[참조: Frasch et al., J. Exp. Med. 140, 87 (1974): Frasch et al., J. Exp. Med. 147. 629 (1978); Zollinger et al., 미합중국 특허 제4,707,43호 (1987); Helting et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. C 89, 69 (1981); Helting et al., 미합중국 특허 제4,271,147호]. 본원에서 사용된 OMPC는 실시예 1에 기술 된 바와 같이 제조한다. 또한, OMPC를 해리시키거나 OMPC를 구성하는 단백질을 암호화하는 물질의 제조합체 발현에 의해 분리된 단백질 아단위, 특히 주요 막 단백질[유사분열-유도 단백질(MIP) 또는 주요 면역-증가 단백질(MIEP)로도 또한 언급된다]도 또한 바람직하다. 아단위 단백질을 수득하는 한 방법을 실시예 2, 16-23 및 미합중국 특허원 제555,978호, 제555,329호 제555,204호 및 제639,457호 (각각 1990년 7월 19일에 출원된 Merck Case 18110, 18159 및 18160, 및 1991년 1월 10일에 출원한 Merck Case 18160IA)에 기술되어 있다.

Ⅱ. c) 반응성 설포하이드릴 잔기를 나타내는 친핵성 또는 친전자성 반응물 PRO*, 바람직하게는 OMPC 또는 이의 아단위를 생성시키기 위한 PRO의 작용화

상기한 Ⅱ.(b)에서와 같이 분리된 PRO를 작용화시켜 친전자성 또는 친핵성 그룹이 드러나게 한다. 수득된 PRO*는 그후 상기한 Ⅱ.(a)에서 제조된 바와 같은 역작용화된 Pn-Ps*와 반응할 수 있다.

1. 친전자성 PRO* 유도체의 형성

분리된 PRO, 예를 들어 나이세리아의 OMPC 또는 OMPC로 부터의 MIEP는 PRO상의 리신의 ε-아미노 그룹과 반응할 수 있는 N-(브로모아세틸)-6-아미노카프로산-p-니트로페닐 에스테르와 같은 시약과 바람직하게 반응한다. 생성된 브로모아세틸화 PRO*는 상기한Ⅱ.(a) 1에서 제조한 바와 같은 Pn-Ps*의 친핵성 유도체와 반응할 수 있다.

2. 친핵성 PRO* 유도체의 형성

분리된 PRO, 예를 들어 나이세리아의 OMPC 또는 MIEP는 N-아세틸호모시스테인 티올락톤과 같은 시약과 반응하여 단백질의 설푸하이드릴 유도체를 생성시킨다. 이 친핵성 유도체는 상기한 II.(a) 2에서 제조된 바와 같은 친전자성 Pn-Ps*와 반응할 수 있다. 상기 공정으로부터 통상적으로 설프하이드릴 적정액 약 0.1 내지 0.3μmol / 단백질 mg이 수득된다.

II d) 단계 II. (a)의 다당류(Pn-Ps*)의 단계 II.(c)의 단백질(PRO*)과 의 결합.

상기 단계 Ⅱ.(a) 및 Ⅱ.(c)에 따라서 반응성 종 Pn-Ps* 및 PRO*를 형성시킨 다음, 역으로 활성화된 반응 파트너를 대략 1:1 질량비로 서로 접촉시킨다. 상기 반응 혼합물은 질소로 공기 퍼징(purging)시킨 다음, 밀봉하고 실온에서 약 4일간 17내지 40℃에서 반응시킨다. 상기와 같은 반응의 예는 다음과 같다:

여기서, 4-브로모아세트아미도부틸아민과 반응한 활성화 다당류는, N-아세틸호모시스테인티올락톤과 반응한 단백질과 반응하여 결합체를 형성하고, 활성화 말레이미도 산과 반응한 아미노-유도체화된 다당류는 아미노티올로 아민화시킨 카복시-활성화 단백질과 반응하여 결합체를 형성한다.

상기식에서, Y"는 C2-C8 알킬 라디칼이다.

유사하게, 펜던트 티올 그룹으로 공유적으로 변형시킨 다당류를 펜던트 친전자성 중심을 갖는 세균 단백질 OMPC 또는 MIEP와 반응시켜 공유 결합체를 수득할 수 있다. 상기와 같은 반응의 예는 다음과 같다:

여기서, 아미노티올과 반응한 활성화 다당류는 디아민의 모노할로아세틸 유도체와 반응한 카복시-활성화 단백질과 반응하여 결합체를 형성한다. 본 발명에 따르는 더욱 바람직한 결합은 다당류 하이드록실을 통한 결합의 경우, 화학식의 스페이서 또는 카복실산 그룹을 포함하는 다당류의 경우, 화학식스페이서이다.

과량의 할로아세틸 그룹의 친전자성 활성은 반드시 제거되어야 할 필요가 있으며, 결합체와 저분자량 티올(예: N-아세틸시스테아민)과의 반응은 그러한 목적으로 수행된다. 또한, 상기 시약, N-아세틸시스테아민을 사용하여 할로아세틸 잔기의 수를 확인할 수 있는데, 이는 형성된 S-카복시메틸시스테아민이 문헌[참조: Spackman, Moore and Stein]의 방법에 의해 독특하게 검출될 수 있기 때문이다.

Ⅱ. e) 잔여 작용성 그룹을 제거하기 위한 Pn-Ps-PRO 결합체의 캐핑

PRO* 또는 Pn-Ps* 상의 잔여 친전자성 그룹은, 저분자량 친핵체 [예:N-에틸말레이미드(NEM)] 또는 친전자체 (예: N-아세틸시스테아민)의 결합체상의 잔여 반응성 그룹보다 약 2 내지 10배 몰 과량을 가함으로써 반응 말기에 급냉시켜 각각 잔여 유리 설프하이드릴 또는 잔여 브로모아세틸 잔기를 캐핑시킨다.

Ⅱ. f) 결합체 생성물의 분리

캐핑된 결합체 생성물을 한외 여과 또는 투석여과에 의해 비결합된 PRO, Pn-Ps 및 기타 반응물로부터 분리시킨다. 상기 결합체 펠렛을 수성 완충 세척액 [이는 0.5% 데옥시콜린 및 염, 예를 들면, 0.1 M 트리스 pH 7-9 및 약 10nM EDTA와 같은 세제 처리를 포함할 수 있다]에 재현탁시켜 잔여 발열 물질을 제거하고 실온에서 1 내지 25시간 동안 정치시킨다. 상기 결합체를 재펠렛화하고, 세제를 함유하지 않는 수성 완충액 중에 재현탁시킨 다음, 약 1 내지 20℃에서 약 2시간 동안 고정각 로터(fixed angle rotor)를 사용하여 약 100,000xg에서 한외원심분리시켜 다시 펠렛화시키거나 투석여과 겔 투과법, 이온 교환 코로마토그래피, 농도 구배원심분리 또는 기타 차등 흡착 크로마토그래피와 같은 여러 가지 정제 공정에 도입시켜 비-공유결합된 다당류 및 단백질을 제거하고, Ps, PRO 및 비탁도 검정법 뿐만 아니라 다음과 같은 목적하는 생물학적 활성을 시험관내 시험법과 같은 이속성 스페이서에 대한 공유성 분석(하기 참조)을 사용한다.

반응물의 추가 분리는 컬럼 중에서 크기-배출 크로마토그래피에 의해 수행하거나, 매우 거대한 비-가용성 단백질의 경우, 상기 분리는 한외원심분리에 의해 수행할 수 있다. 상기 결합체를 멸균수 중에 재현탁시키고 4℃에서 약 1일간 숙성시켜 완전 용해시킨 다음, 저속으로 원심분리시켜 불용성 입자를 제거한다. 상층액은 최종 생성물을 함유하며, 이는 멸균 여과되고 면역학적 유효 투여량 농도의 백신 조성물로 제형화되어 병에 멸균 충전시킬 수 있다.

결합체의 공유성 및 안정성을 확인하기 위한 결합체의 분석은 결합체를 가수분해(바람직하게는 6N HC1로 110℃에서 20시간 동안)시킨 다음, 티오에테르 결합 및 단백질의 구성 아미노산을 함유하는 가수분해적으로 안정한 스페이서의 독특한 아미노산에 대한 정량적 분석으로 수행된다. 경우에 따라, 포함된 단백질에 대한 적합한 아미노산 표준물과 비교함으로써, 상기 단백질의 아미노산으로 제거될 수 있거나, 스페이서의 아미노산은 분석중 단백질의 아미노산 표준물을 외부에서 나타내도록 설계될 수 있다. 공유성 분석은 또한 정제 공정을 모니터링하는데 유용하여 생물학적 활성 성분 농도의 증대를 표시한다.

상기 실시예에서 펩타이드 결합 및 기타 가수분해-불안정 결합에서 Ps-A-E-S-B-PRO 분자의 분해에 의해의 가수분해로 S-카복시메틸호모시스테인,이 방출되고;

의 가수분해로 아미노디카복실산,이 방출되며;의 가수분해로 S-카복시메틸시스테아민,이 방출된다. 그 다음, 그 다음, 스팩만, 무어 및 스타인의 방법과 같은 크로마토그래피 방법을 편리하게 적용시키고 아미노산 구성비를 측정한다.

IgG 항체의 최적 생산에는 관심있는 항원에 대해 특이성을 갖는 B 및 T 임파구의 협력이 요구된다. T-임파구는 다량류를 인지할 수 없지만 다당류가 T 세포가 인지할 수 있는 단백질에 공유결합할 경우 항-다당류 IgG 항체 반응에 대해 도움을 제공할 수 있다.

C. 백신 제형 및 유용성

바람직한 양태에서, 결합체 생성물을 수산화 알루미늄 겔 상에 흡착시킨다. 이를, 예를 들면, Pn-Ps의 20㎍/ml의 농도에 상당하는 결합체 스톡 용액을 제조하여 수행한다. 단백질을 멸균수로 1:1, 1:5 및 1:10으로 희석시킬 수 있다. 20㎍/ml 스톡의 단백질을 포함하는 이들 샘플 각각을 Al+3 0.85mg/ml, 1.7% NaCl(w/v) 및 티메로솔 100㎍/ml를 함유하는 수산화알루미늄 희석액을 사용하여 1:1로 희석시킨다. 용액의 pH를 1N NaOH로 약 7.5로 조정하여 Pn-Ps 농도가 10, 5, 2 및 1㎍/ml인 용액을 제조한다. 이들 제형 각각 약 0.1ml 내지 0.75ml의 투여량이 상이한 연령 및 체중 범위의 피투여자에게 투여하기 적합하다. 상기한 바와 같이 제형화된 백신은 Pn-6B-Ps-OMPC, Pn14-Ps-OMPC, Pn19F-Ps-OMPC 및 Pn23F-Ps-OMPC에 대해 2 내지 3개월된 어린 몽키에서 현저한 아형-특이적 항-뉴모코커스 다당류 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다. Pn-Ps-OMPC 결합체 백신은 또한 치매 마우스에서 T-세포 의존적인 것으로 밝혀졌다.

본 명세서에 정의된 특성을 갖는 다른 다당류 및 이들 특성을 갖는 Ps를 제조하는 방법이 부분적으로 가수분해되고 분별된 뉴모코커스 다당류를 포함하는 결합체를 제외한 결합체의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 상기 기술로부터 분명히 알 수 있을 것이다. 이들 결합체는 다른 병원성 유기체에 의해 야기되는 질병을 예방하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 신생아 수막염의 원인이 되는 그룹 B 스트랩토코커스, 유아 수막염의 원인이 되는 나이세리아 메닝기티디스 B 또는 S, 또는 요로 및 다른 기회 감염의 중요한 원인이 되는 이, 콜라이(E. coli)를 다당류 공급원으로 사용할 수 있다. Pn-Ps 및 이의 공유 결합체를 비롯한 이들 다당류는 또한 혼합 백신 제형의 중요한 성분을 제공할 수 있다. 이러한 배합물에는, 예를 들면, 프로인트(Freund), 리비(Ribi) 또는 면역 조절 화합물[예: 인터루킨, 인터페론(참조: Market letter, Nov. 30, 1987, p. 26-27; Genetic Engineering News. Jan. 1988. Vol. 8. p. 23)또는 추가의 면역원과 같은 면역학적 유효량의 보조제를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역학적 유효량의 보조제를 포함하는 조성물은 B형 간염, A형 간염, 비-A형 간염, 비- B형 간염, AIDS, 디프테리아, 백일해, 파상풍, 홍역, 유행성이하선염, 풍진, 수두, 소아마비 또는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) b에 대한 백신중 하나 이상을 포함한다. 방금 언급한 백신중에서 선택된 바람직한 추가의 백신은 Pevax HIB , Recombivax HB , M-M-R 및 삼가 DTP 백신중에서 선택한다.

하기 실시예는 본 발명을 추가적 기술하기 위한 것이며 본 발명을 이에 한정 시키려는 것이 아니다.

[실시예 1]

나이세리아 메닝기티디스 B11 혈청형 2 OMPC의 제조

A. 발효

1. 나이세리아 메닝기티디스 그룹 B11

나이세리아 메닝기티디스의 동결건조 배양물[와싱턴 디. 시. 소재의 Walter Reed Army Institute of Research(WRAIR)의 Dr. M. Artenstein으로부터 입수]을 담은 튜브를 열고 유곤브로스(Eugonbroth) (BBL)를 첨가한다. 배양물을 무엘러 힌톤(Mueller Hinton) 한천 사면 배지 상에 스트리킹(streaking)하여 36시간 동안 5% CO₂하 37℃에서 항온처리하고 배양물을 10% 탈지유 배치 (Difco 제조원)내에 수거 하여 분취량을 -70℃에서 동결시킨다. 유기체의 동일성을 WRAIR이 공급하는 특이적 항혈청으로 응집시키고 Difco가 공급하는 혈청으로 타입을 분류하여 확인한다.

제2계대 배양물의 바이알을 행동시키고 10개의 콜롬비아 양 혈액 한천 프레이트(CBAB-BBL)상에 스트리킹한다. 플레이트를 5% CO₂하에 18시간 동안 37℃에서 항온처리한 다음 배양물을 10% 탈지유 배지 100ml 내에 수거하고, 분취량을 0.5ml 양으로 취하여 -70℃에서 동결시킨다. 유기체는 특이적 항혈청을 사용한 응집, 당 발효 및 그램 염색에 의해 양성으로 확인된다.

상기 계대 배양물의 바이알을 해동시키고, 무엘러-힌톤 브로스로 희석시켜 40개의 무엘러-힌톤 한천 플레이트 상에 스트리킹한다. 플레이트를 6% CO₂하에 18시간 동안 37℃에서 항온처리한 후 배양물을 10% 탈지유 배지 17ml내에 수거하고, 0.3ml 양으로 분위하여 -70℃에서 동결시킨다. 유기체는 그램 염색, 특이적 항혈청을 사용한 응집 및 옥시다제 시험에 의해 양성으로 확인된다.

2. 발효 및 세포 페이스트의 수집

a. 접종물 발육-접종물을 상기(계대 4)로부터의 나이세리아 메닝기티디스 그룹 B. B-11의 동결 바이알 하나로부터 성장시킨다. 10개의 무엘러-힌톤 한천 사면 배지에 접종시키고 6개를 약 18시간 후에 수거하여 pH 6.35에서 고츠클리히(Gotschlich) 효모 투석물 배지의 3 x 250ml들이 플라스크용 접종물로서 사용한다. OD660을 0.18로 조정하고 OD660이 1 내지 1.8이 될때까지 항온처리한다. 이 배양물 1ml를 사용하여 5 x 2ℓ들이 삼각 플라스크 (각각 배지 1ℓ 함유, 하기 참조) 각각을 접종시키고 200rpm으로 진탕기 내에서 37℃에서 항온처리한다. O.D.를 접종후 매시간 간격으로 모니터링한다. OD660이 1.28인 브로스 배양물 4ℓ가 수득된다.

70ℓ들이 종자 발효기- 약 4ℓ의 종자 배양물을 사용하여 완전한 생산 배지(하기 참조) 약 40ℓ를 담은 70ℓ들이 멸균 발효기에 접종시킨다. 70ℓ들이 발효조건에는 37℃, 185rpm, 분당 10ℓ의 공기 스파징(air sparging) 및 약 2시간 동안 약 pH 7.0에서의 일정한 pH 조절이 포함된다. 이 배취에 있어서, 2시간 후의 최종 OD660은 0.732이다.

800ℓ들이 생산 발효기

종자 배양물 약 40ℓ를 사용하여 완전한 생산 배지(하기 참조) 568.2ℓ를 함유하는 800ℓ들이 멸균 발효기를 접종시킨다. 배취를 분당 60ℓ로 공기 스파징하고 pH를 7.0으로 일정하게 유지하면서 100rpm으로 37℃에서 항온처리한다. 이 배취의 경우, 접종한지 13시간 후의 최종 OD는 5.58이다.

3. 삼각 플라스크 및 70- 및 800-ℓ들이 발효기관용의 완전 배치

분획 A

분획 B (고즈클리히 효모 투석물)

Difco 효보 추출물 1280g을 증류수 6.4ℓ에 용해시킨다. 용액을 3개의 H1OSM 카트리지가 있는 2 Amicon DC-30 중공 섬유 투석 단위내에서 투석한다. MgSO₄·7-H₂O 384g 및 텍스트로즈 3200g을 투석물내에 용해시키고 총 용적을 증류수로 15ℓ가 되게 한다. pH를 NaOH를 사용하여 7.4로 조정하고, 0.22μ필터를 통과하여 멸균시킨 다음 분획 A를 함유하는 발효기로 옮긴다.

삼각 플라스크의 경우 : 분획 A 1ℓ 및 분획 B 25ml를 첨가하고 pH를 NaOH를 사용하여 7.0 내지 7.2로 조정한다.

70ℓ 발효기의 경우 : 분획 A 41.8ℓ 및 분획 B 900ml를 첨가하고 pH를 NaOH를 사용하여 7.0 내지 7.2로 조정한다.

800ℓ 발효기의 경우 : 분획 A 553ℓ 및 분획 B15.0ℓ를 첨가하고 pH를 NaOH를 사용하여 7.1내지 7.2로 조정한다.

b. 수거 및 불활성화

발효가 끝난 다음, 페놀을 별도 용기에 첨가하고, 여기에 세포 브로스를 옮겨 최종 페놀 농도가 약 0.5%가 되게 한다. 물질을 배양물이 더 이상 생존하지 않을때까지 (약 24시간) 온화하게 교반하면서 실온에서 유지시킨다.

c. 원심분리

4℃에서 약 24시간 후, 불활성화된 배양액 614.4ℓ를 Sharples 연속 유동 원심분리기를 통해 원심분리시킨다. 페놀 처리후 세포 페이스트의 중량은 3.875kg이다. 다른 방법으로, 페놀 사멸시킨 발효 브로스를 하기하는 바와 같이 투석여과에 의해 수거한다.

B. OMPC 분리

단계 1. 농축 및 투석여과

페놀 불활성화된 배양물을 약 30ℓ로 농축치키고 0.2㎛ 중공 섬유 필터(ENKA)를 사용하여 멸균 증류수 중에서 투석여과한다.

단계 2. 추출

동 용적의 2X TED 완충액[0.1M 트리스 0.01M EDTA 완충액, pH 8.5, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트 함유]을 농축 투석여과된 세포에 첨가한다. 현탁액을 56℃에서 30분동안 교반하면서 OMPC 추출용 온도 조절 탱크에 옮긴다.

추출물을 약 4℃에서 약80ml/분의 유속으로 Sharples 연속 유동 원심분리기 내에서 약 18,000rpm으로 원심분리시킨다. 점성 상층액을 수집하여 4℃에서 저장한다. 추출된 세포 펠렛을 상기한 바와 같이 TED 완충액 중에서 재추출한다. 상층액을 수거하여 4℃에서 저장한다.

단계 3. 한외여과에 의한 농축

수거된 추출물을 AG-Tech 0.1㎛ 폴리설폰 필터에 부착된 온도 조절 용기에 옮긴다. 추출물의 온도를 농축 공정을 통해 용기 내에서 25℃로 유지시킨다. 샘플을 11 내지 24psi의 투과막(transmembrane) 압력에서 10배 농축시킨다.

단계 4. OMPC의 수집 및 세척

단계 3으로부터의 잔류물을 300 내지 500ml/분의 유속으로 연속 유동 원심분리기 내에서 약 70℃에서 약 160,000xg(35.000rpm)으로 원심분리시키고, 상층액을 버린다.

OMPC 펠렛을 TED 완충액중에 현탁(완충액 190ml, 20ml/g 펠렛)시키고, 단계 2 및 단계 4를 2회 반복한다(단계 3 생략).

단계 5. OMPC 생성물의 회수

단계 4로부터의 세척된 펠렛을 유리 막대 및 다운스 균질화기(Dounce homogenizer)를 사용하여 증류수 100ml에 완전히 현탁시킨다. 그런 다음 수성 OMPC 현탁액을 0.22㎛ 필터에 통과시켜 필터 멸균시키고 TED 완충액을 0.1㎛ 중공 섬유 필터를 사용하여 멸균 증류수에 대해 투석여과하여 물로 대체시킨다.

[실시예 2]

OMPC의 아단위의 정제

폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 OMPC 또는 제조합체 세포로부터의 정제된 MIEP의 제조

아크릴아미드/BIS (37.5:1) 겔 (18x14cm, 두께 3mm)를 사용한다. 스태킹(stacking) 겔은 4% 폴리아크릴아미드이고 분리 겔은 12% 폴리아크릴아미드이다. 겔당 OMPC 단백질 또는 재조합 숙주 세포 단백질 약 5㎍을 사용한다. OMPC 1ml에 샘플 완충액(4% 글리세롤, 300mM DTT, 100mM 트리스, 0.001% 브로모페놀 블루, pH 7.0) 0.5ml를 가한다. 혼합물을 20분 동안 105℃로 가열하고 겔 상에 부하하기 전에 실온으로 냉각시킨다. 겔을 브로모페놀 블루가 겔 바닥에 도달할 때까지 냉각시키면서 200 내지 400㎃에서 작동시킨다. 겔의 수직 스트립을 절단(폭 약 1 내지 2cm)하고 쿠마시(Coomassie)/아세트산 제2구리(0.1%)로 염색한다. MIEP 밴드(약 38KD)가 보일때까지 스트립을 탈착색시킨다. 그런 다음 스트립을 이의 원래 겔 위치에 위치시키고 MIEP 부분을 작은칼(scalpel)을 사용하여 겔의 나머지로부터 절개한다.

절개된 부분을 정육면체(약 5mm)로 절단하여 0.01M 트리스- 완충액(pH 8.1)으로 용출시킨다. 2사이클의 용출후 용출물의 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가한다. 용출물을 통상의 수거된 용출물과 합하여 60mM 암모니아-포름산(pH 10)에 대해 48시간 동안 투석한다. 다르게는 , 용출된 단백질을 물증의 50%아세트산에 대해 투석한다. 투석후 용출된 단백질을 증발 건조시킨다. 물질을 PD10 크기 분류 컬럼(Pharmacia 제조원, Piscataway. MJ)를 통해 통과시켜 추가 정제하고, 실온에서 저장한다.

[실시예 3]

스트랩토코커스 뉴모니애 아형의 배양 및 조 Pn-Ps의 분리

Ⅰ. 뉴모코커스 배양

뉴모코커스의 배양 방법은 본 기술분야에 널리 공지되어 있다[참조: Chase, M. W., Methods of Immunology and Immunochemistry 1. 52 (1967)]. 뉴모코커스 아형의 분리물은 ATCC에서 입수할 수 있다. 세균은 봉입되고, 비-운동성이며, 그램-양성이고, 란셋-모양(lancet-shaped)인 쌍구균속으로서 혈액-한천 상에서 알파-용혈성인 것으로 확인되었다. 아형은 특이적 할혈청을 사용하여 퀄링 반응(Quelling reaction)을 기준으로 분류한다. 매스터 및 스톡 종자 배양물을 바람적하게는 동결건조하거나 8℃이하에서 유지시킨다. 바람직한 배양 방법에서, 스톡 배양액을 105 탈피브린화된 래빗 혈액을 함유하는 하트 인퓨젼(Heart Infusion) 한천 상에 플레이팅한 하트 인퓨전 브로스를 사용하여 복원시키고 약 18시간 동안 37℃ 2℃에서 항온처리한다.

플레이트상의 배양물을 하트 인퓨젼 브로스로 재현탁시키고 재현탁된 배양물의 분취량을 사용하여 10% 탈피브린화된 토끼 혈액을 함유하는 하트 인퓨젼 브로스 100ml를 접종시킨 다음, 정지 배양액으로서 37℃ 2℃에서 약 18시간 동안 항온처리한다. 액화 배양물(실험 종자) 100ml를 하트 인퓨전 혈액 한천 플레이트상에 그램-염색된 얼룩 및 배양물을 현미경 관찰하여 순도를 체크한다. 실험 종자를 2 내지 8℃에서 14일 이하 동안 보관하거나 즉시 사용할 수 있다. 뉴모코커스 접종 배지(YUF) 및 텍스트로즈(25gm/ℓ)를 함유하는 2ℓ들이 삼각 플라스크 또는 다른 적합한 용기에 실험 종자를 접종시킨 다음 37℃ 2℃에서 약 8 내지 24시간 동안 정치 항온처리한다. 항온처리 기간은 배양되는 스트렙토코커스 뉴모니애의 종류에 좌우되어 변한다. 발효 pH는 광학 밀도가 1.5 내지 4.0에 도달할 때까지 12% 중탄산나트륨 용액을 주기적으로 첨가함으로써 목적 pH 범위가 6.0 내지 7.2를 유지하도록 조정한다. 광학 밀도는 660nm에서 모니터링한다. 배양물의 샘플을 현미경으로 관찰하고 혈청학적 응집 반응을 수행하여 순도를 체크한다. 상기 단계로 부터의 배양물을 증류수, 뉴모코커스 종자 배지(YUF)에 대한 성분의 무수 충전물, 효모 추출 한외여액, UCON 및 덱스트로즈(약 25gm/ℓ)로 이루어진 뉴모코커스 발효배지 40ℓ를 함유하는 종자 발효액에 옮긴다. 배양물을 온화하게 교반시키면서 37℃ 2℃에서 약 2 내지 12시간 동안 항온처리한다. pH는 수산화나트륨 용액을 주기적으로 첨가하여 6.0 내지 7.2로 조정한다. 증류수, 뉴모코커스 생산 배치(YUF)에 대한 성분의 무수 충전물, 효모 추출 한외여액, UCON 및 덱스트로즈(약 25gm/ℓ)로 이루어진 뉴모코커스 발효 배지 525ℓ를 함유하는 발효액에 2 내지 12시간에 걸쳐 종자 배양물 약 50ℓ를 접종시킨다. 배양물을 배양되는 종류에 따라 37℃ 2℃에서 온화하게 교반시키면서 6 내지 30시간 동안 항온처리한다. pH는 수산화나트륨 용액을 주기적으로 첨가하여 6.0 내지 7.2로 조정한다. 광학 밀도를 측정한 다음 발효시키고, 덱스트로즈를 완전히 사용하여 더 이상 pH 변화가 나타나지 않는 경우 발효를 정지시킨다.

발효를 정지시킨 후 즉시 병원성 유기체를 죽인다. 이는 페놀을 약 1%농도로 가한 다음 주위 온도에서 2 내지 12시간 동안 방치하여 수행한다.

Ⅱ) 조 Pn-Ps 분리 :

변성된 알콜을 세포 파편 및 핵산을 침전시키는데 충분한 양으로 죽은 배양물에 가한 다음, 원심분리시켜 제거한다. 조 다당류는 변성된 에탄올을 추가로 가하여 상층액으로 부터 침전시킨다. 고체를 원심분리시켜 수집하고 상층액을 제거한다.

핵산의 오염은 중성 수용액(예: 1 내지 5% 나트륨 아세테이트 또는 뉴클레아제를 가한 0.05M 인산염 완충액 및 약 0.01M 염화마그네슘)에 다당류를 용해시켜 감소시킨다. 약 36℃에서 약 60내지 120분 동안 유지시킨 후, pH를 약 8.0으로 조정하고, 트립신과 같은 프로테아제를 가하여 단백질성 오염물을 분해시킨다.

추가와 불순물은 다당류를 변성된 알콜 또는 이소프로판올을 사용하여 나트륨 아세테이트에 재침전시킨 다음, 증류수에 재용해시킴으로써 제거할 수 있다. 세트리모늄 브로마이드를 약 8℃에서 가하여 불순물을 침전시킨 다음 원심분리시켜 제거한다. 나트륨 아세테이트 및 변성된 알콜 또는 이소프로판올의 분취량을 가하면 불순물이 추가로 제거된다. 다당류는 알콜을 추가로 가한 다음 원심분리시켜 회수한다. 침전물은 백색 분말이 수득될 때까지 무수 에탄올로 세척한다. 다당류를 여과시켜 수집하고, 무수 에탄올 및 아세톤으로 세척한 다음 진공하에 건조시켜 분말로서 조 Pn-Ps를 수득한다.

[실시예 4]

부분적으로 가수분해되고 정제된 Pn6B-Ps의 제조

(1) 열 가수분해

조 Pn6N-Ps 분말 3.0g을 염수(0.9% NaCl) 1200ml에 실온에서 교반시키면서 약 4기간 동안 용해시킨 다음 4℃에서 밤새 보관한다. 용액을 콜드-핑거 환류 응축(cold-finger reflux condenser apparatus)중에서 100℃로 24시간 동안 가수분해시킨 다음 실온으로 냉각시킨다. 나트륨 아세테이트 시약(59.7g)을 최종 농도가 3%(w/v)로 되도록 가한다.

(2) 혈청학적 프로브

샘플 10ml에 대해 이소프로판올(IPA) 분별 파일롯을 연구하고 항체-지시 종점 네펠로즈 분석을 수행하면 Pn6B-Ps가 40 내지 50% IPA에서 침전되는 것으로 나타난다.

(3) 제1 IPA 첨가

가수분해된 샘플(상기 단계(1)의 샘플, 용적: 1210ml)에 IPA 932ml를 가함으로써 (실온에서 교반시키면서 적가) 43.5% IPA로 만든다. 샘플을 15내지 30분 동안 교반시킨 다음 11.000xg에서 30분 동안 원심분리시킨다(Beckman JA-10 로터: 8,000rpm: 20℃). 폐 펠렛은 250ml들이 옴니박스 쟈(omnimix jar)에서 무수 에탄올로 연마시킨 다음 60ml 소결 유리 깔대기에서 수집한다. 침전물은 깔때기에서 무수 에탄올로 직접 세척한 다음, 다시 아세톤으로 세척하고 분석용 제제중에서 CaC_l2로 실온에서 진공 건조시킨다.

(4) 제2 IPA 첨가 및 생성물 회수

43.5% IPA 상층액(상기 단계 (3)의 상층액; 용적=2020ml)에 실온에서 교반시키면서 IPA 93.5ml를 적가함으로써 46.0% IPA로 만든다. 샘플을 상기 단계(3)에서 처럼 숙성시킨 다음 원심분리시킨다. 펠렛을 상기 단계(3)에서 처럼 연마시키고, 수집한 후, 세척하여 건조시킨다. 생성된 Pn6B-Ps의 중량은 1.650mg이고, Kd는 0.62이며 인 함량은 3.3%이다.

[실시예 5]

스트렙토코커스 뉴모니애 6B-OMPC 결합체, Pn6B-Ps-OMPC:

A. Dowex 50x2 테트라부틸암모늄 수지[Dowex 50 (Bu4n+)]의 제조

Dowex 50x2 (200 내지 400메쉬) H+ 형태(72g)를 물로 슬러리화 시키고 컬럼에 충전시킨 다음, 물과 6N HCl로 계속 세척한 후 시험된 용출물이 pH 페이퍼로 중성이 될 때까지 물로 다시 세척한다. 테트라부틸암모늄 하이드록사이드의 10% 수용액을 시험된 용출물이 강한 알칼리성으로 될 때까지 컬럼에 통과시킨다. 최종적으로, 시험된 용출물이 다시 중성으로 될 때까지 물을 컬럼에 통과시킨다.

B. Pn6B(Bu4N+):

크기가 감소되고 분별된 Pn6B-Ps (600mg) (참조: 물리적 특성에 대한 표 1의 Pn6B-Ps 로트 1)를 멸균 증류수(60ml)에 용해시킨 다음 용액을 고체가 모두 용액으로 될 때까지 기계적으로 교반시킨다.(1.5시간). 다당류 용액을 세정한 수지에 적용시킨 다음 중력에 의해 베드를 통과시킨다(4.5시간). 컬럼을 물(10 내지 12ml)로 세척한 다음 합한 용출물을 동결건조시켜 무수 Pn6B-Ps 테트라-n-부틸 암모늄염, Pn6B(n-Bu4N+)640을 수득한다.

C. Pn6B-BuA2:

Pn6B(n-Bu4N+) (640mg)을 디메틸설폭사이드(DMSO)(24ml)에 용해시킨 다음 고체가 모두 용액으로 될 때까지 30분 동안 기계적으로 교반시킨다. 상기 용액에 1,1'-카보닐디이미다졸(44.2mg)을 가한 다음 반응물을 실온에서 교반시킨다(60분). 분리 프라스크에서, 물(16ml)중의 부탄디아민 디하이드로클로라이드(BuA2·2HCl, 1.022g)의 용액에 10N NaOH를 가하여 염기성( pH 10.2)으로 만든다. 용액을 0.2㎛ 멸균 필터를 통해서 여과시킨 다음 빙욕하에 냉각시킨다. 활성화된 다당류를 함유하는 숙성된 DMSO 혼합물을 냉각된 BuA2·2HCl 용액에 저속 정상 스트림하에서 가한 다음 생성된 용액을 0℃에서 교반시킨다(15분). 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 추가로 1시간 동안 교반시킨 후, 투석 튜브에 옮기고 하기와 같이 투석한다(4℃): 1) pH7.0인 0.1M 인산나트륨 완충액 15ℓ로 6시간 동안 투석; 2) 7.0인 0.01M 인산나트륨 완충액 15ℓ로 12시간 동안 투석; 3) pH 7.0인 0.01M인 인산나트륨 완충액 15ℓ로 9시간 동안 투석; 4) 증류수 15ℓ로 17.5시간 동안 투석. 투석 튜브의 내용물을 동결건조시켜 Pn6B-1.4-부탄 디아민(Pn6B-BuA2) 222mg을 수득한다. 상기 물질 약 5mg의 NMR (300MHz, D2O)에 의하면 부탄 디아민 메틸렌과 Pn6B-Ps의 람노즈 메틸 양성자의 공명을 적분하여 비교하면 Pn6B-Ps 반복 단량체 단위 100개당 디아민 잔기 22개가 부하됨을 나타낸다.

Pn6B-BoA2-BrAc :

Pn6B-BuA2 (210mg)을 pH 9.04인 0.1M Kolthoff 붕산염-인산염 완충액(21ml)에 용해시킨 다음 혼합물이 용액으로 되도록 30분 동안 기계적으로 교반시킨다. 이러한 수용액에 아세토니트릴(2.6ml)중의 p-니트로페닐 브로모아세테이트(210mg)로 이루어진 혼합물을 가한 다음 반응물을 밤새 교반시킨다(20시간, 4℃). 용액을 투석 튜브에 옮긴 다음 하기와 같이 투석한다(4℃): 1)멸군 증류수 15ℓ로 12.3시간 동안 투석; 2) 멸균 증류수 15ℓ로 8.25시간 동안 투석; 3) 멸균 증류수 15ℓ 5.5시간 동안 투석. 백의 내용물로부터 분석(NMR 및 HPSEC-다양한 검량 또는 분자 크기 분석)을 위해 1.7ml를 제거한 다음 여기에 pH 8의 무수 인산염 완충액 염 (pH 8인 0.1M 인산나트륨 용액을 동결건조시켜 제조) 0.449g을 가한다. 완전히 용해시킨 후930분), 용액을 멸균 0.2㎛ 필터를 통해서 여과시켜 pH 8인 Pn6B-BuA2-BrAc 용액을 수득한다.

Pn6B-OMPC

멸균 OMPC (40ml, 4.5mg/ml)를 10ml 용적의 원심분리 튜브 4개에서 한외 원심분리(4℃, 43K rpm, 2시간)시켜 펠렛화시킨다. 각각의 펠렛을 하기 성분으로 이루어진 멸균-여과(0.22㎛)된 타올화 혼합물 3ml중에 재현탁시킨다 : pH 11.09인 Na2B4O7 완충액(30ml)중의 N-아세틸호모시스테인 티올락톤 하이드로클로라이드 (164mg), 에틸렌-디아민-테트라아세트산 이나트륨 염(255mg) 및 디티오트레이톨(53mg), 재현탁된 펠렛을 균질화시키고(Dounce), 합한 다음, 용기를 탈기시키고 질소로 블랭킷시킨 다음 실온에서 밤새(19시간) 숙성시킨다. 용액을 3개의 한외원심분리 튜브에 분배하고, 1M KH2PO4로 토핑시킨 다음 단백질을 펠렛화시킨다(4℃, 43K rpm, 2시간). 펠렛을 pH 8인 0.1M 인산나트륨 완충액(30ml)중에 재현탁시키고 균질화시킨 다음 (Dounce). 재펠렛화시킨다.(4℃, 43K rpm, 2시간). 멸균 단백질 펠렛을 여과된 Pn6B-BuA2-BrAc 용액중에 재현탁시킨다. 엘만 (Ellman)의 시험을 즉시 수행하면, SH 역가가 34㏖f로 나타난다. 반응 혼합물을 탈기시키고 질소로 블랭킷시킨 다음 실온에서 91시간 동안 숙성시킨다.

단백질은 pH 8.0인 0.1M 인산나트륨 완충액 5ml중의 N-에틸 말레이미드(75mg)로 이루어진 용액(0.22㎛ 멸균 필터) 1ml를 가하여 캐핑시킨다. 상기 혼합물을 실온에서 4기산 동안 숙성시킨 다음 N-아세틸 시스테아민(0.22㎛ 멸균 여과된) 300㎕를 가하고 용액을 19.5시간 동안 추가로 숙성시킨다.

멸균 캐핑된 결합체를 4개의 원심분리 튜브에 분배하고 pH 7인 0.1M 인산나트륨 완충액으로 토핑시킨 후 한외 원심분리(4℃, 43K rpm, 2시간)로 펠렛화시키고, 이를 pH 7인 0.1M NaPO4 멸균 완충액 (42ml)에 재현탁시키고 균질화시킨다(Dounce). 재원심분리시키기 전에, 펠렛은 멸균 증류수 총 50ml에서 Dounce 균질 화기로 재현탁시킨다. 4℃에서 17시간 동안 숙성시킨 후, 결합체 제제를 TJ-6 원심분리기의 TH 4 로터에서 3.5분동안 1000rpm으로 원심분리시키고 소량의 침강물을 제거한다. 최종 생성물인 결합체 현탁액을 단백질(Lowry), Pn6B-다당류(페놀/황산). 비결합된 다당류 (크기 배출 크로마토그래피 비탁도) 및 아미노산(아미노산분석)에 대해 분석한다. 결과는 하기와 같다.

[실시예 6]

부분적으로 가수분해되고 정제된 Pn14-Ps의 제조 :

(1) 음이온-교환 수지를 사용하는 처리 :

Pn14-Ps 분말 2.81g을 증류수 H2O 1124ml에 교반시키면서 실온에서 약 4기간 동안 용해시키고 4℃에서 밤새 저장한다. 용액을 pH가 약 5 내지 6인 증류슈에서 약 15시간 동안 미리 팽창시킨 DE 52 (Whatman, 디에틸아미노-에틸 셀룰로즈) 60g 에 가한다. 슬러리를 실온에서 약 15시간 동안 플렛포옴 진탕기(platform shaker)에서 온화하게 진탕시킨 후, 20℃의 Beckman JA-10 로터에서 15분동안 5,000rpm으로 원심분리시킨다. 상층액을 소결 유리 깔때기(150ml, 중간 정도의 다공성)를 통해서 추가로 정제시켜 2ℓ 용량의 사이드 암 플라스크에 수집한다.

2) 초음파 가수분해:

DE52-처리된 Pn14-Ps[용적, 1100ml; 상기 단계(1)에서 수득]를 Branson 초음파기 (0.5inch 프로브, 세팅 8)를 사용하는 빙욕상의 플라스틱 비이커에서 2분 동안 초음파 처리한다. 샘플을 약 15분동안 냉각기키면서 점도를 측정하고 1분 간격으로 추가로 초음파 처리한다. 점도 종점이 1.096 센티스토크에 도달한 후에 최종 초음파 처리를 한다. 가수분해된 샘플을 실온으로 가져오고 나트륨 아세테이트 시약 (18.0g)을 최종 농도 1%(w/v)로 가한다.

(3) 혈청학적 프로브 :

샘플 10ml로 수행한 이소프로판올(IPA) 분별 파일롯 연구 및 항체-지시 종점 네펠로즈 검정으로 35 내지 45% IPA에서 Pn14-Ps가 침전됨을 알 수 있다.

(4) 제 1 IPA 첨가 :

가수분해된 샘플[용적: 1090ml, 상기 단계(2)로부터]에 IPA 706ml (실온에서 교반하묜서 적가)를 가하여 39.3% IPA가 되도록 한다. 샘플을 15 내지 30분 동안 교반한후 11.000xg에서 30분동안 원심분리하고 (beckman JA-10 로터: 8,000rpm:20。C) 상층액을 버린다. 폐 펠렛을 250ml 옴니믹스 쟈중에서 무수 EtOH로 연마한후 , 60ml 소결 유리 깔대기상에 수집한다. 침전물을 무수 EtOH에 이러서 아세톤으로 깔대기상에서 직접 세척한 후 분석 제조용으로 실온에서 CaCl2 상에서 진공 건조 시킨다.

(5) 제 2 IPA 첨가 및 생성물 회수 :

39.3% IPA 상층액 [용적-1712ml, 상기 단계(4)로 부터]에 실온에서 교반하면서 IPA 73.5ml를 적가하여 41.8% IPA가 되게 한다. 샘플을 단계(4)에서와 같이 숙성시키고 원심분리한다. 펠렛을 단계(4)에서와 같이 연마하고, 수집하고 세척하고 건조시킨다. Pn14-Ps 생성물은 1.399mg이다.

(6) 투석 및 동결 건조 :

상기 단계(5)로부터의 샘플(1385.6mg)을 실온에서 2 내지 3시간 동안 증류수 554ml에 용해시킨다. 용액(2.5mg/ml)를 투석 튜브 (12,000MW 차단; 45mm)로 옮기고 증류수를 추가로 2번 교환시키면서 27시간동안 증류수에 대해 투석한다. 이어서 투석한 샘플을 동결건조 플라스크로 이동시켜 드라이아이스:메탄을 욕중에서 쉘 동결시킨 후 건조될 때까지 2-1/2일 동안 Virtis (Freezemobile) 동결건조기 상에서 동결건조시킨다. 최종 Pn14-Ps 생성물은 1326.8mg 으로 회수되며 이의 Kd는 0.56이다.

상기 설명으로부터 당해분야 전문가에게는 다른 중성 Pn-Ps 아형(예:Pn7F-Ps)을 상술한 방법에 따라 제조할 수 있으며 중성 다당류인 Pn14-Ps에 대해서와 같이 결합시킬 수 있음이 명백하다

[실시예 7]

뉴모코커스 14 다당류와 외막 단백질 복합체의 결합체 Pn14-Ps-OMPC

a. Pn14-Ps의 1.4-부탄디아민 유도체(14-BuA2)의 제조:

진공에서 3시간동안 P₂O₅상에서 저장한 후 Pn14-Ps 410mg을 디메틸설폭사이드(DMSO) 26ml로 덮고 0.75시간동안 교반하여 용해시킨다. 여기에 카보닐 디이미다졸 62mg을 가하고 생성된 용액을 실온(r.t)에서 80분동안 교반한다.

H20 38.5ml중의 1.4-부탄디아민 디하이드로클로라이드(BuA2·2HCl) 1.067g을 함유하는 용액을 제조하고 2.5N NaOH로 pH를 10.20으로 조정한다. 이 용액을 Millex 0.2㎛ GV필터를 통해 여과한 후 빙욕에서 냉각시킨다.

숙성된 DMSO 용액을 냉각된 BuA2 용액에 가하고 빙욕중에서 추가의 10분동안 교반한다. 실온에서 50분동안 숙성시킨 후 용액을 12" 길이의 Spectrapor 2 투석 튜브 2개에 충전시키고 액체 상부로부터 1cm를 취해 1) 16.5시간 동안 pH 7.0의 0.1M 인산나트륨 완충액 15ℓ; 3) 8시간 동안 pH 7.0의 0.1M 인산나트륨 완충액 15ℓ; 및 4) 17.5시간동안 H₂O 15ℓ에 대해 투석한다. 그후 동결건조시켜 Pn14-Ps의 1.4-부탄 디아민 유도체(Pn14-BuA₂)210mg을 수득한다. 약 5mg 샘플의 NMR 스펙트럼 분석은 부탄디아민 메틸렌 및 N-아세틸 메틸(Pn14-Ps) 공명을 적분하여 비교함에 의해 규명된 다당류 반복 단위 100개당 약 31개의 부탄디아민 잔기가 "부하"되어 있음을 나타낸다.

b. Pn14-Ps의 브로모아세틸화 부탄디아민 유도체(Pn14- BuA2-BrAc)의 제조 :

Pn14-BuA2 (210mg)을 pH 9.0의 0.1M 붕산염-인산염 완충액 36ml로 덮고 2.5시간 동안 교반하여 용액을 제조한다. 그후 아세토니트릴 4ml에 용해된 p-니트로페닐 브로모아세테이트 195mg을 가한다. 생성된 혼합물을 4℃에서 21ㅣ간 동안 교반한다. 이어서 Spectrapor 2 튜브에서 1) 16시간 동안 증류수 15ℓ, 2) 14.5시간 동안 증류수 15ℓ 및 3) 6시간 동안 H2O 15ℓ에 대해 투석한다. 백의 투석된 내용물로부터 검정용으로 2.0ml를 제거한 후 pH 8.0의 무수 인산염 완충액 염 492mg (pH 8.0의 0.1M 인산나트륨 용액을 동결건조시켜 제조)을 가한다. 용액을 2개의 0.2㎛ Corning 필터를 통해 여과하여 Pn14-BuA₂-BrAc의 pH 8.0의 수용액(43ml)을 수득한다.

c. Pn14-BuA2-BrAc-Ps에 대한 OMPC의 결합:

OMPC 50ml (농도 3.2mg/ml)를 5개의 10ml 원심분리 튜브에 충전시켜 Beckman 80Ti 로터중에서 43,000rpm(43K)에서 4℃에서 2시간동안 원심분리한다. 티올화 혼합물을 pH 11.0의 Na2B4O7 완충액 30ml 중에 EDTA (에틸렌 디아민 테트라아세트산이나트륨 염) 350mg 및 디티오트레이톨(DTT) 64mg을 용해시켜 제조한다. N-아세틸호모시스테인 티올락톤 346mg을 가하고 용액을 0.2㎛ Cornoing 필터(컵형)를 통해 여과한다.

상기 원심분리로부터의 펠렛을 여과된 티올화 혼합물 3ml (총 15ml)로 각각 제거하여 Dounce 균질화기로 옮겨 재현탁시킨다. 튜브를 티올화 용액 추가의 5ml로 수회 이동하여 세정한다. 세정 과정을 티올화 용액 추가의 5ml로 반복한다. 합한 세정액을 Dounce에서 균질화시키고 총 재현탁된 물질(25ml)을 100ml 환저 플라스크로 이동시킨다.

격막으로 밀봉하고 Firestone 밸브를 사용하여 공기를 N₂로 대체한 후 반응 혼합물을 21시간동안 숙성시킨다. 반응 혼합물 25ml를 3개의 원심분리 튜브로 나누고 각각 1M KH₂PO₄(수성)로 토핑하고 43K rpm 및 4℃에서 2시간 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 0.1M 인산나트륨 pH 8.0 완충액중에 재현탁시킨다(총 30ml가 최종 재현탁 용적이다).

제2의 한외원심분리(2시간, 4℃, 43K rpm)를 수행한다. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 상기에서 제조한 여과된 Pn14-BuA2-BrAc 용액중에서 Dounce 방법에 의해 재현탁시킨다. 이점에서의 엘만 검정은 총 티올 약 23 ㏖을 나타낸다.

Pn14-BuA₂-BrAc 용액의 여과는 티올화 단백질의 재현탁 바로 전에 수행하여야 함에 유의해야 한다. 생성된 반응물(즉, 티올화된 OMPC를 갖는 Pn14-BuA₂-BrAc)을 (탈기하면서) N₂하에 N₂박스중에서 실온에서 114시간 동안 숙성한다.

반응물을 다음과 같이 캐핑시킨다(즉, Pn14-Ps 및 OMPC 상의 반응성 잔기를 불활성화시킨다): pH 8.0의 0.1M 인산나트륨 완충액 5ml중에 N-에틸말레이미드(NEM) 75mg을 함유하는 용액을 가하고 혼합물을 추가의 22.5시간 동안 숙성시킨다.

캐핑된 반응 혼합물(35ml)을 4개의 원심분리 튜브로 나누고 43K, 4℃에서 2시간 동안 원심분리한다. 펠렛을 TED 완충액(0.1M 트리스, 0.01M EDTA, 0.6% DOC, pH 8.5) 40ml에 재현탁시키고 실온에서 19시간 동안 숙성시킨다. 용액을 43K, 4℃에서 2시간 동안 원심분리한다. 펠렛을 pH 8의 0.1M 인산나트륨 완충액 40ml에 재현탁시킨 후 재원심분리(43k, 2시간, 4℃)시킨다. 이 펠렛을 H₂O 44ml에 재현탁시키고 4℃에서 17시간 동안 숙성시킨다. 저속 원심분리(1000rpm, 3.5분)하여 소형펠렛을 수득하고 이를 제거한다. 상층액을 제거하여 다음 분석 특성을 갖는 43ml의 벌크 결합체를 수득한다:

[실시예 8]

Pn23F-Ps 중간체의 제조 :

(1) 초음파 가수분해 : Pn23F-Ps 분말 3.0g을 실온에서 교반하면서 약 4기간 동안 염수(0.9% NaCl) 1200ml에 용해시킨다. 용액을 Branson 초음파기(1/2 inch 프로브, 세팅 8)로 빙욕중에서 플라스틱 비이커중에서 3분 간격으로 총 15분까지 초음파 처리한다. 각각의 간격마다 점도를 측정한다. 15분 후에, 추가의 5분간 초음파 처리하여 1,206 센티스토크의 점도 종점을 수득한다. 가수분해된 샘플을 실온으로 상승시키고 나트륨 아세테이트 시약(58.4g)을 가하여 최종 농도가 3%(w/v)로 되도록 한다.

(2) 혈청학적 프로브 : 샘플 10ml에 대해 이소프로판올(IPA) 분별 파이롯 연구 및 항체-지시 종점 네펠로즈 검정을 수행한 결과 Pn23F-Ps가 35내지 45% IPA에서 침전됨을 알 수 있다.

(3)제1 IPA 첨가 : 가수분해된 샘플[용적: 1165ml, 상기 단계 (1)로부터]에 IPA 810ml(실온에서 교반하면서 적가)를 가하여 41.0% IPA가 되도록 한다. 샘플을 15 내지 30분 동안 교반한 후 11,000xg에서 30분 동안 원심분리 한다(Beckman JA-10 로터; 8,000rpm; 20℃). 폐 펠렛을 250ml 옴니믹스 쟈중에서 무수 EtOH로 연마한 후, 60ml 소결 유리 깔때기상에 수집한다. 침전물을 무수 EtOH에 이어서 아세톤으로 깔때기상에서 직접 세척한 후 분석용으로 실온에서 CaCl2 상에서 진공 건조시킨다.

(4) 제2 IPA 첨가 및 생성물 회수 : 41.0% IPA 상층액[용적=1925ml, 상기 단계(3)으로부터]에 실온에서 교반하면서 IPA 85.0ml를 적가하여 43.4% IPA가 되게한다. 샘플을 단계(3)에서와 같이 숙성시키고 원심분리한다. 펠렛을 단계(3)에서와 같이 연마하고, 수집한 다음 , 세척하고 건조시킨다. Pn23F-Ps 생성물은 1,795mg이다.

(5) 두석 및 동결건조: 상기 단계 (4)로부터의 Pn-Ps 샘플 (1779mg)을 실온에서 3 내지 4시간 동안 증류수 712ml에 용해시킨다. 용액(2.5mg/ml)를 투석 튜브(12,000MW 차단; 45mm)로 옮기고 증류수를 추가로 2번 교환시키면서 27시간 동안 4℃에서 증류수에 대해 투석한다. 이어서 샘플을 동결건조 플라스크로 이동시켜 드라이아이스; 메탄올 욕중에서 쉘-동결시킨 후 2 내지 3일 동안 Virtis(Freezemobile) 동결건조기상에서 동결건조시킨다. 최종 Ps 생성물은 1703mg 회수되며 최종 생성물의 Kd는 0.60이다.

[실시예 9]

Pn23F-Ps 중간체와 외막 단백질 복합체의 결합

a. Dowex 50X2(200-400메쉬)의 제조

테트라부틸암모늄 형태 수지[Dowex 50(Bu4N+)] Dowex 50X2(200-400메쉬) H+ 형태(72g)를 H20 (이 공정 전체에서 사용되는 물은 발열 물질을 함유하지 않으며 멸균 증류수이다) 중에 슬러리시키고 컬럼에 충전시키고 1) H2O 800ml; 2) 6N HCl 400ml; 3) 유출물이 pH 페이퍼에 중성이 될때까지 H2O 300ml ; 4) 유출물이 pH 페이퍼에 강한 알칼리성이 될때까지 테트라부틸암모늄 하이드록사이드 10% 수용액 250g; 및 5)H2O 750ml로 연속적으로 세척한다.

b. Pn23F-Ps 테트라부틸암모늄 형태[Pn23F(Bu4N+)]의 제조

Dowex 50X2(Bu4N+)의 34ml 컬럼을 H2O 70ml로 세척한다. 크기 분류된 Pn23F-Ps 450을 H20 50ml로 덮고 0.5시간 동안 교반한다. 이 용액을 컬럼에 가하고 중력(약 2시간)에 의해 삼투시킨다. 이점에서 컬럼 바닥에 진공을 적용하여 추가로 1시간동안 계속 용출(진공하에)한다. 컬럼을 H2O 25ml로 세척하고 합한 용출물을 동결 건조시켜 Pn23F(Bu4N+) 염 0.5g을 수득한다. 이를 약 17시간동안 P2O5 하에 진공 데시케이터에 저장한다.

c. Pn23F-Ps의 1.4-부탄디아민 유도체(Pn23F-BuA2)의 제조:

상기 단계 b로 부터 Pn23F(Bu4N+)0.5g을 디메틸설폭사이드 (DMSO) 25ml로 덮고 15분간 교반하여 용해시킨다. 여기에 카보닐 디이미다졸(CDI) 22mg을 가하고 생성된 용액을 0.5시간 동안 실온에서 교반한다.

H20 32ml 중에 1.4-부탄디아민 디하이드로클로라이드(BuA2·2HCl) 507g을 함유하는 용액을 제조하고 pH를 2.5N NaOH를 사용하여 10.23으로 조정한다. 이 용액을 Millex 0.2㎛ GV 필터를 통해 여과하고 빙욕에서 냉각시킨다.

숙성된 DMSO 용액을 냉 BuA₂용액에 가하고 빙욕에서 추가로 1시간 동안 교반시킨다. 이어서 실온에서 1시간 동안 숙성시킨 후, 용액을 2x 12"의 Spectrapor 투석 튜브에 넣고, 액체 상부로부터 1cm를 취해 하기에 대해 분석한다.

1) 16시간 동안 pH 7.0의 0.1M 인산나트륨 완충액 15ℓ :

2) 10.5시간 동안 pH 7.0의 0.01M 인산나트륨 완충액 15ℓ:

3) 12.5시간 동안 pH 7.0의 0.01M 인산나트륨 완충액 15ℓ:

4) 10.5시간 동안 H₂O 15ℓ. 동결 건조시켜 Pn23F-Ps의 1.4-부탄디아민 유도체(Pn23F-BuA2) 220mg을 수득한다.

약 6.9mg의 NMR 스펙트럼은 부탄디아민 메틸렌 및 람노즈 메틸(Pn23F)공명의 적분을 비교함으로써 규명된 다당류의 반복 단위 100개당 약 23.5개의 부탄디아민 잔기가 "부하"되어 있음을 나타낸다.

d. Pn23F-Ps의 브로모아세틸화 부탄디아민 유도체(Pn23F-BuA2-BrAc)의 제조

Pn23F-BuA2(214mg)을 pH 9.0의 0.1M 붕산염-인산염 완충액 23ml로 덮고 30분 동안 교반하여 용해시킨다. 이어서 아세토니트릴 6ml중의 p-니트로페닐 브로모아세테이트 230mg을 가한다. 생성된 혼합물을 4℃에서 23시간 동안 교반한다. 이어서 Spectrapor 2 튜브내에서 하기에 대해 투석한다: 1) 8시간 동안 H2O 15ℓ, 2)12시간동안 H₂O 15ℓ 및 3) 6시간 동안 H₂O 15ℓ. 백의 투석된 내용물로 부터 검정용으로 1.5ml를 제거한 다음 pH 8.0의 무수 인산염 완충액(pH 8.0의 0.1M 인산나트륨 용액을 동결건조시켜 제조) 490mg을 가한다. 용해에는 약 15분이 필요하고, 이 시간후 0.2㎛의 Corning 필터를 통해 여과하여 Pn23F-BuA₂-BrAc의 pH 8.0 수용액을 수득한다.

e. OMPC의 Pn23F-BuA2-BrAc-Ps로의 결합:

OMPC 60ml(3.1mg/ml)를 6개의 10ml 원심분리 튜브에 넣고 4℃에서 43,000 rpm(43K)의 Beckman 80 Ti 로터 안에서 2시간 동안 원심분리한다. 티올화 혼합물은 EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산 이나트륨염) 260mg을 용해시키고 Na₂B₄O₇티올락톤 30ml중의 디티오트레이톨(DTT) 52mg을 가한 다음 0.2㎛ Corning 필터(컵형)를 통해 용액을 여과하여 제조한다.

상기 원심분리로부터의 펠렛을 각각 여과된 티올화 혼합물(총 20ml) 3ml로 제거하고 Dounce 균질화기로 옮긴 다음 재현탁시킨다. 추가의 티올화 용액 6ml를 연속적으로 이동시키면서 튜브를 세정한다. 세정 공정을 추가의 티올화 용액 4ml로 반복한다. 합한 세적액을 Dounce내에서 균질화하고 재현탁된 총 물질(28ml)을 10ml들이 환저 플라스크로 이동시킨다.

격막으로 밀봉하고 Firestone 밸브를 사용하여 공기를 N2로 대체시킨 후, 반응 혼합물을 19시간동안 숙성시킨다. 이어서 반응 혼합물 28ml를 3개의 원심분리 튜브에 나누어 넣고, 각각을 1M 인산칼륨(수성)으로 토핑한 다음 4℃, 43K rpm의 Beckman 80 Ti 로터 내에서 2시간 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 pH 8.0의 0.1M 인산나트륨 완충액 중에서 재현탁시킨다( 총 30ml가 최종 재현탁 용적이다).

이어서 제2한외 원심분리(2시간, 4℃,43K rpm)를 수행한다. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 7.I.C. 3d 단락에서 제조된 여과된 Pn23F-BuA2-BrAc 용액중에서 Dounce 방법으로 채현탁시킨다. 이 시점에서의 엘만 검정은 생성된 용액중에 총 약 28㏖의 티올이 있음을 나타낸다.

Pn23F-BuA2-BrAc 용액을 여과는 티올화 단백질의 재현탁 직전에 해야 함을 주목해야 한다. 생성된 반응물(즉, 티올화 OMPC을 갖는 Pn23F-BuA2-BrAc)을 N₂상자내 실온에서 117시간 동안 (탈기하면서) N₂하에서 숙성시킨다.

이어서 반응물을 하기와 같이 캐핑한다(즉, Pn23F-Ps 및 OMPC 상의 반응성 잔기를 불활성화한다): 0.22㎛ 필터를 통해 여과된 pH 8.0의 0.1M 인산나트륨 완충액 5ml 중의 N-에틸말레이미드(NEM) 75mg을 함유하는 용액을 반을물에 가하고 18시간 동안 숙성시킨다.

캐핑된 결합 혼합물의 총 용적은 38.5ml이고 , pH8.0의 0.1M 인산나트륨 완충액 1.5ml를 가해 총 용적을 40ml로 한다. 이 용액 35ml를 4개의 10ml들이 원심분리 튜브에 똑같이 넣고 각각 pH 8의 0.1M 인산나트륨 완충액으로 토핑한다. 이를 43K rpm으로 4℃에서 2시간 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 각각의 펠렛을 TED 완충액 (1M 트리스, pH 8.5. 0.01M EDTA, 0.5% Na 데옥시콜레이트) 8ml로 제거한 다음 Dounce 균질화기로 옮긴다. 원심분리 튜브를 추가의 TED 완충액 8ml로 연속적으로 재정하고 펠렛을 재현탁(총 40ml)시킨 다음 실온에서 20시간동안 숙성시킨다. 숙성된 물질을 (상기와 같이) 4℃에서 43K, 4개의 10ml들이 튜브내에서 2시간 동안 원심분리한다. 각각의 펠렛을 TED 완충액 8ml로 제거하고, 튜브를 TED 완충액 8ml로 연속적으로 세정한 다음, 상기와 같이 재현탁시키고 원심분리한다. 이어서 이들 펠렛을 pH 7의 0.1M 인산나트륨 완충액 총 40ml중에 재현탁시키고, 상기와 같이 재원심분리한다. 펠렛을 물 총 44ml중에 재현탁시키고 4℃에서 17시간 동안 숙성시킨다. 소량의 불용성 물질을 저속 원심분리(1000rpm, 3.5분)시켜 제거하여 상층액중의 생성물을 수득한다.

생성된 상층액은 약제 물질로서 벌크 결합체 백신이다. 결합체는 하기 분석 특성을 갖는다 :

[실시예 10]

Gaulin 균질화에 의한 Pn-Ps의 제조

조 뉴모코커스 분말을 4℃에서 밤새 혼합함으로써 물중에서 1.5mg/ml의 농도로 용해시킨다. 또한 보다 농축된 Pn-Ps 용액을 10mg/ml로 제조한다 50mM CaCl₂를 가하는 것은 점도를 10mg/ml 용액중에서 1.5mg/ml로 감소시키는데 성공적이다. 이어서 용해된 Pn-Ps를 4개의 압력 세팅 2000, 5000, 10000 또는 15000 PSI 중 하나로 세팅된 가울린 균질화기를 통해 통과시킨다. 이어서 전단시킨 Pn-Ps를 CaCl₂중에서 2M 스톡으로부터 50mM로 만든 60% 이소프로판올을 가해 수집 한다. 펠렛을 Omni- 혼합기내에서 100% 에탄올로 세척하고, 여과하여 침전된 Pn-Ps를 회수한다. Pn-Ps를 필터상에서 아세톤으로 세척한 다음 CaSO4(건조물)상에서 건조시키고 -70℃에서 분석할 때까지 저장한다. 전단시킨 Pn-Ps의 분취량을 약 1mg/ml로 재현탁시키고 HPSEC-통상적 검량에 의한 분자 크기 및 다중분산도, 및 비탁도에 의한 항원성 지수에 대해 분석한다:

[실시예 11]

마우스 T-세포 자극

본 시험은 마우스중의 Pn-Ps 결합체 백신의 의존성/면역원성을 입증하기 위하여 수행한다. 2세 미만의 어린이는 통상적으로 T-의존성 항원에 잘 반응하기 때문에 본 모델로 채택한다. 치매성 마우스는 비정성적인 흉선 상피를 갖기 때문에 이들의 T-의존성 항원에 대한 반응은 이들의 정상적 동종 동포자(littermate)보다 상당히 떨어진다.

다당류 0.5㎍의 투여량을 제공하기 위하여 백신의 단일 희석물을 0.7 및 28일째에 성숙한 치매성 마우스(nu/nu) 및 이들의 동종 대조 동포자(nu/+)에게 복강내 주입한다. 마우스를 1주후에 방혈시키고 항체 반응성을 알아보기 위하여 방사선면역검정(RIA)으로 이들 개개의 혈청을 시험한다.

RIA에서, 각 마우스 혈청을 C14 표지된 Pn-Ps와 합한다. 이어서 형성된 모든 항원-항체 복합체를 포화 황산 암모늄을 첨가함으로써 침전시킨다. 가공된 각 샘플을 1분동안 β 계수한다. 본 발명의 Pn6B-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pn18C-Ps 및 Pn4-Ps 결합체를 본 방법으로 시험한 결과 Nu/+ 마우스에서 우수한 T-세포 자극을 유도해 낸다는 사실을 밝혀내었다.

[실시예 12]

유아 레서스 몽키(Rhesus Monkey) 중의 Pn-Ps 결합체의 면역원성

유아 몽키의 Pn-Ps-OMPC EH는 Pn-Ps-MIEP 결합체 백신의 벌크 결합체 또는 충전된 컨테이너의 면역원성을 입증하기 위하여 본 시험을 수행한다. 유아 몽키 모델은 PedvaxHIBTM 결합체 백신에 대한 우수한 임상 지시제인 것으로 밝혀졌으며 [참조: Vella et al., Pediatrcs, April 5 Suppl., pp 668-675(1990)] 따라서, Pn-Ps 결합체 백신 평가용 모델로서 선택된다.

백신 투여량을 0 및 28일째 2 내지 3개월된 유아 몽키에게 근육내(2개 부위 각각에 0.25ml씩) 주사한다. 0.28 및 42일째에 몽키를 방혈시키고 항체 반응성을 알아보기 위하여 방사선 면역검정(RIA)으로 개개의 혈청을 시험한다.

RIA에서, 각 몽키 혈청을 C14 표지된 Pn-Ps와 합한다. 이어서 형성된 항원-항체 복합체를 포화 황산암모늄을 첨가함으로써 침전시킨다. 가공된 각 샘플을 1분동안 β계수기에서 계수한다. 시럼 동물의 50% 이상이 2회 투여량의 백신을 투여받은 후 1㎍ 이상의 항체 반응성을 나타내면, 백신에 대한 면역원성 반응은 만족할만하다.

Pn6B-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pn19F-PS-OMPC, Pn18C-Ps-OMPC, Pn4-Ps-OMPC 및 Pn14-Ps-OMPC는 강력한 항-타입-특이적 항체 반응성을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, Pn6b-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, PN19F-Ps-OMPC 및 Pn14-Ps-OMPC를 포함하는 4가지 조성물은 모든 4가지 혈청형에 대한 항-Pn-Ps 항체 반응성이 우수한 것으로 나타났다.

[실시예 13]

친칠라에서 뉴모코커스 결합체의 보호 효능

AL(OH)3에 흡착된 Pn6B-Ps-OMPC(0, 0.25, 1.0 또는 4.0㎍)을 각 친칠라에게 피하 또는 근육내 주사한다. 친칠라을 0, 2, 4, 6 및 8주째 방혈시킨다. 주사한지 8주 후에 당해 동물은 스트랩토코커스 뉴모니애 6B로 첼린지하고 1 내지 3일마다 검이법 및 고막측정법으로 모니터링한다. 배양용으로 중이 유출물을 흡인시키고 챌린지한지 2주 후에 당해 동물을 희생시킨다. 희생된 동물을 중이 조직 병리학에 대해 분석한다. 결합체가 전혀 투여되지 않은 동물에서는 60%의 치사율을 가져온 반면, 최저의 투여량으로 투여된 동물에서는 치사율이 0%로 나타났다. 결합체가 전혀 투여되지 않은 동물은 화농성 중이염에 대한 보호를 전혀 받지 못하는 반면, 결합체가 투여된 동물의 60 내지 100%가 모든 투여량 범위에 걸쳐 보호되었다.

[실시예 14]

2 내지 5세 어린이의 항-뉴모코커스 면역 반응

항-Pn6B-Ps 항체의 생성을 알아보기 위하여 Pn6B-Ps 0.5 또는 5㎍이 각각 2회 투여된 2 내지 5세 어린이를 RIA 및 ELISA으로 시험한다. 항-PN6B-Ps 항체의 상당한 증가가 관찰되었다.

[실시예 15]

뉴모코커스 다당류 비탁도

본 분석의 목적은 비탁도를 사용하여 유리 Pn-Ps 및 결합체 제제의 다당류 함량과 항원성 지수를 측정하는 것이다.

비탁도에 대한 표준 곡선의 법위는 Pn-Ps 단위 질량당 반응성으로서 각종 Pn-Ps에 대한 것과 상이하고 방응성 대 Pn-Ps 항원 농도 프로파일의 직선 부분은 각 Pn--Ps에 대한 것과 상이하다. 본 명세서에서 제시된 방법 실시예는 Pn6B 결합체에 대해 특이적이며, 기타 Pn-Ps 타입의 결합체에 대해 적용할 필요는 없다. 부가적으로, 명반-흡착된 샘플 및 이들의 각각의 표준물을 다음에 기술하는 바와 같이 0.9% NaCl 보다는 3% 나트륨 시트레이트종에 희석시킨다. 수성 결합체 샘플 및 표준물(즉, 명반상에 흡착되지 않은 것들)은 0.9% NaCl 중에 희석시키고, 표준 곡선의 제한 범위내인 것으로 예상되는 공정 농도로 재희석시킨다.

a) 시약

염수 용액 : 0.9% 수성 NaCl

항-Pn-Ps 혈청 : 항혈청(Health Research, inc., Albany, NY)을 염수 용액으로 30배 희석시킨다.

표준물 : 스톡 용액 387㎍/ml으로부터 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 및 4.0mg/ml Pn-Ps 결합체 표준물을 제조하고, 다당류에 대한 페놀 황산 분석으로 이의 농도를 측정한다.

시험 샘플 : 나트륨 시트레이트 스톡 중에서 3% 나트륨 시트레이트의 최종 농도를 갖도록 제조하고, 1.0, 2.0 및 3.0mg Pc-Ps/ml의 이론 농도로 시험 샘플을 일련 희석한다.

b) 공정

이중 측정법을 이용하는 Beckman ICS 비탁도 측정기를 사용하여 모든 샘플과 표준물을 분석한다. 표준 곡선으로부터 샘플의 농도를 측정한다. 샘플 농도에 희석인자를 곱한 다음 각 시험 샘플에 대한 값을 평균한다.

앞서 지적한 바와 같이, 본 발명에 의해 항원성 지수가 70% 미만인 것으로 밝혀진 샘플은 사용되어진 Pn-Ps가 목적하는 면역학적 특징을 지니는 것을 확인하기 위한 결합을 거부한다.

[실시예 16]

MIEP를 암호화하는 게놈성 DNA의 클로닝

페놀 불활성화된 나이세리아 메닝기티디스 세포(실시예 1 참조) 약 0.1g을 깨끗한 튜브 속에 위치시킨다. 페놀 불활성화된 세포는 TE 완충제[10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0] 567㎕ 속에 재현탁시킨다. 재현탁된 세포에 10% SDS 30㎕ 및 20mg/ml 프로테이나제 K(Sigma 제조원) 3㎕를 가한다. 세포를 혼합하여 37℃로 약 1시간 동안 항온처리한 후에, 5M NaCl 100㎕를 가한다음 골고루 혼합시킨다. 이어서, 0.7M NaCl 중의 1% 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 80㎕를 가하고, 골고루 혼합한 다음 65℃로 10분동안 항온처리한다. 동일 용적(약 0.7내지 0.8ml)의 클로로포름/이소아밀 알콜(각각 24:1의 비)를 가하고, 골고루 혼합한 다음 약 10,000xg으로 약 5분동안 원심분리시킨다. 수성(상부)상은 새로운 튜브로 옮긴 다음 유기상을 제거시킨다. 동일 용적의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(각각 25:24:1의 비)을 수성상에 가하고, 골고루 혼합한 다음, 10,000xg으로 약 5분동안 원시분리시킨다. 수성상(상부)은 새로운 큐브로 옮기고, 0.6 용적(약 420㎕)의 이소프로필 알콜을 가한 후에, 골고루 혼합하여 침전된 DNA를 10,000xg으로 10분 동안 원심분리시킨다. 상층액을 제거한 다음, 펠렛은 70% 에탄올을 사용하여 세척한다. DNA 펠렛은 건조시키고, 100㎕의 TE 완충제 중에 재현탁시킨 결과 나이세리아 메닝기티디스 게놈성 DNA가 나타났다.

MIEP 유전자의 5' 말단 및 MIEP 유전자의 3' 말단[참조: Murakami, E.C et al,(1989). Infection and Immunity, 57, pp. 2318-23]에 상응하는 2개의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. MIEP 유전자의 5' 말단에 대하여 특이적인 DNA 올리고뉴클레오타이드의 서열은 5'-ACTAGTTGCAATGAAAAAATCCCTG-3'이고 MIEP 유전자의 3' 말단에 대하여 특이적인 DNA 올리고뉴클레오타이드의 서열은 5'-GAATTCAGATTAGGAATTTGTT-3'이다. 이들 DNA 올리고뉴크렐오타이드는 10ng의 나이세리아 메닝기티디스 게놈성 DNA를 사용하는 MIEP 유전자의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭에 대한 프라이머로서 사용된다. PCR 증폭 단계는 제조자(Perkin Elmer)에 의해 제공된 공정에 따라 수행한다.

이어서, 증폭된 MIEP DNA는 제한 앤도뉴클레아제 Spel 및 EcoRI로 분해된다. MIEP의 완전한 암호화 영역을 포함하는 1.3kb DNA 단편은 1.5% 아가로즈 겔 상에서 전기영동시킴으로써 분리한 다음, 전기용출시킴으로써 겔로부터 회수한다[참조: Current Protocols in Molecuar Biology, (1987), Ausubel. R. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore. D. D., Smith. J. A., Seidman. J, G. and Struhl. K., eds., Green Publishing Assoc.]

플라즈미트 백터 pUC-19는 Spel 및 EcoRI로 분해시킨다. 겔 정제된 Spel-EcoRI MIEP DNA는 Spel-EcoRI pUC-19 백터로 연결시킨 다음 이, 콜라이 균주 DH 5로 형질전환시키는데 사용한다. 1.3kbp MIEP DNA 와의 pUC-19 백터를 포함하는 형질전환체는 제한 엔도뉴클레아제 매핑(mapping)에 의해 확인하고, MIEP DNA는 서열분석하여 이의 동정성을 확인한다.

[실시예 17]

pC1/1. Ga110p (B) ADHlt 백터의 작제:

Gal 10 프로모터는 Sau 3A 및 Hind Ⅲ으로 절단시킨 후에 수득된 0.5kbp 단편을 겔 정제시킴으로써 플라즈미드 YEp 52[참조 : Broach, et al.. (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression Inouye. M(Ed) Academic Press pp. 83-117]로부터 분리시킨다. ADH1 터미네이터는 Hind Ⅲ과 Spel으로 절단시킴으로써 수득된 0.35kbp 단편을 겔 정제시킴으로써 벡터 pGAp. tADH2[참조: Kniskern, et al., (1986), Gene, 46, pp 135-141]로부터 분리시킨다. 2개의 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 BamHI 및 SphI로 분해시킨 겔 정제된 pUC 18△ Hind Ⅲ 벡터[Hind Ⅲ 부위는 Hind Ⅲ을 사용하여 pUC18을 분해시키고, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 Klenow 단편을 사용하여 평활 말단화시킨 다음, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킴으로써 제거된다]에 연결시켜 모 백터 pGallo-tADHl을 생성시킨다. 이것은 Gal10p, ADHlt 접합부에서 독특한 Hind Ⅲ 클로닝 부위는 Hind Ⅲ을 사용하여 pGal10, tADHl을 분해시키고, 절단된 DNA를 겔 정제한 다음, T4 DNA 리가제를 사용하여, 하기 HInd Ⅲ-BamHI 링커에 연결시켜 변화시킨다:

5'-AGCTCGGATCCG-3'

3'-GCCTAGGCTCGA-5'.

수득한 프라즈미드, pGal10(B)tADH1은 Hind Ⅲ 부위가 삭제되어 독특한 BamHI 클로닝 부위를 생성한다.

Gal10p. tADH1 단편은 Smal 및 Sph1을 사용하여 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활 말단화시킨 다음, 겔 정제시킴으로써 pGal10(B)tADh1으로부터 분리시킨다. 효모 셔틀 벡터 p C1/1 [참조 : Brake et al., (1984). Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA. 81. pp. 4062-4646]는 SphI을 사용하여 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활 말단화시킨 다음, 정제한다. 당해 단편은 T4 DNA 리가제를 사용하여 벡터에 연결시킨다. 이어서, 연결 반응 혼합물을 사용하여 이, 콜라이 HB101 세포를 형질전환시켜 앰피실 내성을 수득하고, 형질 전환체는³²P-표지된 Hind Ⅲ-BamHI 링커의 단일쇄에 하이브리드화시킴으로써 스크리닝(screening)한다. 신규한 벡터 작제물, pC1/1.Gal10p(B)ADH1t는 Hind Ⅲ 및 BamHI을 사용하여 분해시킴으로써 확인한다.

[실시예 18]

MIEP+ 리더 DNA 서열을 갖는 효모 MIEP 발현 벡터의 작제

MIEP의 완전한 암호화 영역을 포함하는 DNA단편은 Spel 및 EcoRI를 사용하여 pUC 19. MIEP #7을 분해시키고, MIEP DNA를 정제시킨 다음 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활 말단화시킴으로써 생성된다.

효모 내부 발현 벡터 pC1/1.Gal10p(B)ADH1t는 BamHI을 사용하여 분해시키고, 송아지 장내의 알칼린 포스파타제를 사용하여 탈포스포릴화한 다음, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활 말단화시킨다. DNA는 겔 정제시켜 비절단된 벡터를 제거시킨다.

MIEP 1.1kbp 평활 말단화된 단편을 평활 말단화된 pC1/1.Ga110p(B)ADH1t 벡터에 연결시킨 다음, 연결 반응 혼합물을 사용하여 적당한 이, 콜라이 DH 5 세포를 형질전환시켜 엠피실린 내성을 수득한다. 형질전환체는³²P-표지된 DNA 올리고 뉴클레오타이드로 하이브리드화시킴으로써 스크리닝시킨다: 5'---AAGCTCGGATCCTAGTTGCAATG---3'는 MIEP-벡터 접합부에 중첩되는 서열과 동종이 되도록 고안된다. DNA의 제제는 하이브리드화 양성 형질전환체로부터 제조되고 Kpnl 및 Sall을 사용하여 분해시켜 MIEP 단편이 Gal10 프로모터로부터의 발현에 있어서 정확하게 배향됨을 입증시킨다. DNA 작제물의 추가의 확인은 Gal10 프로모터로부터 MIEP 암호와 영역으로 디데옥시 서열분석함으로써 수득된다.

형질전환체에 의한 MIEP의 발현은 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)시킴으로써 검출된다. 형질전환체 속에서 생성된 재조합체 MIEP는 OMPC 소포로부터 정제된 MIEP와 함께 폴리아크릴 겔 상에서 동시이동되고, MIEP에 대해 특이적인 항체와 면역학적으로 반응성이 있다.

[실시예 19]

5'- 변형된 MIEP DNA 서열을 갖는 효모 MIEP 발현 벡터의 작제

폴리머라제 쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여 Hind Ⅲ 부위, 보존된 효모 5' 비해독된 리더(NTL), 메티오닌 출발 코돈(ATG), 완전한 MIEP(위치+20의 Asp로 시작)의 처음 89개 코돈 및 KpnI 부위(위치+89)를 함유하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 제조업자(Perkin Elmer Cetus)의 지시에 EK라 플라스미드 pUC19MIEP42#7을 주형으로서 사용하고 다음 DNA 올리고머를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행한다:

5'CTAAGCTTAACAAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT3' 및

5'ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG3'

MIEP 클론의 5' 영역을 제거하기 위해, 플라즈미드 pUC19MIEP42#7을 KpnI 및 Hind Ⅲ로 분해시키고 3.4kbp 벡터 단편을 아가로즈 겔 정제한다. 280bp PCR 단 편을 KpnI 및 Hind Ⅲ로 분해시키고, 아가로즈 젤 정제하고 3.4kbp 벡터 단편으로 연결시킨다. 이, 콜라이 HB101(BRL)의 형질전환체를 DNA 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화에 의해 스크리닝하고, 양성 형질전환체로부터의 DNA을 제한효소 분해에 의해 분석한다. PCR 단계중에 돌연변이가 없었다는 것을 보증하기 위해서, 양성형질전환체의 280 bp PCR 제조된 DNA를 서열분석한다. 생성된 플라즈미드는 효모 NTL, ATG 코돈 및 Asp 코돈(아미노산+20)에서 시작되는 MIEP의 전체 개방 판독 프레임 (ORF)로 구성되는 Hind Ⅲ-EcoRI 삽입물을 함유한다.

이 효모 MIEP 발현 벡터는 다음과 같이 작제한다. pGAL10/pC1/1 및 pGAp/pCl/1 벡터[참조: Vlasuk, G. P., et al.,(1989), J. B. C. 264 pp. 12, 1016-12, 112]를 BamHI로 분해하고, DNA 포리머라제 I의 Klenow 단편으로 섬광 말단화하고, 송아지 장내 알갈린 포스파타제로 탈포스포릴화한다. 이 선형 벡터를 처리된 Klenow으로 연결시키고 상기한 바와 같이 Hind Ⅲ-EcoRI 단편(효모 NTL, ATG 및 MIEP의 OPF 함유)을 겔 정제하여 pGa110/pC1/1-MIEP 및 pGAP/pCl/1-MIEP을 형성한다.

시카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae) 균주 U9(ga110pga14-)을 플라즈미드 pGa110/pCl/1-MIEP로 형질전환시킨다. 재조합체 클론들을 분리하여 MIEP 발현을 조사한다. 클론들은 20% 글루코즈(w/v)를 함유하는 합성 배지(leu-) 중에 약 6.0의 0.D.₆₆₀로 진탕시키면서 37℃에서 배양한다. 그런 다음, 갈락토즈를 2%(w/v)로 가해서 Ga110 프로모터로부터 MIEP의 발현을 유도한다. 세로들을 추가의 45시간 동안 배양하여 약 9.0의 O.D.₆₆₀로 갈락토즈 유도시킨다. 원심분리로 세포들을 수거한다. 세포 펠렛을 중류수로 세척하고 동결시킨다.

제조합체 MIEP에 대한 웨스턴 블롯

효모가 MIEP을 발현하는지 알아보기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행한다. 12%, 1mm, 10 내지 15 웰 Novex Laemmli 겔을 사용한다. 효모 세포들은 유리 비이드[나트륨 도데실설페이트(SDS)를 분쇄 과정에서 2%로 사용할 수 있다]을 사용하여 물속에서 분쇄한다. 세포 파편들을 원심분리(10,000xg에서 1분간)로 제거한다.

상층액을 MIEP의 폴리아크릴아미드 겔 정제에 대해 기술한 바와 같이, 샘플 전개 완충액과 혼합한다. 샘플을 35mA에서 OMPC을 참고 대조물로 사용하고 브로모페놀 블루 염료 마커가 겔로부터 전개할 때까지 전개시킨다.

단백질을 0.45㎕ 공그 크기의 니트로셀룰로즈 페이퍼 위에 NOVEX 수송 장치를 사용하여 옮긴다. 수송후, 이 니트로셀룰로즈 페이퍼를 인산염 완충 염수증의 5%소 혈청 알부민으로 1시간 동안 차단시킨다. 그 후 15ml의 1:1000 희석된 래빗항-MIEP 항혈청(표준 절차를 이용하여 겔 정제된 MIEP로 면역시켜 제조)을 가한다. 실온에서 밤새 항온처리한 후 15ml의 1:1000 알칼린 포스파타제 결합된 염소 항 래빗 IgG을 가한다. 2시간 항온처리한 후 FAST RED TR SALT(Sigma) 및 나프톨-As-MX 포스페이트(Sigma) 를 사용하여 블롯을 전개시킨다.

[실시예 20]

재조합체 MIEP의 세균 발현

1.3kb의 MIEP 유전자 삽입물을 함유하는 플라즈미드 pUC19-MIEP을 제한 엔도뉴클레아제 Spel 및 EcoRI로 분해한다. 1.1kbp 단편을 본 분야에서 공지된 표준기술을 사용해서 아가로즈 겔상에서 분리하여 정제한다. 2개의 시스트론(cistron) TAC 프로모터 및 유일한 EcoRI 부위를 갖고 있는 플라스미드 pTACSD을 EcoRI로 분해한다. 제조자의 지시사항에 따라 T4 DNA 폴리머라제(Boehringer Mannheim)을 사용하여 1.3kbp MIEP DNA 및 pTACSD 벡터에 평활 말단을 만든다. 평활 말단화 1.3kbp MIEP DNA룰 제조자의 지시 사항에 따라 TA DNA 리가제(Boehringer Mannheim 제조원)을 사용해서 평활 말단 벡터에 연결한다. 이 연결 DNA을 사용하여 제조자의 지시에 따라서 이. 콜라이 균주 DH5aIQMAX(BRL)을 형질전환시킨다. 형질전환된 세포들은 25㎍ 가나마이신/ml 및 50㎍ 페니실린/ml을 함유하는 한천 플레이트상에 플레이팅하고 37℃에서 약 15시간 동안 항온처리한다. MIEP와 상동의 서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오타이드를³²P로 표지하여, 표준 DNA 하이브리드화 기술들을 사용하여 형질전환제들의 플레이트로부터 용해되고 변성된 콜로니를 함유하는 니트로셀룰로즈 필터들을 스크리닝하는데 사용한다. 하이브리드화에 의해 양성인 콜로니를 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 매핑하여 MIEP 유전자의 배향을 측정한다.

형질전환체에 의한 MIEP의 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 검출한다. 형질전환체들 내에서 생성된 재조합체 MIEP는 OMPC 소포로부터 정제된 MIEP와 함께 폴리아크릴아미드 겔에서 함께 이동하며 MIEP에 특이적인 항체와 면역학적으로 반응성이다.

[실시예 21]

나이세리아 메닝기티디스 MIEP에 대한 Pn-Ps의 결합

미합중국 특허 제4,882,317호에 기술되어 있는 방법에 따라 화학적 결합을 수행한다.

pH 11.5의 0.1M 붕산염 완충액 3ml 중 MIEP 10mg을 10mg의 에틸렌디아민 테트라아세트산 이나트륨 염(EDTA, Sigma Chemicals 제조원) 및 4mg의 디티오트레이톨(Sigma Chemicals 제조원)와 혼합한다. 단백질 용액을 N₂로 충분히 플러싱한다. N-아세틸호모시스테인티올락톤(Aldrich Chemicals 제조원)125mg을 이 MIEP 용액에 가하고 혼합물을 16시간 동안 실온에서 항온처리한다. 그 다음에, 4mM EDTA를 함유하고 있는 pH 9.5의 0.1M 붕산염 완충액 2ℓ에 대해 N₂하에서, 실온으로 24시간동안 2회 투석한다. 이 티올화 단백질을 엘만 시약(Sigma Chemicals 제조원)으로 티올 함량을 분석하고 Bradford 시약(Pierce Chemicals 제조원)로 단백질 농도를 측정한다. Pn-Ps에 MIEP을 결합시키기 위해, 브로모아세틸화 Pn-Ps을 MIEP 용액에 1.5배 과량(wt/wt)으로 가하고 1N NaOH로 pH 9 내지 9.5로 조정한다. 혼합물을 실온에서 6 내지 8시간 동안 N2하에서 항온처리한다. 반응 말기에 25㎕의 N-아세틸시스테아민(Chemical Dynamics 제조원)을 혼합물에 가한다. 그리고, 실온에서 N₂하에서 18시간 동안 방치한다. 1N HCl로 pH 3내지 4사이로 결합체 용액을 산성화하고 10분간 10,000xg에서 원심분리한다. 상층액 1ml을 FPLC Superose 6B(1.6x50cm, Pharmacia 제조원)의 컬럼에 직접 붓고, 결합체를 PBS로 용출한다. 다당류-단백질 결합체(Pn-Ps-MIEP)를 함유하는 공극 용적 피이크를 수거한다. 결합체 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하여 멸균한다.

[실시예 22]

Pn-Ps-MIEP 결합체의 면역원성의 증명

면역화 : 숫컷 Balb/c 마우스(Charles River, Wilmington, MA)를 미리 제조된 명반 0.5ml 중의 2.5㎍ Pn-Ps을 사용해서 MIEP에 공유결합된 Pn-Ps로 복강내 면역화시킨다. 대조군 마우스들은 Pn-Ps-CRM [참조: Anderson, M. E. et al. (1985). J. Pediatrics. 107. pp 346-3511 (2.5㎍ Pn-Ps/6.25㎍ CRM : 사람에 대한 투여량의 1/4)Pn-Ps-DT (2.5μg Pn-Ps/1.8μg DT ; Pn-Ps 일정량이 사용되도록 하는 사람에 대한 투여량의 1/10) 및 Pn-Ps-OMPC(2.5μg Pn-Ps/35μg OMPC ; 사람 투여량의 1/4)로서 주어지는 동량의 Pn-Ps로 면역화한다.

유아 레서스 몽키(생후 6 내지 13.5주)을 명반위에 흡착시킨 Pn-Ps-MIEP 결합체로 면역화한다. 각 몽키는 0.25ml의 결합체를 2개의 상이한 부위(즉 총 투여량 0.5ml)에 주사 맞는다. 이 몽키들은 0, 28, 56일에 면역화하고 매 2 내지 4주마다 혈액 샘플을 채취한다.

항체 반응은 ELISA로 측정한다. 이것은 면역글로블린 반응의 부류 및 아부류를 구별한다. 총 항-Pn-Ps 항체를 정량하는 RIA도 몽키의 반응을 평가하는데 사용한다.

Pn-Ps-MIEP 결합체는 IgG kd-Pn-Ps 항체 및 기억 반응으로 구성되는 마우스 들에서의 면역 반응을 유발할 수 있다. 이것은 측정가능한 항-Pn-Ps 항체를 유발하지는 않는 Pn-Ps-CRM 및 Pn-Ps-DT와는 대조적이다. 그러므로, MIEP는 Pn-Ps에 대한 면역학적 담체 단맥질로서 작용하며 Pn-Ps 항원에 공유결합되었을 때 항 Pn-Ps 항체 반응를 유발할 수 있다. 따라서, 정제된 MIEP는 세균의 다당류 결합체 백신의 작제시 이종 MIEP을 대체할 유요한 면역학적 담체 단백질이다.

[실시예 23]

Pn-Ps 제제에서 C-다당류 함량의 정량적 측정

NMR, 효소적 또는 크로마토그래피 방법들에 근거한 C-다당류의 정량을 휘한 시스템이 개발되어 왔다. 본 경우에서는 가수분해된 Ps-Pn의 샘플들로부터 콜린(C-Ps의 성분)의 크로마토그래피 분리를 사용하고 이를 다른 방법들과 비교했다. 콜린을 저하된 전도도 검출과 커플링된 양이온 교환 컬럼에서 분리한다.

Pn-Ps 샘플을 45내지 65℃헤서 2시간 동안 36% 불화수소산 다음에 100℃에서 16시간 동안 2M 트리를루오로아세트산으로 처리함으로써 완전히 가수분해한다. 가수분해 후, 200 내지 300㎍의 샘플을 Dionex BioLC 크로마토그래피 시스템에 주입한다. 이 Dionex BioLC 크로마토그래피 시스템은 Omnipac PCX-500 분석 및 가드 컬럼, Ion Pac CTC-1 양이온 트랩 컬럼, CMMS-2 미세막 압축기를 갖추고 있고 50mM 테트라부틸암모늄 하이드록사이드(10ml/분)로 재생하는 것이고 전도도 검출기는 1uSiemen 민감도에 맞춰져 있다. 이 샘플을 5% 200mM HCl, 5%, 20%, 아세토니트릴, 85% MilliQ 물, 5% 20mM 디아미노프로피온산을 사용하여 등전적으로 (isocratically) 용출시킨다. 용출된 콜린은 약 10분후 날카로운 피이크를 보이며 용출한다.

정제된 C-Ps(Statens Serum Institut에서부터 입수)을 이 방법으로 콜린 함량에 대해 분석하고 5.4중량% 콜린치를 얻었다. 이 값은 C-Ps 콜린 함량의 문헌 보고치들과 일치한다.

이 인자는 nmol 야으로 HPLC에 의해 수득된 콜린의 양들을 질량치들로 바꿈으로써 Pn-Ps 제제들의 여러 가지 샘플들 중의 C-Ps 중량을 계산했다. 3%이상의 C-Ps농도들을 갖는 샘플들은 결합에 부적당한 것으로 거부된다. 하기의 표는 NMR 및 효소적 방법들에 의해 이 방법을 수정한 것을 보여주고 여러 순도의 Pn-Ps 제제 중의 전형적인 C-Ps 오염도를 보여준다.

[실시예 24]

부분-가수분해되고 정제된 Pn-18c-Ps의제조

(1) 초음파 가수분해 :

3.0g의 Pn18C Ps 분말을 1200ml 식염수(0.9% NaCl)에 실온에서 약 3 내지 4시간 동안 교반하면서 용해한다. 그 다음, 덮고 4℃에서 밤새 저장한다. 이 용액을 빙욕중의 플라스틱 비이커에서 Branson 초음파기(1/2inch 프로브, 세팅 8)로 총 40분까지(5분 파열시)20분의 간격으로 초음파 처리한다. 점도는 매 간격후 체크한다. 40분 후, 10분간 더 초음파 처리하여 1.218센터스토크의 점도 종점을 얻는다. 가수분해된 샘플(용적-1188ml)을 실온으로 하고 나트륨 아세테이트 시약 (59.2g)을 가해 최종 농도가 3%(w/v)가 되게끔 한다.

(2)혈청학척 프로브:

이소프로판(IPA) 분별 프로브 및 항체-지시 종점 네펠로즈 분석을 샘플 10ml에 대해 행하면 Pn18C-Ps가 40-50% IPA 사이에서 침전하게 됨을 알게 된다.

(3) 제1IPA 첨가

가수분해된 샘플[용적=1200ml, 상기 단계(1)로부터]을 894ml IPA를 가해 42.7% IPA가 되게 한다(실온에서 교반하면서 적가한다). 샘플을 15 내지 30분동안 교반하고 30분동안 11,000xg에서 원심분리 한다(Beckman JA-10 로터 : 8,000rpm: 20℃). 폐 펠렛을 250ml Omnimix 쟈에서 무수 에탄올로 연마한 다음 60ml 소결 유리 깔대기에 수집한다. 침전물을 깔대기 위에서 무수 에탄올, 다음 아세톤으로 직접 세척하고, CaSO4(건조물) 상에서 분석을 위해 실온에서 진공 건조한다.

(4) 제2 IPA 첨가 및 중간체 생성물 회수 :

42.7% IPA 상층액[용적은 2016ml, 위의 단계(3)으로 부터]을 실온에서 교반하면서 92.0ml IPA을 가함으로써 45.2% IPA가 되게 한다. 이 샘플을 상기 단계(3)에서 처럼 숙성시키고, 원심분리한다. 상기 단계 (3)에서 처럼 펠렛을 연마하고 수거, 세척 및 건조한다. Pn18C-Ps 중간체 생성물은 1,609mg 이었다.

(5) 투석 및 동결건조 :

상기 단계 (4)로부터의 샘플(1612.5mg)을 실온에서 약 2시간 동안 증류수 645ml에 용해시킨다. 이 용액(2.5mg/ml)을 투석 튜브(12,000 MW 차단 ; 45mm)에 붓고 4℃세서 30분간 2회 증류수를 교체하면서 증류수에 대해 투석한다. 그 다음 샘플을 동결건조 플라스크에 넣고 드라이아이스; 메탄올 욕 중에서 쉘 동결시키고 Virtis(Freezemobile) 동결건조기상에서 2 내지 3일 동안 동결건조시킨다. 최종 Ps 산물은 1487mg로 회수된다.

[실시예 25]

스트렙토코커스 뉴모니애 18C-OMPC 결합체, Pn18C-Ps-OMPC :

A. Dowex 50x2(200 내지 400 메쉬) 테트라부틸암모늄형 수지[Dowex 50(BH₄N⁺)]의 제조

Dowex 5x2(200 내지 400 메쉬)H+ 형(500g)을 H2O에서 슬러리화하고 컬럼에 충전시키고

1] 600ml H₂O

2] 1000ml 6N HCl

3] 400ml H₂O

(유출물이 pH 페이퍼에 중성일 때까지)

4] 72gdml 10% 테트라부틸암모늄 하이드록사이드 수용액

(유출물이 pH 페이퍼에 강한 알칼리성일 때가지)

5] 1000ml 물(중성이 되기까지)로 차례로 세척한다.

B. 스트렙토코커스 뉴모니애 타입 18C 다당류 테트라부틸암모늄 형 [Pn18c(Bu4N+)]의 제조 :

60ml Dowex 50x2(Bu₄N+) 컬럼을 250ml의 물로 세척한다. Pn18C-다당류[분자량 감소된)(650mg)]를 물 65ml로 덮고 1시간 동안 교반하면 모두 용액이 된 것 처럼 보인다. 이 용액을 컬럼에 적용시키고 중력에 의해 삼투시킨다(2시간 동안, 그 다음 진공하 1시간 동안). 커럼을 150ml 물로 세척하고, 합한 유출물을 동결건조시켜 655mg의 18C(Bu₄N+)염을 얻었다. 25mg을 NMR 분석을 위해 취하고 나머지는 보관한다.

C. 18c의 1.4-부탄 디아민 유도체(18C-BuA₂)의 제조 :

18C(Bu₄N+) (630mg)을 143ml의 DMSO(디메틸설폭사이드)로 덮고 3.25시간 동안 교반시킨다. 이 시간에 모든 고체가 용해되며 함수량 측정을 위한 Karl Fischer 적정을 위해 1ml를 취한다. 28.2u㏖의 H2O/ml 값이 얻어진다(총 4mmol). 이 용액에 165.1mg의 카보닐 디이미다졸(CDI)을 가하고 생성 용액을 실온에서 2.0시간 동안 교반시킨다. 40ml의 H₂0 중에 1,260g의 1.4-부탄 디아민 디하이드로클로라이드 (BuA₂·2HCl)를 함유하는 용액을 제조하고 이의 pH를 2.5N NaOH를 써서 10.20으로 조정한다. 이 용액을 빙욕중에서 냉각시킨다. 숙성된 DMSO 요액을 냉 BuA2 용액에 서서히 가하고 빙욕중에서 추가로 10분간 교반한다. 그휴 이를 실온에서 50분간 교반하고 이후에 이 용액을 SPECTRAPOR 2 투석 튜브에 충전시키고 액체의 상단으로부터 1/2"를 취하여 다음과 같이 투석한다 :

1] 15ℓ의 pH 7.0, 0.1M NaPo4 완충액에서 13.0시간 :

2] 15ℓ의 pH 7.0. 0.1M NaPO4 완충액에서 11시간 :

3] 15ℓ의 pH 7.0, 0.01M NaPO₄완충액에서 10.8시간 :

4] 15ℓ의 H₂O로 9.5시간. 이때의 용적은 190ml이다.

7.5ml의 분취량을 취하여 NMR 분석용으로 별도 동결건조시킨다. 나머지 182.5ml를 416mg의 18C의 1.4-부탄 디아민 유도체(Pn18C-BuA2)로 동결건조 시킨다. 약 5mg의 NMR 스펙트럼은. 부탄디아민 내부 메틸렌과 람노즈 메틸(18C) 공명의 적분 비교에 의해 규정된 다당류 100개의 반복 단량체성 단위당 100개의 반복 단량체성 단위당 10개의 부탄 디아민 잔기의 "부하"를 나타내낸다.

D. 18C의 브로모아세틸화 부탄 디아민 유도체(Pn18C-BuA2-BrAc)의 제조:

18C-BuA₂(416mg)를 36ml의 0.1M pH 9.04 완충액 (Kolthoff 붕산염-인삼염)으로 덮고 용해될 때까지 교반시킨다. 그후 4.48ml의 아세토니트릴 중의 256mg p-니트로페닐 브로모아세테이트를 가한다. tpod성 혼합물을 4℃에서 2시간 교반한다. 그후 이를 SPECTRAPOR 2튜브에서 다음에 대해 투석한다 :

1] 15ℓ H₂O에서 6시간 :

2] 15ℓ H₂O에서 6시간 :

3] 15ℓ H₂O에서 6시간, 이때 60ml 용적이 수득되며 이로부터 분석용(NMR, Ouchterlony 및 Viscotek다)으로 1.7ml를 취한 후 2.42g의 pH 8 무수 인산염 완충액 (0.1M pH 8 NaPO4 용액을 동결건조하여 제조)을 가한다. 용해시킨 후, 이를 0.2μ의 CORNING 필터를 통해 여과시켜 18C-BuA₂-BrAc의 pH 8 수용액을 제공한다. 여과는 느리게 진행하며 4컵의 필터를 필요로 한다.

E. OMPC(나이세리아 메닝기티디스)의 Pn18C-BuA₂-BrAc에 대한 결합 :

외막 단백질 복합체(나이세리아 메닝기티디스, OMPC 3.2mg/ml) 80ml를 4개의 25ml들이 원심분리 튜브에 충전시키고 60Ti 로터내에서 43,000rpm (43K)로 4℃에서 2시간 원심분리시킨다. 40ml의 pH 11.09 Na2B4O7 완충액에 680mg의 EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산 이나트륨 염) 및 120mg의 디티오트레이톨(DDT)을 용해시켜 티올화된 혼합물을 제조한다. 320mg의 N-아세틸호모시스테인 티올락톤을 가한 후 이 용액을 0.2μ의 Corning 필터(컵 형)을 통해 여과시킨다. 상기 원심분리로 부터의 펠렛을 5ml의 여과된 티올화 혼합물(총 20ml)과 함께 제거하고 DOUNCE 균질화기로 이동시킨 후 재현탁시킨다. 튜브를 추가의 2/10ML의 티올화 용액의 연속 이동으로 세정한다. 혼합 용액을 DOUNCE 중에서 균질화시키고 전체 재현탁된 물질(40ml)을 100ml의 환저 플라스크에 이동시킨다. 글라스웨어를 추가의 20ml 티올화 용액으로 세정시키고 반응 플라스크에 가한다. 플라스크를 격막으로 밀봉시킨 후 FIRESTON 밸브를 사용하여 공기를 N₂로 대체한 다음 반응 혼합물을 18.5시간 동안 숙성시킨다. 그후 60ml를 4개의 원심분리 튜브에 분할공급하고 1M KH2PO4(수성)으로 토핑한 다음 4℃, 43K에서 2시간 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 0.1M NaPO4 pH 8 완충액에 재현탁시킨다(최종 재현탁 용적은 총 40ml이다). 이 용액을 균등하게 2개의 25ml들이 원심분리 튜브(폴리카보네이트)로 옮기고 글라스웨어(DOUNCE 등)를 pH 8의 약 10ml 인산염 완충액으로 세정한 다음 원심분리 튜브를 토핑한다. 두 번째의 한외원심분리(4℃, 43K에서 2시간)를 실시한다. 펠렛을 pH 8, 30ml의 0.1 PO₄완충액에 재현탁시킨다. 엘만 분석은 총 24μmol의 SH 또는 약 100nmol/mg의 OMPC을 나타낸다. 티올화 단백질을 100ml의 환저 플라스크로 옮기고 여과시킨 18C-BuA₂-BrAc)용액을 가한다. 생생된 반응물(티올화된 OMPC와의 18C-BuA₂-BrAc)을 실온에서 N₂상자 내에서 N₂하에 탈기시키면서 89시간동안 숙성시킨다.

이 반응물은 그후 다음과 같이 캐핑한다 : 5ml의 pH 8, 0.1M NaPO4 완충액 중의 75mg N-에틸말레이미드(NEM)를 함유하는 용액을 0.22μ필터를 통해 여과하고 이 반응 혼합물에 2ml를 가하여 4시간 동안 숙성시킨다.

그 후, 2.5ml의 0.1M PO4 완충액(pH 8)중의 0.5ml N-아세틸 시스테아민을 0.22u필터를 통해 여과하고 이 용액 1.0ml를 이 반응물에 가하고 22.5시간동안 숙성시킨다.

이 캐핑된 생성물을 그후 4개의 25ml들이 원심분리튜브에 동일하게 충전시키고 총 8ml의 pH 8, 0.1M PO₄완충액으로 토핑하고 4℃, 43K에서 2시간동안 원심분리시킨다. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 총 40ml의 TED 완충액으로 DOUNCE 균질화기에 재현탁시키고 글라스웨어를 추가의 10ml TED 완충액으로 세정하고 이 용액을 2개의 25ml 튜브에 옮긴다. 이 튜브를 실온에서 15.25시간동안 저장한 후 24℃, 43K rpm에서 2시간 동안 원심분리한다. 생성된 펠렛을 총 30ml의 TED 완충액중에서 DOUNCE 균질화기내에 재현탁시키고, 이를 2개의 25ml들이 원심분리 튜브로 옮기고 글라스웨어를 추가의 20ml TED 완충액으로 세정한 후, 4℃, 43K에서 2시간 동안 재원심분리한다. 펠렛을 50ml pH 7의 인산염 완충액에 재현탁시키고 4℃, 43K에서 2시간 동안 재원심분리한다. 펠렛을 82ml의 물에 재현탁시키고 20.5ml를 2개의 50ml 프라스틱 멸균(FALCON) 원심분리 튜브에 옮긴다. 4℃에서 18시간동안 숙성시킨 후, 결합체 제제를 TJ-6 원심분리시 TH 로터에서, 1000rpm으로 3.5분간 원심분리시킨다. 최종 결합체 현탁 생성물을 단백질(Lowry), 18C 다당류(페놀/황산). 비결합된 다당류(크기 배출 크로마토그래피-비탁도) 및 아미노산(SPINCO)에 대해 분석한다 :

다당류 = 339㎍/ml :

단백질 = 2.57mg/nl :

유리 다당류 : 〈5%(실험상 오차의 한계)

S-카복시메틸호모시스테인/리신=0.02 ;

S-카복시메틸시스테아민/리신=0.005.

[실시예 26]

Pn4-Ps 중간체의 제조 :

(1) 초음파 가수분해 : 1.0g Pn4-Ps 분말을, 교반과 함께 실온에서 약 4시간 동안 400ml의 염수(0.9% NaCl) 중에서 용해시킨다. 그후 이 용액을, 10분의 간격으로 총 20분간, Branson 초음파기(1/2inch 프로브, 세팅 8)로 빙욕중에서, 플라스틱 비이커 내에서 초음파 처리한다. 매 간격에서 점도를 체크한다. 20분 후 점도 종점1.267 센티스토크가 수득된다. 이 가수분해된 샘플을 실온까지 상승시키고 최종 농도3%(w/v)까지 나트륨 아세테이트 시약(18.7g)을 가한다.

(2) 혈청학적 프로브 : 10ml의 샘플중에서 실시한 이소프로판올(IPA) 분별 파일롯 연구와 항체-지시 종점 네펠로스 분석은, Pn4Ps가 45-55% IPA 사이에서 침전함을 나타내고 있다.

(3) 제1 IPA 첨가 : 397ml의 IPA를 가하여(실온에서 교반과 함께 적가) 가수분해된 샘플[용적=385ml, 상기 단계(1)로부터]을 49.7% IPA가 되도록 한다. 이 샘플을 15내지 30분간 교반시키고 11000xg에서 30분간 원심분리시킨다(Beckman JA-10 로터 : 8000rpm. 20℃). 폐 펠렛은 250ml Omnimix 쟈에서 무수 EtOH로 연마시킨 후 60ml의 소결 유리 깔대기 사에서 수거한다. 이 침전물을 깔대기상에서 무수 EtOH과 아세톤으로 직접 세척하고 실온에서 CaCl₂로 진공중에서 건조시켜 분석용 제제를 제조한다.

(4) 제2IPA 첨가 및 생성물 회수 : 실온에서 교반시키면서 38ml의 IPA를 적가하여, 49.7%의 IPA 상층액[용적 = 727ml, 상기 단계(3)로 부터]을 52.2% IPA로 만든다. 이 샘플을 단계 (3)에서와 같이 숙성시키고 원심분리한다. 펠렛을 단계(3)에서와 같이 연마, 수거, 세척 및 건조시킨다. 516mg의Pn4Ps 생성물을 수득한다.

(5) 투석 및 동결건조 : 상기 단계 (4)로부터 Pn-Ps 샘플(500mg)을 실온에서 증류수 200ml 중에 2 내지 3시간 동안 용해시킨다. 용액(2.5mg/ml)을 투석 튜브(12,000MW 차단 ; 45mm)로 옮기고, 4℃에서 2회 추가로 증류수를 변화시켜 27시간동안 증류수에 대해 투석한다. 그후 샘플을 동결건조 플라스크로 옮기고 드라이아이스: 메탄올 욕 중에서 쉘 동결시키며, Virtis(Freezemobile) 동결건조기 상에서 2 내지 3일간 동결건조시킨다. 최종 Ps 생성물 491mg을 수득한다. 최종 생성물은 Kd-0.69를 갖는다.

이로부터, 당해 분야의 전문가라면, 본 발명의 방법에 따라 기타 카복실 함유 Pn-Ps 아형, 예를 들어 Pn1-Ps 또는 Pn5-Ps가 제조될 수 있으며, 산성 다당류인 Pn4-Ps 또는 Pn9V-Ps와 결합할 수 있음을 알 수 있을 것이다.

[실시예 27]

스트렙토코커스 뉴모니애 타입 4-OMPC 결합체, Pn4-Ps-OMPC

A. Dowex 50x2(200-400 메쉬) 테트라부틸암모늄 형 수지[Dowex 50(Bu4N+)]의 제조

Dowex 50x2(200-400 메쉬) H+ 형(500g)을 H20(CM-66) 중에 슬러리화하고 컬럼에 충전시킨 다음 1][ 60ml의 H2O ; 2}

1000ml의 6N HCl; 3] 용출물이 pH 페이퍼 상에서 중성을 나타낼 때까지 400ml의 H2O, 4] 용출물이 pH 페이퍼에 대해 강한 알칼리성을 나타낼 때까지 72g의 10% 테트라부틸암모늄 하이드록하이드 수용액, 5] 중성이 될 때까지 1000ml의 H2O로 순차적으로 각각 세척시킨다.

B. 스트랩토코커스 뉴모니애 타입 4 다당류 테트라부틸암모늄 형 [Pn4(Bu4N+)]의 제조 : 65ml 컬럼의 Dowex 50x2(Bu4N+)를 520ml의 H₂O로 세척한다. Pn4-다당류(분자량 감소)(400mg)를 35ml의 H₂0로 덮고 20분간 교반시키며 이때 모든 것은 용액 상태로 보인다(교반은 밤새 수행). 이 용액을 컬럼에 적용시키고 중력을 통해 삼투시키며 컬럼을 150ml의 H₂0로 세척하고 합한 용출물을 동결건조시켜 504mg의 Pn4(Bu₄n+) 염을 수득한다.

C. Pn4의 1.4-부탄 디아민 유도체(Pn4-BuA2)의 제조 :

Pn4(Bu₄N+)(97mg)를 16ml의 DMSO(디메틸설폭하이드)로 덮고 15분 이상에 걸쳐 52℃에서 용액으로 교반시킨다. 이때 모든 고체는 용해되고 용액을 실온까지 냉각시킨다.

이 용액에 160㎕의 DMSO 중에 용해시킨 2mg의 카보닐 디이미다졸(CDI)을 가하고 생성된 용액을 실온에서 1.0시간 교반시킨다. 5ml이 H20 중의 0.500g의 1,4-부탄 디아민 디하이드로클로라이드(BuA2·2HCl)을 함유하는 용액을 제조하고, 5.0N NaOH를 사용하여 이의 pH를 10.20으로 조정한다. 이 용액을 빙욕중에서 냉각시킨다. 숙성시킨 DMSO 용액을 서서히 냉 BuA₂용액에 가하고 빙욕 중에서 추가로 5분간 교반시킨다. 그 후 이를 실온에서 1시간 교반시키고, 이후 이 용액을 SPECTRATOR 2투석 튜브에 충전시키고 액체의 상부로부터 1/2"를 취하고 다음과 같이 투석한다. : 1] 4ℓ의 pH 7.0 ).1M NaPO₄완충액으로 15.0시간 : 2] 4ℓ의 pH 7.0. 0.01M NaPO₄완충액으로 9시간 : 3] 4ℓ의 pH 7.0, 0.01M NaPO₄완충액으로 21시간 : 4] 4ℓ의 H20로 20시간. 이 용액을 Pn4의 1.4-부탄 디아민 유도체(Pn4-BuA2) 70mg으로 동결건조시킨다. 약 5mg의 NMR 스펙트럼은 부탄디아민 내부 메틸렌 및 n-아세틸 메틸(Pn4) 공명의 적분과 비교하여 규정된 다당류 100개 반복 단량체성 단위당 22개 부탄 디아민 잔기의 "부하"를 나타낸다.

D. Pn4의 브로모아세틸화 부탄 디아민 유도체(Pn4-BuA₂-BrAc)의 제조 : Pn4-BuA₂(54mg)을 5.5ml의 0.1M pH 9.04 완충액(Kolthoff 붕산염-인산염 완충액)으로 덮고 용액이 될 때까지 교반시킨다. 그 후, 1.0ml의 아세토니트릴중의 p-니트로페닐 브로모아세테이트 55mg을 가한다. 생성 혼합물을 4℃에서 17시간 동안 교반한다. 그후 이를 다음과 같이 SPECTRATOR 2 튜브내에서 투석한다 : 1] 16ℓ H₂O에서 24시간; 2) 16ℓH₂O에서 8시간 ; 3] 16ℓ H₂O에서 23시간. 이때 이로부터 12.5ml의 용적을 얻고 분석(NMR, Ouchterlony 및 Viscoet)을 위해 1.0ml를 취하며 275mg의 pH 8의 무수 인산염 완충액 염(0.1M pH 8 NaPO₄용액을 동결건조시켜 제조)을 가한다. 용해후 이를 0.2μ의 CORNING 필터를 통해 여과하여 Pn4-BuA₂-BrAc의 pH 8 수용액을 수득한다.

E. Pn4-BuA₂-BrAc에 대한 OMPC(나이세리아 메닝기티디스)의 결합 :

4℃, 43,000rpm(43K)에서 80Ti 로터중에서, 외막 단백질 복합체 (나이세리아 메닝기티디스, OMPC, 4.3mg/ml)(5ml)을 2시간 원심분리시킨다. pH 11.09 Na₂B₄O₇완충액 10ml 중에 85mg의 EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산 이나트륨 염) 및 15mg의 디티오트레이톨(DDT)을 용해시켜 티올화 혼합물을 제조한다. 50mg의 N-아세틸 호모 시스테인 티올락톤을 가한 후 용액을 0.2μ 필터를 통해 여과한다. 상기원심 분리로부터의 펠렛을 5ml의 여과된 티올화 혼합물과 함께 제거하고 DOUNCE 균질화기로 옮겨 재현탁시킨다. 재현탁시킨 용액을 원심분리 튜브로 옮기고 격막으로 캐핑하며 FIRESTONE 밸브를 써서 공기를 N₂로 대체시킨다. 이 혼합물을 19시간 동안 숙성시킨 후, 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 10ml의 0.1M NaPO₄pH 8 완충액에 재현탁시킨다. 이 용액을 원심분리 튜브에 옮기고 두 번째 한외 원심분리(2시간, 4℃, 43K에서)를 수행한다. 펠렛을 상기 D에서의 Pn4-BuA₂-BrAc 용액 11.5ml 중에 재현탁시킨다. 엘만 분석은 총 3.44u㏖의 SH 또는 약 158n㏖ SH/OMPC mg이 존재함을 나타낸다. 생성된 반응물(즉, 티올화 OMPC와의 Pn4-BuA₂-BrAc)을 N₂하에(탈기시키면서) 실온에서 N₂상자내에서 66시간 동안 숙성시킨다.

이 반응물은 다음과 같이 캐핑시킨다 : 1ml의 pH 8, 0.1M NaPO₄완충액 중에 5mg N-에틸말레이미드(NEM)를 함유하는 용액을 0.22μ의 필터로 여과하고 이 용액을 반응물에 가하고 14.5시간 동안 숙성시킨다.

그 후 0.4ml의 0.1M pH 8PO₄완충액중의 0.1ml N-아세틸시스테아민을 0.22μ의 필터로 여과하고 이 용액을 반응물에 가하고 14.5시간 동안 숙성시킨다.

이 반응 혼합물을 4℃, 43K에서 2시간 원심분리시킨 후 펠렛을 8ml의 1xTED 완충액에 재현탁시킨다. 이 용액을 실온에서 밤새 숙성시킨 후 4℃, 43K에서 2시간 동안 재원심분리시킨다. 그후 이 펠렛을 pH 7.0, 0.1M PO₄완충액 10ml 중에 재현탁시키고 4℃, 43K에서 2시간 재원심분리한다. 이 최종 펠렛을 7.5ml의 H2O의에 재현탁시킨다. 4℃에서 밤새 숙성시킨 후, 현탁액을 1000rpm에서 3분간 원심분리시키고 최종 결합체로서 상층액을 제거한다.

분석 : Lowry 단백질 : 0.920mg/ml ;

페놀 황산 분석 : 0.212mg/ml ;

Ps/Pro = 0.23 ;

SCMHC/1ys=0.031 ;

SCMC/1ys=0.022.

이 결합체를 마우스 또는 아프리카산 그린 몽키(African Green Monkey)에게 투여하면, Pn4-Ps 특이적 ELISA 분석으로 측정되는 바와 같이 고 역가의 항-Pn4-Ps 항체가 생성된다.

[실시예 28]

Pn9V-Ps 중간체의 제조

(1) 초음파 가수분해 : 실온에서 교반시키면서 1.0g의 Pn9VPs 분말을 4시간 동안 400ml 염수(0.9% NaCl) 중에서 용해시킨다. 그후 이 용액을, 3분의 간격으로 Branson 초음파기(1/2inch 프로브, 세팅 8)로 빙욕중에서, 플라스틱 비이커내에서 초음파 처리한다. 이 간격 후 점도를 체크한다. 13분 후 추가로 1분간 점도 종점 1.117 센티스토크가 수득되도록 초음파 처리한다. 이 가수분해된 샘플을 실온까지 상승시키고 최종 농도 3%(w/v)RK지 나트륨 아세테이트 시약(19.5g)를 가한다.

(2) 혈청학적 프로브 : 10ml의 샘플중에서 실시한 이소프로판올 (IPA) 분별 파일롯 연구와 항체-지시 종점 네펠로즈 분석은, Pn9VPs가 45-55% IPA 사이에서 침전함을 나타내고 있다

(3) 제1IPA 첨가 : 281mldm IPA를 가하여(실온에서 교반과 함께 적가) 가수분해된 샘플[용적=391ml, 상기 단계(1)로부터]을 41.8% IPA로 되게 한다. 이 샘플을 15내지 30분간 교반시키고 1000xg에서 30분간 원심분리시킨다(Beckman JA-10 로터 : 8000rpm, 20℃). 폐 펠렛은 250ml 옴니믹스 쟈에서 무수 EtoH로 연마시킨 후 60ml의 소결 유리 깔때기 상에서 수거한다. 이 침전물로 깔때기상에서 무수 EtOH과 아세톤으로 직접 세척하고 실온에서 CaCl₂로 진공중에서 건조시켜 분석용 제제를 제조한다.

(4) 제2 IPA 첨가 및 생성물 회수 : 실온에서 교반시키면서 28.6ml의 IPA를 적가하여, 41.8%의 IPA 상층액[용적 = 637ml, 상기 단계 93)로 부터]을 44.3% IPA로 만든다. 이 샘플을 단계 (3)에서와 같이 숙성시키고 원심분리한다. 펠렛을 단계 (30에서와 같이 연마 , 수거 , 세척 및 건조시킨다. 342.2mg의 Pn9VPs 생성물을 수득한다.

(5) 투석 및 동결건조 : 상기 단계(4)로부터 Pn-Ps 샘플(347mg)을 실온에서 증류수 139ml 중에 4-5시간 동안 용해시킨다. 용액 (2.5mg/ml)을 투석 튜브(12,000MW 차단; 45mm)로 옮기고 4℃에서 2회 추가로 증류수를 변화시켜 25시간 동안 증류수에 대하여 투석한다. 그 후 샘플을 동결건조 플라스크로 옮기고 드라이 아이스; 메탄올 욕 중에서 쉘 동결시키며, Virtis(Freezemobile) 동결건조기 상에서 2 내지 3일간 동결건조시킨다. 최종 Ps 생성물 303.5mg을 수득한다. 최종 생성물은 Kd=0.60을 갖는다.

(6)제 3 IPA 첨가 및 생성물 회수 : 실온에서 교반과 함께, 30.8ml IPA를 적가하여 44.3% IPA 상층액[용적=655ml, 상기 단계 (4)로부터]을 46.8% IPA로 만든다 이 샘플을 상기 단계 (3)에서와 같이 숙성시키고 원심분리한다. 펠렛을 단계 (3)에서와 같이 연마, 수거, 세척 및 건조시킨다. Pn9V-Ps 생성물의 중량은 410.8mg이다.

(7) 투석 및 동결건조 : 실온에서 168ml의 중류수중에 상기 단계 (6)으로부터의 Pn-Ps 샘플(420.4mg) 4 내지 5시간 동안 용해시킨다. 이 용액(2.5mg/ml)을 투석튜브(12,000 MW 차단, 45mm)에 옮기고, 4℃에서 25시간 동안 추가로 증류수를 2회 변화시키면서 증류수에 대해 투석한다. 이 샘플을 동결건조 플라스크에 옮기고 드라이 아이스: 메탄올 욕중에 쉘 동결시키고 Virtis(Freezamobile) 동결건조기로 2-3일간 동결건조시킨다. 최종 Ps 생성물의 회수량은 342.5mg이다. 최종 생성물은 Kd=0.65이다.

(8) 당해 분야의 전문가라면, 단계 4 및 6의 생성물이 다량의 IPA를 가함과 함께 수거되고, 각각의 소 분획무의 중령 평균 특서의 분석 특성을 지닌 단일 생성물로서 투석 및 동결건조시킬 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 당해 분야의 전문가라면, 본원에 기술된 바와 같이 Pn1-Ps 또는 Pn5-Ps가 Pn9V-Ps 또는 Pn4-Ps 와 동일한 방식으로 처리될 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 29]

Pn9V-Ps와 OMPC의 결합 :

실시예 28에 따라 제조한 Pn9V-Ps는 실시예 27에 나타난 바와 같이 Pn4-ps와 같은 방법으로 결합시킨다.

[실시예 30]

Pn9V/18C-Ps 중의 아세테이트와 Pn4-Ps 중의 피루베이트의 정량적 측정

뉴모코커스(Pn) 캡슐형 다당류(Ps) 프로세싱중에 Pn4-Ps 중의 O-피루베이트와 Pn9V-Ps 및 Pn18C-Ps 중의 O-아세테이트 그룹 보유를 정량하기 위한 방법이 개발되었다. 먼저 O-아세틸 또는 O-피루베이트 그룹을 가수분해시켜 방출시키고 그 후 PnPs 가수분해물 중의 아세테이트와 피루베이트를 동정하며 억제된 전도성(conductivity)과 커플링시킨 고 성능 음이온 교환 크로마토그래피로 정량한다.

이 방법으로 미처리 및 처리된 Pn4, Pn9V 및 Pn18C 샘플을 분석한다. 예비 결과는 미처리 및 크기 분류된 Pn4에 대한 각각의 Ps 반복 단위에 대해 약 1:1 내지 0.8:1 몰 비의 피루베이트를 나타낸다. Pn18C-Ps에서 각 Ps 반복 단위에 대한 아세테이트의 몰비는 미처리 및 크기 분류된 샘플에 대해 각각 1:1 및 0.8:1 이고 미처리 및 크기 분류된 Pn9V에 대해서는 각각 l.7:1 및 1.5:1인 것으로 나타났다. Pn18C-Ps-OMPC 결합체 수성 벌크의 샘플을 각각의 Ps 반복단위에 대한 O-아세테이트의 몰비에 대해 분석한 결과 약 0.5:1인 것으로 나타났다.

문헌에 피루베이트 그룹이 타입 4 캡슐형 다당류에서 강력한 면역결정원이고, 이의 제거는 면역특이성에 현저한 변화를 나타낸다고 보고된 바 있다[참조 : Heidelberger, M., Dudman, W. F., and Nimmich, W., 'Immunochemical relationships of certain capsular polysaccharides of Klebsiella, pneumococci, and Rhizobia.' J. Immunol., 104:1321-1328, (1970); Higginbotham, J. D., Heidelberger. M., and Gotschlich, E., 'Degradation of pneumococcal type-specific polysaccharide with exposure of group-specificity,' Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67:138-142. (1970)]. 유사하게, 타입 Pn18C-Ps 다당류에서 O-아세티이트 그룹의 제거는 이의 면역학적 특이성을 상실하게 한다[참조 : Estrada-parra. S., and Heidelberger, M., 'the specific polysaccharide of type ⅩⅧ pneumococcus.' Biochemistry, 2:1288-1294, (1963)]. 따라서, 이것은 Pn18C-Ps 및 Pn4에서 아세테이트 및 피루베이트 측정을 위한 정량적 방법을 개발하는데 절대적이다. Pn9V 중의 O-아세틸 그룹은 또한 Pn9V의 면역학적 구조에서 중요한 역할을 나타내는데, 이는 탈-O-아세틸화 Pn9V가 비탁도 측정에 의해 측정된 바와 같이 항원적 반응성을 갖고 있지 않기 때문이다.

본 출원인은 O-아세테이트가 4℃의 알칼리성 조건(pH 11)에서 Pn9V 및 Pn18C-Ps로부터 용이하게 방출되며, O-피루베이트는 Pn4로부터 65℃로 가열함에 따라 용이하게 방출됨을 발견하였다. 본 출원인은, 이동상으로서 0.98mM NaOH 및 2% MeOH를 1ml/분의 유속으로 OmniPac Pax 500 컬럼을 사용하여 아세테이트 및 피루베이트를 가수분해된 PnPs 샘플로부터 분리시킬 수 있음을 발견하였다. 이런 검출은 재생제로서 25mM H2SO4를 유속 10ml/분으로 사용하여 억제 전도도 검출로써 성취할 수 있다. 각각 Pn18C-Ps, 9V 및 Pn4로부터 O-피루베이트 및 O-아세테이트를 정량적 HPLC 분석하기 위한 최적 가수분해 조건은 본 실시예에 기술되어 있다.

장치

DIonex BioLC에 OmniPac PAX-500 가드 및 분석용 컬럼 (4.6x250mm)을 장치한다. 재생제로서 25mN 황산을 사용하여 억제 전도도 검출을 수행한다. 유속은 Dionex 오토레젠 단위를 써서 10ml/분으로 세팅한다. 가수분해된 PnPs의 샘플로부터 아세테이트 및 피루베이트를 분리시키기 위한 이동상 및 구배 프로그램은 다음과 같다 :

완충액 1-mM 수산화나트륨

완충액 2-100% 메탄올

완충액 3-200mM 수산화나트륨

완충액 4-물

이와 같은 조건 및 3μSiemens의 검출기 민감도를 사용하여 대략 5.2 내지 9.5분의 보유시간에 용출되는 4nmol의 각 아세테이트 및 피루베이트가 각각 용이하게 검출될 수 있다.

샘플 제조

정제된 PnPs 샘플(Merck Manufacturing Division으로부터 입수)을 잔여 H₂O 함량을 측정하기 위해 Aquastar V3000 용적 습도 적정계를 사용하여 Karl-Fisher 적정에 적용시킨 후, Milli-Q H2O에 ml당 1.0mg 무수 중량의 농도로 용해시킨다. Pn9V-Ps 및 Pn19C-Ps 샘플로부터 0-아세테이트를 제거하기 위해 샘플(100μg/ml)을 실온에서 2mM NaOH로 16시간 처리한다. Pn4 로부터 0-피루베이트를 제거하기 위해 Pn4-Ps 샘플을 1mM HCL 중에서, 65℃에서 16시간 동안 가수분해시킨다. 또한 크기 분류된 Pn9V 및 Pn18C-Ps 및 Pn18C-Ps-OMPC 결합체 수성 벌크 샘플을 고-pH 음이온-교환 크로마토그래프 및 펄스된 전류계 검출을 사용하여 단당류 조성물 분석을 수행한다. 이 단당류 조성물 분석은 크기 분류되고 수성 결합체 벌크 샘플중에 정확한 PnPs의 농도를 수득하기 위해 수행한다.

아세테이트, 피루베이트 및 N-아세틸만노스아민 표준말을 200nmol/ml의 농도로 Milli-Q H₂0 중에 용해시킨다.

샘플 및 표준말의 가수분해

Pn18C-Ps의 탈-O-아세틸화를 4개의 NaOH 농도(1, 2, 5 및 50mM), 다양한 온도(4,25,45 및 65℃) 및 다양한 시간(3, 5 및 16시간)에 Pn18C-Ps을 처리하여 조사한다. 탈-O-아세틸화에 필요한 조건이 또한 N-아세틸 그룹의 상실 또는 아세테이트/피루베이트의 분해를 초래하는가를 결정하기 위해 아세테이트, 피루베이트 및 N-아세틸만노스아민의 표준 용액도 조사에 포함시킨다.

Pn4로부터 피루베이트의 제거는 다양한 농도(1, 10, 100mM), 시간(3, 5 및 16시간) 및 온도(65,85 및 100℃)에서 수산화나트륨 (50mM/100/16시간) 또는 염산으로 처리하여 조사한다.

비탁도

탈-O-아세틸화 또는 탈-O-피루빌화 전후의 Pn9V-Ps, Pn18C-Ps 및 Pn4-Ps의 비탁 활성도를 측정한다. 샘플을 1, 1.5, 2 및 2.5μg/ml로 희석시킨다.

고 성능 크기 배출 크로마토그래피(HPSEC)

탈-O-아세틸화 또는 탈-O-피루빌화 전후의 Pn9V-Ps, Pn18C-Ps 및 Pn4의 HPSEC를 측정한다. 유속 제한기가 장치된 7.5X600mm TSK G 6000PW 컬럼을 800 내지 1000psi에서 50℃로 가열하고 0.3ml/분에서 0.2M 나트륨 아세테이트로 평형화시킨다. 샘플 60μg(1mg/ml)을 컬럼에 주입하고, 0.3ml/분에서 이동상으로 용출시킨다. 컬럼 용출물을 0.5ml/분의 유속에서 0.5M NaOH의 후컬럼 첨가물과 혼합하고, Dionex 펄스된 전류 검출기로 모니터링하며, kd를 측정한다.

검정의 민감성 및 선형성

검출기의 선형성 및 민감성을 피루베이트 및 아세테이트 모두에 대하여 3μ Siemens에서 측정한다. 피루베이트 및 아세테이트는 0.125nmol의 하한에서 검출가능하다. 두 성분 모두에 대한 검출기 반응은 피루베이트 및 아세테이트 각각에 대해 0.9999 및 0.9992의 상관계수를 갖는 2nmol까지 선형이다.

Pn18C-Ps로부터 O-아세테이트 제거의 최적화

Pn18C-Ps의 시간 경과적 가수분해의 예비적 조사는 저온에서 O-아세틸 그룹의 알칼린 가수분해의 불안정도를 입증한다. 2mM 수산화나트륨이 4℃에서 16시간동안 항온처리 후 Pn18C-Ps를 완전히 탈-O-아세틸화시키는데 충분하다. 고온(〉25℃) 처리는 Pn9V O-아세테이트의 측정을 방해하는 N-아세틸만노스아민으로부터 N-아세테이트를 방출시키는 것으로 밝혀졌다. PnPs로부터 O-아세테이트를 제거시키기 위한 최적의 가수분해 조건은 4℃, 16시간인 것으로 밝혀졌다. 1% 미만의 아세테이트가 실온에서 16시간 동안 2mM NaOH로 처리된 N-아세틸만노스아민의 표준물로부터 제거되는 것으로 밝혀졌다.

Pn4로부터 O-피루베이트 제거의 최적화

Pn4의 가수분해 조사는 먼저 수산화나트륨 가수분해를 사용하여 수행한다. 수산화나트륨을 사용하는 경우 매우 소량의 피루베이트가 회수된다는 것이 즉시 발견되었다. 초기의 대조군 조사는 피루베이트가 100℃에서 H2O 중의 Pn4로부터 절단된 것으로 입증하였다. 이러한 정보를 갖고, 승온에서 HCL 가수분해를 이용하여 Pn4로부터 O-피루베이트 방출에 대한 최적화 조사를 수행하기로 결정하였다. 피루베이트의 얼마간의 분해가 고온에서 나타났다. 이는 Pn4와 동일한 조건하에서 가수분해된 피루베이트 표준물 샘플로 입증될 수 있다. 가수분해를 16시간 동안 65℃에서 1mM HCl 중에서 수행하는 경우 피루베이트가 최대로 회수된다.

PnPs 샘플중의 O-아세테이트 및 O-피루베이트의 분석

출발 PnPs, 크기 분류된 PnPs 및 하나의 Pn18C-Ps-OMPC 결합체를 대표하는 다양한 샘플을, Pn9V-Ps/18C 중의 O-아세테이트를 방출시키기 위해서는 실온에서 2mM NaOH 중에서 가수분해시키거나, Pn4-Ps 중의 O-피루베이트를 방출시키기 위해서는 65℃에서 1mM HCl 중에서 가수분해시킨 후 상술한 HPLC 방법에 의해 O-아세테이트/피루베이트에 대해 분석한다. 이 조사의 결과가 하기에 나타나 있다.

이 결과는 크기 분류된 PnPs에서 부 그룹의 보유률이 Pn9V-Ps에 대해서는 약 90%이고, Pn4 및 18C에 대해서는 80%임을 나타내었다. Pn18C-Ps-OMPC 결합체 수성벌크에서 O-아세테이트의 보유률은 약 50%인 것으로 밝혀졌다. Pn18C-Ps 및 Pn4에 대한 이론치는 Ps 반복 단위 몰당 아세테이트 또는 피루베이트 1몰이고, Pn9V에 대해서는 비가 2:1이다[참조 : Jansson P-E., Lindberg, B., and Lindquist, U.'Structural studies of the capsular polysaccharides from Streptococcus pneumoniae Type 4.' Carbohyd. Res., 95:73-80, (1981). Lugrowski, C. and Jennings, H. J. 'Structural determination of the capsular polysaccharide of Streptococcus peumoniae Type 18C.' Carbohyd. Res. 131:119-129, (1984). Perry, M. B., Daoust, V., and Carlos, D. j. 'The specific capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 9V.' Can. J. Biochem. 59:524-533(1981)]. Pn18C-Ps-OMPC 결합체에서 발견되는 O-아세테이트의 낮은 보유률은 저온에서의 알칼리성 조건에 O-아세틸 그룹이 가수분해되기 쉽기 때문인 것으로 예측된다.

Pn4, Pn9V 및 Pn18C-Ps의 샘플, 및 탈-O-피루빌화 및 탈-O-아세틸화된 샘플의 비탁 활성도를 측정한다. 미처리된 샘플의 Kd에도 불구하고, 그 결과는 이들 부 그룹의 제거후 네펠로즈 활성이 완전히 상실되는 것으로 나타났다. Kd는 상술한 HPSEC 방법으로 수득한다. 그러나, 온화한 산 가수분해에 의한 탈-O-피루빌화후의 Pn4의 Kd는 0.6으로부터 0.68로 증가되었으며, 출현은 염 용적 근처이다. Pm4 및 Pn18C-Ps에 대한 항원성 데이터는 뉴모코커스 다당류의 면역학적 반응성에서 이들 부 그룹의 중요성에 대한 다른 조사를 지지한다. Pn9V에 대한 결과는, 글루쿠론산 이외에 이 분자의 O-아세틸 그룹이 중요한 면역학적 결정원이라는 것을 제시한다.

이로써, 이 방법에 따라 Pn4에서 O-피루빌 케탈 및 Pn9V에서 O-아세테이트의 정량적 분석을 위한 빠르고 민감한 공정이 개발되었다. 이러한 공정은 이들 다당류의 항원성 구조를 보유하기 위해 Pn4, Pn9V 및 Pn18C-Ps를 크기 분류하고 결합시키기 위한 정확한 방법을 정의 하는데 중요하다.

[실시예 31]

Pn6B-Ps-MIEP 결합체의 분리

1. 2개의 결합체 반응 혼합물 샘플(하나는 다른 샘플의 H2O 투석된 샘플을 나타낸다)을 사용할 때까지 3 내지 8℃에서 저장한다.

2. 0.2 MOPS pH 7.2 완충액을 샘플에 가하여 약 7mM의 최종 농도를 수득한다. 고체 GuHCl을 샘플에 가하여 4.2M의 최종 농도를 수득한다(주 : GuHCl 1.42g/샘플ml을 가하여 고체 GuHCl의 첨가에 의한 용적 증가를 보상해야 한다. 마찬가지로, 완충액의 첨가는 샘플 조성물이 컬럼 용출 조성물에 보다 근접하도록 용적 증가에 대해 조정해야 한다. 달리는, 크로마토그래피전에 샘플을 컬럼 용출물에 대해 투석시킬 수 있다).

3. 샘플(lowry 단백질 검정에 기초한 단백질 약 1mg을 함유) 2.8ml을 0.6ml/분의 유속으로 10mM MOPS pH 7.2, 6M GuHcl 중에 평형화시킨 Sephacry S-1000의 12.6x96cm 컬럼에 주입한다. 컬럼 용출물을 280nM에서 연속적으로 모니터링하고(Perkin Elmer LC 235 다이오드 배열 검출기), 3ml 분획을 수집한다.

4. 단백질 분포는 A280(또한 스펙트럼)에 기초하고, Pn6B-Ps 분포는 Pn6B-Ps 특이적 샴 분석에 기초한다. Pn6B-Ps-BrAc 단독 및 불활성화된 MIEP와의 물리적 혼합물의 용출 위치에 기초하여, Ps 및 단백질 모두를 함유하는 분획의 수거물을 만들고, Pn6B-Ps-BrAc에 대하여 관측된 위치로부터 뚜렷하게 용출하는 수거물을 추정적으로 Pn8B-Ps-MIEP 결합체로 명명한다.

5. 푸울을 YM-30 막을 사용하여 한외여과로 농축시키고, Milli-Q H2O로 투석시킨다. 단백질 및 Pn6B-Ps 함량을 정량적 조성 조사로부터 평가한다. SCMHC의 존재를 아미노산 분석에 의해 검출한다.

[실시예 32]

뉴모코커스 다당류 Pn18C-Ps 지시 RIA 검정

이 검정은 뉴모코커스 다당류 타입 18C의 정량화를 위해 이용한다. 이는 다중층 샌드위치 RIA 검정이다. 토끼 항-Pn18C-Ps를 폴리스티렌 비이드상에 피복시킨다. 비이드를 Pn18C-Ps를 함유하는 샘플 용액중에서 항온처리한다. 항온처리 후, 비이드를 세척하고, Pn18C-OMPC에 대한 마우스 항체를 함유하는 제2용액중에서 재항온처리한다. 이 항온터리 후, 비이드를 세척하고,¹²⁵I-염소 항-미우스 IgG를 함유하는 용액중에서 3번째 항온처리한다. 플레이트를 다시 세척하고, 비이드를 플라스틱 튜브에 옮겨 계수한다. Pn18C-Ps의 미지 샘플을 정량화하기 위해 표준 곡선과 비교한다.

장치

1. RIA 키트 : Abbot Labs, Diagnostic Div., Catalog No. 6171-10.

2. Qwik 세척 시스템, Abbot Labs, Diagnostic Div.

3. 조정가증한 피펫 및 일회용 피펫 팁(예: 에펜도르프 디지털)

4. 감마 계수기(예: Abbot Autologic).

5. 검경 마무리를 갖는 1/4" 폴리스티렌 비이드 Precision Plastic Ball Co., 3000N, Cicero Ave., Chicago Illinois 60641.

시약

1. New York State Health Services 항-Pn18 C-Ps 항체 로트 R-18-44 또는 등가물.

2. 마우스 항-Pn18C-Ps OMPC 항혈청(푸울 11260-235 또는 등가물).

3. 염소, 항-마우스 IgG 125I-표지된 항혈청.

NEX 159, New England Nuclear, 549 Albany Street, Bostonm MA 02118

4. 항온처리 완충액 : 하기를 함유하는 RCM8

1.0% BSA, Sigma A2153

0.1% 아지드, Sigma S2002

5. 희석액

8부 태아 송아지 혈청 Sigma F3885

1부 염소 혈청 Sigma G6767

1부 토끼 혈정 Sigma R4505

0.05% TWEEN 20 Sigma P1379

0.1% 아지드 Sigma S2002

3. 샘플 또는 표준물을 함유하는 플레이트의 각각의 웰에 항-Pn18C-Ps 피복된 비이드를 가하고, 모든 비이드를 완충액으로 완전히 덮기 위해 플레이트를 온화하게 교반시킨다.

4. 플레이트를 R14 키트가 제공된 접착 백킹으로 덮고, 플레이트를 6시간 동안 실온에서 항온처리한다.

5. 플레이트를 Qwik 세척 장치 및 탈이온수로 세척한다.

6. 마우스 항-18C 항체를 희석액으로 1:1000으로 희석시킨다.

7. 이 용액 200㎕를 비이드를 함유하는 각각의 웰에 가한다.

8. 플레이트를 덮고, 실온에서 밤새 항온처리한다.

9. 플레이트를 Qwik 세척 장치 및 탈이온수로 세척한다.

10. 125I-표지된 염소, 항-마우스 항체를 희석액중에서 15000cpm/10㎕ (∼1:160희석)으로 희석시킨다.

11. 이 용액 20㎕를 비이드를 함유하는 각각의 웰에 가한다.

12. 플레이트를 덮고, 2시간 동안 37℃에서 항온처리한다.

13. 플레이트를 Qwik 세척 장치 및 탈이온수로 세척한다.

14. 비이드를 RIA 키트가 제공된 플라스틱 튜브에 옮겨 적합한 감마 계수기로 계수한다.

계산

1. 각각의 샘플, 표준말 및 항온처리 완충액 대조군에 대한 평균을 얻기 위해서 이중 측정치를 함께 조합한다. 모든 표준물 및 샘플로부터 항온처리 완충 대조군을 감한다.

2. 통계 계산법이 갖추어진 계산기를 이용하여, 표준 곡선에 대한 데이터를 입력하여 상관 계수 및 기울기를 계산다.

3. 적합한 표준 곡선(유리된 물질에 대해서는 유리된 물질, 결합체에 대해서는 결합체)을 이용하여 샘플의 반응을 계산하고, 희석물에 대해 보정한다.

상술한 바와 동일한 공정을 타입 특이적 시약으로 대체시킴으로써 다른 Pn-Ps 종류에도 적용할 수 있다.

Claims (11)

1. 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 하나 이상의 아형으로부터 기원되며, 평균적으로 분자당 약 1200개 미만의 반복 단위를 갖고 분자량이 약1x10⁵내지 1x10⁶이고, 다중 분산도가 1.0 내지 1.4이고, 뉴모코커스 그룹-특이적 C-다당류에 의한 오염 수준이 타입-특이적 다당류의 3.0% 미만인 다당류에 공유 결합된 면역원성 단백질을 포함하는 결합체.
2. 제1항에 있어서, 다당류의 항원성 지수가 0.7 내지 1.1이고 고유 점도가 0.6내지 3.0dL/g인 결합체.
3. 제2항에 있어서, 다당류가 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F 중에서 선택되는 스트랩토코커스 뉴모니애의 아형으로부터 기원하는 결합체.
4. 제3항에 있어서, 다당류의 크기 다중분산도가 1.0 내지 1.4이고 타입 특이적 다당류와 비교하여 C-다당류 오염 수준이 3% 미만이고,

   (1) 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니애 6B로부터 기원하며,

   (a) 약 3x10⁵내지 6x105의 M_N;

   (b) 약 0.60±0.05의 Kd(피이크) ;

   (c) 약 3x10⁵내지 7x10⁵M_W;

   (d) 1.0 내지 2.0의 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 중에서의 고유 점도 및

   (e) 평균적으로 분자당 약 1000개 미만의 반복 단위를 갖거나;

   (2) 다당류가 스트랩토코커스 뉴모니애 14로부터 기원하며,

   (a) 약 3x10⁵내지 8x10⁵의 M_N;

   (b) 약 0.60±0.05의 Kd(피이크) ;

   (c) 약 4x10⁵내지 1x10⁶의 M_W;

   (d) 0.6 내지 1.6의 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 중에서의 고유 점도 및

   (e) 평균적으로 분자당 약 1200개 미만의 반복단위를 갖거나;

   (3) 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니애 19F로부터 기원하며,

   (a) 약 2x10⁵내지 6x10⁵의 M_N;

   (b) 약 0.65±0.05의 Kd(피이크) ;

   (c) 약 2x10⁵내지 6x10⁵M_W;

   (d) 1.0 내지 2.0의 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 중에서의 고유 점도 및

   (e) 평균적으로 분자당 약 1000개 미만의 단량체 반복 단위를 갖거나;

   (4) 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니애 23F로부터 기원하며,

   (a) 약 2x10⁵내지 6x10⁵M_N;

   (b) 약 0.54±0.05의 Kd(피이크) ;

   (c) 약 4x10⁵내지 8x10⁵의 M_W;

   (d) 1.5 내지 3.0의 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 중에서의 고유 점도 및

   (e) 평균적으로 분자당 약 1000개 미만의 단량체 반복 단위를 갖거나;

   (5) 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니애 4호부터 기원하며,

   (a) 약 2x10⁵내지 4x10⁵의 M_N;

   (b) 약 0.65±0.05의 Kd(피이크) ;

   (c) 약 2x10⁵내지 5x10⁵의 M_W;

   (d) 1.0 내지 3.0의 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 중에서의 고유 점도 및

   (e) 평균적으로 분자당 약 600개 미만의 단량체 반복 단위를 갖거나;

   (6) 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니애 9V로부터 기원하며,

   (a) 약 3x10⁵내지 6x10⁵의 M_N;

   (b) 약 0.65±0.05의 Kd(피이크) ;

   (c) 약 3x10⁵내지 7x10⁵의 M_W;

   (d) 1.0 내지 2.0의 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 중에서의 고유 점도 및

   (e) 평균적으로 분자당 약 800개 미만의 단량체 반복 단위를 갖거나;

   (7) 다당류가 스트렙토코커스 뉴모니애 18C로부터 기원하며,

   (a) 약 2x10⁵내지 6x10⁵M_N;

   (b) 약 0.65±0.05의 Kd(피이크) ;

   (c) 약 2x10⁵내지 6x10⁵의 M_W;

   (d) 1.5 내지 3.0의 0.1M 인산나트륨(pH 7.2) 중에서의 고유 점도 및

   (e)평균적으로 분자당 약 700개 미만의 단량체 반복 단위를 갖거나; 또는 이들 다당류의 혼합물이며, 여기에서 이들 다당류가 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) b의 외막 단백질 복합체(OMPC), 또는 이의 MIEP 아단위에 결합되는 결합체.
5. 제4항에 있어서, OMPC 또는 MIEP 및 Pn-Ps 가 다당류 하이드록실을 통한 결합에 대해서는 일반식(A)의 스페이서를 통해 결합되거나 카복실산 그룹을 갖는 다당류의 경우에는 일반식(B)의 스페이서를 통해 결합되고, 결합체가 약 0.05 내지 0.5의 Pn-Ps : OMPC 또는 Pn-Ps : MIEP 질량비를 가지며, 가수분해 및 아미노산 분석결과가 약 0.01 내지 0.15의 SCMHC/Lys 비를 갖는 공유 결합체.

   상기식에서, PRO는 OMPC 또는 MIEP를 나타내고, Pn-Ps는 뉴모코커스 다당류를 나타낸다.
6. (a) 뉴모코커스를 배양하고, 조 뉴모코커스 다당류를 분리시키거나 뉴모코커스 다당류 분말을 용해시키는 단계,

   (b) 단계 (a)의 다당류를 예정된 종점으로 정제하고 부분적으로 가수분해시켜 다당류의 타입-특이적 항원성이 단계 (a)의 조 다당류와 비교하여 30% 이하 감소된 분석가능한 다당류를 생성하는 단계 및

   (c) 단계 (b)의 생성물을 면역원성 단백질과 결합시키는 단계[여기서, 단계(a)에서 배양된 뉴모코커스는 하나 이상의 아형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 중에서 선택되고, Pn-Ps는 항-Pn-Ps 타입- 특이적 항체를 사용하는 오우크터로니

   이중 면역확산법(Ouchterlony double immunodiffusion) 또는 비탁도 검정법(rate nephelometry assay)에 의해 측정한 바 이의 항원적 보존성을 보유하며, 결합전의 Pn-Ps는 각각의 열거된 Pn-Ps 아형에 대해 하기와 같은 0.9M 염화나트륨중 1mg/ml 용액에 대한 점도 또는 Kd(피이크) 종점으로, 약 2000 내지 15000PSI의 압력하에서 가울린 프레스(Gaulin press) 내에서 물리적으로 절단되거나 24시간 동안 100℃에서 가열 또는 초음파 처리로 가수분해된다]를 포함하고, 크로마토그래퍼 또는 알콜 분별하여 1.4 미만의 다중분산도를 갖는 물질을 선별하는 추가의 단계를 포함하거나 포함하지 않는 방법에 의해 생성된 뉴모코커스 다당류-면역원성 단백질 결합체.
7. (a) 조 뉴모코커스 다당류 Pn-Ps를 분리시키는 단계,

   (b) 조 Pn-Ps를 부분적으로 가수분해시키거나 기계적으로 절단시키는 단계,

   (c) 부분적으로 가수분해된 Pn-Ps를 크기 및 순도에 따라 분별하는 단계,

   (d) 단계 (a) 내지 (c)에 따른 하나 이상의 뉴모코커스 아형으로부터 기원한 분별 Pn-Ps를 유도체화시켜 펜던트 친핵성 또는 친전자성 잔기를 드러내는 단계

   (e) 나이세리아 메닝기티디스 b OMPC 또는 이의 아단위를 분리시키는 단계,

   (f) OMPC 또는 이의 아단위를 분별하여 반응적 친전자성 또는 친핵성 잔기를 드러내는 단계,

   (g) 단계 (d)의 다당류와 단계 (f)의 단백질을 결합시키는 단계,

   (h) 결합체를 캐핑시켜 잔여 작용성 그룹을 제거시키는 단계 및

   (i)결합체 생성물을 분리시키는 단계를 포함하는, Pn-Ps-PRO 결합체의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 단계 (b)가 Pn-Ps를 용액중에서 (1) 1내지 48시간 동안 50 내지 150℃에서 가열하거나,

   (2) 초음파 프로브의 동력 고정에 따라 5초 내지 5분의 기간 도안 초음파 처리한 후 냉각시키고 추가의 초음파 처리를 하거나,

   (3) 약 2000 내지 15000 PSI의 압력에서 가울린 프레스내에서 절단시켜 예정된 점도 종점으로 부분적으로 가수분해시켜 항-뉴모코커스 타입 특이적 항체에 결합하는 Pn-Ps를 조 Pn-Ps와 비교하여 30% 이하로 감소시키고,

   단계 (c)가 가수분해된 Pn-Ps를 분별하고, 1x10⁵내지 1x10⁶범위의 분자량을 갖는 분획을

   (i) 예정된 농도의 이소프로판올을 사용하여 상이한 알콜 용해도에 의해 목적하는 Pn-Ps 크기 범위로 침전시키거나,

   (ii) 5x10⁴내지 1x10⁶크기 범위의 다당류를 포함하고 분별할 수 있는 크기-배출 액체 크로마토그래피 컬럼 상에서 분별하여 선별하고, 가수분해 또는 절단에 대한 종점이 각각 열거된 다당류에 대해 아형 Pn-Ps에 대한 종점에 따라 0.1M 인산 나트륨(pH 7.2)중 1mg/ml 용액의 점도 측정법 또는 크로마토그래피에 의해 측정됨을 포함하는 방법.
9. 제1항에 따른 결합체 및 불활성 담체를 면역학적 유효량의 보조제 또는 면역 조절 화합물 또는 추가의 임뮤노겐(immunogen)의 존재 또는 부재하에 포함하며, 결합체가 Pn4-Ps-OMPS, Pn6B-Ps-OMPC, Pn-9V-Ps-OMPC, Pn-14-Ps-OMPC, Pn-18C-Ps- OMPC, Pn19F-Ps-OMPC, Pn23F-PS-OMPC, Pn1-Ps-OMPC, Pn5-Ps-OMPC 및 Pn-7F-Ps-OMPC 중에서 선택된 1개 내지 모든 결합체를 포함하고, 불활성 담체가 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 명반이고, 추가의 임뮤노겐이 B형 간염, A형 간염, 비-A형 비-B형 간염, AIDS, 디프테리아-백일해-파상풍, 홍역, 유행성이하선염, 풍진, 수두, 소아마비 및 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) b에 대한 하나 이상의 백신 중에서 선택되며, 다당류 성분이 기원된 동종의 병원균에 대한 보호성 수용체 면역 반응의 유도에 유용한 백신 조성물,
10. 제7항에 있어서, 단계 (a)후, 조 Pn-Ps를 불순물의 이온 교환 흡착에 의해 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법,
11. 제10항에 있어서, 약 pH 5의 용액에서 음이온성 불순물을 Whatman DE 52 상에서 흡착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.