NO304117B1 - Konjugat av pneumokokkpolysakkarid og immunogent protein, fremgangsmÕte for fremstilling av konjugatet, samt vaksine som inneholder konjugatet - Google Patents
Konjugat av pneumokokkpolysakkarid og immunogent protein, fremgangsmÕte for fremstilling av konjugatet, samt vaksine som inneholder konjugatet Download PDFInfo
- Publication number
- NO304117B1 NO304117B1 NO920350A NO920350A NO304117B1 NO 304117 B1 NO304117 B1 NO 304117B1 NO 920350 A NO920350 A NO 920350A NO 920350 A NO920350 A NO 920350A NO 304117 B1 NO304117 B1 NO 304117B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- approx
- polysaccharide
- conjugate
- solution
- hours
- Prior art date
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 217
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 217
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 116
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 25
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 109
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 45
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims abstract description 21
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 155
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 82
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 52
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 51
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 21
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 21
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 20
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 19
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 19
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 19
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 17
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 12
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 10
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003497 anti-pneumococcal effect Effects 0.000 claims description 8
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 3
- 241001607520 Streptococcus pneumoniae 23F Species 0.000 claims description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000000196 viscometry Methods 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 13
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 abstract description 12
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 abstract description 12
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 abstract description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract 1
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 173
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 135
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 75
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 57
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 51
- 239000000047 product Substances 0.000 description 41
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 34
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 30
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 29
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 28
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 27
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 24
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 23
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 23
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 14
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 14
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 14
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 13
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 12
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 12
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 10
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 10
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 10
- -1 polysaccharide compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 10
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 10
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 10
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- HMZKKJDOCRYTTH-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethylsulfanyl)acetic acid Chemical compound NCCSCC(O)=O HMZKKJDOCRYTTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 9
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 9
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 9
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 9
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AXFZADXWLMXITO-UHFFFAOYSA-N N-acetylcysteamine Chemical compound CC(=O)NCCS AXFZADXWLMXITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- QVYARBLCAHCSFJ-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diamine Chemical group CCCC(N)N QVYARBLCAHCSFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- NRFJZTXWLKPZAV-UHFFFAOYSA-N N-(2-oxo-3-thiolanyl)acetamide Chemical compound CC(=O)NC1CCSC1=O NRFJZTXWLKPZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-OZRXBMAMSA-N N-acetyl-beta-D-mannosamine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-OZRXBMAMSA-N 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 229960004753 citiolone Drugs 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 7
- HVNXGOPARVAZNX-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) 2-bromoacetate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(=O)CBr)C=C1 HVNXGOPARVAZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 6
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical compound CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N boric acid;phosphoric acid Chemical compound OB(O)O.OP(O)(O)=O ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 5
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 5
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- BWLMCOKQHQOEEE-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-amino-4-(carboxymethylsulfanyl)butanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCSCC(O)=O BWLMCOKQHQOEEE-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 4
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 4
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- IFHAMTJNLDFVPU-LURJTMIESA-N (2s)-2-acetamido-4-(carboxymethylsulfanyl)butanoic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSCC(O)=O IFHAMTJNLDFVPU-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPHGMWVJJCWDPB-UHFFFAOYSA-N 4-aminobutylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCCCN BPHGMWVJJCWDPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011928 denatured alcohol Substances 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 229940033515 pneumovax 23 Drugs 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 3
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M sodium;butyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCOS([O-])(=O)=O NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- VHBNOXBGFQQNSF-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-acetamido-3-(carboxymethylsulfanyl)propanoic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CSCC(O)=O VHBNOXBGFQQNSF-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 2-bromoacetamide Chemical group NC(=O)CBr JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 2
- 241000700114 Chinchillidae Species 0.000 description 2
- 206010009137 Chronic sinusitis Diseases 0.000 description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical group CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GBFLZEXEOZUWRN-VKHMYHEASA-N S-carboxymethyl-L-cysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSCC(O)=O GBFLZEXEOZUWRN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000009798 acute exacerbation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 201000005547 chronic conjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 208000027157 chronic rhinosinusitis Diseases 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 2
- 239000012834 electrophilic reactant Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 2
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 2
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 2
- RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N thiohydroxylamine Chemical compound SN RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N trimethylenediamine Chemical compound NCCCN XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 2
- ZTKZPMACNRDISZ-JTQLQIEISA-N (2s)-2-benzamido-4-(carboxymethylsulfanyl)butanoic acid Chemical compound OC(=O)CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 ZTKZPMACNRDISZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- MSYWZRCJRHQKQK-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) 6-[(2-bromoacetyl)amino]hexanoate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(=O)CCCCCNC(=O)CBr)C=C1 MSYWZRCJRHQKQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(azaniumyl)propanoate;chloride Chemical compound Cl.NCC(N)C(O)=O SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanamine Chemical compound NCCOCCN GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJVAQLSZGXLPLT-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethylsulfanyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)SCCN CJVAQLSZGXLPLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKYZDCTWJGBFDW-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-2-methylaniline;hydron;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC(Cl)=CC=C1N VKYZDCTWJGBFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAYOCELKCDKZCA-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxy-2,4-dimethylthiophen-3-one Chemical compound CC1SC(O)=C(C)C1=O FAYOCELKCDKZCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZUGAOYSWHHGDJY-UHFFFAOYSA-K 5-hydroxy-2,8,9-trioxa-1-aluminabicyclo[3.3.2]decane-3,7,10-trione Chemical compound [Al+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O ZUGAOYSWHHGDJY-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910018626 Al(OH) Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000486679 Antitype Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150030235 CTC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940032024 DPT vaccine Drugs 0.000 description 1
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000003072 Ellman's test Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 241000295146 Gallionellaceae Species 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N Glycerol-phosphate Chemical group OP(O)(O)=O.OCC(O)CO XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 108010050195 Haemophilus influenzae-type b polysaccharide-Neisseria meningitidis outer membrane protein conjugate vaccine Proteins 0.000 description 1
- 206010019786 Hepatitis non-A non-B Diseases 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 238000003109 Karl Fischer titration Methods 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010058780 Meningitis neonatal Diseases 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XOCCAGJZGBCJME-IANFNVNHSA-N N-Acetyl-D-fucosamine Chemical compound C[C@H]1OC(O)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XOCCAGJZGBCJME-IANFNVNHSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229940124909 PedvaxHIB Drugs 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108700033496 Recombivax HB Proteins 0.000 description 1
- 229940124942 Recombivax HB Drugs 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 201000002014 Suppurative Otitis Media Diseases 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N [3-[(2,4-dimethylphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1NC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1OP(O)(O)=O IOMLBTHPCVDRHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N aminoazanium;chloride Chemical compound Cl.NN BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229910052925 anhydrite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920001586 anionic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000004836 anionic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- QBXJGGDHZLBZDS-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.CCCC(N)N QBXJGGDHZLBZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- OEERIBPGRSLGEK-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;methanol Chemical compound OC.O=C=O OEERIBPGRSLGEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229960000800 cetrimonium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L copper(ii) acetate Chemical compound [Cu+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O OPQARKPSCNTWTJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000004427 diamine group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002367 endolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910001679 gibbsite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000006415 heart infusion blood agar Substances 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000002766 immunoenhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010978 in-process monitoring Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000002578 otoscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000006069 physical mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229960001973 pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000009283 thermal hydrolysis Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-O tributylazanium Chemical compound CCCC[NH+](CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
De patogene bakterier klassifisert som Streptococcus pnevmoniae (pneumokokker, Pn) er blitt inndelt i 84 antigene serotyper basert på kapselpolysakkaridet (Pn-Ps) til organismen. Sykdomstilstander som kan tilskrives disse organismene, omfatter lungebetennelse, hjernehinnebetennelse, mellomøre-betennelse, bakteriemi og akutte forverringer av kronisk bronkitt, sinusitt, artritt og konjunktivitt. Overvekten av disse sykdommene forårsakes imidlertid av en begrenset del av de 84 kjente isolater. En flerverdig vaksine som inneholder Pn-Ps fra de mest fremherskende og patogene isolatene av organismen, kan således gi beskyttelse mot en svært høy prosentandel av de hyppigst rapporterte patogener i denne klassen.
Det er blitt fremstilt flerverdige vaksiner som er virkningsfulle når det gjelder å frembringe beskyttende immunresponser mot pneumokokkene hos voksne. F.eks. er "PNEUMOVAX 23" (Pneumococcal Vaccine Polyvalent, MSD; se PDR, 1990-utgaven, s. 1431) et flytende preparat som inneholder 50 ug/ml av hver av de 23 forskjellige, ukonjugerte pneumokokkpolysakkarider som alle er deponert ved ATCC og gir én mulig kilde for utgangsmaterialet for denne oppfinnelse. "PNEUMOVAX 23" omfatter hver av de følgende frie, dvs. ukonjugerte, polysakkarider: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F og 33F, som utgjør ca. 90 % av pneumokokkblodisolater. Slike vaksiner er imidlertid minst effektive i den delen av populasjonen som har størst risiko for pneumokokkinfeksjoner: B-celleimmunokompromitterte individer, de eldre og småbarn som er yngre enn to år som er avhengige av T-celleresponser for immunbeskyttelse. Ettersom ukonjugerte polysakkarider er dårlige induksjonsmidler for T-celleimmunresponser, er omdannelse av Pn-Ps til immunogener som er i stand til å indusere T-celleresponser, nøkkelen til frembringelse av passende beskyttelse hos denne målpopulasjon. Anvendelse er imidlertid ikke begrenset til denne gruppen av individer. Administrering av en vaksine som omfatter ett eller flere av de nye konjugatene, til et hunnpattedyr før eller under svangerskap, frembringer f.eks. antistoffer hos moren som passivt kan beskytte et foster under utvikling og patte-barn, selv om vaksinen ikke administreres direkte til fosteret eller spedbarnet. Slike konjugatvaksiner burde også kunne vise seg å være nyttige for frembringelse av antistoffer for endelig passiv beskyttelse av risikopopulasjoner, slik som nyfødte eller søsken av smittede individer.
Polysakkarider som er funnet å være lite immunogene i seg selv, er blitt påvist å være ganske gode immunogener så snart de konjugeres til et immunogenprotein, PRO, [Marburg et al., US-patentskrift nr. 4 695 624; Schneerson et al., New Dev. with Hum. & Vet. Vaccines, 77-94 (1980); Schneerson, et al., J. Exptl. Med., 152, 361 (1980); Anderson, Infection and Immunity, 39, 233 (1983)]. Et hovedproblem ved fremstillingen av slike konjugater er imidlertid den viskøse og ikke-homogene natur av polysakkaridutgangsmaterialet og følgelig vanskelig-heten ved å definere konjugatproduktet kjemisk. Det er således påkrevd med en fremgangsmåte hvor utgangsmaterialene er så godt definerte som mulig, og hvor hvert trinn i synteseveien er analyserbar med hensyn til mellomprodukt dannet. Fremgangsmåten som her er beskrevet, tilfredsstiller dette kravet ved å tilveiebringe svært immunogene konjugatimmunogener mot de be-slektede patogener hvorfra Pn-Ps utvinnes. Konjugatene er anvendbare for småbarn som er mindre enn to år.
I Marburg et al., [J. Am. Chem. Soc, 108, 5282
(1986) og US-patentskrifter nr. 4 695 624, 4 830 852 og 4 882 317] ble det beskrevet et middel for konjugering av polysakkarider og immunogene proteiner gjennom bigeneriske mellomledd. PRO ble derivatisert til å oppvise fremspringende nukleofile eller elektrofile grupper (PRO<*>), mens et partner-Ps ble funksjonalisert slik at det oppviste pendantgrupper med motsatt reaktivitet (Ps<*>). Etter kombinering av Ps<*>med PRO<*>ble det dannet bigeneriske mellomledd som knyttet Ps kovalent til PRO (Ps-PRO). Etter syrehydrolyse frigjøres det bigeneriske mellomledd som en uvanlig aminosyre, kvantifiseres ved aminosyreanalyse og gir derved et middel for å bevise kovalens. Denne oppfinnelse beskriver en fremgangsmåte som er forbedret sammenlignet med den som er beskrevet i US-patent skrifter nr. 4 695 624, 4 830 852 og 4 882 317. Forbedringene omfatter fremstilling av Pn-Ps-utgangsmateriale med mer spesifikke, reproduserbare eller håndterbare fysikalske egenskaper enn det som tilveiebringes ved urene Pn-Ps-preparater, inkludert: økt oppløselighet, økt filtrerbarhet, økt renhet (reduksjon i forurensning med et gruppespesifikt C-polysakkarid (C-Ps) og redusert molekylvekt, polydispersitet og viskositet. De resulterende konjugater som her er beskrevet, er forbedret sammenlignet med de som er tilveiebrakt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge US-patentskrift nr. 4 695 624 når det gjelder økninger i ensartetheten og fremstillingslettheten, forbedret antigenisitet og forbedret renhet for sluttproduktet. Spesielt betydningsfull er den 3-20 ganger reduksjon av gruppespesifikt C-polysakkarid og peptidoglykan hos førkonjugasjons-Pn-Ps i forhold til førkonjugasjons-Ps-preparatene ifølge US-patentskrift nr. 4 695 624. Selv om tilstedeværelsen av C-polysakkaridforurensningen ikke virker inn på immunresponsene mot de typespesifikke antigener, ville C-Ps kunne delta i konjugasjonsreaksjonen og gjøre det mindre spesifikt og regulert for det typespesifikke Ps. Fremstilling av anti-C-polysakkaridantistoffer vil dessuten kunne korrelere med vevsødeleggelsen observert ved noen pågående pneumokokkinfeksjoner. I tillegg til det nye konjugatprodukt beskriver denne oppfinnelse en ny fremgangsmåte for fremstilling av et Ps-Pn-PRO-konjugat, samt nye vaksinepreparater som inneholder et konjugat. Av særlig interesse er kapselpolysakkaridene inkludert i "PNEUMOVAX 23" (Pneumococcal Vaccine Polyvalent, MSD; se PDR, 1990-utgaven, s. 1431). En svært foretrukket delmengde er kapselpolysakkaridene til Streptococcus pneumoniae-undertypene 6B, 23F, 19F, 14, 18C, 4 og 9V, ettersom denne lille gruppen av pneumokokkundertyper er beregnet til å være ansvarlig for mellom 75-85 % av pneumokokkinfeksjonene hos spedbarn og barn. Fremgangsmåten som her er tilveiebrakt, er anvendbar på en bred samling av pneumokokk-polysakkarider. Kjemisk definert pneumokokkpolysakkarid (Pn-Ps) fremstilles ved delvis hydrolyse av et urenset Pn-Ps-preparat inntil et sluttpunkt som er forutbestemt til å bibeholde den antigene integritet til Pn-Ps. Det delvis hydrolyserte Pn-Ps renses i vesentlig grad og kan anvendes for fremstillingen av konjugater (Pn-Ps-PRO) av Pn-Ps og immunogenprotein (PRO). Nye og svært antigene Pn-Ps-PRO-konjugater ifølge oppfinnelsen som omfatter yttermembranproteinkomplekset (OMPC) eller Neisseria meningitidis b eller rekombinante eller rensede underenheter derav, slik som MIEP, eller andre immunogene bærerproteiner som er kovalent bundet til delvis hydrolyserte og høyrensede Pn-Ps-mellomprodukter fra fremherskende pneumokokkisolater, kan anvendes til forhindring av pneumokokkinfeksjoner hos pattedyr. Konjugatene er særlig anvendbare i vaksinepreparater for stimulering av antipneumokokkimmunresponser hos pattedyr, spesielt hos B-celleimmunokompromitterte individer, de eldre og hos spedbarn som er yngre enn to år, ettersom konjugatene utløser T-celleresponser. Pn-Ps-OMPC- og Pn-Ps-MIEP-konjugatene lages ved hjelp av en fremgangsmåte som omfatter følgende trinn: isolering av kapsel-Ps fra kulturer av Streptococcus pneumoniae (pneumokokker, Pn), delvis hydrolysering eller fysisk deling av Pn-Ps, fraksjonering av Pn-Ps, hvorved man får et Pn-Ps-produkt med redusert molekylstørrelse, polydispersitet og viskositet og så kovalent konjugering av Pn-Ps til OMPC eller
MIEP.
Det tilveiebringes nye, delvis hydrolyserte og høyrensede antigenisk type-spesifikke pneumokokkapselpolysakkarider (Pn-Ps) som kan anvendes som mellomprodukter ved fremstillingen av T-celleavhengige konjugater av Pn-Ps og de immunogene proteiner. Det er et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe T-celleavhengige konjugater av Pn-Ps og de immunogene proteinene, som kan anvendes i vaksinepreparater for å forhindre pneumokokkinfeksjoner, spesielt hos spedbarn som er yngre enn to år og hos B-celleimmunokompromitterte mennesker. Et annet formål er å tilveiebringe en fremgangsmåte som er forbedret sammenlignet med den som er tilveiebrakt ifølge US-patentskrift nr. 4 695 624, for dannelse av kovalente konjugater av pneumokokkpolysakkarid og immunogent protein (Pn-Ps-Pro), hvor forbedringen består i bedre kjemisk definisjon og renhet av utgangs-Pn-Ps, mellomprodukter og sluttprodukt og økt ensartethet og letthet hvorved selve fremgangsmåten utføres. Det tilveiebringes kjemisk definerte Pn-Ps-PRO-konjugater ifølge den forbedrede fremgangsmåte, som oppviser T-celleavhengighet og som kan anvendes ved frembringelse av beskyttende serumantistoff mot patogene pneumokokker, spesielt hos spedbarn som er yngre enn 2 år, og hos immunokompromitterte individer. Disse konjugatene anvendes i immunologisk effektive mengder i vaksinepreparater ved en fremgangsmåte for behandling for å forhindre pneumokokk-induserte sykdommer, slik som mellomørebetennelse, hjernehinnebetennelse, lungebetennelse, bakteriemi og de akutte for-verringene av kronisk artritt, sinusitt, bronkitt og konj unktivitt.
Ifølge oppfinnelsen er det således tilveiebrakt et konjugat som er kjennetegnet ved at det omfatter et immunogent protein kovalent bundet til et polysakkarid som gjennomsnittlig har mindre en 1200 repeterende enheter pr. molekyl, en molekyl vekt mellom 1 x 10<5>og 1 x IO<6>, en polydispersitet mellom 1,0 og 1,4 og et forurensningsnivå med pneumokokk-gruppespesifikt C-polysakkarid under 3,0 % av det typespesifikke polysakkarid, og som er utvunnet fra: 1) Streptococcus pneumoniae 6B, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 3 x 10<5>og 6 x 10<5>,
b) en Kd(topp) på ca. 0,60 ± 0,05,
c) en My mellom ca. 3 x 10<5>og 7 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,0 og
2,0, og
e) mindre enn ca. 1 000 repeterende enheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 2) Streptococcus pneumoniae 14, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 3 x IO<5>og 8 x 10<5>,
b) en Kd(topp) på ca. 0,60 ± 0,05,
c) en M„ mellom ca. 4 x 10<5>og 1 x 10<6>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 0,6 og 1,6, og e) mindre enn ca. 1 200 repeterende enheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 3) Streptococcus pneumoniae 19F, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 2 x 10<5>og 6 x 10<5>,
b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05,
c) en M„ mellom ca. 2 x 10<5>og 6 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,0 og
2,0, og
e) mindre enn ca. 1 000 repeterende monomerenheter pr. molekyl i
gj ennomsnitt,
4) Streptococcus pneumoniae 23F, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 2 x 10<5>og 6 x 10<5>,
b) en Kd(topp) på ca. 0,54 ± 0,05,
c) en M„ mellom ca. 4 x 10<5>og 8 x10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,5 og
3,0, og
e) mindre enn ca. 1 000 repeterende monomerenheter pr. molekyl i
gj ennomsnitt,
5) Streptococcus pneumoniae 4, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 2 x 10<5>og 4 x 10<5>,
b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05,
c) en My mellom ca. 2 x IO<5>og 5 x 105,--d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,0 og
3,0, og
e) mindre enn ca. 600 repeterende monomerenheter pr. molekyl i gjennomsnitt,
6) Streptococcus pneumoniae 9V, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 3 x IO<5>og 6 x IO<5>,
b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05,
c) en M„ mellom ca. 3 x 10<5>og 7 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,0 og
2,0, og
e) mindre enn ca. 800 repeterende monomerenheter pr. molekyl i
gj ennomsnitt,
7) Streptococcus pneumoniae 18C, hvor polysakkaridet har: a) en M„ mellom ca. 2 x 10<5>og 6 x 10<5>,
b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05,
c) en Mj, mellom ca. 2 x IO<5>og 6 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,5 og
3,0, og
e) mindre enn ca. 700 repeterende monomerenheter pr. molekyl i
gj ennomsnitt,
eller en blanding av hvilket som helst av disse polysakkaridene, hvor polysakkaridet er konjugert til yttermembranproteinkomplekset (OMPC) fra Neisseria meningitidis b eller MIEP-underenheten derav, idet OMPC eller MIEP og Pn-Ps er bundet gjennom et mellomledd med formelen:
for bindinger gjennom polysakkaridhydroksylgruppene, eller
i tilfellet med polysakkarider som bærer karboksylsyregrupper, hvor PRO er OMPC eller MIEP og Pn-Ps er et pneumokokkpolysakkarid og konjugatet har et vektforhold mellom Pn-Ps og OMPC eller Pn-Ps og MIEP som er mellom ca. 0,05 og 0,5 og som etter hydrolyse og aminosyreanalyse gir et SCMHC/Lys-forhold mellom 0,01 og 0,15.
Ifølge oppfinnelsen er det også tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av et Pn-Ps-PRO-konjugat ved at:
a) urenset pneumokokkpolysakkarid, Pn-Ps, isoleres,
b) 1) anioniske urenheter adsorberes eventuelt på
Whatman DE52 ved en oppløsnings-pH på ca. 5,
2) det urensede Pn-Ps hydrolyseres delvis eller behandles med mekaniske skjærkrefter, c) det delvis hydrolyserte Pn-Ps fraksjoneres etter størrelse og renhet, d) det fraksjonerte Pn-Ps, utvunnet fra én eller flere pneumokokkundertyper i henhold til trinnene (a)-(c),
derivatiseres slik at det oppviser fremstikkende
nukleofile eller elektrofile rester,
e) Neisseria meningitidis b-OMPC eller underenheter derav isoleres, f) OMPC eller underenheten derav funksjonaliseres slik at den oppviser reaktive elektrofile eller nukleofile
rester,
g) polysakkaridet fra trinn (d) konjugeres med proteinet fra trinn (f), h) konjugatet tildekkes for å fjerne gjenværende funksjonelle grupper, og
i) konjugatproduktet isoleres,
kjennetegnet ved at trinnene b)2) og c) utføres ved at:
b) 2) Pn-Ps i oppløsning hydrolyseres delvis til en sluttpunktviskositet forutbestemt til å redusere Pn-Ps-bindingen til antipneumokokktype-spesifikt antistoff med ikke mer enn 30 %
sammenlignet med urenset Pn-Ps, ved:
1. oppvarming ved 50-150°C i mellom 1 og
48 timer, eller
2. sonikering i perioder på 5 sekunder til 5 minutter, avhengig av pulverinnstillingen av sonikeringsproben, etterfulgt av perioder med avkjøling og ytterligere sonikering, eller 3. skjærkraftbehandling i en Gaulin-presse ved trykk mellom ca. 140 og 1 054 kg/cm<2>,
det hydrolyserte Pn-Ps fraksjoneres, og en fraksjon med en molekylvekt i området mellom 1 x 10<5>og 1 x 10<6>utvelges ved hjelp av: i forskjellig alkoholoppløselighet under
anvendelse av isopropanol ved konsentrasjoner forutbestemt til å utfelle det ønskede Pn-Ps-størrelsesområde, eller ii fraksjonering på en størrelsesutelukkelses-væskekromatografikolonne som er i stand til å inkludere og fraksjonere polysakkarider i størrelsesområdet mellom 5 x 10<*>og 1 x IO<6>, og sluttpunktet for hydrolyse eller skjærkraft bestemmes ved viskometri av en 1 mg/ml opp-løsning i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, eller kromatografi for hvert av de angitte polysakkarider i henhold til sluttpunktet for undertypen av Pn-Ps:
A. Det nve Pn- Ps- PRO- konjugat og polysakkarid-mellomproduktene
Pn-Ps-PRO-konjugatprodukter ifølge denne oppfinnelse har et forhold mellom Pn-Ps og PRO mellom 0,05 og 0,5 mg polysakkarid/mg protein, en høy grad av kovalens, minimal forurensning av konjugatet med fritt Pn-Ps og unike fysiske og kjemiske kjennetegn tilført ved hjelp av de nye bestanddel-polysakkaridene.
Konj ugatet omfatter et immunogent protein (PRO) som er kovalent koblet gjennom et mellomledd til et nytt, delvis hydrolysert og høyrenset pneumokokkapselpolysakkarid (Pn-Ps). Det immunogene protein er fortrinnsvis yttermembranproteinkomplekset (OMPC) utvunnet fra en kultur av Neisseria meningitidis b. Én fremgangsmåte for fremstilling av OMPC er idet vesentlige som gitt i US-patentskrift nr. 4 271 147 og eksempel 1. Alternativt er det også foretrukket med en underenhet av OMPC, slik som MIEP, fremstilt ved dissosiasjon av - OMPC eller ved rekombinant ekspresjon derav. Én fremgangsmåte for å oppnå dette formål er gitt i US-patentsøknader nr.
555 978, 555 329 og 555 204 (innlevert 19. juli 1990) og eksempel 2, 16-23.
Det nye, delvis hydrolyserte og høyrensede pneumokokkapselpolysakkarid (Pn-Ps) er et preparat av et antigent polysakkarid utvunnet fra en kultur av én av pneumokokkundertypene (som beskrevet nedenunder i avsnittet som beskriver en ny konjugasjonsfremgangsmåte og i eksemplene 3-10). Pn-Ps har en gjennomsnittlig molekyl vekt mellom ca. lx 10<5>og 1 x IO<6>dalton, gjennomsnittlig mindre enn ca. 1 000 repeterende enheter pr. molekyl, et C-polysakkaridforurensningsnivå på mindre enn ca. 3 % og en antigenisitetsindeks mellom 0,4 og 1,1 og fortrinnsvis mellom 0,7 og 1,1. Denne siste parameter er den relative mengde av antipneumokokktypespesifikk antistoff binding oppvist pr. enhetsvekt av det nye Pn-Ps sammenlignet med urenset Pn-Ps deponert ved ATCC. Den nye Pn-Ps er dessuten ansvarlig for konjugasjon med immunogent protein slik at Pn-Ps-PRO-produktet ifølge oppfinnelsen fremstilles. Noen fysiske og kjemiske kjennetegn til 2 forskjellige Pn6B-Ps- og 2 forskjellige Pn23F-Ps-preparater er gitt i tabell I nedenunder, mens beskrivelsen som følger avslører hvordan disse kjennetegnene måles. Fremgangsmåten beskrevet nedenunder gir en metode for fremstilling av Pn-Ps-mellomprodukter og Pn-Ps-PRO-konjugater med mange forskjellige pneumokokkundertyper, inkludert, men ikke begrenset til de som er valgt fra under-typene 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F og 33F. Som nevnt ovenfor er en foretrukket delmengde av pneumokokkpolysakkarider de som er utvunnet fra pneumokokkundertypene 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F og 23F. Det vil være åpenbart for fagfolk innen teknikken at det i tillegg til, eller istedenfor, noen av disse polysakkaridene, kan benyttes andre ettersom behovet oppstår hos risikopopulasjonen. Pnl-Ps og Pn5-Ps kan således behandles som Pn4-Ps eller Pn9V-Ps, noe som også gjelder for Neisseria meningitidis B, C eller gruppe B streptokokkpolysakkarider, mens Pn7F-Ps kan behandles som Pnl4-Ps, som nærmere beskrevet nedenunder og inkluderes i en flerverdig vaksine. Det vil også være klart for fagfolk innen teknikken at ved innlemmelse av Pn6B-Ps vil beskyttelse mot Pn6A tilveiebringes ved kryss-reaktive antistoffer. Dette gjelder også for en rekke andre pneumokokkundertyper.
Flerverdige vaksiner er de som omfatter blandinger av forskjellige Pn-Ps-PRO-konjugater som hver er fremstilt separat med en bestemt Pn-Ps-undertype. I tillegg er flerverdige vaksiner de hvor flere forskjellige Pn-Ps-undertyper alle konjugeres til et bestemt PRO samtidig eller etter hverandre.
1. Karakterisering av de nye polysakkaridmellomprodukter
De fysiske og kjemiske kjennetegn til de delvis hydrolyserte, rensede pneumokokkapselpolysakkarid-mellomprodukter avhenger av pneumokokkundertypen hvorfra det ble utvunnet, og manipulasjonene som de gjennomgår i henhold til fremgangsmåten som her er beskrevet. Generelt har Pn-Ps-mellomproduktene en 2-10 ganger mindre molekylstørrelse og polydispersitet sammenlignet med urenset polysakkarid utvunnet fra bakteriekultur. Den reduserte størrelse muliggjør forbedret polysakkaridhåndtering under konjugasjon og etter konjugasjonsfjerning av fritt Pn-Ps, høyere Pn-Ps-renhet/homogenitet, lavere Pn-Ps-molekylstørrelsespolydispersitet og idet vesentlige uendret antigenisitet. Disse nye Pn-Ps-kjennetegnene bidrar i betydelig grad til den enhetlige dannelse av et nøye definert, svært typespesifikt, antigent Pn-Ps-PRO-produkt.
i. Pn- Ps- molekvlvekt og polydispersitet
Ved å måle den vektgjennomsnittlige molekylvekt, M„, ved hjelp av en diffusjons-, sedimentasjons- eller kromatografisk måte, og den antallsgjennomsnittlige molekylvekt, MN, gjennom en slik samordnende egenskap som viskositet, fryse-punktnedsettelse eller kokepunktforhøyelse, fås polydispersiteten til Pn-Ps-preparatet som forholdet M„/MN. Dess nærmere 1 dette tallet kommer, dess mer homogent er polysakkaridpreparatet. Polydispersiteten til et antall Pn-Ps-preparater er her angitt og det er også beskrevet en foretrukket fremgangsmåte for å oppnå denne forøkte homogenitet.
Fordelingskoeffi sienten,
V0 = kolonnehulromsvolum
Vi = totalt permeasjonsvolum
Ve = prøvens elueringsvolum
Kd= prøvens fordelingskoeffisient
for hvert urenset og delvis hydrolysert Pn-Ps-preparat måles ved størrelsesutelukkelseskromatografi (SEC) eller størrelses-utelukkelseskromatografi med høy yteevne (HPSEC), av en aliquot av polysakkarid i henhold til fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. Den derved erholdte Kder et mål for polysakkaridpreparatets gjennomsnittlige hydrodynamiske volum. Etterhvert som molekylstørrelsen til Pn-Ps reduseres av fysisk skjærkraft eller ved varme- eller sonisk hydrolyse i henhold til den beskrevne fremgangsmåte, øker elueringsvolumet, Ve, for Pn-Ps og det gjør også KD.
En foretrukket kolonnematriks for dette formål er SEPHAROSE CL2B-gel (Pharmacia nr. 17-0120-01). Kolonnehulroms-volumet (V0) bestemmes med Blue Dextran 2000 (Pharmacia nr. 17-0360-01) og det totale permeasjonsvolum (Vi) fra en natriumkloridsalttopp. Ifølge én metode fremstilles Pn-Ps-prøven ved 2,5 mg/ml i destillert vann og et 1 ml injeksjons-volum brukes. Forholdet Vo/Vibør være i området 0,32-0,37. Kdfor Dextran T500 (Pharmacia nr. 17-0320-01) bør være mellom 0,37-0,49. Et foretrukket HPSEC-system omfatter en 7,5 x 600 mm TSK G6000 PW-kolonne oppvarmet til 50°C.
Ved en svært foretrukket metode kombineres SEC eller HPSEC med et differensialrefraktometer som måler relativ analyttkonsentrasjon som en funksjon av elueringsvolum og et differensialviskosimeter som måler den spesifikke viskositet i analytten som en funksjon av elueringsvolum. En universal-kalibreringskurve [logg (egenviskositet ganger molekylvekt) versus retensjonsvolum] konstrueres fra analyse av en serie av monodisperse polyetylenoksidstandarder. Profilene for konsentrasjon og spesifikk viskositet kan brukes til å beregne profil for molekylvekt versus elueringsvolum for prøven, som igjen brukes til å beregne verdiene for Mnog M„, hvorfra poly-dispersitetsindeksen (N^/M,,) beregnes [Yau, W. W. and Rementer, S. W., J. Liq. Chromatog., 13, 627-675 (1990); Nagy, J. Liq. Chrom., 13, 677-691 (1990); Benoit, et al., J. Ch. Phys. Tome., 63, 1507-1514 (1966)]. Ved foreliggende oppfinnelse ble egenviskositet målt i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,2.
Når først den gjennomsnittlige molekylvekt til et Pn-Ps-preparat er blitt bestemt, bestemmes det gjennomsnittlige antall av repeterende enheter pr. molekyl lett ved å dividere polymermolekylvekten med molekylvekten til den repeterende enhet (se tabell II).
ii. Retensjon av Pn- Ps- typespesifikk antiqenisitet
Det er viktig for hvert urenset Pn-Ps som underkastes fysisk skjærkraft eller kjemisk, termisk, sonisk eller enzymatisk hydrolyse, at det fastslås et sluttpunkt hvor den antigene integritet begynner å forsvinne. Dette sluttpunktet fastslås passende ved å korrelere viskositet med hvilken som helst av et antall immunologiske tester som er kjent innen teknikken. Ved en foretrukket fremgangsmåte måles en aliquot av polysakkaridoppløsning ved hjelp av Ouchterlony-dobbelt-immunodiffusjonsanalysen under anvendelse av pneumokokk-undertypespesifikt antistoff. Fremkomst av et hvitt presipitinbånd i agaren som forbinder presipitinbåndet til en prøve av urenset Pn-Ps plassert i en tilgrensende brønn etter en diffusjonsperiode, gir kvalitativ identitet for reaktanter og bevis for at polysakkaridets antigene integritet forblir intakt. En mer kvantitativ immunologisk analyse oppnås ved hjelp av hastighetsnefelometrianalyse eller en RIA.
Hastighetsnefelometri måler endringen eller endrings-hastigheten i styrken av lys spredt under dannelse av antigen-antistoffkomplekser. Reaksjonen kjøres i en reaksjonscelle som en lysstråle passerer gjennom. I foreliggende tilfelle dannes kompleksene ved hjelp av en immunoutfellingsreaksjon som oppstår i oppløsning når et spesifikt antistoff (Ab) reagerer med sitt spesifikke antigen (Ag), dvs. Pn-Ps. Ettersom dannelsen av et Ag-Ab-kompleks er avhengig av tilstedeværelsen av Ag- og Ab-molekyler i optimale forhold, øker graden av kompleks-dannelse for en konstant mengde av Ab med mengden av Ag opp . til et maksimalt nivå; større mengder Ag resulterer i at mindre kompleks dannes. Ved å holde et konstant nivå av Ab og måle lysspredningen med økte konsentrasjoner av Ag, frembringes således en standardkurve. Det er mulig å beregne Ag- konsentrasjonen for et Ps-preparat (eller derivatisert Ps-preparat) når prøver omsettes med sitt spesifikke Ab under de samme betingelser som brukes for å utvikle standardkurven.
En sammenligning av konsentrasjonen beregnet immunologisk ved hastighetsnefelometri med konsentrasjonen oppnådd kjemisk eller fysisk (ved kolorimetri, refraksjonsindeks eller ved total hydrolyse og kvantifisering av monosakkarider, se nedenunder), gir en antigenisitetsindeks for Ps-prøvene. Tørr-vektanalyse av polysakkarider er egnet bare dersom innholdet av flyktig stoff i pulverpreparatet er kjent. Polysakkarider er som kjent hygroskopiske og kan inneholde alt fra 5 til 30 vekt% flyktige stoffer. Som sådanne er tørrvektmålinger i og for seg ikke særlig pålitelige. Én fremgangsmåte som brukes for å bestemme polysakkaridkonsentrasjon med rimelig nøyaktig-het, er ved hjelp av kolorimetrisk analyse hvor analysen kalibreres med en standardoppløsning av det aktuelle polysakkarid. Pn6B-Ps, Pnl8C-Ps, Pnl9F-Ps og Pn23F-Ps kan f.eks. alle kvantifiseres ved hjelp av metylpentoseanalysen til Dische and Shettles [J. Biol. Chem., 175, 595-603 (1948)]. Pn4-Ps, Pn9V-Ps, Pnl4-Ps og Pnl9F-Ps kan kvantifiseres ved hjelp av heksosamininnholdet og Pn9V kan også kvantifiseres ved hjelp av uronsyreinnhold. Fenolsvovelsyreanalysen [Dubois et al., Anal. Chem., 28, 350-356 (1956)] kan anvendes for kvantifisering av alle disse Pn-Ps-preparater som del av testing i fremgangsmåten under konjugatfremstilling. Den andre fremgangsmåten som anvendes, er å bruke et refraksjonsindeks-signal som et mål for analyttmasse, også kalibrert med en standardoppløsning av det aktuelle polysakkarid. Selv om den kolorimetriske analyse anvendes for å overvåke polysakkaridinnholdet i prøvene under derivatiserings- og konjugasjonsprosessen, brukes den sistnevnte fremgangsmåte- under den fysiske karakterisering av polysakkaridpreparatet ved hjelp av HPSEC-universalkalibreringsanalyse og for beregning av antigenisitetsindeksen. Urenset utgangs-Pn-Ps er gitt en anti-genisitetsindeksverdi på 1,0. En indeks for relativ antigenisitet beregnes for eksperimentelle prøver og en verdi på 0,4-1,1 ansees for å være tilfredsstillende. Det er mulig å få en antigenisitetsindeks som er høyere enn 1,0 dersom poly sakkaridet renses i betydelig grad under hydrolyse- og fraksjoneringstrinnet. Det er også teoretisk mulig at størrelsesreduksjon alene ville kunne øke antigenisitetsindeksen til et preparat ved å øke fleksibiliteten til poly-sakkaridmolekylene og således redusere sterisk innvirkning rundt de antigene epitoper. Disse bestemmelsene utføres som en sjekk med hensyn på hydrolyserte, fraksjonerte og derivatiserte Ps-prøver under fremgangsmåten. Prøver som har relative antigenisiteter på < 0,4 forkastes, dvs. ikke konjugert. Det er tilgjengelig anti-Pn-Ps-antistof f preparater som kan anvendes ved en karakterisering av pneumokokkpolysakkarider. Kilder for anti-Pn-Ps-antistoffer omfatter Health Research, Inc., Albany, NY. og Staten Serun Institute. Alternativt kan typespesifikke anti-Pn-Ps-antistoffer fremstilles for dette formål i henhold til fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, under anvendelse av kommersielt tilgjengelig urenset Pn-Ps som immunogen [Baker et al., Immunology, 20, 469
(1971); Brooke, M. S., J. Immunol., 95, 358 (1966); Kearney, R. and Halladay, W. J., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei., 48, 227
(1970); Schneerson, R. et al., Prog. Allergy, 33, 144 (1983); Robbins, J. B., Infect. Immun., 26, 1116 (1979)].
En ytterligere indikasjon på bibeholdt antigen-integritet er opprettholdelsen av den korrekte kjemiske sammensetning av Pn-Ps-preparat. F.eks. har Pn6B-Ps en repeterende enhet [a-Gal(l-3)-a-Glu(l-3)-a-L-Rhap(l-4)-D-Ribitol-5-P04(2)], slik at molforholdet mellom karbohydratbestanddelene ribitol:ramnose:galaktose: glukose er omtrent 1:1:1:1. Forholdet kan bestemmes f.eks. etter hydrolyse av polysakkaridet med 36 % fluss-syre i ca. 2 timer ved 45-65°C, etterfulgt av 2 M trifluoreddiksyre i 10-20 timer ved 100°C og anionbyttekromatografi med høy yteevne med pulset amperometrisk bestemmelse. Fire topper som representerer omtrent like molare mengder av karbohydratbestanddelene, er således en indikasjon på opprettholdt integritet. Idet vesentlige teoretiske forhold mellom karbohydratbestanddeler opprett-holdes for alle de nye Pn-Ps-forbindelsene ifølge oppfinnelsen innenfor ca. 20 %. Avvikene fra teoretiske verdier skyldes hovedsakelig begrensninger ved teknikken i fremgangsmåten.
Etter total hydrolyse har således:
Pn23F-Ps et forhold på ca.
glyserol:ramnose:galaktose:glukose = 1:2:1:1;
Pnl4-Ps har et forholdt på ca.
N-acetyl-glukosamin:galaktose: glukose = 1:2:1;
Pnl9F-Ps har et forholdt på ca.
ramnose:N-acetylmannosamin:glukose = 1:1:1;
Pnl8C-Ps har et forhold på ca.
glukose :galaktose: ramnose: glyserol: acetat = 3:1:1:1:1; Pn9V-Ps har et forhold på ca.
glukose: galaktose: N-acetylmannosamin: glukuronsyre: galakturon-syre:acetat = 2:1:1:1:1:1,7; og
Pn4-Ps har et forhold på ca.
N-acetylmannosamin: N-acetylf ukosamin: galaktosamin: galaktose: - pyruvat = 1:1:1:1:1.
I tillegg har Pn4-Ps nylig blitt funnet å inneholde en ytterligere bestanddel identifisert ved HPLC-analyse, som synes å være 2-aminopneumosamin-( 2-amino-2, 6-dideoksytalose), noe som også gjelder Pn5-Ps [Barker et al., Carbohydrate Res., 224-233
(1966)]. Pnl9F-Ps har også en ytterligere bestanddel, sann-synligvis et heksosamin, som ikke er blitt rapportert i litteraturen og som det fortsatt gjenstår en definitiv identifikasjon av. Disse og ytterligere teoretiske poly-sakkaridrepeterende preparater er rapportert i de følgende referanser: J. E. G. van Dam et al., Carbohyd. Res. 187, 267
(1988); H. J. Jennings, Adv. Carbohyd. Chem. 41, 155 (1983) og referansene deri; J. C. Richards and M. Perry, Biochem. Cell. Biol. 66, 758 (1988). I tillegg til karbohydratbestanddelene er det fosfat-, acetat- og pyruvatsidégrupper i flere av de aktuelle Pn-Ps, idet noen av disse er immunodominante trekk. Som sådanne kan disse bestanddelene også overvåkes (se eksempel 30). Kvantifisering av monosakkarider er også et anvendbart middel for kvantifisering av polysakkaridkonsentrasjonen i en prøve.
Et ytterligere element i antigenisiteten til de aktuelle polysakkaridene er opprettholdelsen av det som er blitt kalt en "konformasjonell epitop" i polysakkaridet [se f.eks. Wessels, M. R. and Kasper, D. L., J. Exp. Med., 169, 2121-2131 (1989)]. Dette antigenisitetsnivå synes å bli ut-trykt bare i former av sakkaridet med høy molekylvekt og de fremgangsmåtene som her er beskrevet, er også rettet mot bi-beholdelse av dette polysakkaridimmunogenisitetsnivå.
iii. Minimal forurensning med C- polysakkarid
En annen kritisk parameter er nivået av C-poly-sakkaridforurensning. Denne verdien kan påvises ved hjelp av total syrehydrolyse av et polysakkaridpreparat, kromatografi av hydrolysatet og konduktometrisk påvisning av kolin [Hermans, et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 107, 600
(1988)]. Alternativt kan det ikke-hydrolyserte polysakkarid analyseres ved hjelp av NMR med hensyn på kolin. NMR-teknikken anvender forholdet mellom kolinsignalet og ramnosemetyl-signalet (for Pn-Ps inneholdende en ramnose; et annet signal for andre Pn-Ps) for beregning av C-Ps-innholdet. Ved den kromatografiske metode anvendes forholdet mellom kolinsignalet og enten polysakkaridinnholdet bestemt ved hjelp av konduktometrisk analyse eller én av Pn-Ps-bestanddeltoppene for å beregne C-Ps-innholdet. I begge metodene muliggjør standarder for kjente konsentrasjoner av kolin direkte beregning av nivået av kolin som er til stede i et polysakkaridpreparat, under anvendelse av den teoretiske repeterende struktur til C-Ps [Herman et al. (full referanse ovenfor)], idet konsentrasjonen av C-Ps i et polysakkaridpreparat bestemmes. Poly-sakkaridkonsentrasjoner av Pn-Ps-prøver måles i henhold til fremgangsmåter som er kjent innen teknikken. Total polysakkaridkonsentrasjon kan f.eks. bestemmes ved hjelp av total hydrolyse av polysakkaridet og måling av konsentrasjonen av et bestemt monosakkarid. Ved å sammenligne C-Ps-konsentrasjonen med total polysakkaridkonsentrasjon, bestemmes graden av C-polysakkaridforurensning (vekt/vekt). Nivåer av C-polysakkarid under 3 % (vekt/vekt) av totalt polysakkarid betraktes som akseptable, men det er enda mer foretrukket med nivåer under, 1 %. Kjemiske og fysiske egenskaper til to partier av Pn6B-Ps og to partier Pn23F-Ps er oppsummert i tabell I nedenunder. Disse dataene viser reproduserbarheten av parametrer fra parti til parti som skriver seg fra den nye fremgangsmåten som her er beskrevet.
I tabell II nedenunder er det vist kjemiske og fysiske parametrer for flere urensede pneumokokkpolysakkarider og for de tilsvarende nyhydrolyserte og fraksjonerte (Hyd+frak) forbindelser ifølge oppfinnelsen. Gjengitte tall er omtrentlig innenfor forsøksfeil og påvisningsgrenser for de komplekse polysakkaridforbindelser som fremstilles.
2. Karakterisering av det nve Pn- Ps- PRO- koniuqat i. Analyse av identiteten og mengden av Pn- Ps
Det er svært nyttig å verifisere mengden og den kjemiske integritet av Pn-Ps i et sluttkonjugat ved hjelp av en uavhengig teknikk for å forsikre seg om antigenisitet (integritet) og beregne Pn-Ps/PRO-forholdet. Én fremgangsmåte omfatter total hydrolyse under anvendelse av 2 M TFA ved 100°C i 5-16 timer, avhengig av den optimale hydrolysetid for hvert bestemt Pn-Ps. Like mengder Pn-Ps-PRO-konjugat og PRO-hydro-lysat (basert på Lowry-protein) analyseres ved hjelp av anionbyttekromatografi med høy yteevne og med pulset amperometrisk påvisning for å oppnå monosakkaridprofiler. Profilen til PRO "trekkes" fra profilen til Pn-Ps-PRO-konjugatet under anvendelse av passende datamaskinprogramvare, slik som Nelson-programmet, for å korrigere for monosakkarider som PRO bidrar med, f.eks. fra lipopolysakkarid (LPS) som er til stede i OMPC. Mengden av Pn-Ps i konjugatet beregnes så ved å sammenligne profilen til den kjente mengde av det derivatiserte Pn-Ps-hydrolysat og de korrigerte Pn-Ps-PRO-konjugater. Pn-Ps/PRO-forholdet måles også på denne måte.
ii. Analyse med hensyn på nve aminosyrer som indikasjon på konjugasjon og tildekking
Etter konjugasjon av Pn-Ps til PRO, hydrolyseres prøver av konjugatet i 6 N HC1 og underkastes aminosyreanalyse. Denne fremgangsmåten påviser tilstedeværelsen og mengden av unike aminosyrer, slik som S-karboksymetylhomocystein (S-CMHC) og S-karboksymetyl-cysteamin (S-CMCA). Den førstnevnte aminosyre skapes som del av den kjemiske binding ved den kjemiske reaksjon mellom derivatisert Pn-Ps og PRO som beskrevet i fremgangsmåteavsnittet nedenunder, og tas som definitivt bevis på den kovalente binding av derivatisert Pn-Ps til PRO. Dannelse av en slik kovalent binding er vesentlig for T-celleimmunogenisiteten til konjugatvaksinen... Umiddelbart etter fullførelse av konjugasjonsreaksjonen kappes ureagerte bromacetamidrester med N-acetylcysteamin. Hydrolyse av denne bindingen resulterer i frigjørelsen av S-karboksymetylcysteamin (S-CMCA), også påvist i aminosyreanalysen. På visning av denne aminosyren bekrefter vellykket tildekking av de reaktive bromacetamidgrupper, noe som gjør dem util-gjengelige for eventuelle uønskede kjemiske reaksjoner. Akseptable nivåer av kovalens og tildekking er mellom ca. 1-15 % for S-CMHC/Lys og ca. 0-5 % for S-CMCA/Lys.
iii. Analyse av den aluminiumhydroksidadsorberte vaksine
Ved en foretrukket utførelsesform absorberes Pn-Ps-PRO-konjugatet til aluminiumhydroksid [alumina, Al(0H)3-gel (se avsnitt C nedenunder)], noe som resulterer i en for-sterkning av immunresponsen mot vaksinen. Annen mulig vaksine-formulering omfatter formulering i fysiologisk akseptable for-tynningsmidler og bruk av andre adjuvanser, immunomodulatorer eller andre inerte eksipienser enn aluminiumhydroksidgelen. Analyse av dette aluminaabsorberte materiale sørges for på følgende måte.
Den aluminaadsorberte Pn-Ps-PRO kan analyseres med hensyn på sammensetning og stabilitet etter desorpsjon av konjugatet fra alun. Dette utføres ved å dialysere den aluminaadsorberte Pn-Ps-PRO mot en 3 % natriumcitratoppløsning i 16 timer ved værelsestemperatur. Det resulterende, opp-løselige aluminiumcitratsalt migrerer ut av dialysemembranen og etterlater seg Pn-Ps-PRO-en. Denne fremgangsmåten er viktig for å bekrefte at den korrekte mengde Pn-Ps-PRO er i det aluminaadsorberte preparat. Noen formuleringer, slik som Pn6B-Ps-OMPC og Pn23F-Ps-OMPC, inneholder imidlertid 10, 5, 2 og 1 ug Pn-Ps/ml (se avsnitt C nedenunder), konsentrasjoner som er godt under kjemiske påvisningsmetoder. For å utføre karbo-hydratsammensetningsanalyser pelleteres derfor de adsorberte Pn-Ps-OMPC-vaksiner først for å fjerne den vandige væske, og pelleten oppslemmes på nytt i én femtedel av det opprinnelige volum før citratoppløsning. Etter dialyse er det oppløselig-gjorte Pn-Ps-OMPC til stede ved 50, 25, 10 og 5 ug Pn-Ps/ml. Disse konsentrasjonene er så rimelige både for Pn-Ps- og proteinanalyse for å bekrefte dosenivåer.
Citratdesorberte prøver analyseres også med hensyn på den mulige tilstedeværelse av fritt Pn-Ps, et spørsmål som er viktig for immunogenisitet og ensartethet av produksjon. Denne analysen utføres ved kromatografi på en SEPHAROSE CL-28- eller SEPHACRYL SlOOOSF-størrelsesbestemmelseskolonne hvor Pn-Ps-OMPC kan skilles fra Pn-Ps. Tilstedeværelsen og mengden av fritt Pn-Ps måles antigent ved hastighetsnefelometri. Forurensningsnivået i Pn-Ps-OMPC med fritt Pn-Ps er mindre enn 15 % av det totale Pn-Ps som er til stede. iv. Pyrogentest: fravær av betydelig pyroqenisitet
Konjugatproduktet ifølge oppfinnelsen testes med hensyn på fravær av ugunstige temperaturforhøyningseffekter. Konjugatprodukter er blitt fremstilt i henhold til fremgangsmåten som her er beskrevet, og funnet å ha akseptable nivåer av pyrogenisitet.
Fremgangsmåte ( I. V.)
Pn-Ps-konjugatvaksinen testes som beskrevet i 21 CFR, avsnitt 610.13 (b)
1) Fremgangsmåte ( I. M.)
Et andre mål for pyrogenisitet er kanin-IM-testen. Denne testen simulerer bedre bruken av produktet klinisk og føles å gjenspeile den tilsynelatende endotoksinbyrde ved produktet mer nøyaktig.
Hver kanin får 1,0 ml vaksine ved intramuskulær injeksjon. Testen utføres ved å bruke minst tre kaniner. Temperatur overvåkes i fem timer etter injeksjon. Andre trekk ved testmetodikken er som beskrevet i 21 CFR, avsnitt 610.13 (b). (Testdose er basert på polysakkaridkonsentrasjonen.)
v. Den kovalente bindings natur
Konjugatene Pn-Ps-PRO, slik som Pn-Ps-OMPC eller Pn-Ps-MIEP, kan kobles sammen gjennom bigeneriske mellomledd som inneholder en tioetergruppe og primært amin, som danner hydrolytisk labile kovalente bindinger med polysakkaridet og PRO,-slik som OMPC eller MIEP. Foretrukne konjugater ifølge denne oppfinnelsen er de som kan representeres ved formelen Pn-Ps-A-E-S-B-PRO eller Pn-Ps-A•-S-E'-B'-PRO. A-E-S-B og A'-S-E'-B' utgjør bigeneriske mellomledd som inneholder hydrolytisk stabile, kovalente tioeterbindinger og som danner kovalente bindinger (slik som hydrolytisk labile ester- eller amid-bindinger) med makromolekylene, PRO og Pn-Ps. I mellomleddet A-E-S-B, er S svovel; E er transformasjonsproduktet av en tiofil gruppe som er blitt omsatt med en tiolgruppe, og som har formelen
hvor R er H eller CH3og p er 1-3; A er hvor W er 0 eller NH, m er 0-4, n er 0-3 og Y er CH2,0,S,NR' eller CHC02H, hvor R' er H eller Cx- eller C2-alkyl, slik at dersom Y er CH2, så kan ikke både m og n være null, og dersom Y er 0 eller S, så er m større enn 1 og n er større enn 1; hvor q er 0-2, Z er NH2, COOH eller H, hvor R' og p er som definert ovenfor og mellomleddet A'-S-E'-B' er S svovel;
hvor a er 1-4 og R" er CH2eller
HOY'
III!
NCCH(CH2)
hvor Y' er NH2eller NHCOR' og W, p og R' er som
definert ovenfor; og E' er transformasjonsproduktet av en
tiofil gruppe som er blitt omsatt med en tiolgruppe og har
formelen
E' er
hvor R er definert ovenfor; og B' er
hvor p er 1-3. Av de bigeneriske mellomledd
A-E-S-B og A'-S-E'-B', er E-S-B- og A'-S-E'-komponentene påvisbare og kvantifiserbare, idet denne identifikasjonen gjen-speiler kovalensen til konjugatbindingen som binder tioeter-svovelsiden som skriver seg fra det kovalent modifiserte polysakkarid, til mellomleddsiden som skriver seg fra det funk-sjonaliserte protein.
Konjugatene, Pn-Ps-A-E-S-B-PRO, ifølge denne oppfinnelsen kan inneholde mellomledd med komponenter som omfatter derivater av blant annet: karbondioksid, 1,4-butandiamin og S-karboksymetyl-N-acetylhomocystein; karbondioksid, 1, 5-pentandiamin og S-karboksymetyl-N-acetylhomocystein; karbondioksid, 3-oksa-l,5-pentandiamin og S-karboksymetyl-N-acetylhomocystein; karbondioksid, 1,4-butandiamin og S-karboksymetyl-N-acetylcystein; karbondioksid, 1,3-propandiamin og S-karboksymetyl-N-benzoylhomocystein; karbondioksid, 3-aza-1,5-pentandiamin og S-karboksymetyl-N-acetylcystein; karbondioksid, 1,2-etandiamin, glysin og S-(succin-2-yl)-N-acetylhomocystein. Konjugatene, Pn-Ps-A'-S-E'-B'-PRO, ifølge denne oppfinnelse kan inneholder mellomledd med komponenter som omfatter derivater av blant annet: karbondioksid og S-karboksymetylcysteamin; karbondioksid og S-(a-karboksyetyl)cysteamin; karbondioksid og S-karboksymetylhomocysteamin; karbondioksid, S-(succin-2-yl)cysteamin og glysin; karbondioksid og S-karboksymetylcystein.
B. Fremgangsmåte for fremstilling av nye Pn- Ps- mellomprodukter og Pn- Ps- PRO- konjugater
I beskrivelsen av denne fremgangsmåten er flere trinn klart beskrevet:
I. Polysakkaridfremstillinq
a) Isolering av urenset pneumokokkpolysakkarid, Pn-Ps. b) Delvis hydrolysering eller mekanisk skjæring av det urensede Pn-Ps. c) Fraksjonering av det delvis hydrolyserte Pn-Ps etter størrelse og renhet.
II. Konj ugas j on
a) Funksjonalisering av det fraksjonerte Pn-Ps for å danne den elektrofile eller nukleofile reaktant
Pn-Ps<*>, fortrinnsvis for å oppvise ca. 21 reaktive bromacetylgrupper pr. 100 Pn-Ps-oligosakkaridrepeterende enheter. b) Isolering av det immunogene protein (PRO), fortrinnsvis Neisseria meningitidis B OMPC eller en underenhet
derav.
c) Funksjonalisering av PRO for å frembringe den nukleofile eller elektrofile reaktant PRO<*>, fortrinnsvis
OMPC eller en underenhet derav, slik som MIEP, for å
oppvise reaktive sulfhydrylrester.
d) Konjugering av polysakkaridet (Pn-Ps<*>) fra trinn (a) med proteinet (PRO<*>) fra trinn (c). e) Tildekking av Pn-Ps-PRO-konjugatet for å fjerne gjenværende funksjonelle grupper.
f) Isolering av konjugatproduktet.
I.a) Isolering av urenset pneumokokkpolysakkarid.Pn- Ps
Pneumokokkapselpolysakkarider atskiller seg kjemisk og antigent fra hverandre pga. sammensetningen og bindingen av den oligosakkaridrepeterende enhet til den bestemte kapsel-polysakkaridserotypen. Isolering av polysakkaridene må forløpe langs noe forskjellige linjer, avhengig av de fysiske kjennetegn til det bestemte polysakkarid. Generelt dyrkes imidlertid bakteriene og Pn-Ps utvinnes i henhold til kjente metoder
[Eksempel 3 og Williams, C. A., and Chase, M. W., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. I, Academic Press
(1967)], mens patogenene selv er tilgjengelige fra ATCC. Etter en storskalakultur av bakteriene i passende næringsmedier som er kjent innen teknikken for å understøtte pneumokokkvekst, tilsettes et baktericid, slik som fenol eller toluen, for å drepe organismene (eksempel 3).
Alkoholfraksjonering av polysakkaridet utføres så i to stadier. I det første stadium brukes en lav alkohol-konsentrasjon for å utfelle cellerest og andre uønskede urenheter, mens det urensede Pn-Ps forblir i oppløsning. En etter-følgende tilsetning av vannblandbar alkohol til en forutbestemt konsentrasjon, utfeller kapselpolysakkaridene mens ytterligere urenheter blir tilbake i supernatantvæsken. Resuspensjon i et vandig medium etterfølges av fjerning av forurensende proteiner og nukleinsyrer ved hjelp av kjente metoder, slik som nuklease- eller proteolytisk oppløsning eller oppløsningsmiddelekstraksjon. Det urensede polysakkarid utvinnes ved alkoholutfelling og tørking, hvorved det fås et pulver av det urensede Pn-Ps (eksempel 3).
I.b Delvis hvdrolvserinq eller behandling av det urensede Pn- Ps med mekanisk skiærkraft
Urenset polysakkarid fremstilt hovedsakelig som beskrevet ovenfor [se også eksempel 3 nedenunder] er blitt brukt i en ukonjugert tilstand for å formulere pneumokokkvaksiner målrettet for bruk hos voksne og barn over 2 år. Fremgangs-måtetrinnene som følger, gir et nytt, delvis hydrolysert, renset Pn-Ps-produkt med unike og definerte kjemiske og fysiske egenskaper (se tabell II) som kan anvendes ved fremstillingen av konjugatvaksiner. Størrelsesreduksjon av det urensede Pn-Ps bidrar til suksessen med etterfølgende rensetrinn, hvorved man får et høyrenset Pn-Ps-produkt. Når den brukes til å fremstille konjugater, er konjugasjonen i tillegg mer effektiv når det nye Ps-Ps ifølge denne oppfinnelsen brukes. Dette skyldes at vandige oppløsninger av det urensede polysakkaridmaterialet er svært viskøse, dårlig oppløselige og konjugater derav er i stor grad uoppløselige og ufiltrerbare. Konjugasjonsprosessen er i seg selv vanskelig å utføre, noe som resulterer i lavt utbytte av konjugat. I tillegg lettes fjerning av ukonjugert Pn-Ps fra sluttkonjugatet når det for-konjugerte Pn-Ps har en redusert størrelse og viskositet og forbedret oppløselighet. Dette er betydningsfullt ved at tilstedeværelsen av det frie Pn-Ps i konjugatpreparater gjør det vanskelig å beregne den faktiske dose av konjugat-Pn-Ps som administreres, og ettersom det er det konjugerte Pn-Ps som har den betydelige T-cellestimulatoreffekt, representerer tilstedeværelse av ukonjugert Pn-Ps en reduksjon av immunologisk "relevant" Pn-Ps.
Det tørre, urensede kapselpolysakkarid fremstilt ovenfor kan også renses, f.eks. ved anionbyttekromatografi eller annen kromatografisk fremgangsmåte før eller etter delvis hydrolyse, som vist i eksempel 6 for Pnl4-Ps. Den kromatografiske adsorpsjon-desorpsjon kan brukes enten positivt eller negativt. På den positive måte adsorberes Pn-Ps til harpiksen og etterlater urenheter i oppløsning som vaskes bort før Pn-Ps-desorpsjon. Ved den negative måte adsorberes urenheter ut av Pn-Ps-oppløsningen og kastes, idet Pn-Ps blir tilbake i oppløsning i en renset tilstand. Alternativt kan Pn-Ps underkastes delvis varmehydrolyse direkte, som vist i eksempel 4 for Pn6B-Ps, eller ved hjelp av sonisk hydrolyse som vist i eksempel 6 for Pnl4-Ps. Andre hydrolytiske midler, slik som kjemiske, enzymatiske eller fysiske (f.eks. en høy-trykkscelle) midler, er også kjent.
Den delvise hydrolyse utføres ved hjelp av en begrenset varmebehandling i et vandig medium, fortrinnsvis ved 50-110°C, i ca. 1 time til ca. 48 timer. Alternativt gjentas en begrenset høyenergisonisk behandling i fra 5 sekunder til 5 minutter med perioder av avkjøling, så mange ganger som nødvendig for å oppnå det ønskede viskositets- eller Kd-sluttpunkt. Den soniske hydrolysemetode er foretrukket fremfor varmehydrolyse med polysakkarider som har komplekse strukturer (se nedenunder). Andre passende midler som er kjent innen teknikken for å bevirke delvis hydrolyse av polysakkarider, er også anvendbare. F.eks. kan også begrenset kjemisk hydrolyse med syre, endolytisk enzymbehandling eller fysisk skjærkraft, i et blandeapparat, en mølle, også anvendes for å redusere gjennomsnittlig Pn-Ps-kjedestørrelse.
Ved en foretrukket utførelsesform underkastes Pn-Ps fysisk skjærkraft ved passering gjennom en homogenisator ved
en temperatur mellom ca. 0°C og 30°C, og trykk mellom ca.
2 000 PSI og 15 000 PSI, forutbestemt til å gi et Pn-Ps-produkt med ønskelige størrelses-, polydispersitets- og antigenisitetskarakteristika (se eksempel 10).
Et målsluttpunkt for hydrolyse, passende målt ved oppløsningsviskositet eller størrelsesutelukkelseskromatografi med høy yteevne, forutbestemmes for hvert polysakkarid i en pilotskala slik at antigenisitet for polysakkaridet ikke mot-virkes. Som omtalt ovenfor betraktes en nominell evne til å binde spesifikt antistoff av antipneumokokktype som ikke er mindre enn 70 % av bindingen som oppvises for en lik konsentrasjon av det urensede Pn-Ps-utgangsmaterialet, som tilfredsstillende. Dette vil ikke si at Pn-Ps med vesentlig lavere MN, M„ eller antall repeterende enheter pr. molekyl (tabell II) ikke ville kunne bli frembragt ved hjelp av fremgangsmåten, og at slikt Pn-Ps som ikke behøver å reagere over 70 %-grensen fastslått ovenfor for hastighetsnefelometrianalysen, kan være immunogent i dyr etter konjugasjon. Dette vil si at istedenfor fraværet av betydelig evne til å binde typespesifikt anti-Pn-Ps-antistof f, kan Pn-Ps med lav molekylvekt i en konjugert tilstand gjenkjennes av pattedyrimmunsystemet og en god type-spesif ikk anti-pneumokokkrespons kan frembringes. I dette tilfellet bør uttrykket "antigen" erstattes med uttrykket "immunogent" som det operative kriterium for godkjennelse eller avvisning av et bestemt Pn-Ps-preparat. I praksis er det imidlertid mest bekvemt å benytte den in vitro-antigenisitets-parameter istedenfor den in vivo-immunogenisitetsparameter som en prosesskontroll.
Generelt er den samme størrelsesreduksjonsfremgangs-måte anvendbar for de fleste polysakkarider. Mens Pn6B-Ps bi-beholder sin antigenisitet etter langvarig varmestørrelses-reduksjon, kan imidlertid Pn23F-Ps tape strukturell helhet (fjerning av glyserolfosfatsidekjeder), noe som krever den mer skånsomme størrelsesreduksjon som lar seg oppnå ved hjelp av soniske midler eller midler med fysisk skjærkraft. Fysisk skjærkraft, f.eks. i en Gaulin-homogenisator, er en foretrukket metode av flere grunner. For det første er metoden egnet for oppskalering. For det andre krever de soniske og varmehydrolyserende metodene generelt en etterfølgende fraksjonering av det hydrolyserte Pn-Ps for å oppnå poly-dispersiteter i området mellom 1,0 og 1,5. Metoden med fysisk skjærkraft gir imidlertid generelt Pn-Ps-produkt med en polydispersitet som faller innenfor dette området uten ytterligere fraksjonering, selv om fraksjonering kan anvendes for å oppnå ytterligere økninger i renhet og reduksjoner i forurensning med CP-er om nødvendig. For det tredje kan metoden med fysisk skjærkraft ha fortrinnet med større reproduserbarhet for et bestemt Pn-Ps sammenlignet med metoden med varme- eller sonisk hydrolyse. For det fjerde synes metoden med fysisk skjærkraft å gi en viss fordel i fremstillingen av Pn-Ps-produkt som beholder mer antigenisitet for en bestemt størrelse, enn Pn-Ps av den samme størrelse fremstilt ved hjelp av sonisk eller varmehydrolyse.
Viskositet som er relatert til gjennomsnittlig Pn-Ps-molekylvekt, er en passende parameter for overvåkning under prosessen og følges lett under hydrolyse for å begrense og regulere graden av størrelsesreduksjon. Partier av Pn6B-Ps ogPn23F-Ps som ikke lar seg skjelne kjemisk og fysisk, er blitt fremstilt på en enkel måte ved størrelsesreduksjon av polysakkaridet til en enhetlig, målrettet sluttpunktviskositet (se tabell I ovenfor). Slik anvendelse av viskositetsmålinger under prosessen er anvendbar på et bredt spekter av urensede polysakkarider, noe som muliggjør deres hydrolytiske størrelsesreduksjon uten endring av antigene kjennetegn hos de resulterende Pn-Ps. Som beskrevet ovenfor fastslås retensjon av antigenisitet lett, f.eks. ved hjelp av en Ouchterlony-dobbeltdiffusjonsanalyse, hastighetsnefelometri eller andre metoder som er kjent innen teknikken.
Målsluttpunktviskositeter for 1 mg/ml-oppløsninger av flere Pn-Ps-preparater i 0,9 % natriumklorid (saltoppløsning) er gitt i tabell III nedenunder. Disse verdiene gjelder på tilsvarende måte for Pn-Ps utvunnet fra andre pneumokokkundertyper .
I tilfellet med noen pneumokokkpolysakkarider er det fordelaktig å inkludere et ytterligere rensetrinn, slik som et ionebyttertrinn, før eller etter delvis hydrolyse. I tilfellet med Pnl4-Ps, utføres dette trinnet ved hjelp av en satsvis adsorpsjon med WHATMAN DE52-harpiks av anioniske urenheter før delvis sonisk hydrolyse. Polysakkaridet som er nøytralt ved den svakt sure pH under behandlingen, gjenvinnes som super-natantfraksjonen klar for hydrolyse.
Molekylvektverdier for Pn6B-Ps-preparater er ca.
900 kilodalton (kD) før, og ca. 300 KD etter størrelses-reduksjon og fraksjonering. For Pn23F-Ps er de respektive verdiene ca. 1 000 KD eller mer før, og ca. 400-500 KD etter. Reduksjon av Pn-Ps-størrelse til ca. 500 pluss-minus ca.
300 kilodalton er således et passende mål for denne fase av fremgangsmåten for hver Pn-Ps-undertype.
Nyutfelling av det delvis hydrolyserte materiale med forutbestemte konsentrasjoner av alkohol, muliggjør gjenvinning og ytterligere rensing av det delvis hydrolyserte Pn-Ps, som beskrevet i underavsnitt (c) nedenunder. I.c) Fraksjonering av det delvis hydrolyserte Pn- Ps etter størrelse og renhet
Polydispersiteten til et Pn-Ps-preparat er en indikasjon ikke bare på variasjonene i undertypespesifikk Pn-Ps-kjedelengde, den er også en indikasjon på at gruppespesifikt C-polysakkarid samt andre forurensninger fortsatt kan være til stede i Pn-Ps-preparatet. Som angitt ovenfor er C-poly-sakkaridforurensning ikke nyttig og kan til og med korreleres med uheldige immunresponser.
Utvelgelse av et snevert område for gjennomsnittlig polysakkaridmolekylstørrelse (redusert polydispersitet) gjøres passende ved hjelp av differensialalkoholoppløselighet etter størrelsesreduksjon, slik som oppløselighet i etanol og fortrinnsvis isopropanol (IPA). Grunnlaget for denne utvelgelse er at for et bestemt Pn-Ps-preparat, er alkoholoppløseligheten omvendt proporsjonal med kjedelengde, som igjen er proporsjonal med molekylvekt. Fremgangsmåten har således med hell blitt anvendt for å isolere kvantitativt populasjoner av molekyler med enhetlig størrelse og med betydelig forbedret homogenitet sammenlignet med det reduserte utgangs-Pn-Ps. Kontroll under fremstilling av IPA-fraksjoneringer sørges for ved å utføre et pilotforsøk for å forutsi IPA-området som Pn-Ps utfelles over. En antistoffrettet nefeloseanalyse anvendes for å overvåke fraksjoneringen for å sikre kvantitativ Pn-Ps-gjenvinning. Gjennom denne forbedringen reduseres forurensing med C-polysakkarid, det gruppespesifikke polysakkarid som er felles for mange forskjellige pneumokokkisolater, med fra ca. 3 til 20 ganger sammenlignet med det nivå som finnes i urensede Pn-Ps-preparater. I tillegg reduseres molekyl-størrelsespolydispersiteten til Pn-Ps-preparatet samtidig med mellom ca. 1,0 og 1,4.
En alternativ fremgangsmåte til IPA-fraksjoneringen av det størrelsesreduserte Pn-Ps, er kromatografi av det vandige, størrelsesreduserte Pn-Ps ved hjelp av en passende , størrelsesutelukkelsesharpiks, f.eks. CL-2B-harpiks eller en annen harpiks som er i stand til å inkludere og fraksjonere polysakkarid i molekylvektområdet 200-1 000 kilodalton. HPSEC under anvendelse av en rigid størrelsesutelukkelsematrisk er passende i denne sammenheng for å redusere forsinkelse og øke oppløsning. Utvelgelse av fraksjoner som eluerer fra kolonnen med en forutbestemt viskositet eller retensjonstid eller ved on-line-påvisning, gir en populasjon av Pn-Ps-molekyler med de ønskelige kjennetegn med hensyn til størrelse, viskositet og renhet som er beskrevet ovenfor.
Fremstilling av Pn-Ps gjort gjennom tilleggstrinnene med IPA eller kromatografisk fraksjonering, skjer mer enhetlig gjennom de kjemiske koblingstrinn og gir derfor konjugater med reproduserbare karakteristika. Betydelig ledsagende økninger i Ps-Ps-renhet oppnås også, særlig reduseres nivåene av CP-er i
stor grad.
Som et resultat av de ovenfor beskrevne manipula-sjoner og målinger, er foretrukne kjennetegn for Pn-Ps-mellom-produktene som oppsummert i tabell II ovenfor.
II.a) Funksionaliserin<q>av det fraksjonerte Pn- Ps for å danne den elektrofile eller nukleofile reaktant Pn- Ps*. fortrinnsvis for å oppvise ca. 10- 40 reaktive bromacetvlgrupper pr. 100 Pn- Ps- monomerenheter
Pn-Ps fra trinn I.(c) ovenfor er tilstrekkelig homogent og har slike egenskaper som forbedret oppløselighet og redusert viskositet som gjør Pn-Ps egnet for konjugasjon. Mange forskjellige skjemaer er tilgjengelige for fagfolk innen teknikken når det gjelder å fremstilles konjugater av polysakkarider og andre rester. Den fremgangsmåte som her er beskrevet, er bare én mulig vei for å utnytte det nye delvis hydrolyserte og fraksjonerte Pn-Ps-mellomprodukt ifølge oppfinnelsen til å danne konjugater og skal ikke forstås som den eneste måte å bruke Pn-Ps-mellomproduktet på.
Den bigeneriske mellomleddmetode beskrevet av Marburg, S. et al., [US-patentskrift nr. 4 695 624; J. Am. Chem. Soc. 108, 5282 (1986)] er en foretrukket fremgangsmåte for konjugering av det fraksjonerte og størrelsesreduserte Pn-Ps til et immunogent protein. Pn-Ps funksjonaliseres slik at det oppviser elektrofile eller nukleofile grupper. Det Pn-Ps<*>som fås, er så i stand til å reagere med et omvendt funksjonalisert protein, PRO<*>. Fremgangsmåten ifølge opp finnelsen omfatter også utvelgelse av en nukleofil eller bis-nukleofil som vil reagere med det aktiverte polysakkarid slik at det dannes et kovalent modifisert polysakkarid med elektrofile motseter eller tiolmotgrupper, hvorved behovet for å ytterligere funksjonalisere det bis-nukleofilmodifiserte polysakkarid før omsetning av det kovalent modifiserte polysakkarid med det kovalent modifiserte protein, unngås. Funksjonaliseringen av proteinet til begge restformene kan også utføres i mer enn ett trinn i henhold til utvelgelsen av reaktanter i disse trinnene.
Uansett den ønskede funksjonalitet av Pn-Ps<*>, må det størrelsesreduserte, fraksjonerte Pn-Ps først oppløseliggjøres i et oppløsningsmiddel som ikke vil virke inn på funksjonali-seringsprosessen. Ettersom det er hydroksylgruppene i Pn-Ps som er mest mottakelig for funksjonalisering, er fjerning av Pn-Ps fra vann av avgjørende betydning for å bevirke den innledende funksjonalisering. Erstatning av sure Pn-Ps-hydrogen-atomer med et hydrofobt kation, slik som tetra- eller tri-butylammonium, lar Pn-Ps bli oppløselig i ikke-vandige opp-løsningsmidler, slik som DMSO eller DMF. Naturligvis er det ikke noe behov for å utføre denne erstatning i Pn-Ps som er nøytralt (f.eks. Pnl4-Ps eller Pn7F-Ps). Når det først er i en ikke-vandig oppløsning, kan Pn-Ps reagere med en slik bis-elektrofil som karbonyldiimidazol, hvorved det dannes et imidazoyldiuretan. Antallet funksjonelle grupper pr. 100 Pn-Ps -monomerenheter reguleres på dette punkt ved tilsetning av en begrenset mengde med ca. 1/5 av karbonyldiimidazolreagenset sammenlignet med det totale antall Pn-Ps-monomerer på et molart grunnlag, slik at gjennomsnittlig bare ca. 10-40 av 100 Pn-Ps-monomerenheter derivatiseres. Disse artene er mot-takelige for nukleofil substitusjon enten ved hjelp av reagenser, slik som i) cystamindi-hydroklorid som muliggjør dannelse av nukleofile Pn-Ps<*->derivater eller ii) 1,4-butandiamin som muliggjør dannelse av elektrofile Pn-Ps<*->derivater, slik som beskrevet i US-patentskrift nr. 4 695 624 og Marburg, et al., J. Am. Chem. Soc, 108, 5282 (1986).
Det er nylig blitt oppdaget at ettersom noen sure pneumokokkpolysakkarider, slik som Pn9V-Ps, Pn4-Ps,Pnl-Ps, Pn5-Ps og Neisseria meningitidis B- eller C-polysakkarider, oppviser frie karboksylsyregrupper samt frie hydroksylgrupper, forløper konjugasjonskjemien til disse polysakkaridene på en noe annerledes måte sammenlignet med nøytrale polysakkarider eller polysakkarider som er anioniske i kraft av tilstedeværelsen av fosfodiesterbindinger, slik som i polyribosyl-ribitolfosfat. Generelt forløper konjugasjonskjemien for karboksylatfrie polysakkarider ved omdannelse av frie poly-sakkaridhydroksylgrupper til uretanbindinger, dvs. fra hvor Ra er det gjenværende av atomkjeden som binder polysakkarid til protein. I karboksyl syren som inneholder polysakkarider, slik som Pn-9V-Ps som inneholder glukuronatgrupper eller Pn4-Ps som inneholder pyruvatgrupper, forløper imidlertid kjemien fra:
hvor Ra igjen er det gjenværende av atomkjeden som binder polysakkarid til protein. Det som derfor observeres er at estergruppen i uretanet enten ikke dannes i karboksylsyren som inneholder polysakkarid, eller i tillegg dannes en enkel amid-binding på disse stedene. Konjugasjonskjemien forløper ved en større hastighet pga. tilstedeværelsen av karboksylsyregruppene.
Ettersom karboksylsyregruppene antas å være viktige bidragsytere til antigeniteten og immunogeniteten til denne klassen av anioniske polysakkarider, må konjugasjonskjemien reguleres forsiktig for disse polysakkaridene. Behovet for høye forhold mellom polysakkarid og protein i sluttkonjugatet, må avbalanseres mot behovet for å bibeholde antigen integritet. Dette formål tas hånd om ved å begrense mengden av initial karbonyldiimidazolmediert aktivering. Når amidet først er dannet, kan det neste trinn som omfatter cystamindi-hydroklorid eller 1,4-butandiamin, forløpe som angitt ovenfor og ytterligere omtalt nedenunder.
Alternativt kan karboksylgruppene beskyttes rever-sibelt og så avbeskyttes ved å bruke trimetylsilyl eller lignende beskyttelsesgrupper som senere kan fjernes ved hjelp av milde alkaliske betingelser, eller ved å bruke 2,4-di-metoksybenzylestere som vil være syrelabile. I dette tilfelle kan konjugasjonskjemien forløpe på den vanlige måte gjennom polysakkaridhydroksylgruppene.
1. Fremstilling av nukleofilt Pn- Ps*
Det karbonyldiimidazolaktiverte, størrelsesreduserte og fraksjonerte Ps erholdt ovenfor kan omsettes i vandige eller andre oppløsningsmidler med reagenser, slik som beskrevet i US-patentskrift nr. 4 695 624. Et foretrukket reagens er cystamindi-hydroklorid. Etterfølgende fjerning av overskudd av cysteamin og reduksjon med ditiotereitol eller ditioerytreitol gir det nukleofilt sulfhydrylfunksjonaliserte Pn-Ps. Dette Pn-Ps<*->derivat er i stand til reaksjon med et elektrofilt PRO<*>, f.eks. når proteinet er blitt modifisert til å fremvise bromacetylmotgrupper.
2. Fremstilling av elektrofilt Pn- Ps*
Det karbonyldiimidazolaktiverte, størrelsesreduserte og fraksjonerte Pn-Ps erholdt ovenfor kan omsettes i vandige eller andre oppløsningsmidler med reagenser som beskrevet i US-patentskrift nr. 4 695 624, fortrinnsvis med 1,4-butandiamin (BuA2). Etterfølgende acylering av Pn-Ps-BuA2med p-nitrofenylbromacetat eller lignende reagens, frembringer det elektrofile Pn-Ps-BuA2-Br Ac-derivat som er i stand til å reagere med et nukleofilt PRO<*>, slik som et sulfhydryl-modifisert protein. Graden av derivatisering måles på dette punkt ved hjelp av NMR og sammenligning av 1,4-butandiamin-integralet med et passende monosakkaridsignal, slik som signalet for metyl av ramnose. Foretrukne grader av derivatisering er mellom 10 og 40 % og helst ca. 20 %.
11. B) Isolering av det immunogene protein ( PRO), fortrinnsvis Neisseria Meningitidis B OMPC eller en underenhet derav
Proteinresten bør virke som en immunforsterker. Ved valget av protein er det ønskelig å unngå de som resulterer i ikke-spesifikk aktivering av mottakerens immunrespons (reakto-genisitet). Ifølge US-patentskrift nr. 4 695 624 ble det anvendt yttermembranproteinkomplekset (OMPC) utvunnet fra Neisseria meningitidis for å fremstille polysakkaridprotein-konjugater. OMPC har vist seg å være egnet ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, selv om andre immunogen-proteiner, slik som tetanus- eller difteritoksoid eller pertussinogen, kan anvendes.
Forskjellige metoder for rensing av OMPC fra de gram-negative bakterier er blitt anvist [Frasch et al., J. Exp. Med., 140, 87 (1974): Frasch et al., J. Exp. Med., 147, 629
(1978); Zollinger et al., US-patentskrift nr. 4 707 543
(1987); Helting et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. C, 89, 69 (1981); Helting et al., US-patentskrift nr. 4 271 147]. OMPC som her er anvendt, ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1. I tillegg er det også foretrukket med en protein-underenhet isolert ved dissosiasjon av OMPC eller ved rekombinant ekspresjon av materialet som koder for et protein som er en bestanddel i OMPC, særlig hovedmembranproteinet (også henvist til som det mitogene induksjonsprotein, MIP, eller som det viktigste immunforsterkende protein, MIEP). Én fremgangsmåte for å oppnå underenhetsproteinene er beskrevet i eksempel 2, 16-23 og i US-patentsøknader nr. 555 978, 555 329, 555 204 og 639 457 (innlevert hhv. 19. juli 1990 og 10. januar 1991).
II.c) Funksjonalisering av PRO for å frembringe den nukleofile eller elektrofile reaktant PRO<*>., fortrinnsvis OMPC eller underenhet derav for å oppvise reaktive sulfhydrylrester
PRO isolert som i II.(b) ovenfor, funksjonaliseres så slik at det fremviser enten elektrofile eller nukleofile grupper. PRO<*>som fås, er så i stand til å reagere med et omvendt funksjonalisert Pn-Ps<*>, som fremstilt i II.(a) ovenfor.
1. Dannelse av elektrofile PRO*- derivater
Det isolerte PRO, f.eks. OMPC fra Neisseria eller
MIEP fra OMPC, omsettes fortrinnsvis med et slikt reagens som N-(bromacetyl)-6-aminokapronsyre-p-nitrofenylester som er i stand til å reagere med G-aminogruppene i lysin på PRO. Det resulterende bromacetylerte PRO<*>er i stand til å reagere med de nukleofile derivatene av Pn-Ps<*>fremstilt i II.(a)l. ovenfor.
2. Dannelse av nukleofile PRO*- derivater
Det isolerte PRO, f.eks. OMPC fra Neisseria eller MIEP, omsettes med et slikt reagens som N-acetylhomocysteintiolakton, for å frembringe sulfhydrylderivatet av proteinet. Dette nukleofile derivat er i stand til reaksjon med et elektrofilt Pn-Ps<*>som fremstilt i II.(a)2 ovenfor. Typiske resultater for denne fase av fremgangsmåten gir sulfhydryl-titere på mellom ca. 0,1 og 0,3 umol/mg protein. II.d) Koniu<q>erin<q>av polysakkaridet ( Pn- Ps*) fra trinn
II.( a) med proteinet ( PRO*) fra trinn II.( c)
Etter dannelse av de reaktive artene Pn-Ps<*>og PRO<*>i henhold til trinnene II.(a) og II.(c) ovenfor, bringes de omvendt aktiverte reaksjonspartnere i kontakt med hverandre i et omtrentlig vektforhold på 1:1. Reaksjonsblandingen bør renses for luft ved hjelp av nitrogen, forsegles og får reagere ved værelsestemperatur i ca. 4 dager ved mellom 17 og 40°C. Eksempler på slike reaksjoner omfatter: hvor et aktivert polysakkarid som er blitt omsatt med 4-brom-acetamidobutylamin, omsettes med et protein som er blitt omsatt med N-acetylhomocysteintiolakton, hvorved det fås et konj ugat, og:
(hvor Y" er et C2-C8-alkylradikal), hvor et aminoderivatisert polysakkarid som er blitt omsatt med aktivert maleimidosyre, omsettes med et karboksyaktivert protein som er blitt aminert med en aminotiol, hvorved det fås et konjugat.
På samme måte kan hvilket som helst av de kovalent modifiserte polysakkarider med tiolmotgrupper omsettes med bakterieproteinet OMPC eller MIEP med elektrofile motsentre, hvorved man får et kovalent konjugat. Et eksempel på en slik reaksjon er:
hvor et aktivert polysakkarid som er blitt omsatt med en aminotiol, omsettes med et karboksyaktivert protein som er blitt omsatt med monohalogenacetylderivater av et diamin, hvorved det fås et konjugat. En svært foretrukket binding i henhold til denne oppfinnelse er mellomleddet med formelen: for bindinger gjennom polysakkaridhydroksylgruppene, eller
i tilfellet med polysakkarider som bærer karboksylsyregrupper.
Dersom den elektrofile aktivitet av et overskudd av halogenacetylgrupper trenger og fjernes, vil omsetning av konjugatet med en tiol med lav molekylvekt, slik som N-acetylcysteamin, oppfylle dette formål. Bruk av dette reagenset, N-acetylcysteamin, muliggjør også bekreftelse pga. halogen-acetylrestene som brukes, ettersom S-karboksymetylcysteaminet som dannes, kan påvises entydig ved hjelp av fremgangsmåten til Spackman, Moore og Stein.
II.e) Tildekking av Pn- Ps- PRO- konjugatet for å fjerne gjenværende funksjonelle grupper
Gjenværende elektrofile grupper på enten PRO<*>eller Pn-Ps<*>gjøres ikke-reaktive ved slutten av omsetningen ved tilsetning av ca. et 2 til 10 ganger molart overskudd i forhold til gjenværende reaktive grupper på konjugatet av en nukleofil med lav molekylvekt, f.eks. N-etylmaleimid (NEM), for å tildekke gjenværende frie sulfhydrylgrupper, eller en elektrofil med lav molekylvekt, f.eks. N-acetylcysteamin for å tildekke gjenværende bromacetylrester.
II.f) Isolering av konjugatproduktet
Det tildekkede produktkonjugat skilles fra ukonjugert PRO, Pn-Ps og andre reaktanter ved ultrasentrifugering eller diafiltrering. Konjugatpelleten oppslemmes på nytt i en vandig buffervaskeoppløsning som kan omfatte en detergentbehandling, slik som 0,5 % deoksykolin, og salt, slik som 0,1 M Tris, pH 7-9, og ca. 10 mM EDTA for å fjerne gjenværende pyrogener, og fikk stå i mellom 1 og 25 timer ved værelsestemperatur. Konjugatet pelleteres på nytt, oppslemmes på nytt i vandig buffer uten detergent og pelleteres så på nytt ved ultrasentrifugering ved ca. 100 000 x g under anvendelse av en sentrifuge med fast vinkel i ca. 2 timer ved ca. 1-20°C, eller underkastes hvilken som helst av mange forskjellige andre rensefremgangsmåter, inkludert diafiltreringsgelpermeasjon, ionebytterkromatografi, gradientsentrifugering eller annen differensialadsorpsjonskromatografi, for å fjerne ikke-kovalent bundne polysakkarider og proteiner under anvendelse av Ps, Pro og hastighetsnefelometrianalyser samt kovalensanalysen for det bigeneriske mellomledd (se nedenunder) som ln vitro-fremgangsmåter for å følge den ønskede biologiske aktivitet.
Den videre separasjon av reagenser kan utføres ved størrelsesutelukkelseskromatografi i en kolonne eller i tilfellet med svært store, ikke-oppløselige proteiner, kan separasjon utføres ved ultrasentrifugering. Resuspensjon av konjugatet i sterilt vann og lagring i ca. én dag ved 4°C for å muliggjøre fullstendig oppløseliggjøring, etterfølges av en lavhastighetssentrifugering for å fjerne uoppløselige partikler. Supernatantoppløsningen inneholder sluttproduktet som kan sterilfiltreres, formuleres til vaksinepreparater ved immunologisk effektive dosenivåer og sterilfylles i flasker.
Analyse av konjugatet for å bekrefte kovalensen og følgelig stabiliteten av konjugatet, utføres ved å hydrolysere (fortrinnsvis med 6 N HC1 ved 110°C i 20 timer) konjugatet, så analysere kvantitativt med hensyn på den unike aminosyre til det hydrolytisk stabile mellomledd som inneholder tioeter-bindingen og aminosyrer som er bestanddeler i proteinet. Bidraget fra aminosyrene i proteinet kan om nødvendig fjernes ved sammenligning med den passende aminosyrestandard for det involverte protein, idet den gjenværende aminosyreverdi gjen-speiler kovalensen til konjugatet eller aminosyren i mellomleddet kan utformes slik at den fremkommer utenfor aminosyre-standarden til proteinet i analysen. Kovalensanalysen kan også anvendes til å overvåke rensefremgangsmåter for å markere økningen av konsentrasjon av de biologisk aktive komponenter. I eksemplene ovenfor resulterer hydrolyse av
i frigjørelse av S-karboksymetylhomocystein, hydrolyse av resulterer i frigjørelse av aminodikarboksylsyren, og hydrolyse av
resulterer i frigjørelsen av S-karboksymetylcysteamin, H2NCH2CH2SCH2C02H ved spalting av Ps-A-E-S-B-PRO-molekylet i peptidbindinger og andre hydrolytisk ustabile bindinger. Kromatografiske metoder, slik som de til Spackman, Moore og Stein, kan så passende anvendes og forholdet mellom aminosyre-bestanddeler bestemmes.
Optimal fremstilling av IgG-antistoff krever sam-arbeide mellom B- og T-lymfocytter med spesifisitet for det aktuelle antigen. T-lymfocytter er ikke i stand til å gjenkjenne polysakkarider, men kan gi hjelp for antipolysakkarid-IgG-antistoffresponser dersom polysakkaridet bindes kovalent til et protein som T-cellen er i stand til å gjenkjenne.
C. Vaksinepreparater og utnyttbarhet
Ved en foretrukket utførelsesform adsorberes konjugatproduktet på aluminiumhydroksidgel. Dette utføres f.eks. ved fremstilling av en konjugatstandardoppløsning som er ekvivalent med en konsentrasjon på 20 ug/ml Pn-Ps. Porsjoner kan fortynnes 1:1, 1:5 og 1:10 med sterilt vann. Porsjoner av hver av disse prøvene, inkludert en porsjon av standard-oppløsningen med 20 ug/ml, fortynnes 1:1 med et aluminium- hydroksidfortynningsmiddel inneholdende 0,85 mg/ml Al<*3>, 1,7 % NaCl (vekt/volum) og 100 ug/ml timerosol. pH i oppløsningen reguleres til ca. 7,5 med 1 N NaOH, noe som resulterer i opp-løsninger med en Pn-Ps-konsentrasjon på 10, 5, 2 og 1 ug/ml. Doser på ca. mellom 0,1 ml og 0,75 ml av hver av disse preparatene er passende for administrasjon til mottakere med forskjellig alder- og vektområde. Vaksinen formulert som beskrevet er blitt funnet å signifikant øke undertypespesifikke, antipneumokokkpolysakkarid-immunresponser hos 2-3 måneder gamle aper for Pn6B-Ps-0MPC, Pnl4-Ps-0MPC, Pnl9F-Ps-0MPC og Pn23F-Ps-0MPC. Pn-Ps-OMPC-konjugatvaksinen har i tillegg blitt funnet å være T-celleavhengig i atymiske mus.
Av denne beskrivelse burde det være klart at andre polysakkarider med egenskaper som definert her og fremgangsmåter for fremstilling av Ps med de egenskapene, vil ha nyttig anvendelse ved fremstillingen av andre konjugater enn de som omfatter delvis hydrolyserte og fraksjonerte pneumokokkpolysakkarider. Disse konjugatene vil så kunne anvendes til å forhindre sykdommer forårsaket av andre patogene organismer. F.eks. vil streptokokker av gruppe B, en årsak til neonatal hjernehinnebetennelse, Neisseria meningitidis B eller C, en årsak til hjernehinnebetennelse hos spedbarn, eller E. coli, en viktig årsak til urinveis- og andre opportunistiske infek-sjoner, kunne brukes som polysakkaridkilder. Disse polysakkaridene, samt Pn-Ps og kovalente konjugater derav, kan også tilveiebringe viktige komponenter for kombinasjons-vaksinepreparater. Slike kombinasjoner kan f.eks. omfatte immunologisk effektive mengder av adjuvans, slik som Freunds, Ribi eller immunomodulatorforbindelser, slik som inter-leukinene, interferonene (se f.eks. forbindelser angitt i Market Letter, 30. nov. 1987, s. 26-27; Genetic Engineering News, jan. 1988, vol. 8, s. 23) eller ytterligere immunogener. Ved en foretrukket utførelsesform er et preparat som omfatter immunologisk effektive mengder av konjugatet ifølge oppfinnelsen, inkludert i én eller flere av vaksinene mot hepatitt B, hepatitt A, ikke-A-ikke-B-hepatitt, AIDS, difteri, kikhoste, kusma, røde hunder, vannkopper, poliomyelitt eller Haemophilus influenzae b. Foretrukne tilleggsvaksiner, valgt blant de som nettopp er nevnt, velges blant "PevaxHIB", "Recombivax HB", "M-M-R" og en treverdig DTP-vaksine.
De følgende eksempler er gitt for ytterligere å beskrive oppfinnelsen.
Eksempel 1
Fremstilling av Neisseria meningitidis Bil serotype 2 OMPC
A. Fermentering
1. Neisseria meningitidis gruppe Bli
Et rør inneholdende den lyofiliserte kultur av Neisseria meningitidis [erholdt fra Dr. M. Artenstein, Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR), Washington, D. C] ble åpnet og Eugonbroth (BBL) ble tilsatt. Kulturen ble strøket ut på Mueller Hinton-skråagar og inkubert ved 27°C med 5 % C02i 36 timer, hvoretter veksten ble innhøstet i 10 % skummet melkmedium (Difco) og aliquoter ble nedfryst ved -70°C. Identiteten til organismene ble bekreftet ved agglutinering med spesifikt antiserum levert av WRAIR og typingserum levert av Difco.
En ampulle med kulturen fra den andre passering ble tint opp og strøket ut på 10 Columbia Sheep Blood-agarplater (CBAB-BBL). Platene ble inkubert ved 37°C med 5 % C02i 18 timer, hvoretter veksten ble innhøstet i 100 ml 10 % skummet melkmedium, aliquoter ble tatt i 0,5 ml mengder og nedfryst ved -70°C. Organismen ble positivt identifisert ved agglutinering med spesifikt antiserum, sukkerfermentering og gramfarging.
En ampulle av kulturen fra denne passering ble opp-tint, fortynnet med Mueller-Hinton-næringsvæske og strøket ut på 40 Mueller-Hinton-agarplater. Platene ble inkubert ved 37 °C med 6 % C02i 18 timer, hvoretter veksten ble innhøstet i 17 ml 10 % skummet melkmedium, aliquottert i 0,3 ml mengder og nedfryst ved -70°C. Organismen ble positivt identifisert ved hjelp av gramfarging, agglutinering med spesifikt antiserum -og oksidasetest.
2. Fermentasjon og oppsamling av cellepasta a. Inokulumfremka11inq
Inokulum ble dyrket fra én nedfryst ampulle av Neisseria meningitidis gruppe B, B-ll nevnt ovenfor (passering 4). 10 Mueller-Hinton-skråagarer ble inokulert og 6 ble inn-høstet omtrent 18 timer senere og brukt som et inokulum for 3 x 250 ml kolber med Gotschlichs gjærdialysatmedium ved pH 6,35. OD660ble regulert til 0,18 og det ble inkubert inntil OD660var mellom 1 og 1,8. 1 ml av denne kulturen ble brukt til å inokulere hver av 5 x 2 1 Erlenmeyer-kolber (hver inneholdende 1 liter medium, se nedenfor) og det ble inkubert ved 37°C i et risteapparat ved 200 rpm. Den optiske densitet ble overvåket ved timeintervaller etter inokulasjon. Man fikk 4 liter dyrkningskultur ved en OD660på 1,28.
70 liter inokulasionsfermentor
Omtrent 4 liter inokulasjonskultur ble brukt til å inokulere en steril 70-liters fermentor inneholdende ca. 40 liter komplett produksjonsmedium (se nedenunder). Betingelsene for 70-liters fermentasjonen inkluderte 37°C, 185 rpm med 10 liter/minutt luftgjennombobling og konstant pH-kontroll ved ca. pH 7,0 i ca. 2 timer. For denne satsen var slutt-OD6600,732 etter 2 timer.
800- liters produksjonsfermentor
Omtrent 40 liter inokulasjonskultur ble brukt til å inokulere en steril 800-liters fermentor inneholdende 568,2 liter komplett produksjonsmedium (se nedenunder). Satsen ble inkubert ved 37°C, 100 rpm med 60 liter/minutt luftgjennombobling og konstant pH-kontroll ved pH 7,0. For denne satsen var slutt-OD 5,58 13 timer etter inokulasjon.
3. Komplett medium for Erlenmeyerkolber og 70- og 800-1iters fermentorer
Fraksjon A
Fraksjon B ( Gotschlichs gjærdialysat)
1 280 g Difco gjærekstrakt ble oppløst i 6,4 liter destillert vann. Oppløsningen ble dialysert i 2 Amicon DC-30 hulfiberdialyseenheter med tre HIOSM-patroner. 384 g MgS04 • 7 H20 og 3 200 g dekstrose ble oppløst i dialysatet og det totale volum brakt til 15 liter med destillert vann. pH ble regulert til 7,4 med NaOH, det ble sterilisert ved passering gjennom et 0,22 um filter og overført til fermentoren inneholdende fraksjon A.
For Erlenmeyer-kolbene: 1 liter av fraksjon A og
25 ml av fraksjon B ble tilsatt og pH ble regulert til 7,0-7,2 med NaOH.
For 70-liters fermentoren: 41,8 liter av fraksjon A og 900 ml av fraksjon B ble tilsatt og pH ble regulert til 7,0-7,2 med NaOH.
For 800-liters fermentoren: 553 liter av fraksjon A og 15,0 liter av fraksjon B ble tilsatt, og pH ble regulert til 7,1-7,2 med NaOH.
b. Innhøsting og inaktivering
Etter at fermenteringen var fullført ble fenol tilsatt i en separat beholder hvortil celle dyrkningsvæsken så * ble overført, hvorved man fikk en sluttfenolkonsentrasjon på ca. 0,5 %. Materialet ble holdt ved værelsestemperatur med forsiktig omrøring inntil kulturen ikke lenger var levedyktig (ca. 24 timer).
e. Sentrifuqerinq
Etter ca. 24 timer ved 4°C ble de 614,4 liter av inaktivert kulturvæske sentrifugert gjennom Sharples-sentri-fuger med kontinuerlig gjennomstrømming. Vekten av celle-pastaen var etter fenolbehandling 3,875 kg. Alternativt ble den fenoldrepte fermentasjonsvæske innhøstet ved diafiltrering som beskrevet nedenunder.
B. OMPC- isolerinq
Trinn 1 Oppkonsentrering og diafiltrering
Den fenolinaktiverte kultur ble oppkonsentrert til ca. 30 liter og diafiltrert i sterilt, destillert vann under anvendelse av 0,2 um hulfiberfiltre (ENKA).
Trinn 2 Ekstraksion
Et likt volum av 2 X TED-buffer [0,1 M TRIS, 0,01 M EDTA-buffer, pH 8,5, med 0,5 % natriumdeoksykolat] ble tilsatt til de konsentrerte, diafiltrerte celler. Suspensjonen ble overført til en temperaturregulert hank for OMPC-ekstraksjon ved 56°C med omrøring i 30 minutter.
Ekstrakten ble sentrifugert ved ca. 18 000 rpm i en Sharples-sentrifuge med kontinuerlig gjennomstrømming ved en strømningshastighet på ca. 80 ml/minutt og ved ca. 4°C. Den viskøse supernatantvæske ble så samlet opp og lagret ved 4°C. De ekstraherte cellepellets ble på nytt ekstrahert i TED-buffer som beskrevet ovenfor. Supernatantvæskene ble slått sammen og lagret ved 4°C.
Trinn 3 Oppkonsentrering ved ultrafiltrering
Den sammenslåtte ekstrakt ble overført til en temperaturregulert beholder knyttet til AG-Tech 0,1 pm poly-sulfonfiltre. Temperaturen i ekstrakten ble holdt ved 25°C i beholderen under konsentrasjonsprosessen. Prøven ble oppkonsentrert 10 ganger ved et gjennomsnittlig transmembrantrykk mellom 0,77 og 1,69 kg/cm<2>.
Trinn 4 Oppsamling og vasking av OMPC
Retentatet fra trinn 3 ble sentrifugert ved ca.
160 000 x g (35 000 rpm) og ved ca. 70°C i en sentrifuge med kontinuerlig gjennomstrømming og en strømningshastighet mellom 300 og 500 ml/minutt og supernatantvæsken ble kastet.
OMPC-pelleten ble oppslemmet i TED-buffer (190 ml buffer, 20 ml/g pellet). Trinn 2 og trinn 4 ble gjentatt to ganger (idet trinn 3 ble utelatt).
Trinn 5 Gjenvinning av OMPC- produkt
De vaskede pellets fra trinn 4 ble oppslemmet i
100 ml destillert vann med en glasstav og en Dounce-homogenisator for å sikre fullstendig oppslemming. Den vandige OMPC-suspensjon ble så filtersterilisert ved passering gjennom et 0,22 um filter og TED-bufferen ble erstattet med vann ved diafiltrering mot sterilt, destillert vann under anvendelse av et 0,1 um hulfiberfilter.
Eksempel 2
Rensing av en underenhet av OMPC:
Fremstilling av renset MIEP fra OMPC eller fra rekombinante celler ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese
Akrylamid/BIS-geler (37,5:1), 18 x 14 cm, 3 mm tykke, ble brukt. Oppsamlingsgelen var 4 % polyakrylamid og separa-sjonsgelen var 12 % polyakrylamid. Omtrent 5 ug OMPC-protein eller rekombinant vertcelleprotein ble brukt pr. gel. Til 1 ml OMPC ble det tilsatt 0,5 ml prøvebuffer (4 % glyserol, 300 mMDTT, 100 mM TRIS, 0,001 % bromfenolblått, pH 7,0). Blandingen ble varmet opp til 105°C i 20 minutter og fikk avkjøles til værelsestemperatur før lading på gelen. Gelen ble så kjørt ved 200-400 milliampere med avkjøling inntil bromfenolblått nådde bunnen av gelen. En vertikal strimmel av gelen ble skåret ut (ca. 1-2 cm bred) og farget med Coomassie/kobberacetat (0,1 %). Strimmelen ble avfarget inntil MIEP-båndet (ca. 38 KD) ble synlig. Strimmelen ble så plassert i sin opprinnelige gelposisjon og MIEP-området ble skåret ut fra det gjenværende av gelen under anvendelse av en skalpell.
Det utskårne området ble delt opp i terninger (ca.
5 mm) og fortynnet med 0,01 M TRIS-buffer, pH 8,1. Etter 2 sykluser med eluering ble eluatet evaluert med hensyn på renhet ved hjelp av SDS-PAGE. Eluatet ble slått sammen med en felles blanding av eluater og dialysert i 48 timer mot 60 mM ammoniakkmaursyre, pH 10. Alternativt kan det eluerte protein dialyseres mot 50 % eddiksyre i vann. Etter dialyse ble det eluerte protein inndampet til tørrhet. Materialet ble ytterligere renset ved passering gjennom en PDlO-kolonne for størrelsesbestemmelse (Pharmacia, Piscataway, NJ) og ble lagret ved værelsestemperatur.
Eksempel 3
Dyrking av Streptococcus pneurooniae- undertyper og isolering av urenset Pn- Ps
1. Dyrking av pneumokker
Fremgangsmåter for dyrking av pneumokker er godt kjent innen teknikken [Chase, M. W., Methods of Immunology and Immunochemistry, 1, 52 (1967)]. Isolater av pneumokokkundertyper er tilgjengelige fra ATCC. Bakteriene identifiseres som innkapslede, ikke-motile, grampositive, lansettformede diplokokker som er alfa-hemolytiske på blodagar. Undertyper differensieres på grunnlag av Quelling-reaksjon under anvendelse av spesifikke antisera. Original- og standardinokula-sjonskulturer holdes fortrinnsvis lyofiliserte eller under 8°C. Ved en foretrukket dyrkningsmetode gjenopprettes standardkulturer med Heart Infusion Broth, plates ut på Heart Infusion Agar, inneholdende 10 % defibrinert kaninblod og inkuberes ved 37°C ± 2°C i omtrent 18 timer.
Veksten på platen oppslemmes på nytt i Heart Infusion Broth og en aliquot av den på nytt oppslemmede vekst brukes til å inokulere 100 ml Heart Infusion Broth inneholdende 10 % defibrinert kaninblod som inkuberes som en stasjonær kultur i omtrent 18 timer ved 37°C ± 2°C. Den 100 ml flytendegjort kultur (arbeidsinokulum) sjekkes med hensyn på renhet ved hjelp av mikroskopisk undersøkelse av en gramfarget blanding og vekst på plater med Heart Infusion Blood Agar. Arbeids- --inokulumet kan lagres ved 2-8°C i opp til 14 dager eller brukes umiddelbart. To-liters Erlenmeyer-kolber eller andre egnede beholdere som inneholder Pneumococcus Inoculum Medium (YUF), inneholdende dekstrose (25 g/liter), inokuleres med arbeidsinokulum og inkuberes stasjonært i omtrent 8-24 timer ved 37°C ± 2°C. Inkubasjonsperioden varierer som angitt, avhengig av typen av Streptococcus pneumoniae som dyrkes. pH i fermentasjonen reguleres til å opprettholde et mål-pH-område på 6,0-7,2 ved periodevis tilsetning av 12 % natriumbi-karbonatoppløsning inntil en optisk tetthet på 1,5-4,0 er nådd. Optisk tetthet måles ved 660 nanometer. En prøve av veksten undersøkes mikroskopisk og det utføres en serologisk agglutinasjonsreaksjon for å sjekke renhet. Veksten fra dette stadium overføres til en inokulasjonsfermentor inneholdende 40 liter Pneumococcus-fermentormedium sammensatt av destillert vann, en tørr ladning av komponentene for Pneumococcus-inokulasjonsmedium (YUF), gjærekstraktultrafiltrat, UCON, og dekstrose (omtrent 25 g/liter). Kulturen inkuberes ved 37°C 2°C med forsiktig omrøring i omtrent 2-12 timer. pH reguleres til 6,0-7,2 ved periodevis tilsetning av natriumhydroksid-oppløsning. En fermentor inneholdende 525 liter Pneumococcus-fermentormedium, sammensatt av destillert vann, en tørr ladning av komponentene for Pneumococcus Production Medium (YUF), gjærekstraktultrafiltrat, UCON, og dekstrose (omtrent 25 g/liter), inokuleres med omtrent 50 liter av én 2-12-timers inokulasjonskultur. Kulturen inkuberes ved 37°C ± 2°C med forsiktig omrøring i 6-30 timer, avhengig av hvilken type som dyrkes. pH reguleres til 6,0-7,2 ved periodevise tilsetninger av natriumhydroksidoppløsning. Fermentasjonen følges ved hjelp av bestemmelse av optisk tetthet og fermentasjonen bestemmes når dekstrosen er fullstendig utnyttet som angitt ved ingen ytterligere endringer i pH.
De patogene organismene drepes umiddelbart etter at fermenteringen er avsluttet. Dette utføres ved tilsetning av fenol til en konsentrasjon på ca. 1 % og drepingen får fortsette i 2-12 timer ved omgivelsestemperatur.
II) Isolering av urent Pn- Ps
Denaturert alkohol tilsettes til den drepte kultur i en tilstrekkelig mengde til å utfelle cellerester og nukleinsyrer som fjernes ved sentrifugering. Det urensede polysakkarid utfelles så fra supernatantvæsken ved tilsetning av mer denaturert etanol. De faste stoffene samles opp ved sentrifugerihg og supernatantvæsken kastes.
Nukleinsyreforurensning reduseres ved oppløselig-gjøring av polysakkaridet i en nøytral, vandig oppløsning, slik som 1-5 % natriumacetat eller 0,05 M fosfatbuffer, hvortil det tilsettes nuklease og ca. 0,01 M magnesiumklorid. Etter ca. 60-120 minutter ved ca. 36°C reguleres pH til ca. 8,0 og en protease, slik som trypsin, tilsettes for å fordøye proteinnoldige forurensninger.
Ytterligere urenheter kan fjernes ved ny utfelling av polysakkaridet i natriumacetat med denaturert alkohol eller isopropanol, etterfulgt av ny oppløseliggjøring i destillert vann. Tilsetning av cetrimoniumbromid ved ca. 8°C utfeller urenheter som fjernes ved sentrifugering. Tilsetning av natriumacetat og en aliquot av denaturert alkohol eller isopropanol muliggjør fjerning av ytterligere urenheter. Polysakkaridet utvinnes ved tilsetning av mer alkohol og sentrifugering. Utfellingen vaskes med absolutt etanol inntil det fås et hvitt pulver. Polysakkaridet samles opp ved filtrering, vaskes med absolutt etanol og aceton og tørkes under vakuum, hvorved man får det urene Pn-Ps som et pulver.
Eksempel 4
Fremstilling av delvis hvdrolysert, renset Pn6B- Ps
(1) Varmehydrolyse:
En 3,0 g porsjon av urenset Pn6N-Ps-pulver ble opp-løseliggj ort i 1 200 ml saltoppløsning (0,9 % NaCl) med om-røring ved værelsestemperatur i ca. 4 timer og lagret ved 4°C over natten. Oppløsningen ble så hydrolysert i et "kald-finger"-reflukskondensasjonsapparat ved 100°C i 24 timer og avkjølt til værelsestemperatur. Natriumacetat (59,7 g) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 3 % (vekt/volum). (2) Serologisk prøve: En fraksjoneringspilotundersøkelse med isopropanol (IPA) og antistoffrettet sluttpunktnefeloseanalyse utført på en 10 ml porsjon av prøven, viste at Pn6B-Ps ville utfelles ved 40-50 % IPA.
(3) Første IPA- tilsetning:
Den hydrolyserte prøve (volum: 1 210 ml, fra trinn 1 ovenfor) ble brakt til 43,5 % IPA ved tilsetning av 932 ml IPA (tilsatt dråpevis med omrøring ved værelsestemperatur). Prøven fikk omrøres i 15-30 minutter og ble så sentrifugert ved 11 000 x g i 30 minutter (Beckman JA-10-sentrifuge, 8 000 rpm, 20°C). Den store pelletmengden ble triturert med absoluttEtOH i en 250 ml Omnimix-beholder og så samlet opp på en 60 ml sinterglasstrakt. Utfellingen ble vasket direkte på trakten med absolutt EtOH, så aceton og tørket under vakuum over CaCl2ved værelsestemperatur som forberedelse for analyse.
(4) Andre IPA- tilsetning og produktutvinning:
Den 43,5 % IPA-supernatantvæske [volum = 2 020 ml, fra trinn 3 ovenfor] ble brakt til 46,0 % IPA ved tilsetning av 93,5 ml IPA dråpevis under omrøring ved værelsestemperatur. Prøven ble lagret og sentrifugert som i trinn 3 ovenfor. Pelleten ble triturert, samlet opp, vasket og tørket som i trinn 3 ovenfor. Det fremstilte Pn6B-Ps veide 1 650 mg og det hadde en Kdpå 0,62 og et fosforinnhold på 3,3 %.
Eksempel 5
S . pneumoniae 6B- 0MPC- kon- jugat, Pn6B- Ps- 0MPC
A. Fremstilling av Dowex 50 x 2 tetrabutylammonium-harpiks TDowex 50 ( BUjN*)]
Dowex 50 x 2 (200-400 mesh) H+<->form (72 g) ble oppslemmet i vann, fylt på en kolonne og vasket sekvensvis med vann, 6 N HC1 og så vann inntil effluenten var nøytral ved testing på pH-papir. En 10 % vandig oppløsning av tetrabutyl-ammoniumhydroksid ble så kjørt gjennom kolonnen inntil effluenten var sterkt alkalisk. Endelig ble vann kjørt gjennom kolonnen inntil effluenten igjen var nøytral.
B. Pn6B( Bu4N+)
Pn6B-Ps (600 mg), størrelsesredusert og fraksjonert (se tabell I, Pn6B-Ps-parti 1, for fysiske egenskaper) ble oppløst i sterilt, destillert vann (60 ml) og oppløsningen ble magnetisk omrørt inntil alle faste stoffer gikk i oppløsning
(1,5 time). Polysakkaridoppløsningen ble tilført den skylte harpiks og fikk passere gjennom laget ved hjelp av tyngdekraft (4,5 timer). Kolonnen ble vasket med vann (10-12 ml) og de kombinerte effluenter lyofilisert, hvorved man fikk 640 mg tørt Pn6B-Ps-tetra-n-butylammoniumsalt, Pn6B(n-Bu4N+).
C. Pn6B- BuA2
Pn6B(n-Bu4N<+>) (640 mg) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) (24 ml) og magnetisk omrørt i 30 minutter, hvoretter alle faste stoffer syntes å være i oppløsning. Til denne blandingen ble det tilsatt 1,1'-karbonyldiimidazol (44,2 mg) og reaksjonsoppløsningen ble omrørt ved værelsestemperatur (60 minutter). I en separat kolbe ble en oppløsning av butandiamindi-hydroklorid (BuA2-2 HC1, 1,022 g) i vann (16 ml) gjort basisk (pH 10,2) ved tilsetning av 10 N NaOH. Opp-løsningen ble filtrert gjennom et 0,2 um sterilfilter og av-kjølt i et isbad. Den lagrede DMSO-blanding inneholdende det aktiverte polysakkarid ble tilsatt til den kalde BuA2* 2 HC1-oppløsning i en sakte, jevn strøm og den resulterende opp-løsning ble omrørt ved 0°C (15 minutter). Reaksjonsblandingen fikk varmes opp til værelsestemperatur og ble omrørt i ytterligere 1 time, hvoretter den ble overført til dialyserør og dialysert (4°C) mot det følgende: 1) 15 1 0,1 M pH 7,0 natriumfosfatbuffer i 6 t; 2) 15 1 0,01 M pH 7,0 natriumfosf atbuf fer, 12 t; 3) 15 1 0,01 M pH 7,0 natriumfosfatbuffer, 9 t; 4) 15 1 destillert H20, 17,5 t. Innholdet til dialyse-røret ble lyofilisert, hvorved man fikk 222 mg Pn6B-l, 4-butandiamin (Pn6B-BuA2). NMR (300 MHz, D20) av ca. 5 mg av dette materialet avslørte et innhold på 22 diaminrester pr. 100 Pn6B-Ps-repeterende monomerenheter ved sammenligning av integralene for resonansene av butandiaminmetylenene og ramnose-metylprotonene til Pn6B-Ps.
Pn6B - BuA2 - Br Ac
Pn6B-BuA2(210 mg) ble oppløst i pH 9,04, 0,1 M Kolthoff-boratfosfatbuffer (21 ml) og blandingen ble magnet-omrørt i 30 minutter for å bevirke oppløsning. Til denne vandige oppløsning ble det tilsatt en blanding bestående av p- nitrofenylbromacetat (210 mg) i acetonitril (2,6 ml) og reaksjonsblaridingen ble omrørt over natten (20 timer, 4°C). Oppløsningen ble overført til dialyserør og dialysert (4°C) mot det følgende: 1) 15 1 sterilt, destillert H20, 12,3 t; 2) 15 1 sterilt, destillert H20, 8,25 t; 3) 15 1 sterilt, destillert vann, 5,5 t. Fra innholdet i beholderen ble 1,7 ml fjernet for analyser (NMR- og HPSEC-universalkalibrerings-eller molekylstørrelsesanalyse) og så ble 0,449 g tørket pH 8 fosfatbuffersalt (fremstilt ved lyofilisering av en 0,1 M, pH 8, natriumfosfatoppløsning) tilsatt. Etter fullstendig opp-løsning (30 minutter) ble oppløsningen filtrert gjennom et sterilt 0,2 um filter, hvorved man fikk en pH 8-oppløsning av Pn6B-BuA2-BrAc.
Pn6B- 0MPC
Sterilt OMPC (40 ml, 4,5 mg/ml) ble pelletert ved ultrasentrifugering (4°C, 43 K rpm, 2 t) i fire 10 ml sentri-fugerør. Hver pellet ble på nytt oppslemmet i 3 ml sterilfiltrert (0,22 um) tioleringsblanding som bestod av det følgende: N-acetylhomocysteintiolakton-hydroklorid (164 mg), etylendiamintetraeddiksyredinatriumsalt (255 mg) og ditiotreitol (53 mg) i pH 11,09, Na2B407-buffer (30 ml). De på nytt oppslemmede pellets ble homogenisert (Dounce), slått sammen, beholderen avgasset og de ble dekket med nitrogen og lagret over natten (19 timer) ved værelsestemperatur. Oppløsningen ble fordelt mellom tre ultrasentrifugerør, toppet med 1 M KH2P04og proteinet pelletert (4°C, 43 K rpm, 2 timer). Pelletene ble på nytt oppslemmet i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 8 (30 ml), homogenisert (Dounce) og på nytt pelletert (4°C, 43 K rpm, 2 timer). Den sterile proteinpellet ble brukt på nytt oppslemmet i den filtrerte Pn6B-BuA2-BrAc-oppløsning. En Ellman's test ble umiddelbart utført og viste en SH-titer på 34 umol. Reaksjonsblandingen ble avgasset, det ble dekket med nitrogen og lagret i 91 timer ved værelsestemperatur.
Proteinet ble tildekket ved tilsetning av 1 ml av en (0,22 um sterilfilter-)oppløsning bestående av det følgende: N-etylmaleimid (75 mg) i 5 ml, pH 8,0, 0,1 M natriumfosfatbuffer. Denne blanding ble lagret i 4 timer ved værelses temperatur, hvoretter 300 ul N-acetylcysteamin (0,22 pm sterilfiltrert) ble tilsatt og oppløsningen lagret i ytterligere 19,5 timer.
Det sterile, tildekkede konjugat ble fordelt mellom fire sentrifugerør, toppet med 0,1 M, pH 7, natriumfosfatbuffer og pelletert ved ultrasentrifugering (4°C, 43 K rpm,
2 timer), så på nytt oppslemmet og homogenisert (Dounce) i steril, pH 7, 0,1 M NaP04-buffer (42 ml). Etter resentri-fugering som tidligere, ble pelleten på nytt oppslemmet i en Dounce-homogenisator i totalt 50 ml sterilt, destillert vann. Etter lagring i 17 timer ved 4°C ble konjugatpreparatet sentrifugert ved 1 000 rpm i 3,5 minutter i en TH 4-rotor i en TJ-6-sentrifuge og en liten mengde sediment fjernet. Slutt-produktkonjugatsuspensjonen ble analysert med hensyn på protein (Lowry), Pn6B-polysakkarid (fenol/svovelsyre), ukonjugert polysakkarid (størrelsesutelukkelseskromatografi - hastighetsnefelometri) og aminosyrer (aminosyreanalyse). Resultatene var som følger:
Eksempel 6
Fremstilling av delvis hydrolvsert, renset Pnl4- Ps
(1) Behandling med anionbytterharpiks
En 2,81 g porsjon av Pnl4-Ps-pulver ble oppløselig-gjort i 1 124 ml destillert H20 med omrøring ved værelsestemperatur i ca. 4 timer og så lagret ved 4°C over natten. Oppløsningen ble tilsatt til 60 g DE52 (Whatman, dietylamino-etylcellulose) som var blitt forsvellet i ca. 15 timer i destillert H20 ved pH ca. 5-6. Oppslemmingen ble forsiktig ., ristet på en plattformrister ved værelsestemperatur i ca.
15 timer, hvoretter den ble sentrifugert i en Beckman JA-10-sentrifuge ved 5 000 rpm i 15 minutter ved 20°C. Supernatantvæsken ble ytterligere klaret gjennom en sinterglasstrakt (150 ml, middels porøsitet) og samlet opp i en 2 liters sidearmkolbe.
(2) Sonisk hydrolyse
Det DE52-behandlede Pnl4-Ps (volum: 1 100 ml, fra trinn 1 ovenfor) ble sonikert i et plastbeger på et isbad med en Branson-sonikator (1,3 cm prøve, innstilling 8) i 2 min. Prøven fikk avkjøles i ca. 15 minutter mens viskositeten ble bestemt og ble så sonikert i ytterligere intervaller på 1 min. Et viskositetssluttpunkt på 1,096 centistoke ble nådd etter den siste soniske behandling. Den hydrolyserte prøve ble brakt til værelsestemperatur og natriumacetatreagens (18,0 g) ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 1 % (vekt/volum).
(3 ) Serologisk prøve
En fraksjoneringspilotundersøkelse med isopropanol (IPA) og antistoffrettet sluttpunktnefeloseanalyse utført på en 10 ml porsjon av prøven, viste at Pnl4-Ps ville utfelles mellom 35 og 45 % IPA.
( 4 ) Første IPA- tilsetninq
Den hydrolyserte prøve (volum: 1 090 ml, fra trinn 2 ovenfor) ble brakt til 39,3 % IPA ved tilsetning av 706 ml IPA (tilsatt dråpevis med omrøring ved værelsestemperatur). Prøven fikk omrøres i 15-30 minutter og ble så sentrifugert ved 11 000 x g i 30 minutter (Beckman JA-10-sentrifuge, 8 000 rpm, 20°C) og supernatantvæsken dekantert. Avfallspelleten ble triturert med absolutt EtOH i en 250 ml Omnimix-beholder og så samlet opp på en 60 ml sinterglasstrakt. Utfellingen ble vasket direkte på trakten med absolutt EtOH, så aceton og tørket under vakuum over CaCl2ved værelsestemperatur som preparering for analyse.
( 5 ) Andre IPA- tilsetninq og produktutvinninq
Den 39,3 % IPA-supernatantvæske [volum = 1 712 ml, fra trinn 4 ovenfor] ble brakt til 41,8 % IPA ved tilsetning av 73,5 ml IPA dråpevis under omrøring ved værelsestemperatur. Prøven ble lagret og sentrifugert som i trinn 4 ovenfor. Pelleten ble triturert, samlet opp, vasket og tørket som i trinn 4 ovenfor. Pnl4-Ps-produktet veide 1 399 mg.
( 6) Dialyse og lyofiliserinq
En porsjon (1 385,6 mg) av prøven fra trinn 5 ovenfor ble oppløseliggjort i 554 ml destillert H20 ved værelsestemperatur i 2-3 timer. Oppløsningen (2,5 mg/ml) ble overført til dialyserør (12 000 molekylvektgrense, 45 mm) og dialysert mot destillert H20 i 27 timer med 2 ytterligere endringer av destillert H20. Så ble den dialyserte prøve overført til lyofiliseringskolber, skjellnedfryst i et tørt is-metanolbad og lyofilisert på en Virtis (frysemobil) lyofilisator i 2,5 dager inntil den var tørr. Gjenvinningen av Pnl4-Ps-sluttproduktet var 1 326,8 mg, som hadde en Kdpå 0,56.
Eksempel 7
Konjugasjon av yttermembranproteinkompleks med pneumokokk- 14-polysakkarid, Pnl4- Ps- 0MPC
a. Fremstilling av 1. 4- butandiaminderivatet av Pnl4- Ps
( 14- BuA2)
En 410 mg porsjon av Pnl4-Ps etter lagring under vakuum over P205i 3 timer ble samlet opp med 26 ml dimetylsulfoksid (DMS0) og omrørt i 0,75 time for å oppløses. Til dette ble det tilsatt 62 mg karbonyldiimidazol og den resulterende oppløsning ble omrørt ved værelsestemperatur i 80 minutter.
En oppløsning inneholdende 1,067 g 1,4-butandiamindi-hydroklorid (BuA2-2 HC1) i 38,5 ml H20 ble fremstilt og dens pH ble regulert til 10,20 med 2,5 N NaOH. Denne oppløsningen ble filtrert gjennom et Millex 0,2 pm GV-filter og avkjølt i et isbad.
Den lagrede DMSO-oppløsning ble tilsatt til den kalde BuA2-oppløsning og det ble omrørt i ytterligere 10 min i isbadet. Den ble så lagret ved værelsestemperatur i 50 min, . hvoretter oppløsningen ble fylt på to 30,5 cm lengder av Spectrapor 2 dialyserør, klippet av 1 cm fra toppen av væsken og dialysert mot: 1) 15 1 av pH 7,0, 0,1 M natriumfosfatbuffer i 16,5 t; 2) 15 1 av pH 7,0, 0,1 M natriumfosfatbuffer i 8 t;
3) 15 1 av pH 7,0, 0,1 M natriumfosfatbuffer i 8 t; 4) 15 1 H20 i 17,5 t. Den ble så lyofilisert, hvorved man fikk 210 mg av 1,4-butandiaminderivatet av Pnl4-Ps (Pnl4-BuA2). Et NMR-spektrum av en ca. 5 mg prøve viste en "ladning" på omtrent 31 butandiaminrester pr. 100 repeterende enheter av polysakkarid definert ved å sammenligne integralene til butandiaminmetylenene og N-acetylmetyl(av Pnl4-Ps)-resonansene. b. Fremstilling av det bromacetylerte butandiaminderivat av Pnl4- Ps ( Pnl4- BuA2- BrAc) Pnl4-BuA2(210 mg) ble dekket med 36 ml av en 0,1 M, pH 9,0, boratfosfatbuffer og det ble omrørt i 2,5 timer for å bevirke oppløsning. Så ble 195 mg p-nitrofenylbromacetat opp-løst i 4 ml acetonitril, tilsatt. Den resulterende blanding ble omrørt i 21 timer ved 4°C. Den ble så dialysert i Spectrapor 2-rør mot: 1) 15 1 destillert H20 i 6 timer, 2) 15 1 destillert H20 i 14,5 timer og 3) 15 1 H20 i 6 timer. Fra det dialyserte innhold i posen ble 2,0 ml fjernet for analyser og så ble 492 mg tørket, pH 8,0, fosfatbuffersalt (fremstilt ved lyofilisering av en 0,1 M natriumfosfatoppløsning, pH 8,0) tilsatt. Oppløsningen ble filtrert gjennom to 0,2 um Corning-filtere, noe som resulterte i en vandig, pH 8,0, oppløsning av Pnl4-BuA2-BrAc (43 ml).
c. Konjugasjon av OMPC til Pnl4- BuA2- BrAc- Ps
50 ml OMPC (konsentrasjon 3,2 mg/ml) ble fylt i fem 10 ml sentrifugerør og sentrifugert i en Beckman 80 Ti-sentrifuge ved 43 000 rpm (43 K) ved 4°C i 2 timer. En tioleringsblanding ble fremstilt ved å oppløse 350 mg EDTA (etylendiamintetraeddiksyredinatriumsalt) og 64 mg ditiotreitol (DTT) i 30 ml Na2B4Ov-buffer, pH 11,0. 346 mg N-acetylhomocysteintiolakton ble tilsatt og oppløsningen filtrert gjennom et 0,2 um Corning-filter (skåltype).
Hver pellet fra sentrifugeringen ovenfor ble fjernet med 3 ml av den filtrerte tioleringsblanding (15 ml totalt), overført til en Dounce-homogenisator og på nytt oppslemmet. Rørene ble skylt med serieoverføring av ytterligere 5 ml av tioleringsoppløsningen. Skylleprosessen ble gjentatt med ytterligere 5 ml tioleringsoppløsning. De kombinerte skyllevæsker ble homogenisert i Dounce-homogenisatoren og det samlede, på nytt oppslemmede materialet (25 ml) ble overført til en 100 ml rundbunnet kolbe.
Etter lukking med en skillevegg og erstatning av luften med N2under anvendelse av en Firestone-ventil, ble reaksjonsblandingen lagret i 21 timer. Reaksjonsblandingen på 25 ml ble så fordelt mellom tre sentrifugerør som hver ble toppet med 1 M KH2P04(vandig) og så sentrifugert i 2 timer ved 43 K rpm og 4°C. Supernatantvæskene ble fjernet og pelleten på nytt oppslemmet i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 8,0 (det endelige resuspensjonsvolum var i alt på 30 ml).
En andre ultrasentrifugering (2 timer, 4°C, 43 K rpm) ble så utfelt. Etter fjerning av supernatantvæsken ble pelleten på nytt oppslemmet ved hjelp av Dounce-metoden i den filtrerte Pnl4-BuA2-BrAc-oppløsning fremstilt ovenfor. En Ellman-analyse indikerte på dette punkt i alt ca. 23 umol tiol.
Det bør legges merke til at filtreringen av Pnl4-BuA2-BrAc-oppløsningen inntrer like før resuspensjonen av det tiolerte protein. Den resulterende reaksjonsblanding (dvs. Pnl4-BuA2-BrAc med tiolert OMPC) ble lagret under N2(med avgassing) i en N2-boks ved værelsestemperatur i 114 timer.
Reaksjonsblandingen ble så tildekket (dvs. de reaktive restene på Pnl4-Ps og OMPC deaktiveres) som følger: En oppløsning inneholdende 75 mg N-etylmaleimid (NEM) i 5 ml 0,1 M, pH 8,0, natriumfosfatbuffer, ble tilsatt og blandingen lagret i ytterligere 22,5 timer.
Den tildekkede reaksjonsblanding (35 ml) ble fordelt mellom 4 sentrifugerør og sentrifugert (43 K, 2 timer, 4°C). Pellets ble på nytt oppslemmet i 40 ml TED-buffer (0,1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,5 % DOC, pH 8,5) og lagret ved værelsestemperatur i 19 timer. Oppløsningen ble så sentrifugert (43 K,
2 timer, 4°C). Pellets ble på nytt oppslemmet i 40 ml 0,1 M„ pH 8, natriumfosfatbuffer og så på nytt sentrifugert (43 K, 2 timer, 4°C). Disse pellets ble på nytt oppslemmet i 44 ml H20 og lagret ved 4°C i 17 timer. En lavhastighetssentrifugering (1 000 rpm, 3,5 min) ga en liten pellet som ble kastet. Supernatantvæsken ble fjernet, noe som resulterte i 43 ml bulkkohjugat med de følgende analytiske karakteristika:
Eksempel 8
Fremstilling av Pn23F- Ps- mellomproduktet
(1) Sonisk hydrolyse
En 3,0 g porsjon av Pn23F-Ps-pulver ble oppløselig-gjort i 1 200 ml saltoppløsning (0,9 % NaCl) med omrøring ved værelsestemperatur i ca. 4 timer. Oppløsningen ble så sonikert i et plastbegerglass i et isbad med en Branson-sonikator (1,3 cm prøve, innstilling 8) i 3 minutters intervaller opp til 15 minutter totalt. Viskositeten ble sjekket etter hvert intervall. Etter 15 minutter ble en ytterligere 5 minutters sonikering utført, hvorved man fikk et viskositetssluttpunkt på 1,206 centistoke. Den hydrolyserte prøve ble brakt til værelsestemperatur og natriumacetatreagens (58,4 g) ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 3 % (vekt/volum).
(2) Serologisk prøve
En fraksjoneringspilotundersøkelse med isopropanol (IPA) og antistoffrettet sluttpunktnefeloseanalyse utført på en 10 ml porsjon av prøven, viste at Pn23F-Ps ville utfelles mellom 35 og 45 % IPA.
(3 ) Første IPA- tilsetning
Den hydrolyserte prøve (volum: 1 165 ml, fra trinn 1 ovenfor) ble brakt til 41,0 % IPA ved tilsetning av 810 ml IPA (tilsatt dråpevis med omrøring ved værelsestemperatur). Prøven fikk omrøres i 15-30 minutter og ble så sentrifugert ved 11 000 x g i 30 minutter (Beckman JA-10-sentrifuge, 8 000 rpm, 20°C). Avfallspelleten ble triturert med absolutt EtOH i en 250 ml Omnimix-beholder og så samlet opp på en 60 ml sinterglasstrakt. Utfellingen ble vasket direkte på trakten med absolutt EtOH og så med aceton og tørket under vakuum over CaCl2ved værelsestemperatur som preparering for analyse.
(4) Andre IPA- tilsetninq og produktutvinninq
Den 41,0 % IPA-supernatantvæske [volum = 1 925 ml, fra trinn 3 ovenfor] ble brakt til 43,5 % IPA ved tilsetning av 85,0 ml IPA dråpevis under omrøring ved værelsestemperatur. Prøven ble lagret og sentrifugert som i trinn 3 ovenfor. Pelleten ble triturert, samlet opp, vasket og tørket som i trinn 3 ovenfor. Pn23F-Ps-produktet veide 1 795 mg.
(5 ) Dialyse og lyofiliserinq
En porsjon (1 779 mg) av Pn-Ps-prøven fra trinn 4 ovenfor ble oppløseliggjort i 712 ml destillert H20 ved værelsestemperatur i 3-4 timer. Oppløsningen (2,5 mg/ml) ble overført til dialyserør (12 000 molekylvektgrense, 45 mm) og dialysert mot destillert H20 ved 4°C i 27 timer med 2 ytterligere utbyttinger av destillert H20. Så ble prøven overført til lyofiliseringskolber, skjellnedfryst i et bad av tørris og metanol og lyofilisert på en Virtis (frysemobil) lyofilisator i 2-3 dager. Utvinningen av slutt-Ps-produktet var 1 703 mg. Sluttproduktet hadde en Kd= 0,60.
Eksempel 9
Konjugasjon av yttermembranproteinkompleks med Pn23F- Ps-mellomprodukt
a. Fremstilling av Dowex 50 x 2 ( 200- 400 mesh) harpiks på tetrabutylammoniumform TDowex 50 ( Bu^Nl)l
Dowex 50 x 2 (200-400 mesh) H+<->form (72 g) ble oppslemmet i H20 (vannet som ble brukt under disse prosessene, var pyrogenfritt, sterilt, destillert vann), fylt på en kolonne og vasket sekvensvis med 1) 800 ml H20, 2) 400 ml 6 N HC1, 3) 300 ml H20 inntil effluenten er nøytral på pH-papir, 4) 250 g av en 10 % vandig tetrabutylammoniumhydroksid-oppløsning inntil effluenten er sterkt alkalisk på pH-papir, 5) 750 ml H20.
b. Fremstilling av Pn23F- Ps- tetrabutylammoniumform rPn23F( Bu^:)1
En 34 ml kolonne av Dowex 50 x 2 (Bu4N<+>) ble vasket med 70 ml H20. En 450 mg porsjon av størrelsesbestemt Pn23F-Ps ble dekket med 50 ml H20 og det ble omrørt i 0,5 time. Denne oppløsningen ble tilført kolonnen og fikk perkolere gjennom ved hj elp av tyngdekraften (ca. 2 timer). Ved dette punkt ble vakuum påsatt bunnen av kolonnen og eluering (under vakuum) fortsatte i en ytterligere time. Kolonnen ble vasket med 25 ml H20 og de kombinerte effluenter ble lyofilisert, hvorved man fikk 0,5 g av Pn23F(Bu4N<+>)-saltet. Dette ble lagret i en vakuumeksikator over P205i ca. 17 timer.
c. Fremstilling av 1. 4- butandiaminderivatet av Pn23F- Ps ( Pn23F- BuA,)
De 0,5 g av Pn23F(Bu4N<+>) fra trinn b ovenfor ble dekket med 25 ml dimetylsulfoksid (DMS0) og det ble omrørt i 15 minutter for å oppløse. Til dette ble det tilsatt 22 mg karbonyldiimidazol (CDI) og den resulterende oppløsning ble omrørt ved værelsestemperatur i 0,5 time.
En oppløsning inneholdende 507 mg 1,4-butandiamindi-hydroklorid (BuA2-2 HC1) i 32 ml H20 ble fremstilt og dets pH regulert til 10,23 med 2,5 N NaOH. Denne oppløsningen ble filtrert gjennom et Millex 0,2 um GV-filter og avkjølt på et isbad.
Den lagrede DMSO-oppløsning ble tilsatt til den kalde BuA2-oppløsning og det ble omrørt i ytterligere 1 time i isbadet. Det ble så lagret ved værelsestemperatur i 1 time hvoretter oppløsningen ble fylt på 2 x 30,5 cm Spectrapor-dialyse-rør, klippet av 1 cm fra toppen av væsken og dialysert mot 1) 15 1 0,1 M, pH 7,0, natriumfosfatbuffer i 16 timer, 2) 15 1 0,01 M, pH 7,0, natriumfosfatbuffer i 10,5 timer, 3) 15 1 0,01 M, pH 7,0, natriumfosfatbuffer i 12,5 timer, 4) 15 1 H20 i 10,5 timer. Det ble så lyofilisert, hvorved man fikk 220 mg
av 1,4-butandiaminderivatet av Pn23F-Ps (Pn23F-BuA2).
Et NMR-spektrum av ca. 6,9 mg viste en "ladning" på omtrent 23,5 butandiaminrester pr. 100 repeterende enheter av polysakkarid definert ved sammenligning av integralene til butandiaminmetylenene og ramnosemetyl(av Pn23F)-resonansene.
d. Fremstilling av det bromacetvlerte butandiaminderivat av Pn23F- Ps ( Pn23F- BuA,- BrAc)
Pn23F-BuA2(214 mg) ble dekket med 23 ml av en 0,1 M, pH 9,0, borat f osf atbuf fer og det ble omrørt i 30 minutter for å bevirke oppløsning. Så ble 230 mg p-nitrofenylbromacetat i 6 ml acetonitril tilsatt. Den resulterende blanding ble omrørt i 23 timer ved 4°C. Den ble så dialysert i Spectrapor 2-rør mot 1) 15 1 H20 i 8 timer, 2) 15 1 H20 i 12 timer og 3) 15 1 H20 i 6 timer. Fra det dialyserte innhold i posen ble det fjernet 1,5 ml for analyse og så ble 490 mg tørket, pH 8,0, fosfatbuffersalt (fremstilt ved lyofilisering av en 0,1 M natriumfosfatoppløsning, pH 8,0) tilsatt. Oppløsning krever ca. 15 minutter hvoretter det filtreres gjennom et 0,2 um Corning-filter som gir en vandig, pH 8,0, oppløsning av Pn23F-BuA2-BrAc.
e. Konjugasjon av OMPC til Pn23F- BuA2- BrAc- Ps
60 ml OMPC (3,1 mg/ml) ble fylt på seks 10 ml sentri-fugerør og det ble sentrifugert i en Beckman 80 Ti-sentrifuge ved 43 000 rpm (43 K) ved 4°C i 2 timer. En tioleringsblanding ble fremstilt ved å oppløse 260 mg EDTA (etylendiamintetraeddiksyredinatriumsalt ) og 52 mg ditiotreitol (DTT) i 30 ml Na2B407-tiolakton ble tilsatt og oppløsningen filtrert gjennom et 0,2 um Corning-filter (skåltype).
Pelletene fra sentrifugeringen ovenfor ble hver fjernet med 3 ml av den filtrerte tioleringsblanding (20 ml totalt) og overført til en Dounce-homogenisator og på nytt oppslemmet. Rørene ble skylt ved serieoverføring av ytterligere 6 ml av tioleringsoppløsningen. Skylleprosessen ble gjentatt med ytterligere 4 ml tioleringsoppløsning. De kombinerte skyllevæsker ble homogenisert i Dounce-homogenisatoren og det samlede, på nytt oppslemmede materialet
(28 ml) ble overført til en 100 ml rundbunnet kolbe.
Etter lukking med en skillevegg og erstatning av luften med N2under anvendelse av en Firestone-ventil, ble reaksjonsblandingen lagret i 19 timer. Reaksjonsblandingen på 28 ml ble så fordelt mellom tre sentrifugerør som hver ble toppet med 1 M kaliumfosfat (vandig) og så sentrifugert i 2 timer ved 43 K rpm og 4°C i en Beckman 80 Ti-sentrifuge. Supernatantvæskene ble fjernet og pelleten på nytt oppslemmet i 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 8,0 (det endelige resuspensjonsvolum var i alt på 30 ml).
En andre ultrasentrifugering (2 timer, 4°C, 43 K rpm) ble så utført. Etter fjerning av supernatantvæsken ble pelleten på nytt oppslemmet ved hjelp av Dounce-metoden i den filtrerte Pn23F-BuA2-BrAc-oppløsning fremstilt i avsnitt 7.I.C.3d. En Ellman-analyse på dette punkt indikerte i alt ca.
28 pmol tiol i den resulterende oppløsning.
Det bør legges merke til at filtreringen av Pn23F-BuA2-BrAc-oppløsningen inntrer like før resuspensj onen av det tiolerte protein. Den resulterende reaksjonsblanding (dvs. Pn23F-BuA2-BrAc med tiolert OMPC) ble lagret under N2(med avgassing) i en N2-boks ved værelsestemperatur i 117 timer.
Reaksjonsblandingen ble så tildekket (dvs. at de reaktive rester på Pn23F-Ps og OMPC deaktiveres) som følger: En oppløsning inneholdende 75 mg N-etylmaleimid (NEM) i 5 ml 0,1 M, pH 8,0, natriumfosfatbuffer ble filtrert gjennom et 0,22 pm filter, ble tilsatt reaksjonsblandingen og lagret i 18 timer.
Det totale volum av tildekket konjugasjonsblanding var 38,5 ml og 1,5 ml 0,1 M, pH 8,0, natriumfosfatbuffer ble tilsatt for å bringe det totale volum til 40 ml. 35 ml av denne oppløsning ble fylt likt på fire 10 ml sentrifugerør og hvert av disse ble toppet med 0,1 M, pH 8, natriumfosfatbuffer. Disse ble sentrifugert ved 43 K rpm, 2 timer, 4°C. Supernatantvæskene ble fjernet og hver av pelletene ble fjernet med 8 ml TED-buffer (1 M Tris, pH 8,5, 0,01 MEDTA, 0,5 % Na-deoksykolat) og overført til en Dounce-homogenisator. Sentrifugerørene ble serieskylt med ytterligere 8 ml TED-buffer og pelletene på nytt oppslemmet (40 ml totalt) og lagret ved værelsestemperatur i 20 timer. Det lagrede materialet ble sentrifugert (som beskrevet ovenfor) i fire 10 ml rør ved 43 K, 2 timer, 4°C. Hver av pelletene ble fjernet med 8 ml TED-buffer, rørende ble serieskylt med 8 ml TED-buffer, det ble på nytt oppslemmet og sentrifugert som beskrevet ovenfor. Disse pelletene ble så på nytt oppslemmet i totalt 40 ml 0,1 M, pH 7, natriumfosfatbuffer og på nytt sentrifugert som beskrevet ovenfor. Pelletene ble på nytt oppslemmet i totalt 44 ml vann og lagret ved 4°C i 17 timer. En liten mengde uoppløselige stoffer ble fjernet ved hjelp av en lavhastighetssentrifugering (1 000 rpm, 3,5 min), hvorved man fikk produktet i supernatantvæsken.
Den resulterende supernatantvæske er legemiddel-stoffet, bulkkonjugatvaksinen. Konjugatet hadde de følgende analytiske karakteristika:
Eksempel 10
Fremstilling av Pn- Ps ved Gaulin- homogeniserinq
Urent pneumokokkpulver ble oppløseliggjort ved en konsentrasjon på 1,5 mg/ml i vann ved å blande over natten ved 4°C. En mer konsentrert oppløsning av Pn-Ps ble også fremstilt ved 10 mg/ml. Tilsetning av 50 mM CaCl2var vellykket for reduksjon av viskositeten i 10 mg/ml-oppløsningen til viskositeten til 1,5 mg/ml-oppløsningen. Det oppløseliggjorte Prt-Ps ble så sendt gjennom en Gaulin-homogenisator innstilt på én av fire trykkinnstillinger: 2 000, 5 000, 10 000 eller 15 000 PSI. Det skjærkraftbehandlede Pn-Ps ble så samlet opp ved tilsetning av 60 % isopropanol gjort 50 mM i CaCl2fra en
2 M standardoppløsning. Pelleten ble vasket med 100 % etanol i en omni-blander og filtrert for å gjenvinne det utfelte Pn-Ps. Pn-Ps vaskes på filteret med aceton og tørkes så over CaS04(drieritt) og lagres ved -70°C inntil det analyseres. Aliquoter av det skjærkraftbehandlede Pn-Ps oppslemmes på nytt ved ca. 1 mg/ml og analyseres med hensyn på molekylstørrelse og polydispersitet ved HPSEC-universalkalibrering og med hensyn på antigenisitetindeks ved hastighetsnefelometri:
Eksempel 11
Muse- T- cellestimulerinq
Denne testen ble utført for å fastslå T-celle-avhengigheten/immunogenisiteten hos mus for Pn-Ps-konjugatvaksiner. Denne modellen ble benyttet ettersom barn mindre enn to år gamle normalt gir god respons på T-avhengige antigener. Atymiske mus har et abnormalt typisk epitel og deres respons på T-avhengige antigener er derfor betydelig mindre enn hos deres normale søsken fra samme kull.
En enkel fortynning av vaksine til en dose på 0,5 ug polysakkarid ble injisert intraperitonealt hos voksne atymiske mus (nu/nu) og deres kontrollsøsken fra samme kull (nu/+) på dag 0,7 og 28. Det ble tatt blodprøver fra musene én uke senere og deres individuelle sera ble testet med hensyn på antistoffrespons ved hjelp av radioimmunologisk analyse (RIA).
Ved RIA ble hvert museserum kombinert med C<14->merket Pn-Ps. Eventuelt antigenantistoffkompleks dannet ble så utfelt ved tilsetning av mettet ammoniumsulfat. Hver bearbeidet prøve ble telt i en beta-teller i ett minutt. Pn6B-Ps-0MPC-, Pnl4-Ps-OMPC-, Pnl9F-Ps-0MPC-, Pn23F-Ps-0MPC-, Pnl8C-Ps- og Pn4-Ps-konjugatene ifølge oppfinnelsen ble testet på denne måte og funnet å utløse god T-cellestimulering hos Nu/+-musene.
Eksempel 12
Immunogenisitet for Pn- Ps- konjuqater hos unge rhesus- aper
Denne testen ble utført for å fastslå immunogen-isiteten hos unge aper for enten bulkkonjugat eller fylte beholdere av Pn-Ps-OMPC- eller Pn-Ps-MIEP-konjugatvaksine. Modellen med unge aper er blitt påvist å være en utmerket klinisk prediktor for PedvaxHIB-konjugatvaksinen [Vella et al., Pediatrics, 5. april, suppl., s. 668-675 (1990)] og ble derfor valgt som en modell for Pn-Ps-konjugatvaksine-evaluering.
En dose vaksine injiseres intramuskulært (0,25 ml i hvert av to steder) til 2 til 2 måneder gamle aper på dag 0 og 28. Det ble tatt blodprøver fra apene på dagene 0, 28 og 42, og de individuelle sera ble testet med hensyn på antistoffrespons ved hjelp av radioimmunologisk analyse (RIA).
Ved RIA ble hvert apeserum kombinert med C<14->merket Pn-Ps. Eventuelt antigenantistoffkompleks dannet ble så utfelt ved tilsetning av mettet ammoniumsulfat. Hver bearbeidet prøve ble telt i en beta-teller i ett minutt. Immunogenresponsen på vaksinen er tilfredsstillende dersom minst 50 % av testdyrene har minst en 1 ug antistoff respons etter å ha fått to doser av vaksine.
Pn6B-Ps-0MPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-0MPC, Pnl8C-Ps-OMPC, Pn4-Ps-0MPC og Pnl4-Ps-0MPC er blitt påvist å utløse sterke antitypespesifikke antistoffresponser. I tillegg oppviste et fireverdig preparat omfattende Pn6B-Ps-0MPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-0MPC og Pnl4-Ps-0MPC gode anti-Pn-Ps-antistof f responser for alle fire serotypene.
Eksempel 13
Beskyttende effektivitet av pneumokokkoniugater hos chinchilla
Hver chinchilla ble injisert subkutant eller intra.-muskulært med 0, 0,25, 1,0 eller 4,0 ug Pn6B-Ps-0MPC adsorbert til A1(0H)3. Det ble tatt blodprøver av chinchillaene etter 0, 2, 4, 6 og 8 uker. Dyrene ble utfordret med Streptococcus pneumoniae 6B åtte uker etter injeksjon og overvåket hver 1.- 3. dag ved otoskopi og tympanometri. Væskeansamlinger i mellomøret ble aspirert for dyrking og dyrene ble avlivet to uker etter utfordring. De avlivede dyr ble analysert med hensyn på mellomørehistopatologi. Det var 60 % dødelighet hos dyrene som ikke fikk noe konjugat, mens selv den laveste dose resulterte i 0 % dødelighet. Det var ingen beskyttelse mot purulent otitismedia hos dyr som ikke fikk konjugat, mens de som fikk konjugat ble beskyttet på nivåer mellom 60 og 100 % over alle doseområder.
Eksempel 14
Antipneumokokkimmunresponser hos 2- 5 år gamle barn
2-5 år gamle barn som fikk to doser hver av 0,5 eller 5 ug Pn6B-Ps, ble testet med hensyn på produksjon av anti-Pn6B-Ps-antistoffer ved hjelp av RIA og ELISA. Betydelige forhøyelser i anti-Pn6B-Ps-antistoffer ble observert.
Eksempel 15
Hastighetsnefelometri av pneumokokkpolysakkarider
Formålet med denne analyse er å bestemme polysakkaridinnholdet og antigenisitetsindeksen til preparater med fritt Pn-Ps og konjugat under anvendelse av hastighetsnefelometri .
Standardkurvens område for hastighetsnefelometrien atskiller seg for de forskjellige Pn-Ps som responsen pr. enhet Pn-Ps-masse, og den lineære del av responsen versus Pn-Ps-antigenkonsentrasjonsprofilen atskiller seg for hvert Pn-Ps. Fremgangsmåteeksemplet som her er gitt, er spesifikt for Pn6B-konjugat og gjelder ikke nødvendigvis for konjugater av andre Pn-Ps-typer. I tillegg fortynnes alunadsorberte prøver og deres respektive standarder i 3 % natriumcitrat istedenfor 0,9 % NaCl, som beskrevet nedenunder. Vandige konjugatprøver og standarder (dvs. de som ikke er på alun) fortynnes i 0,9 % NaCl og fortynnes igjen til nominelle konsentrasjoner som . forventes å være innenfor grensene til standardkurven.
A) Reagenser
Saltoppløsning: 0,9 % vandig NaCl.
Anti-Pn-Ps-sera: Antisera (Health Research, Inc., Albany,
NY) fortynnes 30 ganger med salt-oppløsning.
Standarder: Fremstill 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 og
4,0 ug/ml Pn-Ps-konjugatstandarder fra en 387 ug/ml utgangsoppløsning, idet konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av
fenolsvovelsyreanalysen for polysakkarid. Testprøver: Fremstill i natriumcitratstandard-oppløsning til en sluttkonsentrasjon på 3 % natriumcitrat og seriefortynninger av
testprøvene til teoretiske konsentrasjoner på 1,0, 2,0 og 3,0 ug Pn-Ps/ml.
B. Fremgangsmåte
Analyser alle prøver og standarder under anvendelse av Beckman ICS-hastighetsnefelometeret under anvendelse av doble målinger. Bestem konsentrasjonen i prøvene fra standardkurven. Multipliser prøvekonsentrasjonen med fortynnings-faktoren og regn ut gjennomsnittet av verdiene for hver testprøve.
Som angitt tidligere avvises prøver som ved hjelp av denne metode ble funnet å ha antigenisitetsindekser under 70 %, for konjugasjon for å sikre at Pn-Ps som anvendes, har de ønskede immunologiske kjennetegn.
Eksempel 16
Kloning av genom- DNA som koder for MIEP
Ca. 0,1 g av de fenolinaktiverte N. meningitidis-celler (se eksempel 1) ble plassert i en nytt rør. De fenolinaktiverte celler ble på nytt oppslemmet i 567 ul TE-buffer (10 mM TRIS-HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0). Til de nyoppslemmede celler ble det tilsatt 30 ul 10 % SDS og 3 ul 20 mg/ml proteinase K (Sigma). Cellene ble blandet og inkubert ved 37°C i 1 time, hvoretter 100 ul 5 M NaCl ble tilsatt og det ble grundig blandet. 80 ul 1 % cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) i 0,7 M NaCl ble så tilsatt, det ble grundig blandet og inkubert ved 65°C i 10 minutter. Et like stort volum (ca. 0,7 til 0,8 ml) kloroform/isoamylalkohol (ved et forhold på 24:1) ble tilsatt, det ble grundig blandet og sentrifugert ved ca.
10 000 x g i ca. 5 minutter. Den vandige (øvre) fase ble over-ført til et nytt rør og den organiske fase ble kastet. Et like stort volum med fenol/kloroform/isoamylalkohol (ved et forhold på 25:24:1) ble tilsatt til vannfasen, det ble grundig blandet og sentrifugert ved 10 000 x g i ca. 5 minutter. Vannfasen
(den øvre) ble overført til et nytt rør og 0,6 volumdeler (ca. 420 ul) isopropylalkohol ble tilsatt, det ble grundig blandet og den utfelte DNA ble sentrifugert ved 10 000 x g i 10 minutter. Supernatantvæsken ble kastet og pelleten ble vasket med 70 % etanol. DNA-pelleten ble tørket og på nytt oppslemmet i 100 pl TE-buffer og utgjør N-meningitidis genom-DNA.
Det ble syntetisert to DNA-oligonukleotider som svarer til 5'-enden i MIEP-genet og til 3'-enden i MIEP-genet [Murakami, E. C. et al. (1989), Infection and Immunity, 57,
s. 2318-23], Sekvensen til DNA-oligonukleotidet som er spesifikt for 5'-enden i MIEP-genet, var: 5'-ACTAGTTGCAATGAAAAAATCCCTG-3', og for 3'-enden i MIEP-genet: 5'-GAATTCAGATTAGGAATTTGTT-3'. Disse DNA-oligonukleotidene ble brukt som primere for polymerasekjedereaksjonsamplifikasjon (PCR-amplifikasjon) av MIEP-genet under anvendelse av 10 nanogram N. meningitidis genom-DNA. PCR-amplifikasjonstrinnet ble utført i henhold til fremgangsmåtene som er angitt av produsenten (Perkin Eimer).
Den amplifiserte MIEP-DNA ble så spaltet med restriksjonsendonukleasene Spel og EcoRI. Det 1,3 kilobase store DNA-fragment som inneholder det komplett kodende området for MIEP, ble isolert ved elektroforese på en 1,5 % agarosegel og utvunnet fra gelen ved elektroeluering [Current Protocols in Molecular Biology (1987), Ausubel, R. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Seidman, J. G. og Struhl, K., red., Greene Publishing Assoc.].
Plasmidvektoren pUC-19 ble spaltet med Spel og EcoRI. Den gelrensede Spel-EcoRI-MIEP-DNA ble ligert i Spel-EcoRI-pUC-19-vektoren og ble brukt til å transformere E. coli-stamme DH5. Transformanter inneholdende pUC-19-vektoren med den 1,3 kbp store MIEP-DNA ble identifisert ved restriksjons- endonukleasekartlegging og MIEP-DNA-en ble sekvensert for å bekrefte dens identitet.
Eksempel 17
Konstruksjon av pCl/ l. GallOp( B) ADHlt- vektoren
Gal-10-promoteren ble isolert fra plasmid YEp52 [Broach, et al., (1983) i Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M(Ed) Academic Press, s. 83-117] ved gelrensing av det 0,5 kilobasepar store fragment erholdt etter spalting med Sau 3A og Hind III. ADHl-terminatoren ble isolert fra vektor pGAP.tADH2 [Kniskern, et al. (1986), Gene, 46, s. 135-141] ved gelrensing av det 0,35 kbp store fragment erholdt ved spalting med Hind III og Spel. De to fragmentene ble ligert med T4-DNA-ligase til den gelrensede pUC18AHind III-vektor (Hind III-setet ble fjernet ved spalting av pUC18 med Hind III, fremstilling av en butt ende med Klenow-fragmentet av E. coli-DNA-polymerase I og ligering med T4-DNA-ligase) som var blitt spaltet med BamHl og SphI for å skape opphavs-vektoren pGallO-tADHl. Denne har et unikt Hind III-kloningssete i GallOp* ADHlt-forbindelsespunktet.
Det unike Hind III-kloningssetet i pGallO- tADHl ble endret til et unikt BamHI-kloningssete ved spalting av pGallO-tADHl med Hind III, gelrensing av den kuttede DNA og ligering under anvendelse av T4-DNA-ligase til den følgende Hind III-BamHI-linker:
5'-AGCTCGGATCCG-3'
3'-GCCTAGGCTCGA-5'.
I det resulterende plasmid, pGallO(B)tADHl, er Hind III-setet fjernet og det er generert et unikt BamHI-kloningssete.
GallOp- tADHl-fragmentet ble isolert fra
pGallO(B)tADHl ved spalting med Smal og SphI, frembringelse av en butt ende med T4-DNA-polymerase og det ble gelrenset. Gjær-skyttelvektoren pCl/1 [Brake et al. (1984), Proe. Nat'l. Acad. Sei., USA, 81, s. 4642-4646] ble spaltet med SphI, det ble
frembragt en butt ende med T4-DNA-polymerase og renset. Dette
fragmentet ble ligert til vektoren med T4-DNA-ligase. Ligeringsreaksjonsblandingen ble så brukt til å transformere E. coIi-HB101-celler til ampicillinresistens og transformantene ble screenet ved hybridisering til en enkel tråd av den<32>p-merkede Hindlll-BamHI-linker. Den nye vektorkonstruksjonen, pCl/1* GallOp(B)ADHlt, ble bekreftet ved spalting med Hindlll og BamHI.
Eksempel 18
Konstruksjon av en qjær- MIEP- ekspresjonsvektor med MIEP + leder- DNA- sekvenser
Et DNA-fragment inneholdende det fullstendige kodende område til MIEP ble frembragt ved spalting av pUC19-MIEP # 7 med Spel og EcoRI, gelrensing av MIEP-DNA-en og frembringelse av en butt ende med T4-DNA-polymerase.
Den interne gjærekspresjonsvektoren
pCl/1-GallOp(B)ADHltble spaltet med Barn HI, defosforylert med alkalisk fosfatase fra kalvetarm og det ble frembragt en butt ende med T4-DNA-polymerase. DNA-en ble gelrenset for å fjerne ukuttet vektor.
Det 1,1 kbp store buttendede fragment av MIEP ble ligert til den buttendede pCl/1-GallOp(B)ADHlt-vektor og ligeringsreaksjonsblandingen ble brukt til å transformere kompetente E. coil DH5-celler til ampicillinresistens. Transformanter ble screenet ved hybridisering til et<32>p-merket DNA-oligonukleotid: 5'... AAGCTCGGATCCTAGTTGCAATG...3', som ble utformet for å være homologt med sekvenser som overlapper MIEP-vektorforbindelsespunktet. Preparater av DNA ble laget fra hybridiseringspositive transformanter og spaltet med Kpnl og Sali for å verifisere at MIEP-fragmentet var i den korrekte orientering for ekspresjon fra GallO-promoteren. Ytterligere bekreftelse av DNA-konstruksjonen ble oppnådd ved hjelp av dideoksysekvensering fra GallO-promoteren og inn i det MIEP-kodende område.
Ekspresjon av MIEP ved hjelp av transformantene ble påvist ved "Western blot"-analyse. Rekombinant MIEP fremstilt i transformantene sammigrerte på polyakrylamidgeler med MIEP renset fra OMPC-vesikler og var immunologisk reaktive med
antistoffer som er spesifikke for MIEP.
Eksempel 19
Konstruksjon av en qjær- MIEP- ekspresjonsvektor med en 5'-modifisert MIEP DNA- sekvens
Et DNA-oligonukleotid som inneholder et Hindlll-sete, en konservert gjær-5<*->ikke-translatert leder (NTL), et metioninstartkodon (ATG), de første 89 kodonene i det fullt ferdige MIEP (som begynner med Asp i stilling +20) og et Kpnl-sete (i stilling +89) ble frembragt ved å bruke polymerase-kjedereaksjonsteknikken (PCR-teknikken). PCR-en ble utført som angitt av produsenten (Perkin Eimer Cetus) under anvendelse av plasmidet pUC19MIEP42#7 som templatet og de følgende DNA-oligomerer som primere: 5' CTAAGCTTAACAAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT3' og 5' ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG3 .
For å fjerne 5'-området i MIEP-klonen, ble plasmid pUC19MIEP42#7 spaltet med Kpnl og Hindlll, og det 3,4 kbp store vektorfragment ble agarosegelrenset. Det 280 bp store PCR-fragment ble spaltet med Kpnl og Hindlll, agarosegelrenset og ligert med det 3,4 kbp store vektorfragment. Transformanter av E. coli HB101 (BRL) ble screenet ved hjelp av DNA-oligo-nukleotidhybridisering og DNA-en fra positive transformanter ble analysert ved restriksjonsenzymspalting. For å forsikre seg om at det ikke var introdusert noen mutasjoner under PCR-trinnet, ble den 280 bp store PCR-genererte DNA fra de positive transformanter sekvensert. Det resulterende plasmid inneholder en Hindlll-EcoRI-innføyelse bestående av en gjær-NTL, et ATG-kodon og hele den åpne leseramme (ORF) fra MIEP som begynner i Asp-kodonet (aminosyre +20).
Gjær-MIEP-ekspresjonsvektorene ble konstruert på følgende måte. pGALlO/pCl/1- og pGAP/pCl/l-vektorene [Vlasuk, G. P., et al., (1989), J. B. C, 264, s. 12, 106-12, 112] ble spaltet med BamHI, gitt jevne ender med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og defosforylert med alkalisk fosfatase fra kalvetarm. Disse lineære vektorene ble ligert med det Klenow-behandlede og gelrensede Hindlll-EcoRI-fragment beskrevet ovenfor som inneholder gjær-NTL, ATG og ORF for MIEP og danner
pGallO/pCl/1-MIEP og pGAP/pCl/l-MIEP.
Saccharomyces cerevisiae-stamme U9 (gall0pgal4-) ble transformert med plasmid pGallO/pCl/l-MIEP. Rekombinante kloner ble isolert og undersøkt med hensyn på ekspresjon av MIEP. Kloner ble dyrket ved 37°C med risting i syntetisk medium (leu-) inneholdende 2 % glukose (vekt/volum) inntil en O.D.660på ca. 6,0. Galaktose ble så tilsatt til 2 % (vekt/volum) for å indusere ekspresjon av MIEP fra GallO-promoteren. Cellene ble dyrket i ytterligere 45 timer etter galaktoseinduksjon inntil en O.D. 600 på ca. 9,0. Cellene ble så innhøstet ved sentrifugering. Cellepelleten ble vasket med destillert vann og nedfryst.
" Western blot" for rekombinant MIEP
For å bestemme hvorvidt gjæren uttrykte MIEP, ble det gjort "Western blot"-analyse. 12 %, 1 mm, 10-15 brønners Novex Laemmli-geler ble brukt. Gjærcellene ble brutt opp i H20 under anvendelse av glasskuler [natriumdodesylsulfat (SDS) kan anvendes ved 2 % under oppbrytningsprosessen]. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering i 1 minutt ved 10 000 x g.
Supernatanten ble blandet med prøvekjøringsbuffer som beskrevet for polyakrylamidgelrensing av MIEP. Prøvene ble kjørt ved 35 mA under anvendelse av OMPC som en referanse-kontroll, inntil bromfenolblåfargemarkøren løper ut av gelen.
Proteiner ble overført på nitrocellulosepapir med 0,45 um porestørrelse under anvendelse av et NOVEX-overføringsapparat. Etter overføring ble nitrocellulosepapiret blokkert med 5 % bovint serumalbumin i fosfatbuffret salt-oppløsning i 1 time, hvoretter 15 ml av en 1:1 000 fortynning av kanin-anti-MIEP-antiserum (frembragt ved immunisering med gelrenset MIEP under anvendelse av standardfremgangsmåter) ble tilsatt. Etter inkubasjon over natten ved værelsestemperatur ble 15 ml av en 1:1 000 alkalisk fosfatasekonjugert geit-anti-kanin-IgG tilsatt. Etter 2 timers inkubasjon ble flekken frem-kalt under anvendelse av "FAST RED TR SALT" (Sigma) og naftol-AS-MX-fosfat (Sigma).
Eksempel 20
Bakterieekspresjon av rekombinant MIEP
Plasmid pUC19-MIEP inneholdende den 1,3 kilobasepar store MIEP-geninnskuddet ble spaltet med restriksjonsendonukleasene Spel og EcoRI. Det 1,1 kbp store fragment ble isolert og renset på en agarosegel under anvendelse av standardteknikker som er kjent innen faget. Plasmid pTACSD inneholdende de to cistron-TAC-promoterne og et unikt EcoRI-sete, ble oppløst med EcoRI. Butte ender ble dannet på både den 1,3 kbp store MIEP-DNA og på pTACSD-vektoren, under anvendelse av T4-DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) i henhold til produsentens retningslinjer. Den buttendede 1,3 kbp store MIEP-DNA ble ligert i den buttendede vektor under anvendelse av T4-DNA-ligase (Boehringer Mannheim) i henhold til produsentens retningslinjer. Den ligerte DNA ble brukt til å transformere E. coli-stamme DH5aIQMAX (BRL) i henhold til produsentens retningslinjer. Transformerte celler ble platet ut på agarplater inneholdende 25 ug kanamycin/ml og 50 ug penicillin/ml, og inkubert i ca. 15 timer ved 37°C. Et DNA-oligonukleotid med en sekvens som er homolog med MIEP, ble merket med<32>p og brukt til å screene nitrocellulosefiltre inneholdende lyserte, denaturerte kolonier fra platene av transformanter under anvendelse av standard-DNA-hybridi-seringsteknikker. Kolonier som ble positive ved hybridisering ble kartlagt under anvendelse av restriksjonsendonukleaser for å bestemme orienteringen til MIEP-genet.
Ekspresjon av MIEP ved hjelp av transformantene ble påvist ved "Western blot"-analyse. Rekombinant MIEP fremstilt i transformantene sammigrerte på polyakrylamidgeler med MIEP renset fra OMPC-vesikler og var immunologisk reaktivt med antistoffer som er spesifikke for MIEP.
Eksempel 21
Konjugasjon av Pn- Ps til N . meninaitidis - MIEP
Kjemiske konjugasjoner utføres i henhold til metoden beskrevet i US-patentskrift nr. 4 882 317.
10 mg MIEP i 3 ml 0,1 M boratbuffer, pH 11,5, blandes med 10 mg etylendiamintetraeddiksyredinatriumsalt (EDTA, Sigma
Chemicals) og 4 mg ditiotreitol (Sigma Chemicals). Protein-oppløsningen gjennombobles grundig med N2. 125 mg N-acetylhomocysteintiolakton (Aldrich Chemicals) tilsettes til MIEP-oppløsningen og blandingen inkuberes ved værelsestemperatur i 16 timer. Den dialyseres så 2 ganger under N2mot 2 1 0,1 M boratbuffer, pH 9,5, inneholdende 4 mM EDTA i 24 timer ved værelsestemperatur. Det tiolerte protein analyseres så med hensyn på tiolinnhold ved hjelp av Ellman's reagens (Sigma Chemicals) og proteinkonsentrasjonen bestemmes ved hjelp av Bradford-reagens (Pierce Chemicals). For konjugasjon av MIEP til Pn-Ps tilsettes et 1,5 ganger overskudd (vekt/vekt) av bromacetylert Pn-Ps til MIEP-oppløsningen og pH reguleres til 9-9,5 med 1 N NaOH. Blandingen får inkubere under N2i 6-8 timer ved værelsestemperatur. Ved slutten av reaksjonstiden tilsettes 25 ul N-acetylcysteamin (Chemical Dynamics) til blandingen og den får stå i 18 timer under N2ved værelsestemperatur. Konjugatoppløsningen surgjøres til mellom pH 3 og 4 med 1 N HC1 og sentrifugering utføres ved 10 000 x g i 10 minutter. 1 ml av supernatantvæsken tilføres direkte på én kolonne av FPLC-Superose 6B (1,6 x 50 cm, Pharmacia) og konjugatet elueres med PBS. Hulromvolumtoppen som inneholder polysakkaridproteinkonjugatet (Pn-Ps-MIEP), slås sammen. Konjugatoppløsningen filtreres så gjennom et 0,22 um filter for sterilisering.
Eksempel 22
Påvisning av immunoqenisitet av Pn- Ps- MIEP- konjugater
Immuniseringer: Balb/c-mus av hannkjønn (Charles River, Wilmington, MA) immuniseres i.p. med Pn-Ps kovalent konjugert til MIEP under anvendelse av 2,5 ug Pn-Ps i 0,5 ml fordannet alun. Kontrollmus immuniseres med ekvivalente mengder Pn-Ps gitt som Pn-Ps-CRM [Anderson, M. E. et al.
(1985), J. Pediatrics, 107, s. 346-351] (2,5 ug Pn-Ps/6,25 ug CRM, 1/4 av humandosen), Pn-Ps-DT (2,5 ug Pn-Ps/1,8 ug DT, - 1/10 av humandosen slik at konstante mengder av Pn-Ps anvendes) og Pn-Ps-OMPC (2,5 ug Pn-Ps/35 ug OMPC, 1/4 av humandosen).
Unge rhesus-aper, 6-13,5 uker gamle, immuniseres med
Pn-Ps-MIEP-konjugater adsorbert på alun. Hver ape får 0,25 ml konjugat på to forskjellige injeksjonssteder med en total dose på 0,5 ml. Apene immuniseres på dag 0, 28 og 56 og det tas blodprøver hver andre til fjerde uke.
Antistoffresponser måles ved hjelp av ELISA som skjelner mellom klassen og underklassen av immunoglobulin-responsen. En RIA som kvantifiserer det totale anti-Pn-Ps-antistof f brukes også til å evaluere aperesponsen.
Pn-Ps-MIEP-konjugater er i stand til å generere en immunrespons hos mus som består av IgG-anti-Pn-Ps-antistoff og en erindringsrespons. Dette er i motsetning til Pn-Ps-CRM og Pn-Ps-DT som ikke utløser målbart anti-Pn-Ps-antistoff. MIEP virker således som et immunologisk bærerprotein for Pn-Ps og er i stand til å fremkalle en anti-Pn-Ps-antistoffrespons når det er kovalent konjugert til Pn-Ps-antigenet. Renset MIEP er derfor et effektivt immunologisk bærerprotein som erstatter det heterogene OMPC ved konstruksjon av bakterielle poly-sakkaridkonj ugatvaksiner.
Eksempel 23
Kvantitativ bestemmelse av C- polvsakkaridinnhold i Pn- Ps-preparater
Det er blitt utviklet systemer for kvantifisering av C-polysakkarid basert på NMR-, enzymatiske eller kromatografiske metoder. I foreliggende tilfelle ble separasjon av kolin (en bestanddel i C-Ps) fra prøver av hydrolysert Pn-Ps brukt og sammenlignet med disse andre metodene. Kolinet ble separert på en kationbytterkolonne koblet med undertrykt ledningsevnepåvisning.
Prøver av Pn-Ps ble fullstendig hydrolysert ved behandling med 36 % fluss-syre i 2 timer ved 45-65°C etterfulgt av 2 M trifluoreddiksyre i 16 timer ved 100°C. Etter hydrolyse ble 200-300 ug av prøven injisert i et Dionex BioLC-kromato-grafisystem med en Omnipac PCX-500-analytisk og overvåknings-kolonne, en Ion Pac CTC-l-kationfellekolonne, en CMMS-2 Micromembrane Suppressor, regenerert med 50 mM tetrabutyl-ammoniumhydroksid (10 ml/min) og ledningsevnedetektoren innstilt på 1 uSiemen følsomhet. Prøven ble eluert isokratisk ved bruk av 5 % 200 mM HC1, 5 % 20 % acetonitril, 85 % MilliQ-vann, 5 % 20 mM diaminopropionsyre. Kolin eluerte som en skarp topp etter omtrent 10 minutter.
Renset C-Ps (erholdt fra Statens Serum Institut) ble analysert med hensyn på kolininnhold under anvendelse av denne metoden og en verdi på 5,4 vekt% kolin ble oppnådd. Denne verdien samsvarer med publiserte rapporter vedrørende kolininnhold i C-PS.
Denne faktoren ble brukt til å beregne C-Ps-konsentrasjonen i forskjellige prøver av Pn-Ps-preparater ved å omdanne nanomolmengdene av kolin erholdt ved hjelp av HPLC til masseverdier. Ved å bruke omdannelsen av 5,4 vekt% kolin ble vektmassen av C-Ps beregnet. Prøver med C-Ps-konsentrasjoner over 3 % ble avvist som uakseptable for konjugasjon. Tabellen nedenunder viser korrelasjonen mellom denne metoden og NMR- og de enzymatiske metodene, og viser typiske C-Ps-forurensningsnivåer i preparater av Pn-Ps med varierende grader av renhet:
Eksempel 24
Fremstilling av delvis hydrolysert, renset Pnl8C- Ps
(1) Sonisk hydrolyse
En 3,0 g porsjon av Pnl8C-Ps-pulver ble oppløselig-gjort i 1 200 ml saltoppløsning (0,9 % NaCl) med omrøring ved værelsestemperatur i ca. 3-4 timer, så tildekket og lagret ved 4°C over natten. Oppløsningen ble så sonikert i et plastbégér-glass i et isbad med en Branson-sonikator (1,3 cm prøve, innstilling 8) i 20 minutters intervaller (med 5 minutters ut-brudd) opp til i alt 40 minutter. Viskositeten ble sjekket etter hvert intervall. Etter 40 minutter ble en annen 10 minutters sonikering utført, hvorved man fikk et viskositetssluttpunkt på 1,218 centistoke. Den hydrolyserte prøve (volum: I 188 ml) ble brakt til værelsestemperatur og natriumacetatreagens (59,2 g) ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på
3 % (vekt/volum).
(2) Seroloqisk prøve
En fraksjoneringsprøve med isopropanol (IPA) og antistoffrettet sluttpunktnefeloseanalyse utført på en 10 ml porsjon av prøven, viste at Pnl8C-Ps ville utfelles mellom 40 og 50 % IPA.
(3) Første IPA- tilsetninq
Den hydrolyserte prøve (volum = 1 200 ml, fra trinn 1 ovenfor) ble brakt til 42,7 % IPA ved tilsetning av 894 ml IPA (tilsatt dråpevis med omrøring ved værelsestemperatur). Prøven fikk omrøres i 15-30 minutter og ble så sentrifugert ved
II 000 x g i 30 minutter (Beckman JA-10-sentrifuge, 8 000 rpm, 20°C). Avfallspelleten ble triturert med absolutt EtOH i en 250 ml Omnimix-beholder og så samlet opp på en 60 ml sinterglasstrakt. Utfellingen ble vasket direkte på trakten med absolutt EtOH, så med aceton og tørket under vakuum over CaS04(drieritt) ved værelsestemperatur som preparering for analyse.
( 4) Andre IPA- tilsetninq og mellomproduktutvinninq
Den 42,7 % IPA-supernatantvæske [volum = 2 016 ml, fra trinn 3 ovenfor] ble brakt til 45,2 % IPA ved tilsetning av 92,0 ml IPA dråpevis under omrøring ved værelsestemperatur. Prøven ble lagret og sentrifugert som i trinn 3 ovenfor. Pelleten ble triturert, samlet opp, vasket og tørket som i trinn 3 ovenfor. Pnl8C-Ps-mellomproduktet veide 1 609 mg.
( 5) Dialyse og lyofilisering
En porsjon (1 612,5 mg) av prøve fra trinn 4 ovenfor ble oppløseliggjort i 645 ml destillert H20 ved værelsestemperatur i ca. 2 timer. Oppløsningen (2,5 mg/ml) ble over-ført til dialyserør (12 000 molekylvektgrense, 45 mm) og dialysert mot destillert H20 ved 4°C i 30 timer med 2 ytter ligere utbyttinger av destillert H20. Så ble prøven overført til lyofiliseringskolber, skjellnedfryst i et bad av tørris og metanol og lyofilisert på en Virtis (frysemobil) lyofilisator i 2-3 dager. Gjenvinningen av Ps-sluttproduktet var 1 487 mg.
Eksempel 25
S . Pneumoniae 18C- 0MPC- konjuqat. Pnl8C- Ps- 0MPC
A. Fremstilling av Dowex 50 x 2 ( 200- 400 mesh) harpiks i tetrabutylammoniumform f Dowex 50 ( Bu^NDl
Dowex 50 x 2 (200-400 mesh) H+<->form (500 g) ble oppslemmet i H20, fylt på en kolonne og vasket sekvensvis med 1) 600 ml H20 , 2) 1 000 ml 6 N HC1, 3) 400 ml H20 inntil effluent var nøytral på pH-papir, 4) 72 g av en 10 % vandig tetrabutyl-ammoniumhydroksidoppløsning inntil effluent var sterkt alkalisk på pH-papir, 5) 1 000 ml H20 til nøytralitet.
B. Fremstilling av S . Pneumoniaetvve 18C- polysakkarid-tetrabutylammoniumform r Pnl 8C ( Bu4Nl) 1
En 60 ml kolonne av Dowex 50 x 2 (Bu4N<+>) ble vasket med 250 ml H20. Pnl8C-polysakkarid (molekylvektredusert)
(650 mg) ble tildekket med 65 ml H20 og omrørt i 1 time, hvoretter alt syntes å være i oppløsning. Denne oppløsningen ble tilført kolonnen og fikk perkolere gjennom ved hjelp av tyngdekraften (i 2 timer, så i 1 time under vakuum). Kolonnen ble vasket med 150 ml H20 og de kombinerte effluenter ble lyofilisert, hvorved man fikk 655 mg av 18C(Bu4N<+>)-saltet.
25 mg ble fjernet for nmr-analyse av beholdt materiale.
C. Fremstilling av 1, 4- butandiaminderivåtet av 18C ( 18C- BuAt )
18C (Bu4N<+>) (630 mg) ble tildekket med 143 ml DMSO (dimetylsulfoksid) og omrørt i 3,25 timer. På dette tidspunkt var alt av det faste stoff oppløst og 1 ml ble fjernet for Karl Fischer-titrering med hensyn på vanninnhold. En verdi på 28,2 umol H20/ml ble funnet (4 mmol totalt). Til denne opp-løsning ble det tilsatt' 165,1 mg karbonyldiimidazol (CDI) og den resulterende oppløsning ble omrørt ved værelsestemperatur i 2,0 timer. En oppløsning inneholdende 1,260 g 1,4-butan-
diamindi-hydroklorid (BuA2-2 HC1) i 40 ml H20 ble fremstilt og dens pH ble regulert til 10,20 med 2,5 N NaOH. Denne opp-løsningen ble avkjølt i et isbad. Den lagrede DMSO-oppløsning ble sakte tilsatt til den kalde BuA2-oppløsning og omrørt i ytterligere 10 minutter i isbadet. Den ble så omrørt ved værelsestemperatur i 50 minutter, hvoretter oppløsningen ble fylt på SPECTRAPOR 2-dialyserør, klippet av 1,3 cm fra toppen av væsken og dialysert på følgende måte mot: 1) 15 1 av,
pH 7,0, 0,1 M NaP04-buffer i 13,0 timer, 2) 15 1 av, pH 7,0, 0,01 M NaP04-buffer i 11 timer, 3) 15 1 av, pH 7,0, 0,01 M NaP04-buffer i 10,8 timer, 4) 15 1 av H20 i 9,5 timer. Volumet på dette punktet var 190 ml. En 7,5 ml aliquot ble fjernet og lyofilisert separat for nmr-analyse. De gjenværende 182,5 ml ble lyofilisert til 416 mg av 1,4-butandiaminderivatet av 18C (Pnl8C-BuA2). Et NMR-spektrum av ca. 5 mg viste en "ladning" på 10 butandiaminrester pr. 100 repeterende monomerenheter av polysakkarid definert ved sammenligning av integralene for resonansene til de interne butandiaminmetylengruppene og ramnosemetylgruppene (av 18C).
D. Fremstilling av det bromacetylerte butandiaminderivat av 18C ( Pnl8C- BuA7- BrAc)
18C-BuA2(416 mg) ble tildekket med 36 ml av en
0,1 M, pH 9,04, buffer (Kolthoff boratfosfat) og omrørt for å bevirke oppløsning. Så ble 256 mg p-nitrofenylbromacetat i 4,48 ml acetonitril tilsatt. Den resulterende blanding ble omrørt i 20 timer ved 4°C. Den ble så dialysert i SPECTRAPOR 2-rør på følgende måte: 1) mot 15 1 H20 i 6 timer, 2) mot 15 1 H20 i 6 timer, 3) mot 15 1 H20 i 6 timer. På dette punkt var det et volum på 60 ml hvorfra det ble fjernet 1,7 ml for analyser (NMR, Ouchterlony og Viscotek) og så ble 2,42 g tørket, pH 8, fosfatbuffersalt (fremstilt ved lyofilisering av en 0,1 M, pH 8, NaP04-oppløsning) tilsatt. Etter oppløsning ble det filtrert gjennom et 0,2 um CORNING-filter som ga en, vandig oppløsning ved pH 8 av 18C-BuA2-BrAc. Filtreringen skjedde sakte og krevde 4 skålfiltere.
E. Konjugasjon av OMPC ( N . meningitidis ) til Pnl8C- BuA?-
BrAc
Yttérmembranproteinkompleks ( N. meningitidis, OMPC 3,2 mg/ml), 80 ml, ble fylt på fire 25 ml sentrifugerør og sentrifugert i en 60 Ti-sentrifuge ved 43 000 rpm (43 K) ved 4°C i 2 timer. En tioleringsblanding ble fremstilt ved å oppløse 680 mg EDTA (etylendiamintetraeddiksyredinatriumsalt) og 120 mg ditiotreitol (DTT) i 40 ml av en Na2B407-buf f er med pH 11,09. 320 mg N-acetylhomocysteintiolakton ble tilsatt og så ble oppløsningen filtrert gjennom et 0,2 pm Corning-filter (skåltype). Pelletene fra sentrifugeringen ovenfor ble fjernet med 5 ml av den filtrerte tioleringsblanding (20 ml totalt) og overført til en DOUNCE-homogeni sa tor og på nytt oppslemmet. Rørene ble skylt ved serieoverføring av ytterligere 2/10 ml av tioleringsoppløsningen. Kombinasjonsoppløsningene ble homogenisert i DOUNCE-homogenisatoren og det samlede, på nytt oppslemmede materialet (40 ml) ble overført til en 100 ml rundbunnet kolbe. Glasstøyet ble skylt med ytterligere 20 ml av tioleringsoppløsningen og tilsatt til reaksjonskolben. Etter lukking av kolben med en skillevegg og erstatning av luften med N2under anvendelse av en FIRESTONE-ventil, ble reaksjonsblandingen lagret i 18,5 timer. De 60 ml ble så fordelt mellom fire sentrifugerør som hver ble toppet med 1 M KH2P04(vandig) og så sentrifugert i 2 timer ved 43 K og 4°C. Supernatantene ble fjernet og pelletene på nytt oppslemmet i 0,1 M NaP04-buffer ved pH 8 (i alt 40 ml var resuspensjons-sluttvolumet).Denne oppløsning ble overført likt til to 25 ml sentrifugerør (polykarbonat) og glasstøyet (DOUNCE etc.) ble skylt med ca. 10 ml fosfatbuffer ved pH 8 og brukt til å toppe sentrifugerørene. En andre ultrasentrifugering (2 timer, 4°C, 43 K) ble så utført. Pelletene ble på nytt oppslemmet i 30 ml 0,1 M P04-buffer ved pH 8. En Ellman-analyse indikerte i alt 24 umol SH eller ca. 100 nanomol/mg OMPC. Det tiolerte protein ble overført til en 100 ml rundbunnet kolbe og den filtrerte 18C-BuA2-BrAc-oppløsning ble tilsatt til det. Den resulterende reaksjonsblandingen (dvs. 18C-BuA2-BrAc med tiolert OMPC) ble lagret under N2(med avgassing) i N2-boksen ved værelsestemperatur i 89 timer.
Reaksjonsblandingen ble så tildekket på følgende måte: En oppløsning inneholdende 75 mg N-etylmaleimid (NEM) i 5 ml 0,1 M NaP04-buffer ved pH 8, ble filtrert gjennom et 0,22 um filter og 2 ml ble tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor og det ble lagret i 4 timer.
Så ble 0,5 ml N-acetylcysteamin i 2,5 ml 0,1 M, pH 8, P04-buffer filtrert gjennom et 0,22 um filter og 1,0 ml av denne løsningen ble tilsatt til reaksjonsblandingen og den ble lagret i 22,5 timer.
Det tildekkede produkt ble så fylt likt på fire 25 ml sentrifugerør og toppet med i alt 8 ml, pH 8, 0,1 M P04-buffer og sentrifugert ved 43 K, 2 timer, 4°C. Etter fjerning av supernatantene ble pelletene på nytt oppslemmet i en DOUNCE-homogenisator med i alt 40 ml TED-buffer, glasstøyet ble skylt med ytterligere 10 ml TED-buffer og oppløsningen overført til to 25 ml tør. Disse rørene ble lagret ved værelsestemperatur i 15,25 timer og så sentrifugert i 2 timer ved 43 K rpm og ved 24°C. De resulterende pellets ble på nytt oppslemmet i en DOUNCE-homogenisator med i alt 30 ml TED-buffer, overført til to 25 ml sentrifugerør, glasstøyet skylt med ytterligere 20 ml TED-buffer og det ble på nytt sentrifugert ved 43 K, 4°C i 2 timer. Pelletene ble på nytt oppslemmet i 50 ml, pH 7, f osf atbuf f er og underkastet en tredje sentrifugering ved 43 K i 2 timer ved 4°C. Pelletene ble på nytt oppslemmet i 82 ml vann og overført i 20,5 ml porsjoner til to 50 ml sterile (FALCON) plastsentrifugerør. Etter lagring ved 4°C i 18 timer ble konjugatpreparatet sentrifugert ved 1 000 RPM i 3,5 minutter med en TH-rotor i en TJ-6-sentrifuge. Sluttproduktkonjugat-suspensjonen ble analysert med hensyn på protein (Lowry), 18C-polysakkarid (fenol/svovelsyre), ukonjugert polysakkarid
( størrelsesutelukkelseskromatograf i - hastighetsnef elometri )
og aminosyrer (SPINCO):
Polysakkarid = 339 ug/ml,
Protein = 2,57 mg/ml,
Fritt polysakkarid: < 5 % (grense for forsøksfeil)TS-karboksymetylhomocystein/lysin = 0,025, S-karboksymetylcysteamin/lysin = 0,005.
Eksempel 26
Fremstilling av Pn4- Ps- mellomproduktet
(1) Sonisk hydrolyse
En 1,0 g porsjon av Pn4-Ps-pulver ble oppløseliggjort i 400 ml saltoppløsning (0,9 % NaCl) med omrøring ved værelsestemperatur i ca. 4 timer. Oppløsningen ble så sonikert i et plastbegerglass i et isbad med en Branson-sonikator (1,3 cm prøve, innstilling 8) i intervaller på 10 minutter opp til 20 minutter totalt. Viskositeten ble sjekket etter hvert intervall. Etter 20 minutter ble det oppnådd et viskositetssluttpunkt på 1,267 centistoke. Den hydrolyserte prøve ble brakt til værelsestemperatur og natriumacetatreagens (18,7 g) ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 3 % (vekt/volum).
(2 ) Serologlsk prøve
En fraksjoneringspilotundersøkelse med isopropanol (IPA) og antistoffrettet sluttpunktnefeloseanalyse utført på en 10 ml porsjon av prøven, viste at Pn4-Ps ville utfelles mellom 45 og 55 % IPA.
(3 ) Første IPA- tilsetning
Den hydrolyserte prøve (volum = 385 ml, fra trinn 1 ovenfor) ble brakt til 49,7 % IPA ved tilsetning av 379 ml IPA (tilsatt dråpevis med omrøring ved værelsestemperatur). Prøven fikk omrøres i 15-30 minutter og ble så sentrifugert ved 11 000 x g i 30 minutter (Beckman JA-10-sentrifuge, 8 000 rpm, 20°C). Avfallspelleten ble triturert med absolutt EtOH i en 250 ml Omnimix-beholder og så samlet opp på en 60 ml sinterglasstrakt. Utfellingen ble vasket direkte på trakten med absolutt EtOH og så med aceton og tørket under vakuum over CaCl2ved værelsestemperatur som preparering for analyse.
(4) Andre IPA- tilsetning og produktutvinning
Den 49,7 % IPA-supernatantvæske [volum = 727 ml, fra trinn 3 ovenfor] ble brakt til 52,2 % IPA ved tilsetning av, 38 ml IPA dråpevis under omrøring ved værelsestemperatur. Prøven ble lagret og sentrifugert som i trinn 3 ovenfor. Pelleten ble triturert, samlet opp, vasket og tørket som i trinn 3 ovenfor. Pn4-Ps-produktet veide 516 mg.
( 5) Dialyse og lyofiliserinq
En porsjon (500 mg) av Pn-Ps-prøven fra trinn 4 ovenfor ble oppløseliggjort i 200 ml destillert H20 ved værelsestemperatur i 2-3 timer. Oppløsningen (2,5 mg/ml) ble overført til dialyserør (12 000 molekylvektgrense, 45 mm) og dialysert mot destillert H20 ved 4°C i 27 timer med 2 ytterligere utbyttinger av destillert H20. Så ble prøven overført til lyofiliseringskolber, skjellnedfryst i et bad av tørris og metanol og lyofilisert på en Virtis (frysemobil) lyofilisator i 2-3 dager. Gjenvinningen av det endelige Ps-produktet var 491 mg. Sluttproduktet hadde en Kd= 0,69.
Fra denne beskrivelse bør det være åpenbart for fagfolk innen teknikken at andre karboksylholdige Pn-Ps-undertyper, slik som Pnl-Ps eller Pn5-Ps, vil kunne fremstilles i henhold til fremgangsmåten som her er beskrevet, og konjugeres som for Pn4-Ps eller Pn9V-Ps som også er sure polysakkarider.
Eksempel 27
S. Pneumoniaetype 4- OMPC- konjugat, Pn4- Ps- 0MPC
A. Fremstilling av Dowex 50 x 2 ( 200- 400 mesh) harpiks i tetrabut<y>lammoniumform T Dowex 50 ( Bu^N*)!
Dowex 50 x 2 (200-400 mesh) rT-form (500 g) ble oppslemmet i H20 (CM-66), fylt på en kolonne og vasket sekvensvis med: 1) 600 ml H20, 2) 1 000 ml 6 N HC1, 3) 400 ml H20 inntil effluent var nøytral på pH-papir, 4) 72 g av en 10 % vandig tetrabutylammoniumhydroksidoppløsning inntil effluent var sterkt alkalisk på pH-papir, 5) 1 000 ml H20 inntil nøytralitet.
B. Fremstilling av S. Pneumoniae- polysakkarid av type 4
i tetrabutylammoniumform \ Pn4( Bu4Nl) 1
En 65 ml kolonne av Dowex 50 x 2 (Bu4N<+>) ble vasket med 520 ml H20. Pn4-polysakkarid (molekylvektredusert)
(400 mg) ble tildekket med 35 ml H20 og omrørt i 20 minutter,, hvoretter alt syntes å være i oppløsning (omrøring ble fortsatt over natten). Denne oppløsningen ble tilført kolonnen og fikk perkolere gjennom ved hjelp av tyngdekraften og kolonnen ble vasket med 150 ml H20 og de kombinerte effluenter
ble lyofilisert, hvorved man fikk 504 mg av Pn4(Bu4N<+>)-saltet.
C. Fremstilling av 1, 4- butandiaminderivatet av Pn4( Pn4-BuA7)
Pn4(Bu4N<+>) (97 mg) ble dekket med 16 ml DMSO (dimetylsulfoksid) og rørt inn i oppløsningen ved 52°C i løpet av et tidsrom på 15 minutter. På dette tidspunktet var alt fast stoff oppløst og oppløsningen ble avkjølt til værelsestemperatur .
Til denne oppløsningen ble det tilsatt 2 mg karbonyldiimidazol (CDI) oppløst i 160 ul DMSO, og den resulterende oppløsning ble omrørt ved værelsestemperatur i 1,0 timer. En oppløsning inneholdende 0,500 g 1,4-butandiamindi-hydroklorid (BuA2*2 HC1) i 5 ml H20 ble fremstilt og dens pH ble regulert til 10,20 med 5,0 N NaOH. Denne oppløsningen ble avkjølt i et isbad. Den lagrede DMSO-oppløsning ble sakte tilsatt til den kalde BuA2-oppløsning og omrørt i ytterligere 5 minutter i isbadet. Den ble så omrørt ved værelsestemperatur i 1 time, hvoretter oppløsningen ble fylt på SPECTRAPOR 2-dialyserør, klippet av 1,3 cm fra toppen av væsken og dialysert som følger mot: 1) 4 1 av pH 7,0, 0,1 M NaP04-buffer i 15,0 timer, 2) 4 1 av pH 7,0, 0,01 M NaP04-buffer i 9 timer, 3) 4 1 av pH 7,0, 0,01 M NaP04-buffer i 21 timer, 4)4 1 H20 i 20 timer. Opp-løsningen ble lyofilisert til 70 mg av 1,4-butandiaminderivatet av Pn4 (Pn4-BuA2). Et NMR-spektrum av ca. 5 mg viste en "ladning" på 22 butandiaminrester pr. 100 repeterende monomerenheter av polysakkarid definert ved sammenligning av integralene for resonansene til de interne butandiaminmetylengruppene og N-acetylmetylgruppene (av Pn4).
D. Fremstilling av det bromacetylerte butandiaminderivat av Pn4( Pn4- BuA2- BrAc)
Pn4-BuA2(54 mg) ble dekket med 5,5 ml av en 0,1 M, pH 9,04, buffer (Kolthoff boratfosfat) og omrørt for å bevirke oppløsning. Så ble 55 mg p-nitrofenylbromacetat i 1,0 ml acetonitril tilsatt. Den resulterende blanding ble omrørt i 17 timer ved 4°C. Den ble så dialysert i SPECTRAPOR 2-rør på følgende måte: 1) mot 16 1 H20 i 24 timer, 2) mot 16 1 H20 i 8 timer, 3) mot 16 1 H20 i 23 timer. På dette tidspunkt var det et volum på 12,5 ml hvorfra det ble fjernet 1,0 ml for analyser (NMR, Ouchterlony og Viscotek) og så ble 275 mg tørket, pH 8, fosfatbuffersalt (fremstilt ved lyofilisering av en 0,1 M, pH 8, NaP04-oppløsning) tilsatt. Etter oppløsning ble det filtrert gjennom et 0,2 um CORNING-filter, hvorved man fikk en vandig oppløsning av Pn4-BuA2-BrAc med pH 8.
E. Konjugasjon av OMPC ( N . meningitidis ) til Pn4- BuA2-BrAc
Yttermembranproteinkompleks ( N. meningitidis, OMPC 4,34 mg/ml) (5 ml) ble sentrifugert i en 80 Ti-sentrifuge ved 43 000 rpm (43 K) ved 4°C i 2 timer. En tioleringsblanding ble fremstilt ved å oppløse 85 mg EDTA (etylendiamintetraeddiksyredinatriumsalt) og 15 mg ditiotreitol (DTT) i 10 ml av en Na2B407-buffer med pH 11,09. 50 mg N-acetylhomocysteintiolakton ble tilsatt og så ble oppløsningen filtrert gjennom et 0,2 pm filter. Pelletene fra sentrifugeringen ovenfor ble fjernet med 5 ml av den filtrerte tioleringsblanding og over-ført til en DOUNCE-homogenisator og på nytt oppslemmet. Den på nytt oppslemmede oppløsning ble overført til et sentrifugerør, dekket med en skillevegg og luften erstattet med N2under anvendelse av en FIRESTONE-ventil. Reaksjonsblandingen ble lagret i 19 timer og så overført til et sentrifugerør som ble toppet med 1 M KH2P04(vandig) og så ble det sentrifugert i 2 timer ved 43 K og 4°C. Supernatantene ble fjernet og pelletene på nytt oppslemmet i 10 ml 0,1 M NaP04-buffer, pH 8. Denne oppløsningen ble overført til et sentrifugerør og en andre ultrasentrifugering (2 timer, 4°C, 43 K) ble så utført. Pelletene ble på nytt oppslemmet i 11,5 ml Pn4-BuA2-BrAc-oppløsning fremstilt i avsnitt D. En Ellman-analyse indikerte i alt 3,44 umol SH eller ca. 158 nanomol SH/mg OMPC. Den resulterende reaksjonsblandingen (dvs. Pn4-BuA2-BrAc med tiolert OMPC) ble lagret under N2(med avgassing) i N2-boksen ved værelsestemperatur i 66 timer.
Reaksjonsblandingen ble så tildekket på følgende måte: En oppløsning inneholdende 5 mg N-etylmaleimid (NEM) i 1 ml 0,1 M NaP04-buffer ved pH 8, ble filtrert gjennom et 0,22 um filter og tilsatt til reaksjonsblandingen ovenfor og oppløsningen ble lagret i 5 timer. Så ble 0,1 ml N-acetylcysteamin i 0,4 ml 0,1 M, pH 8, P04-buffer filtrert gjennom et 0,22 um filter og denne løsningen ble tilsatt til reaksjonsblandingen og den ble lagret i 14,5 timer.
Reaksjonsblandingen ble så sentrifugert ved 43 K, 4°C i 2 timer og pelleten på nytt oppslemmet i 8 ml 1 x TED-buffer. Denne oppløsningen ble lagret ved værelsestemperatur over natten og så sentrifugert ved 43 K, 4°C i 2 timer. Pelleten ble på nytt oppslemmet i 8 ml TED-buffer og umiddelbart på nytt sentrifugert i 2 timer ved 43 K og 4°C. Pelleten ble så på nytt oppslemmet i 10 ml pH 7,0, 0,1 M P04-buffer og det ble på nytt sentrifugert ved 43 K, 4°C i 2 timer. Denne sluttpellet ble på nytt oppslemmet i 7,5 ml H20. Etter lagring over natten ved 4°C ble suspensjonen sentrifugert ved 1 000 rpm i 3 minutter og supernatanten ble fjernet som slutt-konj ugatet.
Analyse: Lowry-protein: 0,920 mg/ml,
Fenolsvovelsyreanalyse: 0,212 mg/ml Ps/Pro =0,23
SCMHC/lys = 0,031
SCMC/lys = 0,022
Etter administrering av dette konjugatet til mus eller afrikanske grønnaper, ble det frembragt høye titere av anti-Pn4-Ps-antistoffer målt ved hjelp av Pn4-Ps-spesifikk ELISA-analyse.
Eksempel 28
Fremstilling av Pn9V- Ps- mellomproduktet
(1) Sonisk hydrolyse
En 1,0 g porsjon av Pn9V-Ps-pulver ble oppløselig-gjort i 400 ml saltoppløsning (0,9 % NaCl) med omrøring ved værelsestemperatur i ca. 4 timer. Oppløsningen ble så sonikert i et plastbegerglass i et isbad med en Branson-sonikator (1,3 cm prøve, innstilling 8) i et intervall på 3 minutter. Viskositeten ble sjekket etter dette intervallet. Etter 13 minutter ble en ytterligere 1 minutters sonikering utført, hvorved man fikk et viskositetssluttpunkt på 1,117 centistoke. Den hydrolyserte prøve ble brakt til værelsestemperatur og natriumacetatreagens (19,5 g) ble tilsatt inntil en sluttkonsentrasjon på 3 % (vekt/volum).
(2 ) Seroloqisk prøve
En fraksjoneringspilotundersøkelse med isopropanol (IPA) og antistoffrettet sluttpunktnefeloseanalyse utført på en 10 ml del av prøven, viste at Pn9V-Ps ville utfelles mellom 40 og 45 % IPA.
(3) Første IPA- tilsetning
Den hydrolyserte prøve (volum=391 ml, fra trinn 1 ovenfor) ble brakt til 41,8 % IPA ved tilsetning av 281 ml IPA (tilsatt dråpevis med omrøring ved værelsestemperatur). Prøven fikk omrøres i 15-30 minutter og ble så sentrifugert ved 11 000 x g i 30 minutter (Beckman JA-10-sentrifuge, 8 000 rpm, 20°C). Avfallspeletten ble triturert med absolutt EtOH i en 250 ml Omnimix-beholder og så samlet opp på en 60 ml sinterglasstrakt. Utfellingen ble vasket direkte på trakten med absolutt EtOH, så med aceton og tørket under vakuum over CaCl2ved værelsestemperatur som preparering for analyse.
(4 ) Andre IPA- tilsetning og produktgjenvinning
Den 41,8 % IPA-supernatantvæske [volum=637 ml, fra trinn 3 ovenfor] ble brakt til 44,3 % IPA ved tilsetning av 28,6 ml IPA dråpevis under omrøring ved værelsestemperatur. Prøven ble lagret og sentrifugert som i trinn 3 ovenfor. Pelleten ble triturert, samlet opp, vasket og tørket som i trinn 3 ovenfor. Pn9V-Ps-produktet veide 342,2 mg.
( 5) Dialyse og lyofilisering
En porsjon (347 mg) av Pn-Ps-prøven fra trinn 4 ovenfor ble oppløseliggjort i 139 ml destillert H20 ved værelsestemperatur i 4-5 timer. Oppløsningen (2,5 mg/ml) ble overført til dialyserør (12 000 molekylvektgrense, 45 mm) og dialysert mot destillert H20 ved 4°C i 25 timer med 2 ytterligere utbyttinger av destillert H20. Så ble prøven overført til lyofiliseringskolber, skjellnedfryst i et bad av tørris og metanol og lyofilisert på en Virtis (frysemobil) lyofilisator i 2-3 dager. Gjenvinningen av det endelige Ps-produkt var 303,5 mg. Sluttproduktet hadde en Kd= 0,60.
( 6 ) Tredje IPA- tilsetning og produktajenvinninq
Den 44,3 % IPA-supernatantvæske [volum = 655 ml, fra trinn 4 ovenfor] ble brakt til 46,8 % IPA ved tilsetning av 30,8 ml IPA dråpevis under omrøring ved værelsestemperatur. Prøven ble lagret og sentrifugert som i trinn 3 ovenfor. Pelleten ble triturert, samlet opp, vasket og tørket som i trinn 3 ovenfor. Pn9V-Ps-produktet veide 410,8 mg.
(7) Dialyse og lyofilisering
En porsjon (420,4 mg) av Pn-Ps-prøven fra trinn 6 ovenfor ble oppløseliggjort i 168 ml destillert H20 ved værelsestemperatur i 4-5 timer. Oppløsningen (2,5 mg/ml) ble overført til dialyserør (12 000 molekylvektgrense, 45 mm) og dialysert mot destillert H20 ved 4°C i 25 timer med 2 ytterligere utbyttinger av destillert H20. Så ble prøven overført til lyofiliseringskolber, skjellnedfryst i et bad av tørris og metanol og lyofilisert på en Virtis (frysemobil) lyofilisator i 2-3 dager. Gjenvinningen av det endelige Ps-produkt var 342,5 mg. Sluttproduktet hadde en Kd= 0,65. (8) Det er åpenbart for fagfolk innen teknikken at produktene i trinnene 4 og 6 ville kunne ha blitt samlet opp sammen med en større tilsetning av IPA, så dialysert og lyofilisert som et enkeltprodukt med analytisk karakteristika til det veide gjennomsnitt av karakteristikaene til de individuelle underfraksjoner. Det burde også være åpenbart for fagfolk innen teknikken at Pnl-Ps eller Pn5-Ps ville kunne behandles på samme måte som Pn9V-Ps eller Pn4-Ps som her er beskrevet.
Eksempel 29
Konjugasjon av Pn9V- Ps med OMPC
Pn9V-Ps fremstilt i henhold til eksempel 28, konjugeres på samme måte som Pn4-Ps som vist i eksempel 27.
Eksempel 30
Kvantitativ bestemmelse av acetat i Pn9V/ 18C- Ps og pyruvat i Pn4- Ps
En fremgangsmåte ble utviklet for å kvantifisere retensjonen av 0-pyruvat i Pn4-Ps og O-acetatgrupper i Pn9V-Ps og Pnl8C-Ps under bearbeiding av pneumokokk(Pn)-kapselpoly-sakkarider (Ps). 0-acetyl- eller O-pyruvatgruppene frigjøres først ved hydrolyse, så identifiseres acetatet og pyruvatet i PnPs-hydrolysåtet og kvantifiseres under anvendelse av anionbyttekromatografi med høy yteevne koblet med undertrykt ledningsevne.
Prøver av ubearbeidet og bearbeidet Pn4, Pn9V og Pnl8C ble analysert ved hjelp av denne metoden. De foreløpige resultatene viste et omtrentlig molart forhold på 1:1 og 0,8:1 mellom pyruvat og hver Ps-repeterende enhet for hhv. ubearbeidet og størrelsessortert Pn4. De molare forhold mellom acetat og hver Ps-repeterende enhet i Pnl8C-Ps ble funnet å være 1:1 og 0,8:1 for hhv. ubearbeidede og størrelsessorterte prøver, og 1,7:1 og 1,5:1 for hhv. ubearbeidet og størrelses-sortert Pn9V. En prøve av vandig Pnl8C-Ps-0MPC-konjugat ble også analysert med hensyn på det molare forhold mellom 0-acetat og hver Ps-repeterende enhet og ble funnet å være omtrent 0,5:1.
Det er blitt rapportert i litteraturen at pyruvat-gruppen er en kraftfull immunodeterminant i kapsulære polysakkarider av type 4, og dens fjerning gir opphav til markerte endringer i immunologisk spesifisitet [Heidelberger, M., Dudman, W. F. og Nimmich, W., "Immunochemical relationships of certain capsular polysaccharides of Klebsiella, pneumococci, and Rhizobia", J. Immunol., 104, s. 1321-1328 (1970); Higginbotham, J. D., Heidelberger, M. og Gotschlich, E., "Degradation of a pneumococcal type-specific polysaccharide with exposure of group-specificity", Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 67, s. 138-142 (1970)]. Likeledes opphevet fjerningen av O-acetatgruppen i polysakkarid av type Pnl8C-Ps dets immunologiske spesifisitet. [Estrada-Parra, S. og Heidelberger, M., "The specific polysaccharide of type XVIII pneumococcus", Biochemistry, 2, s. 1288-1294 (1963).] Det var derfor vesentlig å utvikle en kvantitativ metode for bestemmelse av acetat og pyruvat i Pnl8C-Ps og Pn4. O-acetylgrupper i Pn9V kan også spille en viktig rolle for den immunologiske struktur til Pn9V ettersom den de-O-acetylerte Pn9V ikke hadde noen antigen reaktivitet bestemt ved hjelp av hastighets-nefelometrisk måling.
Vi fant at O-acetat frigjøres lett fra Pn9V og Pnl8C-Ps ved alkaliske betingelser (pH 11) og ved 4°C, og 0-pyruvat frigjøres lett fra Pn4 etter oppvarming ved 65°C. Vi fant at acetat og pyruvat kan separeres fra en hydrolysert PnPs-prøve ved å bruke en OmniPac PAX500-kolonne ved en strømnings-hastighet på 1 ml/min med 0,98 mM NaOH og 2 % MeOH som den mobile fase. Påvisningen ble utført ved hjelp av undertrykt ledningsevnepåvisning under anvendelse av 25 mM H2S04som regenereringsmiddel ved en strømningshastighet på 10 ml/min. Optimale hydrolysebetingelser for kvantitativ HPLC-analyse av O-acetat og 0-pyruvat fra hhv. Pnl8C-Ps, 9V og Pn4, er beskrevet i dette eksemplet.
Instrumentering
En Dionex BioLC ble utstyrt med en OmniPac PAX-500-overvåknings- og analytisk kolonne (4,6 x 250 mm). Påvisning av undertrykt ledningsevne ble utført ved å bruke 25 mN svovelsyre som regenereringsmiddel. Strømningshastigheten ble innstilt på 10 ml/min med en Dionex autoregenereringsenhet. Den mobile fase og gradientprogrammet for å separere acetat og pyruvat fra en prøve av hydrolysert Pn-Ps er angitt i den følgende tabell:
Buffer 1-1 mM natriumhydroksid Buffer 2 - 100 % metanal Buffer 3 - 200 mM natriumhydroksid Buffer 4 - vann
Ved å bruke disse betingelsene og en detektor-sensitivitet på 3 uSiemens, kan det lett påvises 4 nanomol hver av acetat og pyruvat som eluerer ved retensjonstider på omtrent hhv. 5,2 og 9,5 minutter.
Prøvefremstillinq
Rensede PnPs-prøver fra Merck Manufacturing Division ble underkastet Karl-Fisher-titrering under anvendelse av en Aquastar V3000 volumetrisk fuktighetstitrator for å bestemme innholdet av rest-H20, og så oppløst i Milli-Q-H20 ved en konsentrasjon på 1,0 mg tørrvekt pr. ml. Prøver (100 ug/ml) ble behandlet i 2 mM NaOH i 16 timer ved værelsestemperatur for å fjerne O-acetat fra Pn9V-Ps- og Pnl8C-Ps-prøver. Pn4-Ps-prøver ble hydrolysert i 1 mM HC1 ved 65°C i 16 timer for fjerning av 0-pyruvat fra Pn4. Prøver av størrelsessortert Pn9V og Pnl8C-Ps og vandig Pnl8C-Ps-0MPC-konjugat ble også underkastet monosakkaridsammensetningsanalyser ved hjelp av anionbyttekromatografi ved høy pH og pulset amperometrisk påvisning. Monosakkaridsammensetningsanalysen ble utført for å oppnå den korrekte konsentrasjon av PnPs i de størrelses-sorterte og vandige konjugatbulkprøver.
Acetat-, pyruvat- og N-acetylmannosaminstandarder ble oppløst i Milli-Q-H20 ved en konsentrasjon på 200 nmol/ml.
Hydrolyse av prøver og standarder
De-O-acetylering av Pnl8C-Ps ble undersøkt ved å behandle Pnl8C-Ps ved fire NaOH-konsentrasjoner (1, 2, 5 og 50 mM) ved forskjellige temperaturer (4, 25, 45 og 65°C) og i forskjellige tidsrom (3, 5 og 16 timer). Standardoppløsninger av acetat, pyruvat og N-acetylmannosamin ble også tatt med i undersøkelsen for å bestemme om betingelsene som var nød-vendige for de-O-acetylering, også ville resultere i ned-brytning av acetat/pyruvat eller tap av N-acetylgrupper.
Fjerningen av pyruvat fra Pn4 ble undersøkt etter behandling med enten natriumhydroksid (50 mM/100°C/16 timer) eller saltsyre ved forskjellige konsentrasjoner (1, 10
100 mM), tidsrom (3, 5 og 16 timer) og temperaturer (65, 85 og 100°C).
Hastighetsnefelometri
Den hastighetsnefelometriske aktivitet av Pn9V-Ps, Pnl8C-Ps og Pn4-Ps før og etter de-O-acetylering eller de-0-pyruvylering ble målt. Prøver ble fortynnet til 1, 1,5, 2 og 2,5 ug/ml.
Størrelsesutelukkelseskromatografi med høy yteevne ( HPSEC)
HPSEC for Pn9V-Ps, Pnl8C-Ps og Pn4 før og etter de-O-acetylering eller de-0-pyruvylering ble målt. En 7, 5 x 600 mm TSK G6000PW-kolonne utstyrt med en strømningshindrer ble oppvarmet til 50°C ved 56-70 kg/cm<2>og ekvilibrert med 0,2 M natriumacetat ved 0,3 ml/min. En 60 ug prøve (1 mg/ml) ble , injisert på kolonnen og eluert med den mobile fase ved 0,3 ml/min. Kolonneeluanten ble blandet med etterkolonne-tilsetning av 0,5 M NaOH ved en strømningshastighet på
0,5 ml/min og overvåket med en Dionex pulset amperometrisk
detektor og Kd ble målt.
Analvsesensitivitet og - linearitet
Detektorlinearitet og -sensitivitet ble bestemt ved 3 uSiemens for både pyruvat og acetat. Pyruvat og acetat var påvisbare ved en nedre grense på 0,125 nanomol. Detektor-respons for begge komponentene var lineær gjennom 2 nanomol med korrelasjonskoeffisienter på 0,9999 og 0,9992 for hhv. pyruvat og acetat.
Optimalisering av O- acetatfjerning fra Pnl8C- Ps
Foreløpige undersøkelser av tidsforløpet for hydrolyse av Pnl8C-Ps viste O-acetylgruppers labilitet overfor alkalisk hydrolyse ved lave temperaturer. 2 mM natriumhydroksid var tilstrekkelig til fullstendig å de-O-acetylere Pnl8C-Ps ved 4°C etter en 16 timers inkubasjon. Behandlinger ved høyere temperaturer (> 25°C) ble funnet å frigjøre N-acetat fra N-acetylmannosamin som ville virke inn på målingen av Pn9V-0-acetat. Den optimale hydrolysebetingelse for fjerningen av O-acetat fra PnPs ble funnet å være 16 timer ved 4°C. Mindre enn 1 % av acetat ble funnet å bli fjernet fra en standard av N-acetylmannosamin behandlet med 2 mM NaOH i 16 timer ved værelsestemperatur.
Optimalisering av 0- pyruvatfjerning fra Pn4
Hydrolyseundersøkelser av Pn4 ble til å begynne med foretatt ved å bruke natriumhydroksidhydrolyse. Det ble fort oppdaget at svært lite pyruvat ble gjenvunnet når natriumhydroksid ble brukt. Innledende kontrollundersøkelser viste at pyruvat ble spaltet fra Pn4 i H20 ved 100°C. Med denne informasjon ble det bestemt å utføre optimaliserings-undersøkelsene for 0-pyruvatfrigjørelse fra Pn4 under anvendelse av HCl-hydrolyse ved forhøyede temperaturer. Noen ned-brytning av pyruvatet fremkom ved høyere temperaturer. Dette kan demonstreres med en prøve av pyruvatstandard som er blitt hydrolysert under de samme betingelser som Pn4. Maksimal gjenvinning av pyruvat oppstod når hydrolyse ble utført i 1 mM HC1 i 16 timer ved 65°C.
Analyse av O- acetat og P- pyruvat i PnPs- prøver
Forskjellige prøver som representerer utgangs-PnPs, størrelsessortert PnPs og ett Pnl8C-Ps-0MPC-konjugat ble analysert med hensyn på O-acetat/pyruvat ved hjelp av HPLC-metoden beskrevet ovenfor etter hydrolyse i 2 mM NaOH ved værelsestemperatur for å frigjøre O-acetat i Pn9V-Ps/18C eller i 1 mM HC1 ved 65°C for å frigjøre O-pyruvat i Pn4-Ps. Resultatene av denne undersøkelsen er presentert nedenunder:
Resultatene viser at retensjonen av sidegruppene i det størrelsessorterte PnPs var omtrent 90 % for Pn9V-Ps og 80 % for Pn4 og 18C. Retensjonen av O-acetat i Pnl8C-Ps-0MPC-konjugat, vandig bulk, ble funnet å være omtrent 50 %. De teoretiske verdiene for Pnl8C-Ps og Pn4 er 1 mol acetat eller pyruvat pr. mol Ps-repeterende enhet, og for Pn9V er forholdet 2:1. [Jansson, P-E., Lindberg, B. og Lindquist, U.,
"Structural studies of the capsular polysaccharides from Streptococcus pneumoniae Type 4", Carbohyd. Res., 95, s. 73-80
(1981). Lugrowski, C. og Jennings, H. J., "Structural determination of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 18C", Carbohyd. Res., 131, s. 119-129 (1984). Perry, M. B., Daoust, V. og Carlos, D. J., "The specific capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 9V", Can. J. Biochem., 59, s. 524-533 (1981)]. Den lavere retensjon av O-acetat som ble funnet for Pnl8C-Ps-0MPC-konjugat, er forventet pga. O-acetylgruppehydrolyses følsomhet overfor alkaliske betingelser ved lave temperaturer.
Den hastighetsnefelometriske aktivitet til prøver av Pn4, Pn9v og Pnl8C-Ps og de-O-pyruvylerte og de-O-acetylerte prøver ble målt. Resultatene viser at nefeloseaktiviteten gikk fullstendig tapt etter fjerning av disse sidegruppene, selv til tross for Kd for de ubehandlede prøver. Kd-ene ble erholdt ved hjelp av HPSEC-metoden beskrevet ovenfor. Kd for Pn4 etter de-O-pyruvylering ved mild syrehydrolyse ble imidlertid økt fra 0,60 til 0,68, og fremkom nært saltvolumet. Anti-genisitetsdataene for Pn4 og Pnl8C-Ps understøtter arbeidet til andre forskere vedrørende viktigheten av disse sidegruppene for immunologisk reaktivitet av pneumokokkpolysakkarid. Resultatene for Pn9V tyder på at i tillegg til glukuronsyre, er også O-acetylgruppene til dette molekylet viktige immunologiske determinanter.
Ifølge denne metoden er det således utviklet en hurtig, følsom fremgangsmåte for kvantitativ analyse av 0-pyruvylketal i Pn4 og O-acetat i Pn9V og Pnl8C-Ps. Denne fremgangsmåten er verdifull når det gjelder å definere den korrekte fremgangsmåte for størrelsessortering og konjugasjon av Pn4, Pn9V og Pnl8C-Ps for å bibeholde den antigene struktur til disse polysakkaridene.
Eksempel 31
Isolering av Pn6B- Ps- MIEP- konjuqat
1. To konjugatreaksjonsblandingsprøver (én som representerer en H20-dialysert prøve av den andre) ble lagret ved 3-8°C inntil de ble brukt. 2. 0,2 MOPS, pH 7,2, buffer ble tilsatt til prøvene, hvorved det ble oppnådd en sluttkonsentrasjon på ca. 7 mM. Fast GuHCl ble tilsatt til prøven for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 4,2 M (anmerkning: 1,42 g GuHCl/ml prøve bør tilsettes for å kompensere økningen i volum pga. tilsetningen av det faste GuHCl. Likeledes bør buffertilsetningen reguleres under hensyntagende til volumøkningen slik at prøvesammen-setningen er nærmere sammensetningen av kolonneeluenten. Alternativt vil prøven kunne dialyseres mot kolonneeluenten
før kromatografien).
3. 2, 8 ml prøve ( inneholdende ca. 1 mg protein basert på Lowry-proteinanalyse) ble injisert i en 2,6 x 96 cm kolonne med sephacryl S-1000 ekvilibrert i 10 mM MOPS, pH 7,2, 6 m GuHCl ved en strømningshastighet på 0,6 ml/min. Kolonne-effluent ble kontinuerlig overvåket ved 280 nM (Perkin EimerLC 235 dioderekkedetektor) og 3 ml fraksjoner ble samlet opp. 4. Proteinfordeling var basert på A280 (samt spektra) og Pn6B-Ps-fordeling var basert på en Pn6B-Ps spesifikk RIA-analyse. Basert på elueringsposisjoner for Pn6B-Ps-BrAc alene og i fysiske blandinger med uaktivert MIEP, ble blandinger av fraksjoner inneholdende både Ps og protein laget og de som eluerte distinkt fra stillingene observert for Pn6B-Ps-BrAc, ble presumptivt betegnet som Pn6B-Ps-MIEP-konjugat. 5. Blandinger ble oppkonsentrert ved ultrafiltrering under anvendelse av en YM-30-membran og diafiltrert under anvendelse av Milli-Q-H20. Protein- og Pn6B-Ps-innhold ble beregnet ut fra kvantitative sammensetningsundersøkelser. Tilstedeværelsen av SCMHC ble påvist ved hjelp av aminosyreanalyse.
Eksempel 32
Pneumokokkpolvsakkarid- Pnl8C- Ps- rettet RIA- analyse
Denne analysen brukes for kvantifiseringen av pneumokokkpolysakkarid av type 18C. Det er en flerlags sandwich-RIA-analyse. Kanin-anti-Pnl8C-Ps belegges på polystyrenkuler. kulene inkuberes i en prøveoppløsning inneholdende Pnl8C-Ps. Etter inkubasjon vaskes kulene og reinkuberes i en andre opp-løsning inneholdende et museantistoff til Pnl8C-0MPC. Etter denne inkubasjonen vaskes kulene og inkuberes en tredje gang i en oppløsning inneholdende125I-geit-anti-mus-IgG. Platene vaskes på nytt, hvoretter kulene overføres til plastrør for telling. Ukjente prøver av Pnl8C-Ps sammenlignes med en standardkurve for kvantifisering.
Utstyr
1. RIA-sett: Abbot Labs, Diagnostic Div., katalog nr. 6171-10. 2. Qwik Wash System, Abbot Labs, Diagnostic Div. 3. Regulerbare pipetter og engangspipettespisser (f.eks. Eppendorf digital).
4. Gammateller (f.eks. Abbott Autologic).
5. 0,64 cm polystyrenkuler med speilglans: Precision Plastic Ball Co., 3000 N. Cicero Ave., Chicago, Illinois 60641.
Reagenser
1. New York State Health Services Anti-Pnl8C-Ps-antistoff, parti R18-44 eller ekvivalent. 2. Muse-anti-Pnl8C-Ps-0MPC-antisera (blanding 11260-235 eller ekvivalent). 3. Geit-antimus-IgG<125>I-merkede antisera: NEX 159, New England Nuclear, 549 Albany Street, Boston,
MA 02118.
4. Inkubasjonsbuffer: RCM8 inneholdende 1,0 % BSA Sigma A2153
0,1 % azid Sigma S2002
5. Fortynningsmiddel
8 deler kalvefosterserum Sigma F3885
1 del geiteserum Sigma G6767
1 del kaninserum Sigma R4505
0,05 % TWEEN 20 Sigma P1379
0,1 % azid Sigma S2002
3. Tilsett 1 anti-Pnl8C-Ps-belagt kule til hver brønn i platen som inneholder en prøve eller standard og rist platen forsiktig for å sikre
at alle kulene dekkes fullstendig med buffer.
4. Tildekk platen med et klebelag tilveiebrakt med RIA-settet og inkuber platen ved værelsestemperatur i 6 timer. 5. Vask platen under anvendelse av "Qwik Wash"-_-apparatet og avionisert vann. 6. Fortynn muse-anti-18C-antistoffet i fortynningsmiddel i forholdet 1:1 000. 7. Tilsett 200 ul av denne oppløsningen til hver
brønn som inneholder en kule.
8. Tildekk platen og inkuber over natten ved værelsestemperatur. 9. Vask platen under anvendelse av "Qwik Wash"-apparatet og avionisert vann. 10. Fortynn125I-merket geit-antimus-antistoff til 15 000 cpm/10 ul i fortynningsmiddel (ca. 1:160 fortynning). 11. Tilsett 20 ul av denne oppløsningen til hver brønn som inneholder en kule. 12. Tildekk platen og inkuber ved 37°C i 2 timer. 13. Vask platen under anvendelse av "Qwik Wash"-apparatet og avionisert vann. 14. Overfør kulene til plastrørene tilveiebrakt med RIA-settet og tell under anvendelse av en egnet gammateller.
Beregninger
1. Kombiner de doble målingene for å få et gjennomsnitt for hver prøve, standard og inkubasjonsbufferkontroll. Trekk inkubasjons-bufferkontrollen fra alle standarder og prøver. 2. Under anvendelse av en kalkulator utstyrt for statiske beregninger, sett inn dataen for standardkurven og beregn korrelasjons-koeffisienten og hellingen til linjen. 3. Under anvendelse av den passende standardkurve (fritt for fritt, konjugat for konjugat), beregn responsen til prøvene og korriger for fortynninger.
Den samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor er anvendbar for enhver av de andre Pn-Ps-arter ved å bytte ut typespesifikke reagenser.
Claims (4)
1. Konjugat,
karakterisert vedat det omfatter et immunogent protein kovalent bundet til et polysakkarid som gjennomsnittlig har mindre en 1200 repeterende enheter pr. molekyl, en molekylvekt mellom 1 x IO<5>og 1 x IO<6>, en polydispersitet mellom 1,0 og 1,4 og et forurensningsnivå med pneumokokk-gruppespesifikt C-polysakkarid under 3,0 % av det typespesifikke polysakkarid, og som er utvunnet fra: 1) Streptococcus pneumoniae 6B, hvor polysakkaridet har: a) en M„ mellom ca. 3 x 10<5>og 6 x IO<5>, b) en Kd(topp) på ca. 0,60 ± 0,05, c) en M„ mellom ca. 3 x 10<5>og 7 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosf at, pH 7,2, mellom 1,0 og 2,0, og e) mindre enn ca. 1 000 repeterende enheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 2) Streptococcus pneumoniae 14, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 3 x 10<5>og 8 x 10<5>, b) en Kd(topp) på ca. 0,60 ± 0,05, c) en M, mellom ca. 4 x 10<5>og 1 x 10<6>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosf at, pH 7,2, mellom 0,6 og 1,6, og e) mindre enn ca. 1 200 repeterende enheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 3) Streptococcus pneumoniae 19F, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 2 x 10<5>og 6 x 10<5>, b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05, c) en My mellom ca. 2 x IO<5>og 6 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosf at, pH 7,2, mellom 1,0 og 2,0, og e) mindre enn ca. 1 000 repeterende monomerenheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 4) Streptococcus pneumoniae 23F, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 2 x 10<5>og 6 x 10<5>, b) en Kd(topp) på ca. 0,54 ± 0,05, c) en M„ mellom ca. 4 x 10<5>og 8 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,5 og 3,0, og e) mindre enn ca. 1 000 repeterende monomerenheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 5 ) Streptococcus pneumoniae 4, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 2 x 10<5>og 4 x 10<5>, b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05, c) en M„ mellom ca. 2 x 10<5>og 5 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, mellom 1,0 og 3,0, og e) mindre enn ca. 600 repeterende monomerenheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 6) Streptococcus pneumoniae 9V, hvor polysakkaridet har: a) en MNmellom ca. 3 x IO<5>og 6 x 10<5>, b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05, c) en My mellom ca. 3 x 10<5>og 7 x 10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosf at, pH 7,2, mellom 1,0 og 2,0, og e) mindre enn ca. 800 repeterende monomerenheter pr. molekyl i gjennomsnitt, 7) Streptococcus pneumoniae 18C, hvor polysakkaridet har: a) en M, mellom ca. 2 x 10<5>og 6 x 10<5>, b) en Kd(topp) på ca. 0,65 ± 0,05, c) en M„ mellom ca. 2 x 10<5>og 6 x10<5>, d) en egenviskositet i 0,1 M natriumfosf at, pH 7,2, mellom 1,5 og 3,0, og e) mindre enn ca. 700 repeterende monomer
enheter pr. molekyl i gjennomsnitt, eller en blanding av hvilket som helst av disse polysakkaridene, hvor polysakkaridet er konjugert til yttermembranproteinkomplekset (OMPC) fra Neisseria meningitidis b eller MIEP-underenheten derav, idet OMPC eller MIEP og Pn-Ps er bundet gjennom et mellomledd med formelen:
for bindinger gjennom polysakkaridhydroksylgruppene, eller
i tilfellet med polysakkarider som bærer karboksylsyregrupper, hvor PRO er OMPC eller MIEP og Pn-Ps er et pneumokokkpolysakkarid og konjugatet har et vektforhold mellom Pn-Ps og OMPC eller Pn-Ps og MIEP som er mellom ca. 0,05 og 0,5 og som etter hydrolyse og aminosyreanalyse gir et SCMHC/Lys-forhold mellom 0,01 og 0,15.
2. Konjugat ifølge krav 1,
karakterisert vedat polysakkaridet har en antigenisitetsindeks mellom 0,7 og 1,1 og en egenviskositet mellom 0,6 og 3,0 dl/g.
3. Fremgangsmåte for fremstilling av et Pn-Ps-PRO-konjugat ved at: a) urenset pneumokokkpolysakkarid, Pn-Ps, isoleres, b) 1) anioniske urenheter adsorberes eventuelt på Whatman DE52 ved en oppløsnings-pH på ca. 5, 2) det urensede Pn-Ps hydrolyseres delvis eller behandles med mekaniske skjærkrefter, c) det delvis hydrolyserte Pn-Ps fraksjoneres etter størrelse og renhet, d) det fraksjonerte Pn-Ps, utvunnet fra én eller flere pneumokokkundertyper i henhold til trinnene (a)-(c), derivatiseres slik at det oppviser fremstikkende nukleofile eller elektrofile rester, e) Neisseria meningitidis b-OMPC eller underenheter derav isoleres, f) OMPC eller underenheten derav funksjonaliseres slik at den oppviser reaktive elektrofile eller nukleofile rester, g) polysakkaridet fra trinn (d) konjugeres med proteinet fra trinn (f), h) konjugatet tildekkes for å fjerne gjenværende funksjonelle grupper, og i) konjugatproduktet isoleres,karakterisert vedat trinnene b)2) og c) utføres ved at: b) 2) Pn-Ps i oppløsning hydrolyseres delvis til en sluttpunktviskositet forutbestemt til å redusere Pn-Ps-bindingen til antipneumokokktype-spesifikt antistoff med ikke mer enn 30 % sammenlignet med urenset Pn-Ps, ved: 1. oppvarming ved 50-150°C i mellom 1 og 48 timer, eller 2. sonikering i perioder på 5 sekunder til 5 minutter, avhengig av pulverinnstillingen av sonikeringsproben, etterfulgt av perioder med avkjøling og ytterligere sonikering, eller 3. skjærkraftbehandling i en Gaulin-presse ved trykk mellom ca. 140 og 1 054 kg/cm<2>, c) det hydrolyserte Pn-Ps fraksjoneres, og en fraksjon med en molekylvekt i området mellom 1 x 10<5>og 1 x 10<6>utvelges ved hjelp av: i forskjellig alkoholoppløselighet under
anvendelse av isopropanol ved konsentrasjoner forutbestemt til å utfelle det ønskede Pn-Ps-størrelsesområde, eller ii fraksjonering på en størrelsesutelukkelses-væskekromatografikolonne som er i stand til å inkludere og fraksjonere polysakkarider i størrelsesområdet mellom 5 x IO<4>og 1 x IO<6>, og sluttpunktet for hydrolyse eller skjærkraft bestemmes ved viskometri av en 1 mg/ml opp-løsning i 0,1 M natriumfosfat, pH 7,2, eller kromatografi for hvert av de angitte polysakkarider i henhold til sluttpunktet for undertypen av Pn-Ps:
4. Vaksinepreparat,
karakterisert vedat det inneholder et konjugat ifølge krav 1.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64657091A | 1991-01-28 | 1991-01-28 | |
US80794291A | 1991-12-19 | 1991-12-19 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO920350D0 NO920350D0 (no) | 1992-01-27 |
NO920350L NO920350L (no) | 1992-07-29 |
NO304117B1 true NO304117B1 (no) | 1998-10-26 |
Family
ID=27094961
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO920350A NO304117B1 (no) | 1991-01-28 | 1992-01-27 | Konjugat av pneumokokkpolysakkarid og immunogent protein, fremgangsmÕte for fremstilling av konjugatet, samt vaksine som inneholder konjugatet |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5623057A (no) |
EP (1) | EP0497525B2 (no) |
JP (1) | JPH0794472B2 (no) |
KR (1) | KR100243958B1 (no) |
CN (1) | CN1080124C (no) |
AT (1) | ATE169825T1 (no) |
AU (1) | AU651656B2 (no) |
CA (1) | CA2059692C (no) |
CZ (1) | CZ283284B6 (no) |
DE (1) | DE69226668T3 (no) |
DK (1) | DK0497525T4 (no) |
ES (1) | ES2121820T5 (no) |
FI (1) | FI107370B (no) |
HU (1) | HU216101B (no) |
IE (1) | IE920244A1 (no) |
IL (5) | IL119961A (no) |
LV (1) | LV12309B (no) |
MX (1) | MX9200328A (no) |
NO (1) | NO304117B1 (no) |
NZ (1) | NZ241367A (no) |
SI (1) | SI9210081B (no) |
SK (1) | SK280659B6 (no) |
YU (1) | YU49068B (no) |
Families Citing this family (122)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2059693C (en) * | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
US5445817A (en) * | 1992-08-21 | 1995-08-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines |
US5439808A (en) * | 1993-07-23 | 1995-08-08 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
US5565204A (en) * | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
US5681570A (en) * | 1995-01-12 | 1997-10-28 | Connaught Laboratories Limited | Immunogenic conjugate molecules |
US5747287A (en) * | 1995-04-28 | 1998-05-05 | North American Vaccine, Inc. | Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis |
US5866132A (en) * | 1995-06-07 | 1999-02-02 | Alberta Research Council | Immunogenic oligosaccharide compositions |
AU725279B2 (en) * | 1995-06-07 | 2000-10-12 | Alberta Research Council Inc. | Immunogenic and immunostimulatory oligosaccharide compositions and methods of making and using them |
US5695768A (en) | 1995-06-07 | 1997-12-09 | Alberta Research Council | Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides |
US6410025B1 (en) | 1996-02-14 | 2002-06-25 | Merck & Co., Inc. | Polysaccharide precipitation process |
SE9601158D0 (sv) * | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Stefan Svenson | Method of producing immunogenic products and vaccines |
US6207157B1 (en) | 1996-04-23 | 2001-03-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Conjugate vaccine for nontypeable Haemophilus influenzae |
ATE208629T1 (de) | 1996-08-27 | 2001-11-15 | Chiron Corp | Neisseria meningitidis serogruppe b glykokonjugate und verfahren zu deren verwendung |
FR2763244B1 (fr) | 1997-05-14 | 2003-08-01 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Composition vaccinale multivalente a porteur mixte |
EP0998557A2 (en) * | 1997-07-21 | 2000-05-10 | North American Vaccine, Inc. | Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines |
US6224880B1 (en) | 1997-09-24 | 2001-05-01 | Merck & Co., Inc. | Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines |
US6756361B1 (en) * | 1997-10-14 | 2004-06-29 | Nabi | Enterococcus antigens and vaccines |
GB9727262D0 (en) * | 1997-12-24 | 1998-02-25 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
AU759391B2 (en) * | 1998-02-12 | 2003-04-10 | Wyeth Holdings Corporation | Pneumococcal and meningococcal vaccines formulated with interleukin-12 |
US7018637B2 (en) * | 1998-02-23 | 2006-03-28 | Aventis Pasteur, Inc | Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines |
AU760669B2 (en) * | 1998-04-28 | 2003-05-22 | Galenica Pharmaceuticals, Inc. | Polysaccharide-antigen conjugates |
GB9816337D0 (en) * | 1998-07-27 | 1998-09-23 | Cortecs Uk Ltd | Proteins |
US6824997B1 (en) * | 1998-09-18 | 2004-11-30 | Binax, Inc. | Process and materials for the rapid detection of streptococcus pneumoniae employing purified antigen-specific antibodies |
US20080096236A1 (en) * | 1998-08-25 | 2008-04-24 | Binax, Inc. | Method for Detecting the Presence of Target Bacteria or a Target Component Carbohydrate Antigen Thereof |
US9134303B1 (en) | 1998-08-25 | 2015-09-15 | Alere Scarborough, Inc. | ICT immunoassay for Legionella pneumophila serogroup 1 antigen employing affinity purified antibodies thereto |
US6146902A (en) * | 1998-12-29 | 2000-11-14 | Aventis Pasteur, Inc. | Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions |
GB9906437D0 (en) * | 1999-03-19 | 1999-05-12 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
MY125202A (en) * | 1999-03-19 | 2006-07-31 | Smithkline Beecham Biologicals S A | Vaccine |
US20040191834A1 (en) * | 1999-10-28 | 2004-09-30 | Laferriere Craig Antony Joseph | Novel method |
JP4870895B2 (ja) * | 2000-06-29 | 2012-02-08 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン組成物 |
GB0108364D0 (en) | 2001-04-03 | 2001-05-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
GB0022742D0 (en) * | 2000-09-15 | 2000-11-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
GB0115176D0 (en) * | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
EP1569955A2 (en) * | 2002-12-03 | 2005-09-07 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Gp120 specific antigens, conjugates thereof, methods for their preparation and uses thereof |
US7369578B2 (en) * | 2003-07-01 | 2008-05-06 | Nortel Networks Limited | Digital processing of SONET pointers |
MY144231A (en) * | 2003-12-17 | 2011-08-15 | Wyeth Corp | Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME |
EA012984B1 (ru) * | 2003-12-17 | 2010-02-26 | Вайет | Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения |
ES2540770T3 (es) | 2004-09-22 | 2015-07-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composición inmunógena para uso en vacunación contra estafilococos |
IL308456A (en) | 2005-04-08 | 2024-01-01 | Wyeth Llc | A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation |
US7709001B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
US20070184072A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
AU2011253684B8 (en) * | 2005-04-08 | 2013-07-11 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
US7955605B2 (en) | 2005-04-08 | 2011-06-07 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
US8329184B2 (en) | 2005-06-27 | 2012-12-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Process for manufacturing vaccines |
TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
PT1962899E (pt) | 2005-12-22 | 2011-10-19 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacina conjugada polissacarídica pneumocócica |
GB0607088D0 (en) * | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
CN101024079B (zh) * | 2006-02-17 | 2012-02-01 | 福州昌晖生物工程有限公司 | 肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法 |
EA020459B1 (ru) | 2006-03-30 | 2014-11-28 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Иммуногенная композиция |
AU2013200552B9 (en) * | 2006-04-07 | 2014-07-03 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Conjugate vaccines |
TW200806315A (en) * | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
US8808707B1 (en) | 2006-05-08 | 2014-08-19 | Wyeth Llc | Pneumococcal dosing regimen |
ZA200900899B (en) * | 2006-08-07 | 2010-07-28 | Harvard College | Protein matrix vaccines and methods of making and administering such vaccines |
EA016417B1 (ru) | 2006-09-07 | 2012-04-30 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Способ получения вакцины |
AU2007307800C1 (en) * | 2006-10-10 | 2014-03-13 | Wyeth Llc | Purification of Streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharides |
CN1963500B (zh) * | 2006-12-06 | 2010-05-12 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定方法 |
GB0700136D0 (en) | 2007-01-04 | 2007-02-14 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Process for manufacturing vaccines |
EP2436700B8 (en) * | 2007-03-23 | 2018-08-01 | Wyeth LLC | Shortened purification process for the production of capsular streptococcus pneumoniae polysaccharides |
WO2008129559A2 (en) | 2007-04-23 | 2008-10-30 | Serum Institute Of India Ltd | Antigenic polysaccharides and process for their preparation |
AR066376A1 (es) | 2007-05-02 | 2009-08-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna |
BRPI0813644B8 (pt) | 2007-06-26 | 2021-05-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | composição imunogênica, vacina, processo para fabricar a mesma, e, uso da composição imunogênica ou vacina |
CN102333540B (zh) | 2008-10-06 | 2015-04-22 | 芝加哥大学 | 与细菌eap、emp和/或adsa蛋白相关的组合物和方法 |
SI2379734T1 (en) * | 2008-12-18 | 2018-05-31 | Wyeth Llc | PROCEDURE FOR THE CONTROL OF THE SEROTYPE 19A STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE POLYESAHARIDE MOLECULAR MASS |
PL2385981T3 (pl) * | 2008-12-18 | 2020-01-31 | Wyeth Llc | Sposób kontroli masy cząsteczkowej polisacharydów streptococcus pneumoniae z zastosowaniem węgla |
WO2010083477A2 (en) | 2009-01-16 | 2010-07-22 | University Of Maryland, Baltimore | Broad spectrum vaccine against non-typhoidal salmonella |
ES2784957T3 (es) | 2009-04-03 | 2020-10-02 | Univ Chicago | Composiciones y métodos relacionados con variantes de la proteína A (SPA) |
US20120135037A1 (en) | 2009-06-01 | 2012-05-31 | Mizel Steven B | Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same |
IN2012DN00791A (no) * | 2009-06-29 | 2015-06-26 | Genocea Biosciences Inc | |
GB0913680D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
GB0913681D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
GB201003924D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
EP2555794A4 (en) | 2010-04-05 | 2014-01-15 | Univ Chicago | PROTEIN A (SPA) ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS AS AN IMMUNE RESPONSE AMPLIFIER |
WO2011148382A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Biological E Limited | An improved process for the purification of capsular polysaccharides of haemophilus influenza - b, neisseria meningitis such as serotypes a, c, y and w-135, and other similar related capsular polysaccharides produced from both gram negative and gram positive microorganisms using aluminium phosphate with alcohol. |
JP6002128B2 (ja) | 2010-07-02 | 2016-10-05 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴThe University Of Chicago | プロテインA(SpA)変種に関連する組成物および方法 |
JP5793194B2 (ja) | 2010-09-09 | 2015-10-14 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴThe University Of Chicago | 感染防御ブドウ球菌抗原が関与する方法および組成物 |
RU2623174C2 (ru) | 2011-01-20 | 2017-06-22 | Дженоцея Байосайенсиз, Инк. | Вакцины и композиции против streptococcus pneumoniae |
GB201103836D0 (en) | 2011-03-07 | 2011-04-20 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
US9878029B2 (en) | 2011-03-22 | 2018-01-30 | Serum Institute Of India Private Limited | Process for preparation of polysaccharides |
US8945588B2 (en) | 2011-05-06 | 2015-02-03 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides |
DK2788023T3 (en) | 2011-12-06 | 2016-12-19 | Valneva Austria Gmbh | Aluminum compounds for use in therapeutics and vaccines |
JP6379041B2 (ja) | 2012-01-20 | 2018-08-22 | ジェノセア バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)に対する融合抗原ワクチンおよび組成物 |
US9968668B2 (en) | 2012-04-26 | 2018-05-15 | The University Of Chicago | Staphylococcal coagulase antigens and methods of their use |
ITMI20121597A1 (it) * | 2012-09-25 | 2014-03-26 | Beta Pharma S A | Coniugato tra frammento di parete cellulare batterica ed un veicolo mucopolisaccaridico e suoi usi in ambito medico |
US11576958B2 (en) | 2013-02-07 | 2023-02-14 | Children's Medical Center Corporation | Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease |
CN105492454B (zh) * | 2013-07-07 | 2019-09-27 | 马普科技促进协会 | 合成针对1型肺炎链球菌的疫苗 |
US11708411B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-07-25 | Wake Forest University Health Sciences | Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines |
US11160855B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2015110941A2 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
PT3096786T (pt) * | 2014-01-21 | 2021-08-24 | Pfizer | Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos |
JP2017505792A (ja) * | 2014-02-14 | 2017-02-23 | ファイザー・インク | 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート |
US9107906B1 (en) | 2014-10-28 | 2015-08-18 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
US10729780B2 (en) * | 2015-06-08 | 2020-08-04 | Serum Institute Of India Private Ltd. | Methods for improving the adsorption of polysaccharide-protein conjugates and multivalent vaccine formulation obtained thereof |
US11058757B2 (en) | 2016-03-31 | 2021-07-13 | Pogona, LLC | Saccharide-polypeptide conjugate compositions and methods of use thereof |
EP3269385A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-17 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
EP3474890A1 (en) | 2016-06-22 | 2019-05-01 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
WO2018144438A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f |
WO2018144799A1 (en) | 2017-02-03 | 2018-08-09 | SCHADECK, Eva, Barbara | Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof |
US11400162B2 (en) | 2017-02-24 | 2022-08-02 | Merck Sharp & Dohme Llc | Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein |
EP3585427A4 (en) * | 2017-02-24 | 2020-12-30 | Merck Sharp & Dohme Corp. | METHODS FOR IMPROVING THE FILTRABILITY OF POLYSACCHARIDE CONJUGATE WITH PROTEIN REACTIONS |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
KR102634811B1 (ko) | 2017-06-10 | 2024-02-06 | 인벤트프라이즈 인크. | 면역원성과 항원항체 결합성이 개선된 2가 또는 다가 접합체 다당류를 가진 다가 접합체 백신 |
US10729763B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-08-04 | Inventprise, Llc | Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds |
US11524076B2 (en) | 2017-09-07 | 2022-12-13 | Merck Sharp & Dohme Llc | Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates |
JP7293201B2 (ja) | 2017-09-07 | 2023-06-19 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー | 肺炎球菌多糖体および免疫原性多糖体-キャリアタンパク質コンジュゲートでのその使用 |
AU2018328036B2 (en) | 2017-09-07 | 2024-03-07 | Merck Sharp & Dohme Llc | Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates |
CN111093650B (zh) | 2017-09-07 | 2024-03-01 | 默沙东有限责任公司 | 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途 |
MX2020002556A (es) | 2017-09-07 | 2020-07-13 | Merck Sharp & Dohme | Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina transportadora. |
CN117982633A (zh) | 2017-12-06 | 2024-05-07 | 默沙东有限责任公司 | 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法 |
CN108079286B (zh) * | 2018-01-19 | 2020-07-31 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用 |
US11530432B2 (en) | 2018-03-19 | 2022-12-20 | Northwestern University | Compositions and methods for rapid in vitro synthesis of bioconjugate vaccines in vitro via production and N-glycosylation of protein carriers in detoxified prokaryotic cell lysates |
SG11202106541WA (en) | 2018-12-19 | 2021-07-29 | Merck Sharp & Dohme | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
US20220211859A1 (en) | 2019-05-10 | 2022-07-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conjugate production |
US20220387614A1 (en) | 2019-11-22 | 2022-12-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Dosage and administration of a bacterial saccharide glycoconjugate vaccine |
EP3900739A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-27 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic streptococcus pneumoniae saccharide conjugates to conserved membrane protein |
EP3919076A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic oligosaccharide vaccines against streptococcus pneumoniae with microparticle adjuvant formulations |
WO2021250626A2 (en) | 2020-06-12 | 2021-12-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Dock tag system |
TW202245835A (zh) | 2021-02-04 | 2022-12-01 | 美商默沙東有限責任公司 | 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物 |
EP4297776A1 (en) | 2021-02-26 | 2024-01-03 | Biological E Limited | Activated-quenched polysaccharide and improved methods for quantification of polysaccharide in a vaccine composition |
EP4169513A1 (en) | 2021-10-19 | 2023-04-26 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Adjuvant composition comprising sting agonists |
WO2024062494A1 (en) | 2022-09-19 | 2024-03-28 | Biological E Limited | Method for the purification of capsular polysaccharides |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4324887A (en) * | 1978-08-16 | 1982-04-13 | President And Fellows Of Harvard College | Type II group B Streptococci polysaccharide |
US4221906A (en) * | 1979-03-19 | 1980-09-09 | American Cyanamid Company | Stabilization of pneumococcal polysaccharides |
US4242501A (en) * | 1979-08-08 | 1980-12-30 | American Cyanamid Company | Purification of pneumococcal capsular polysaccharides |
US4271147A (en) * | 1980-01-10 | 1981-06-02 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same |
IE51174B1 (en) * | 1980-04-14 | 1986-10-29 | Merck & Co Inc | Group b streptococcal capsular polysaccharides |
FR2495939B1 (fr) * | 1980-12-11 | 1985-10-11 | Merieux Inst | Procede de purification de polyosides de streptococcus pneumoniae et vaccin a base de polyosides ainsi purifies |
NL8202527A (nl) * | 1982-06-22 | 1984-01-16 | Univ Utrecht | Vaccins tegen door bacterien met kapsel-polysacchariden verwekte ziekten en werkwijze voor het bereiden daarvan. |
US4496538A (en) * | 1982-07-06 | 1985-01-29 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine |
US4619828A (en) * | 1982-07-06 | 1986-10-28 | Connaught Laboratories, Inc. | Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines |
US4644059A (en) * | 1982-07-06 | 1987-02-17 | Connaught Laboratories, Inc. | Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine |
US4459286A (en) * | 1983-01-31 | 1984-07-10 | Merck & Co., Inc. | Coupled H. influenzae type B vaccine |
US4686102A (en) * | 1984-04-12 | 1987-08-11 | American Cyanamid Company | Multivalent pneumococcal vaccine and preparation thereof |
US4882317A (en) * | 1984-05-10 | 1989-11-21 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency |
US4695624A (en) * | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
NZ214503A (en) * | 1984-12-20 | 1990-02-26 | Merck & Co Inc | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates |
IT1187753B (it) * | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
US4707543A (en) * | 1985-09-17 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Process for the preparation of detoxified polysaccharide-outer membrane protein complexes, and their use as antibacterial vaccines |
US4727136A (en) * | 1985-10-01 | 1988-02-23 | Canadian Patents And Development Ltd. | Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine |
ES2000034A6 (es) * | 1985-11-26 | 1987-10-01 | Schweiz Serum & Impfinst | Procedimiento para la preparacion de una vacuna viva contra paperas |
US4755381A (en) * | 1986-03-27 | 1988-07-05 | Swiss Serum And Vaccine Institute Berne | Klebsiella capsular polysaccharide vaccine |
EP0302887B1 (en) * | 1986-04-16 | 1994-06-22 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bacterial antigens, antibodies, vaccines, and methods of manufacture |
NZ223009A (en) * | 1986-12-31 | 1990-06-26 | Nl Rivm Of Thoven | Oligosaccharides containing d-ribose d-ribitol and phosphate units mimicing haemophilus influenzae type b antigens |
DE68915046T2 (de) * | 1988-04-19 | 1994-12-08 | American Cyanamid Co | Haemophilus influenzae Typ B Polysaccharid-Aussermembranprotein-Konjugat als Impfstoff. |
US5091300A (en) * | 1989-08-03 | 1992-02-25 | Merck & Co., Inc. | Radio-immuno assay for hepatitis b virus pres2 antibodies |
CA2059693C (en) * | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
JP2636128B2 (ja) * | 1993-02-03 | 1997-07-30 | 株式会社アマダメトレックス | パンチング金型 |
-
1992
- 1992-01-20 CA CA002059692A patent/CA2059692C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-01-21 IL IL11996192A patent/IL119961A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-01-21 IL IL10071692A patent/IL100716A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-01-21 IL IL11996292A patent/IL119962A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-01-22 NZ NZ241367A patent/NZ241367A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-01-23 SK SK199-92A patent/SK280659B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-01-23 CZ CS92199A patent/CZ283284B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-01-24 AU AU10467/92A patent/AU651656B2/en not_active Expired
- 1992-01-27 SI SI9210081A patent/SI9210081B/sl unknown
- 1992-01-27 ES ES92300655T patent/ES2121820T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-01-27 IE IE024492A patent/IE920244A1/en unknown
- 1992-01-27 DE DE69226668T patent/DE69226668T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-01-27 HU HUP9200252A patent/HU216101B/hu unknown
- 1992-01-27 MX MX9200328A patent/MX9200328A/es unknown
- 1992-01-27 EP EP92300655A patent/EP0497525B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-01-27 DK DK92300655.5T patent/DK0497525T4/da active
- 1992-01-27 NO NO920350A patent/NO304117B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-01-27 AT AT92300655T patent/ATE169825T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-01-27 KR KR1019920001108A patent/KR100243958B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-01-27 YU YU8192A patent/YU49068B/sh unknown
- 1992-01-27 FI FI920353A patent/FI107370B/fi active
- 1992-01-27 CN CN92100700A patent/CN1080124C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1992-01-28 JP JP4012941A patent/JPH0794472B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-20 US US08/246,394 patent/US5623057A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-03 IL IL11996197A patent/IL119961A0/xx unknown
- 1997-01-03 IL IL11996297A patent/IL119962A0/xx unknown
-
1999
- 1999-04-26 LV LVP-99-69A patent/LV12309B/en unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO304117B1 (no) | Konjugat av pneumokokkpolysakkarid og immunogent protein, fremgangsmÕte for fremstilling av konjugatet, samt vaksine som inneholder konjugatet | |
EP0497524B1 (en) | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae | |
EP0161188B1 (en) | Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency | |
US4830852A (en) | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins and methods of preparing such polysaccharides and conjugates | |
US4882317A (en) | Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency | |
US5371197A (en) | Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine | |
AU2015329590A1 (en) | An improved process of conjugation and novel synthetic oligosaccharide- protein conjugates obtained thereof | |
CA3139257A1 (en) | Conjugate production | |
EP3817775A1 (en) | Improvements in immunogenic conjugates |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |