JP2017505792A - 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート - Google Patents

免疫原性糖タンパク質コンジュゲート Download PDF

Info

Publication number
JP2017505792A
JP2017505792A JP2016551278A JP2016551278A JP2017505792A JP 2017505792 A JP2017505792 A JP 2017505792A JP 2016551278 A JP2016551278 A JP 2016551278A JP 2016551278 A JP2016551278 A JP 2016551278A JP 2017505792 A JP2017505792 A JP 2017505792A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sugar
conjugate
carrier protein
activated
oxo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2016551278A
Other languages
English (en)
Inventor
グー ジャンシン
グー ジャンシン
クマール カインサン ラジェシュ
クマール カインサン ラジェシュ
キム ジン−ホワン
キム ジン−ホワン
クリシュナ プラサド アヴァッリ
クリシュナ プラサド アヴァッリ
ヤン ユー−イン
ヤン ユー−イン
Original Assignee
ファイザー・インク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ファイザー・インク filed Critical ファイザー・インク
Publication of JP2017505792A publication Critical patent/JP2017505792A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids

Abstract

本発明は概して、（（２−オキソエチル）チオ））を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートに関する。一態様では、本発明は、式（Ｉ）を有する、（（２−オキソエチル）チオ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する［式中、Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり得、Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであり、前記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、またはプロピルから選択される］。本発明はさらに、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物を調製および使用するための方法に関する。【化１】

Description

本発明は概して、一般式（Ｉ）：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｂ、Ａ、およびＲは、下記に示す意味を有する］を有する、（（２−オキソエチル）チオ）（下記では「オキソ−ｅＴ」）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲート、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物を調製および使用するための方法に関する。
一実施形態では、上記スペーサーは、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサーではない。
免疫原性が不十分な分子の免疫原性を、これらの分子を「担体」分子にコンジュゲートすることによって増大させる手法は、数十年にわたって利用され、成功を収めてきた（例えば、Ｇｏｅｂｅｌら（１９３９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３を参照されたい）。例えば、この「担体効果」を利用することによって、より有効な免疫原性組成物を得るために、精製された莢膜状ポリマーが担体タンパク質にコンジュゲートされた多くの免疫原性組成物が記載されている。（Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：５８２〜５９１）。コンジュゲーションによって、遊離多糖で免疫化された場合に乳児において通常観察される不十分な抗体応答が回避されることも示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０７：３４６；Ｉｎｓｅｌら（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２９４）。
ホモ二官能性、ヘテロ二官能性、またはゼロ長架橋剤などの様々な架橋またはカップリング試薬を使用してコンジュゲートを生成することに成功している。糖、タンパク質、およびペプチドなどの免疫原性分子をペプチドまたはタンパク質担体にカップリングするために、現在、多くの方法が利用可能である。大部分の方法が、アミン、アミド、ウレタン、イソチオ尿素、もしくはジスルフィド結合、または場合によってはチオエーテルを生ずる。反応性部位を担体および／または免疫原性分子上の反応性アミノ酸分子の側鎖に導入する架橋またはカップリング試薬を使用する欠点は、中和されなければ、反応性部位が遊離であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（したがって、コンジュゲートの官能性または安定性に不利な影響を及ぼす可能性がある）、またはｉｎ ｖｉｖｏ（したがって、その調製物で免疫化されたヒトまたは動物において有害事象の潜在的なリスクをもたらす）のいずれかで、何らかの望ましくない分子と反応することである。これらの部位を不活性化させるように、様々な公知の化学反応を利用して、そのような過剰な反応性部位を反応させるか、または「キャッピングする」ことができるが、これらの反応は他の点で、コンジュゲートの官能性に対して破壊的であり得る。このことは特に、担体分子のより大きなサイズおよびより複雑な構造（免疫原性分子と比較して）によって、担体分子が化学的処理の破壊的作用に対してより脆弱になり得るので、反応性部位を担体分子に導入することによってコンジュゲートを得ようとする場合には問題となり得る。したがって、担体の官能性が維持され、コンジュゲートが所望の免疫応答を誘発する能力が保持されるように適切にキャッピングされた担体タンパク質コンジュゲートを調製する新たな方法が依然として必要とされている。
本発明は概して、（（２−オキソエチル）チオ））を含有するスペーサー（下記では、「オキソ−ｅＴ」とも名づけられる）を介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートに関する。
一態様では、本発明は、一般式（Ｉ）：
Figure 2017505792
 ［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり得、
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであり、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、またはプロピルから選択される］を有する、（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートに関する。
上記一般式（Ｉ）において、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレンは、２〜１６個の炭素原子を含有する直鎖を示す。適切な（Ｃ２〜Ｃ１６）アルキレンラジカルの例は、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、または（ＣＨ２）１０である。
上記一般式（Ｉ）において、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される同じかまたは異なるヘテロ原子で置き換えられている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。好ましい実施形態では、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞれ、酸素原子で置き換えられている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。好ましい実施形態では、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１、２、３、または４個がそれぞれ、酸素原子で置き換えられている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。適切なＣ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンの例は、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２である。
好ましい実施形態では、
Ｂは、Ｏであり、かつＡは、Ｃ（＝Ｏ）であるか、または
Ｂは、ＣＨ２であり、かつｍは、０であるか、または
Ｂは、Ｃ（＝Ｏ）であり、かつｍは、０であり、かつ／または
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、もしくはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレンであり、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２、もしくは３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、もしくはプロピルから選択されるか、または
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、もしくはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレンであり、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＨによって置換されていてもよい。
他の好ましい実施形態では、
Ｂは、Ｏであり、かつＡは、Ｃ（＝Ｏ）であるか、または
Ｂは、ＣＨ２であり、かつｍは、０であるか、または
Ｂは、Ｃ（＝Ｏ）であり、かつｍは、０であり、かつ／または
Ｒは、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、または（ＣＨ２）１０からなる群から選択される。
他の好ましい実施形態では、
Ｂは、Ｏであり、かつＡは、Ｃ（＝Ｏ）であるか、または
Ｂは、ＣＨ２であり、かつｍは、０であるか、または
Ｂは、Ｃ（＝Ｏ）であり、かつｍは、０であり、かつ／または、
Ｒは、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、およびＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、（（２−オキソエチル）チオ）（下記では「オキソ−ｅＴ」とも呼ばれる）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むが、ただし、上記スペーサーが、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサー（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）ではないことを条件とする。
本発明はさらに、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物を調製および使用するための方法に関する。
一態様では、本発明は、（（２−オキソエチル）チオ）または「オキソ−ｅＴ」スペーサーと本明細書において称される二価ヘテロ二官能性リンカーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法を対象とする。
一部の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、次の式を有する
１．式（ＩＩ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒは、（ＣＨ２）ｎであり、ｎは、３〜１０である］。
２．次の式（ＩＩＩ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
３．式（ＩＶ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）連結糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒは、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
４．式（Ｖ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）連結糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒは、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
好ましい実施形態では、本発明は、Ｒが、
（ＣＨ２）ｎ（ｎは、３〜１０から選択される）、
（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２（ｍは、１〜３から選択される）、
ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ（ｎは、１〜８から選択される）、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ（ｎは、１〜８から選択される）、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２（ｍは、１または２である）、
ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ（ｎは、１〜８から選択される）、または
−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２（ｍは、１または２である）
から選択される、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）（ＩＶ）、または（Ｖ）の糖コンジュゲートに関する。
糖と担体タンパク質またはペプチドとの間の構造的連結部の一部として（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを含む、上記で定義した糖コンジュゲートにおいて、上記スペーサーは、安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。
本発明の糖コンジュゲートは、糖と担体タンパク質またはペプチドとの間の構造的連結部の一部として（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを含み、上記スペーサーは、安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。加えて、コンジュゲートのスペーサー部分に対して免疫応答が生じるリスクを低下させるように、上記スペーサーは、比較的短いことが好ましい。コンジュゲートのスペーサー部分に対する免疫応答は望ましくなく、短いスペーサーは、上記リスクを最小化する利点を有する。したがって、一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、そのスペーサーの原子数（例えば、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶの中央枠内に含有される）が原子２５個以下である（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを含む。好ましくは、そのスペーサーの原子数（例えば、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶの中央枠内に含有される）は、原子２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６個である。なおより好ましくは、そのスペーサーの原子数（例えば、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶの中央枠内に含有される）は、１５個以下である（原子１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６個など）。
本発明はさらに、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲート、それを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物を使用するための方法を提供する。
一態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結され、その担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結された糖コンジュゲートを提供する。一実施形態では、上記オキソ−ｅＴＡＣスペーサーは、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサー（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）ではない。
一態様では、コンジュゲートにおいてオキソ−ｅＴＡＣスペーサーを生成するために、本明細書において使用する好ましいリンカーは、メルカプトプロピオニルヒドラジド（ＭＰＨ、ｎ＝２）、Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリド（ｎ＝１）、および２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ、ｎ＝２）、および４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリド（ｎ＝４）である。
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、アミン連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結され、その担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結された糖コンジュゲートを提供する。
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、アミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結され、その担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結された糖コンジュゲートを提供する。
一部の実施形態では、糖は、細菌に、特に病原細菌に由来する莢膜多糖細菌などの多糖である。他の実施形態では、糖は、オリゴ糖または単糖である。
本発明の糖コンジュゲートに組み込まれる担体タンパク質は、本明細書においてさらに記載されているか、または当業者に知られているとおりの、そのような目的に一般に適した担体タンパク質の群から選択される。特定の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）糖を、炭酸誘導体またはシアノゲン誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカー（保護されたまたは遊離チオール形態、例えば、ＤＬ−シスチンもしくはＤＬ−システインもしくはその塩、またはメルカプトプロピオニルヒドラジド、もしくは２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール、もしくは４−アミノ−１−ブタンチオールもしくはその塩として）と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する方法を提供する。
多くの実施形態では、ステップａ）を有機溶媒中で行う。
多くの実施形態では、炭酸誘導体は、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルマートである。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態では、チオール化糖を、活性化糖をヘテロ二官能性チオアルキルアミン試薬またはその塩と反応させることによって生成する。本発明の方法によって生成されるオキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートは、一般式（ＩＩおよびＩＩＩ）によって表され得る。
多くの実施形態では、第１のキャッピング試薬は、担体タンパク質のリシン残基上の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基と反応して、チオエーテル連結を介して活性化リシン残基に共有結合で連結されたＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）残基を形成するＮ−アセチル−Ｌ−システインである。他の実施形態では、第２のキャッピング試薬は、活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル基と反応して、キャッピングされたチオアセトアミドをもたらすヨードアセトアミド（ＩＡＡ）である。多くの場合に、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬および第２のキャッピング試薬の両方を用いるキャッピングを含む。ある種の実施形態では、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬としてＮ−アセチル−Ｌ−システイン、および第２のキャッピング試薬としてＩＡＡを用いるキャッピングを含む。
一部の実施形態では、キャッピングステップｅ）はさらに、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応を含む。
一部の実施形態では、ステップｄ）はさらに、活性化チオール化糖を活性化担体タンパク質と反応させる前に、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得ることを含む。多くの実施形態では、活性化担体タンパク質は、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む。
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）糖を、アルデヒド基を生成するための酸化試薬と反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、リンカーのアミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有する二官能性リンカーと反応させて、還元的アミノ化によってチオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを生成する方法を提供する。本発明の方法によって生成されたオキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートは、一般式（ＩＶ）によって表され得る。
チオール化多糖を生成するための上記の好ましい実施形態では、ｅＴＡＡＮリンカーのアミノ末端とさらに反応させる前に、多糖の第一級ヒドロキシル基を、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）／Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）試薬系によって酸化させる（図２またはその全体が記載されている場合と同様に参照によって本明細書に組み込まれる出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６０９３３を参照されたい）。
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされたカルボキシル含有糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）活性化糖を生成するためのカルボキシル基含有糖を、カルボジイミドまたはその誘導体と初めに反応させるステップと、ｂ）活性化糖を、アミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有するヘテロ二官能性リンカーと反応させて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を脱保護剤または還元剤（保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを生成する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされたカルボキシル官能化糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。例として、糖の第一級ヒドロキシルを初めに、ＴＥＭＰＯ／次亜塩素酸ナトリウムとの反応によってカルボキシルに変換することができた。
多くの実施形態では、カルボジイミド誘導体は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドである。好ましくは、カルボジイミド誘導体は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態では、活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーと反応させることによって、チオール化糖を生成する。本発明の方法によって生成されるオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートは、一般式（Ｖ）によって表され得る。カルボキシル含有糖を反応させるための上記の好ましい実施形態では、当初の活性化ステップを、ヘテロ二官能性ｅＴＡＡＤリンカーのアミノ末端との反応の前に、カルボジイミドおよびチアゾリジノンチオンによって達成する。別の実施形態では、当初のカルボン酸活性化ステップを、二官能性ｅＴＡＡＤリンカーのアミノ末端との反応前にＮ−エチル−３−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナート（Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ）によって達成する。
別の態様では、本発明は、本明細書において開示する方法のいずれかによって生成された、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。
本発明の態様のそれぞれで、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、細菌莢膜多糖、特に、病原細菌に由来する莢膜多糖である糖を含む。
例として、多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モラクセラカタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ポルフィロモナス−Ａ−ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ−Ａ−ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｄ群赤痢菌（Ｓｈｅｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、およびビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）からなる群から選択されるグラム陰性細菌に由来し得る。多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム結核（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択されるグラム陽性細菌に由来し得る。
一部の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する肺炎球菌（Ｐｎ）莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する髄膜炎菌（Ｍｎ）莢膜糖（オリゴ糖または多糖）を含む。具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ｘ莢膜多糖である。
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
特に好ましい実施形態では、糖は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖などの細菌莢膜多糖である。
本明細書に記載の組成物および方法は、様々な用途において有用である。例えば、本発明の糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物の生成において使用することができる。そのような免疫原性組成物は、受容者を、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）などの病原細菌による細菌感染から防御するために使用することができる。
したがって、別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物であって、その糖コンジュゲートが、本明細書に記載のとおりオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む免疫原性組成物を提供する。
多くの実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含み、糖コンジュゲートは、細菌莢膜多糖を含む。
一部のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ｘ莢膜多糖である。
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖などの細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。一部のそのような実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、アジュバントリン酸アルミニウムを含む。
別の態様では、本発明は、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、改善する方法であって、免疫有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、上記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む方法を提供する。
一実施形態では、感染症、疾患、または状態は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に関連し、糖コンジュゲートは、Ｐｎ莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、Ｍｎ莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）に関連し、糖コンジュゲートはそれぞれ、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖を含む。
他の態様では、本発明は、それぞれの場合に、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することにより、病原細菌に対する免疫応答を誘発するための方法；病原細菌に起因する疾患または状態を予防、処置、または改善するための方法；および病原細菌に起因する感染症、疾患、状態の少なくとも１つの症状の重症度を低下させるための方法であって、糖コンジュゲートが、病原細菌に由来する細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、糖コンジュゲートが、細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、上記方法は、本明細書においてさらに記載するとおり、対象において防御免疫応答を生じさせることを伴う。
別の態様では、本発明は、本明細書においてさらに記載するとおり、対象において防御免疫応答を生じさせるために、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫学的有効量の免疫原性組成物を対象に投与する方法を提供する。
さらなる一態様では、本発明は、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲート、またはそのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物に応答して産生される抗体を提供する。そのような抗体は、細菌検出および血清型判定などの研究および臨床検査室アッセイにおいて使用することができるか、または受動免疫を対象に付与するために使用することができる。
また別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）による感染症を予防、処置、または改善する際に使用するための本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）による感染症を予防、処置、または改善するための医薬品を調製するための、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物の使用を提供する。
上記の治療および／または予防方法ならびに使用のある種の好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結された細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法および使用の多くの実施形態では、細菌莢膜多糖は、Ｐｎ莢膜多糖またはＭｎ莢膜多糖またはＧＢＳ莢膜多糖または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖または腸球菌多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）である。一部のそのような実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
上記の治療および／または予防方法および使用のある種の実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結された細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法および使用のある種の実施形態では、細菌莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
上記の治療および／または予防方法および使用のある種の実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結された細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法および使用のある種の実施形態では、細菌莢膜多糖は、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。特に好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）莢膜多糖などの細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。
ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲートについて、本発明のオキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを調製するための一般スキームである。 ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲートについて、本発明のオキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを調製するための一般スキームである。 ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲートについて、本発明のオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを調製するための一般スキームである。 ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲートについて、チアゾリジノンチオン誘導体を使用して本発明のオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを調製するための一般スキームである。 肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型３３Ｆ（Ｐｎ−３３Ｆ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造である。 肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型２２Ｆ（Ｐｎ−２２Ｆ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造である。 肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１０Ａ（Ｐｎ−１０Ａ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造である。 肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１１Ａ（Ｐｎ−１１Ａ）莢膜多糖の繰り返し多糖構造である。
本発明の好ましい実施形態の次の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解され得る。別段に定義しない限り、本明細書において使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記載したものと同様また同等の任意の方法および材料を本発明の実行および試験において使用することができるが、いくつかの好ましい方法および材料を本明細書において記載する。実施形態を記載し、かつ本発明を特許請求する際には、いくつかの専門用語を、下記に提示する定義に従って使用することとする。
本明細書において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段に示さない限り、複数の言及を含む。したがって、本開示を読めば当業者には明らかであろうとおり、例えば、「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ（方法）」という言及は、本明細書に記載の種類の１つまたは複数の方法および／またはステップを含み、「ａｎ ｏｘｏ−ｅＴ ｓｐａｃｅｒ（オキソ−ｅＴスペーサー）」という言及は、１個または複数のｅＴスペーサーを指している。
本明細書において使用する場合、「約」という用語は、述べられている濃度範囲、時間枠、分子量、温度、またはｐＨなどの値の統計的に有意な範囲内であることを意味する。そのような範囲は、指示値または範囲のある程度の範囲内、典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、なおより典型的には５％以内であり得る。時には、そのような範囲は、所与の値または範囲を測定または決定するために使用される標準的な方法に典型的な実験誤差の範囲内であり得る。「約」という用語に包含される許容できる変化は、研究中の特定の系に依存するはずであり、当業者には容易に認められ得る。範囲が本出願内において列挙されている場合には常に、その範囲内の全整数のそれぞれも、本発明の実施形態として企図される。
本開示において、「含む」、「含まれる」、「含むこと」、「含有する」、「含有すること」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し得ることに注意する；例えば、それらは、「含む」、「含まれる」、「含むこと」などを意味し得る。そのような用語は、任意の他の構成要素を排除することなく、特定の構成要素または構成要素のセットを含むことを指す。「本質的に〜からなること」および「本質的に〜からなる」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し、例えば、それらは、本発明の新規または基本的な特性を損なうことがない追加の構成要素またはステップの包含を許容し、すなわち、それらは、本発明の新規または基本的な特性を損なう追加の列挙されていない構成要素またはステップを排除する。「からなる」および「からなること」という用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有する；すなわち、これらの用語は、閉鎖型（ｃｌｏｓｅｄ ｅｎｄｅｄ）である。したがって、これらの用語は、特定の構成要素または構成要素のセットの包含と、他の構成要素すべての排除とを指す。
「糖」という用語は、本明細書において使用する場合、多糖、オリゴ糖、または単糖を指し得る。多くの場合に、糖に対する言及は、細菌莢膜多糖、特に、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）などの病原細菌に由来する莢膜多糖を指す。
「コンジュゲート」または「糖コンジュゲート」という用語は、担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を指すために、本明細書において互換的に使用される。本発明の糖コンジュゲートは時折本明細書において、「オキソ−ｅＴ連結」糖コンジュゲートと称され、これは、少なくとも１個のオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む。本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲート、およびそれを含む免疫原性組成物は、多少の量の遊離糖を含有し得る。
「遊離糖」という用語は、本明細書において使用する場合、担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートしていない糖、または高い糖／タンパク質比（＞５：１）で結合した非常に少ない担体タンパク質に共有結合で結合しているが、それにも関わらず、糖コンジュゲート組成物中に存在する糖を意味する。遊離糖は、コンジュゲートされた糖−担体タンパク質糖コンジュゲートと非共有結合で会合し得る（すなわち、非共有結合で結合するか、それに吸着されるか、またはそれに捕捉され得る）。本明細書において、「遊離多糖」および「遊離莢膜多糖」という用語が、糖がそれぞれ多糖または莢膜多糖である糖コンジュゲートに関して同じ意味を伝えるために使用されることがある。
本明細書において使用する場合、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートされる」、および「コンジュゲートすること」は、糖、例えば、細菌莢膜多糖を担体分子または担体タンパク質に共有結合で結合するプロセスを指す。本発明の方法において、糖は、少なくとも１個のオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされている。コンジュゲーションは、下記の方法によって、または当技術分野で公知の他のプロセスによって行うことができる。担体タンパク質へのコンジュゲーションは、細菌莢膜多糖の免疫原性を増強する。
糖コンジュゲート
本発明は、１個または複数のオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、カルバマートまたはアミンまたはアミド連結を介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合でコンジュゲートされ、その担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合でコンジュゲートされた糖コンジュゲートに関する。
１個または複数のオキソ−ｅＴスペーサーの存在に加えて、本発明の糖コンジュゲートの新規の特徴には、糖および得られたオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートの分子量プロファイル、担体タンパク質１個当たりのコンジュゲートされたリシンとオキソ−ｅＴスペーサー（複数可）を介して多糖に共有結合で連結されたリシンとの比、糖の繰り返し単位を関数とした担体タンパク質と糖との間の共有結合連結の数、および糖の全体量と比較した遊離糖の相対量が含まれる。
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、下記で例示されるとおり、一般式（Ｉ）によって表され得る：
Figure 2017505792
 ［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり得、
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであり、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、またはプロピルから選択される］。
上記一般式（Ｉ）において、Ｃ２〜Ｃ１０アルキレンは、２〜１０個の炭素原子を含有する直鎖または分枝基を示す。適切な（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキレンラジカルの例は、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、ＣＨ２−（ＣＨ−ＣＨ３）−ＣＨ２、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、（ＣＨ２）１０、（ＣＨ２）２−（ＣＨ−ＣＨ３）−（ＣＨ２）２である。
上記一般式（Ｉ）において、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される同じかまたは異なるヘテロ原子で置き換えられている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。好ましい実施形態では、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞれ酸素原子で置き換えられている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。適切なＣ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレンの例は、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２である。
一実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、
Ｒ＝（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２（ｎ＝１〜５）または
Ｒ＝（ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ（ｎ＝１〜４）または
Ｒ＝Ｏ（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ（ｎ＝１〜４）である、上記一般式（Ｉ）によって表され得る。
オキソ−ｅＴＡＣスペーサーは、糖と担体タンパク質との間の安定なカルバマート、チオエーテル、およびアミド結合をもたらす。オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートの合成は、糖へのカルバマート連結を形成してチオール化糖をもたらす、糖の活性化ヒドロキシル基とチオアルキルアミン試薬のアミノ基との反応を伴う。１個または複数の遊離スルフヒドリル基の生成を還元剤との反応によって達成して、活性化チオール化糖（チオールが保護されている場合）を得る。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基と、アミン含有残基上に１個または複数のα−ハロアセトアミド基を有する活性化担体タンパク質との反応はチオエーテル結合を生成して、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド結合を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに結合しているコンジュゲートを生ずる。
ｅＴスペーサーのサブグループの１つであるオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーは、糖と担体タンパク質との間に安定なアミン、チオエーテル、およびアミド結合をもたらす。糖を初めに、過ヨウ素酸塩でビシナルなジオール基を酸化させるか、またはＴＥＭＰＯおよび酸化剤の組合せで第一級ヒドロキシル基を酸化させることによって活性化させて、アルデヒド基を生成する。第一級ヒドロキシル基の酸化が、過ヨウ素酸塩酸化よりも好ましい。これは、鎖切断を伴わず、それによって、軽微なエピトープ改変をもたらすためである。オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートの合成は、糖へのアミン連結を形成してチオール化糖をもたらす、活性化糖アルデヒドと、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーのアミノ基との反応を伴う。１個または複数の遊離スルフヒドリル基の生成を、還元剤との反応によって達成して、活性化チオール化糖を得る（チオールが保護されている場合）。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基と、アミン含有残基上に１個または複数のα−ハロアセトアミド基を有する活性化担体タンパク質との反応は、チオエーテル結合を生成して、担体タンパク質がチオエーテルおよびアミド結合を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに結合しているコンジュゲートを生ずる。
オキソ−ｅＴスペーサーのサブグループの１つであるオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーは、糖と担体タンパク質との間に安定なチオエーテルおよびアミド結合をもたらす。オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートの合成は、糖へのアミド連結を形成して、チオール化糖をもたらす、糖の活性化カルボキシル基と、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーのアミノ基との反応を伴う。１個または複数の遊離スルフヒドリル基の生成を、還元剤との反応により達成して、活性化チオール化糖を得る（チオールが保護されている場合）。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基と、アミン含有残基上に１個または複数のα−ハロアセトアミド基を有する活性化担体タンパク質との反応は、チオエーテル結合を生成して、担体タンパク質がチオエーテルおよびアミド結合を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに結合しているコンジュゲートを生ずる。
本発明の糖コンジュゲートにおいて、糖は、多糖、オリゴ糖、または単糖であってよく、担体タンパク質は、本明細書においてさらに記載するとおりか、または当業者に知られている任意の適切な担体から選択され得る。多くの実施形態では、糖は、細菌莢膜多糖である。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
一部のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。他の実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１０Ａ、１１Ａ、２２Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。そのような一実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−３３Ｆ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−２２Ｆ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−１０Ａ莢膜多糖である。また別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−１１Ａ莢膜多糖である。
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。そのような一実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ−Ａ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ−Ｃ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ−Ｗ１３５莢膜多糖である。また別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ−Ｙ莢膜多糖である。別の具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ｘ莢膜多糖である。
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するＧＢＳ莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される。そのような一実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−Ｉａ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−Ｉｂ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−ＩＩ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−ＩＩＩ莢膜多糖である。また別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−Ｖ莢膜多糖である。
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
特に好ましい実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎ細菌莢膜多糖、例えば、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、もしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、もしくはＹ莢膜多糖、またはＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖を含む。
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５もしくは８莢膜多糖、またはエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）もしくはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖を含む。
一部の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含み、その糖は、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他のそのような実施形態では、糖は、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。さらにそのような実施形態では、糖は、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間の分子量を有する。一部のそのような実施形態では、糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、もしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、もしくはＹ莢膜多糖、またはＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＶ莢膜多糖などの細菌莢膜多糖であり、その莢膜多糖は、上記のとおりの分子量範囲のいずれかに該当する分子量を有する。一部の他の実施形態では、糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からの莢膜多糖（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖）、または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）からの莢膜多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖など）などの細菌莢膜多糖であり、その莢膜多糖は、上記のとおりの分子量範囲のいずれかに該当する分子量を有する。
一部の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、２００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。なお他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、１，０００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間の分子量を有する。
さらなる実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、２００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａおよび１２，５００ｋＤａの間；７５０ｋＤａおよび１０，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａおよび７，５００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの間；または２，０００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間の分子量を有する。
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを特徴づける別の方法は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して糖にコンジュゲートされることとなった担体タンパク質中のリシン残基の数による方法であり、これは、コンジュゲートされたリシンの範囲として特徴づけられ得る。
多くの実施形態では、担体タンパク質は、担体タンパク質上のリシン残基の１個または複数のε−アミノ基へのアミド連結を介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合でコンジュゲートされる。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、糖に共有結合でコンジュゲートされた２〜２０個のリシン残基を含む。他のそのような実施形態では、担体タンパク質は、糖に共有結合でコンジュゲートされた４〜１６個のリシン残基を含む。
好ましい実施形態では、担体タンパク質は、３９個のリシン残基を含有するＣＲＭ１９７を含む。一部のそのような実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち４〜１６個のリシン残基を、糖に共有結合で連結された形で含み得る。このパラメーターを別の方法で表すと、ＣＲＭ１９７リシンの約１０％〜約４１％が糖に共有結合で連結されている、となる。別のそのような実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち２〜２０個のリシン残基を、糖に共有結合で連結された形で含み得る。このパラメーターを別の方法で表すと、ＣＲＭ１９７リシンの約５％〜約５０％が糖に共有結合で連結されている、となる。
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートはまた、糖と担体タンパク質との比（重量／重量）によって特徴づけられ得る。一部の実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．２〜４の間である。他の実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１．０〜２．５の間である。さらなる実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．４〜１．７の間である。一部のそのような実施形態では、糖は細菌莢膜多糖であり、かつ／または担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
糖コンジュゲートはまた、糖の繰り返し単位の関数として、担体タンパク質と糖との間の共有結合連結の数によって特徴づけられ得る。一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、多糖の糖繰り返し単位４個ごとに、少なくとも１個の担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結を含む。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位１０個ごとに少なくとも１回起こる。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位１５個ごとに少なくとも１回起こる。さらなる一実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位２５個ごとに少なくとも１回起こる。
多くの実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、オキソ−ｅＴスペーサーを介してのＣＲＭ１９７と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位４、１０、１５、または２５個ごとに少なくとも１回起こる。
コンジュゲーションについての重要な検討事項は、糖エピトープの一部を形成し得るＯ−アシル、ホスファート、またはグリセロールホスファート側鎖などの個々の構成要素の潜在的に感受性の非糖置換基官能基の保持を可能にする条件の開発である。
一実施形態では、糖コンジュゲートは、１０〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する糖を含む。一部のそのような実施形態では、糖は、５０〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する。他のそのような実施形態では、糖は、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する。さらなる実施形態では、糖は、７０％以上（≧７０％）のＯ−アセチル化度を有する。
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされていないが、それにも関わらず、糖コンジュゲート組成物中に存在する遊離糖を含有し得る。遊離糖は、糖コンジュゲートと非共有結合で会合し得る（すなわち、非共有結合で結合するか、それに吸着されるか、またはそれに捕捉され得る）。
一部の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、糖の合計量に対して、遊離糖約４５％未満、遊離糖約４０％未満、遊離糖約３５％未満、遊離糖約３０％未満、遊離糖約２５％未満、遊離糖約２０％未満、遊離糖約１５％未満、遊離糖約１０％未満、または遊離糖約５％未満を含む。好ましくは、糖コンジュゲートは、遊離糖１５％未満、より好ましくは遊離糖１０％未満、いっそうより好ましくは、遊離糖５％未満を含む。
ある種の好ましい実施形態では、本発明は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた莢膜多糖、好ましくは、ＰｎまたはＭｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートであって、単独か、または組み合わせで、次の特徴の１つまたは複数を有するオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する：多糖が、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有し；糖コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１０，０００ＫＤａの間の分子量を有し；担体タンパク質が、糖に共有結合で連結された２〜２０個のリシン残基を含み；糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４の間であり；糖コンジュゲートが、多糖の糖繰り返し単位４、１０、１５、または２５個ごとに、少なくとも１個の担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結を含み；糖が、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有し；コンジュゲートが、多糖の合計に対して、遊離多糖約１５％未満を含み；担体タンパク質がＣＲＭ１９７であり；莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖から選択されるか、または莢膜多糖が、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹ莢膜多糖から選択される。
ある種の好ましい実施形態では、本発明は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた莢膜多糖、好ましくは、ＰｎまたはＭｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートであって、単独か、または組み合わせで、次の特徴の１つまたは複数を有するオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する：多糖が５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有し；糖コンジュゲートが５００ｋＤａ〜１０，０００ＫＤａの間の分子量を有し；担体タンパク質が、糖に共有結合で連結された２〜２０個のリシン残基を含み；糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４の間であり；糖コンジュゲートが、多糖の糖繰り返し単位４、１０、１５、または２５個ごとに、少なくとも１個の担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結を含み；糖が、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有し；コンジュゲートが、多糖の合計に対して、遊離多糖約１５％未満を含み；担体タンパク質がＣＲＭ１９７であり；莢膜多糖が、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＶ莢膜多糖、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５もしくは８莢膜多糖、またはエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）もしくはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖から選択される。
オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、それらの分子サイズ分布（Ｋｄ）によっても特徴づけられ得る。コンジュゲートの分子サイズは、セファロースＣＬ−４Ｂ固定相サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）媒体によって、高圧液体クロマトグラフィー系（ＨＰＬＣ）を使用して決定される。Ｋｄ決定では、クロマトグラフィーカラムを初めに、ボイド体積または合計排除体積を表すＶ０、および粒子間体積としても知られている、試料中で最小の分子が溶離する体積を表すＶｉを決定するために較正する。すべてのＳＥＣ分離は、Ｖ０からＶｉの間で起こる。収集された各画分でのＫｄ値は、次の式によって決定される：Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖｉ）／（Ｖｉ−Ｖ０）[式中、Ｖｅは、化合物の保持体積を表す］。≦０．３を溶離する画分％（主なピーク）が、コンジュゲートＫｄ（分子サイズ分布）を定義する。一部の実施形態では、本発明は、≧３５％の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有するオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。他の実施形態では、本発明は、≧１５％、≧２０％、≧２５％、≧３０％、≧３５％、≧４０％、≧４５％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、または≧９０％の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有するオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒドリル残基を含有し得る。一部の事例では、本明細書において提供する方法によって形成される活性化チオール化糖は、複数の遊離スルフヒドリル残基を含有するはずであり、その一部は、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質に共有結合でコンジュゲーションされ得ない。潜在的に反応性の官能基をキャッピングするために、そのような残留遊離スルフヒドリル残基を、チオール反応性キャッピング試薬、例えば、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）との反応によってキャッピングする。他のチオール反応性キャッピング試薬、例えば、マレイミド含有試薬なども企図される。
加えて、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、キャッピングプロセスステップ中に改変を施されている活性化担体タンパク質を含み得る残留非コンジュゲート担体タンパク質を含有し得る。
本発明の糖コンジュゲートは、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）などの病原細菌による細菌感染症から受容者を防御するための免疫原性組成物の生成において使用することができる。したがって、別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物であって、その糖コンジュゲートが、本明細書に記載のとおり、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む免疫原性組成物を提供する。
多くの実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含み、その糖コンジュゲートは、細菌莢膜多糖を含む。
一部のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するＧＢＳ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
特に好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳ莢膜多糖などの細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。一部のそのような実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントリン酸アルミニウムを含む。
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよびそれらを含む免疫原性組成物は、多少の量の遊離糖を含み得る。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、多糖の合計量と比較して、遊離多糖約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、遊離糖１５％未満、より好ましくは遊離糖１０％未満、いっそうより好ましくは遊離糖５％未満を含む。
別の態様では、本発明の糖コンジュゲートまたは免疫原性組成物は、動物有効性モデルにおける、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に機能的である抗体を生成するために使用することができる。細菌莢膜多糖を含む本発明の糖コンジュゲートは、そのような細菌莢膜多糖に対する抗体の生成において使用することができる。続いて、そのような抗体を、細菌検出および血清型判定などの研究および臨床検査室アッセイにおいて使用することができる。そのような抗体は、受動免疫を対象に付与するために使用することもできる。一部の実施形態では、細菌多糖に対して生成された抗体は、動物有効性モデルまたはオプソニン作用性死滅アッセイのいずれかにおいて機能的である。
本明細書に記載のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物はまた、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善するための様々な治療方法または予防方法において使用することができる。特に、病原細菌からの細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを、病原細菌に起因する、対象における細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善するために使用することができる。
したがって、一態様では、本発明は、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法であって、免疫有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、上記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む方法を提供する。
一実施形態では、感染症、疾患、または状態は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に関連し、糖コンジュゲートは、Ｐｎ莢膜多糖を含む。一部のそのような実施形態では、感染症、疾患、または状態は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、胸膜蓄膿症、結膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂巣炎、軟部組織感染症、および脳腫瘍からなる群から選択される。
別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、Ｍｎ莢膜多糖を含む。一部のそのような実施形態では、感染症、疾患、または状態は、髄膜炎、髄膜炎菌血症、菌血症、および敗血症からなる群から選択される。
別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖を含む。
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、その糖コンジュゲートが細菌莢膜多糖を含む方法を提供する。
また別の態様では、本発明は、対象において、病原細菌に起因する疾患または状態を予防、処置、または改善するための方法であって、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与すること含み、糖コンジュゲートが細菌莢膜多糖を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、病原細菌の感染に起因する疾患または状態の少なくとも１つの症状の重症度を低減するための方法であって、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、その糖コンジュゲートが、細菌莢膜多糖、例えば、ＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与して、本明細書においてさらに記載するとおり、対象において防御免疫応答を生じさせる方法を提供する。
また別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）による感染症を予防、処置、または改善する際に使用するための、本明細書に記載のとおりの本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）による感染症を予防、処置、または改善するための医薬品を調製するための、本明細書に記載のとおりの本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物の使用を提供する。
上記の治療および／または予防方法および使用では、免疫原性組成物は多くの場合に、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結された細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法の多くの実施形態では、細菌莢膜多糖は、Ｐｎ莢膜多糖またはＭｎ莢膜多糖またはＧＢＳ莢膜多糖または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）である。一部のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、莢膜多糖は選択され、莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。特に好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖などの細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。
加えて、本発明は、それぞれの場合に、対象に、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を投与することによる、対象において肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）に対する免疫応答を誘発するための方法、対象において肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）に起因する感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善するための方法、および対象において肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）の感染に起因する感染症、疾患、または状態の少なくとも１つの症状の重症度を低減するための方法であって、糖コンジュゲートが、それぞれ肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）に由来する細菌莢膜多糖を含む方法を提供する。
糖
糖には、多糖、オリゴ糖、および単糖が含まれ得る。多くの実施形態では、糖は、多糖、特に、細菌莢膜多糖である。莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な技術によって調製される。
本発明では、莢膜多糖を、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）のＰｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから調製することができる。一実施形態では、各肺炎球菌多糖血清型を、大豆ベースの培地中で増殖させることができる。個々の多糖を、遠心分離、沈殿、限外濾過、および／またはカラムクロマトグラフィーによって精製する。本明細書においてさらに記載するとおり、精製多糖を、オキソ−ｅＴスペーサーと反応し得るように活性化させ、次いで、本発明の糖コンジュゲートに組み込むことができる。
莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物において使用するための検討事項である。高分子量莢膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープの比較的高い価によって、確実な抗体免疫応答を誘発し得る。高分子量莢膜多糖の単離および精製が、本発明のコンジュゲート、組成物、および方法において使用するために企図される。
一部の実施形態では、糖は、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他のそのような実施形態では、糖は、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、糖は、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間の分子量を有する。一部のそのような実施形態では、糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、もしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、もしくはＹ莢膜多糖、またはＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖、または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）などの細菌莢膜多糖であり、その莢膜多糖は、上記の分子量範囲の１つに該当する分子量を有する。
一部の実施形態では、本発明の糖をＯ−アセチル化する。一部の実施形態では、糖コンジュゲートは、１０〜１００％の間、２０〜１００％の間、３０〜１００％の間、４０〜１００％の間、５０〜１００％の間、６０〜１００％の間、７０〜１００％の間、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、または８０〜９０％の間のＯ−アセチル化度を有する糖を含む。他の実施形態では、Ｏ−アセチル化度は、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、または≧９０％、または約１００％である。
一部の実施形態では、本発明の莢膜多糖、糖コンジュゲート、または免疫原性組成物を、動物有効性モデル、または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン作用性死滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に機能的である抗体を生成するために使用する。
莢膜多糖は、当業者に知られている単離手順を使用して、細菌から直接得ることができる。例えば、その全体が記載されている場合と同様に、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれるＦｏｕｒｎｉｅｒら（１９８４）、前出；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８７）Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５６１〜５６７；米国特許出願公開第２００７／０１４１０７７号；および国際特許出願ＷＯ００／５６３５７を参照されたい。加えて、これらは、合成プロトコルを使用して生成することができる。さらに、莢膜多糖を、同じく当業者に知られている遺伝子操作手順を使用して組換えによって生成することができる（その全体が記載されている場合と同様に、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれるＳａｕら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：２３９５〜２４０５；および米国特許第６，０２７，９２５号を参照されたい）。
本発明の糖コンジュゲートにおいて使用される個々の多糖を作製するために使用される肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）の菌株は、確立された培養物収集または臨床試料から得ることができる。
担体タンパク質
本発明の糖コンジュゲートの別の構成要素は、糖がコンジュゲートされた担体タンパク質である。「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。担体タンパク質は好ましくは、非毒性および非反応誘導性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり、十分な量および純度で得ることができるタンパク質である。担体タンパク質は、標準的コンジュゲーション手順のために修正可能であるべきである。本発明の新規の糖コンジュゲートでは、担体タンパク質は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して糖に共有結合で連結されている。
担体へのコンジュゲーションによって、抗原、例えば、細菌莢膜多糖などの細菌抗原の免疫原性が増強し得る。抗原のための好ましいタンパク質担体は、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）からの毒素、類毒素、または毒素の任意の変異交差反応性物質（ＣＲＭ）である。一実施形態では、特に好ましい担体は、ＣＲＭ１９７タンパク質を産生するジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）に由来するジフテリア毒素ＣＲＭ１９７である。この株は、ＡＴＣＣ受入番号５３２８１を有する。ＣＲＭ１９７を生成するための方法は、その全体が記載されている場合と同様に参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６１４，３８２号において記載されている。
別法では、タンパク質担体または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用することができる。例えば、ハプテン抗原を、細菌毒素、類毒素、またはＣＲＭのＴ細胞エピトープにカップリングさせることができる。その全体が記載されている場合と同様に参照によって本明細書に組み込まれる、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ａ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ ａｓ ａ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆｏｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」と題された１９８８年２月１日出願の米国特許第１５０，６８８号を参照されたい。他の適切な担体タンパク質には、コレラ類毒素（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａなどの不活性化細菌毒素が含まれる。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着タンパク質（ＰｓａＡ）、またはヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄなどの細菌外膜タンパク質も使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用することができる。
一実施形態では、好ましい担体は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド）もしくはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の非毒性だが、抗原としては同一のバリアント）、他のＤＴ変異体（ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８；３８３８〜３８４４、１９７３）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、またはＣＲＭ１０７；およびＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによってＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ、１９９２において記載された他の変異；Ｇｌｕ−１４８からＡｓｐ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒおよび／またはＡｌａ１５８からＧＩｙへの欠失または変異、および米国特許第４７０９０１７号または米国特許第４９５０７４０号において開示された他の変異；少なくとも１個以上の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０、および／またはＬｙｓ５３４の変異、ならびに米国特許第５９１７０１７号または米国特許第６４５５６７３号において開示された他の変異；または米国特許第５８４３７１１号において開示された断片など）、いくつかの様式で無毒化されたｐｌｙを含む肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ６３；２７０６〜１３）、例えば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）、ｄＰＬＹ−ホルモール、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含むＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、またはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５またはＷＯ００／３９２９９において開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体、Ｐｈｔ Ａ−Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）、ＯＭＰＣ（髄膜炎菌外膜タンパク質、通常、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出、欧州特許第０３７２５０１号）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質、例えば、欧州特許第０ ５９４ ６１０ Ｂ号を参照されたい）、またはその免疫学的機能性同等体、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号、欧州特許第０４２７３４７号）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、欧州特許第０４７１ １７７号）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来の抗原からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１；３８１６〜３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２；４８８４〜７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌付着タンパク質（ＰｓａＡ）、組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（特に、その非毒性変異体（グルタミン酸５５３に置換を有する外毒素Ａなど（Ｕｃｈｉｄａ Ｃａｍｅｒｏｎ ＤＭ、ＲＪ Ｃｏｌｌｉｅｒ．１９８７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４９６７〜４９７１））からなる群において選択される。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用することができる。他の適切な担体タンパク質には、コレラ類毒素（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａなどの不活性化細菌毒素が含まれる。
一実施形態では、担体は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合体（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７において記載のもの）、無毒化ニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群において選択される。
好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、例えば、欧州特許第０ ５９４ ６１０ Ｂ号を参照されたい）である。
最も好ましい実施形態では、本発明の莢膜糖を、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートする。
したがって、多くの実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として含み、莢膜多糖は、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合で連結され、ＣＲＭ１９７は、タンパク質の活性化アミノ酸残基によって形成されるアミド連結、典型的には、１個または複数のリシン残基のε−アミン基を介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合で連結されている。
糖にコンジュゲートされることとなった担体タンパク質中のリシン残基の数を、コンジュゲートされたリシンの範囲として特徴づけることができる。例えば、免疫原性組成物の一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち４〜１６個のリシン残基を、糖に共有結合で連結された形で含み得る。このパラメーターを別の方法で表すと、ＣＲＭ１９７リシンの約１０％〜約４１％が糖に共有結合で連結されている、となる。他の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち２〜２０個のリシン残基を、糖に共有結合で連結された形で含み得る。このパラメーターを別の方法で表すと、ＣＲＭ１９７リシンの約５％〜約５０％が糖に共有結合で連結されている、となる。
担体タンパク質上のリシンへの糖鎖の結合頻度は、本発明の糖コンジュゲートを特徴づけるための別のパラメーターである。例えば、一部の実施形態では、多糖の糖繰り返し単位４個ごとに、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は少なくとも１個である。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位１０個ごとに少なくとも１回起こる。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位１５個ごとに少なくとも１回起こる。さらなる実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位２５個ごとに少なくとも１回起こる。
多くの実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のオキソ−ｅＴスペーサーを介しての共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位４、１０、１５、または２５個ごとに少なくとも１回起こる。一部のそのような実施形態では、多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）もしくは髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）もしくはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖、または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）に由来する細菌莢膜多糖である。
他の実施形態では、コンジュゲートは、糖繰り返し単位５〜１０個ごとに；糖繰り返し単位２〜７個ごとに；糖繰り返し単位３〜８個ごとに；糖繰り返し単位４〜９個ごとに；糖繰り返し単位６〜１１個ごとに；糖繰り返し単位７〜１２個ごとに；糖繰り返し単位８〜１３個ごとに；糖繰り返し単位９〜１４個ごとに；糖繰り返し単位１０〜１５個ごとに；糖繰り返し単位２〜６個ごとに、糖繰り返し単位３〜７個ごとに；糖繰り返し単位４〜８個ごとに；糖繰り返し単位６〜１０個ごとに；糖繰り返し単位７〜１１個ごとに；糖繰り返し単位８〜１２個ごとに；糖繰り返し単位９〜１３個ごとに；糖繰り返し単位１０〜１４個ごとに；糖繰り返し単位１０〜２０個ごとに；または糖繰り返し単位４〜２５個ごとに、少なくとも１個の担体タンパク質と糖との間の共有結合連結を含む。
別の実施形態では、多糖の糖繰り返し単位２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個ごとに、少なくとも１個の担体タンパク質と糖との間の連結が起こる。
オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを作製するための方法
オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを作製するための方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。安定なカルバマート、チオエーテル、およびアミド結合を含むオキソ−ｅＴＡＣスペーサーは、糖および担体タンパク質を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＣスペーサーの一方の末端は、カルバマート連結を介して糖のヒドロキシル基に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴＡＣスペーサーの他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、典型的にはε−リシン残基に共有結合で結合される。
活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた多糖を含む本発明の糖コンジュゲートを調製する代表的な経路を図１に示す。
オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを作製するための方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーは、安定なアミン、チオエーテル、およびアミドを含有し、糖および担体タンパク質を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーの一方の末端は、アミン連結を介して糖の炭素原子に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーの他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、典型的にはε−リシン残基に共有結合で結合される。
活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた多糖を含む本発明の糖コンジュゲートを調製する代表的な経路を図２に示す。
オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製する方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーは、安定なアミド、チオエーテル、およびアミド結合を含有し、糖および担体タンパク質を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーの一方の末端は、アミド連結を介して糖のカルボキシル基に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーの他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、典型的にはε−リシン残基に共有結合で結合される。
活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた多糖を含む本発明の糖コンジュゲートを調製する代表的な経路を図３に示す。
チアゾリジノン活性化経路を介してオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製するための方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーは、安定なアミド、チオエーテル、およびアミド結合を含有し、糖および担体タンパク質を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーの一方の末端は、アミド連結を介して糖のカルボキシル基に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーの他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、典型的にはε−リシン残基に共有結合で結合される。
チアゾリジノン活性化を介して、活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた多糖を含む本発明の糖コンジュゲートを調製する代表的な経路を、図４に示す。
オキソ−ｅＴスペーサープロセスを使用して改変され得る部位を有する、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する代表的な細菌莢膜多糖、肺炎球菌血清型３３Ｆ、１０Ａ、１１Ａ、および２２Ｆ多糖の化学構造を、それぞれ図５、図６、図７、および図８に示す。
一態様では、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを作製する方法は、ａ）糖を、有機溶媒中で１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）などの炭酸誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を有するヘテロ二官能性リンカーまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する。
特に好ましい実施形態では、上記方法は、ａ）Ｐｎ−３３Ｆ莢膜多糖を、有機溶媒中でＣＤＴまたはＣＤＩと反応させて、活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｂ）活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、アミンおよびチオール官能基を有するヘテロ二官能性リンカーまたはその塩と反応させて、チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｃ）チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む活性化ＣＲＭ１９７担体タンパク質と反応させて、チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ブロモアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイン；および（ｉｉ）活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬としてのヨードアセトアミドと反応させるステップとを含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７糖コンジュゲートを生成する。
多くの実施形態では、炭酸誘導体は、ＣＤＴまたはＣＤＩまたはＤＳＣまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルマートである。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。チオール化および／またはコンジュゲーションステップの前に、活性化糖の凍結乾燥は必要ない。
好ましい実施形態では、チオール化糖を、活性化糖を二硫化物形態、またはその塩での二官能性対称チオアルキルアミン試薬と反応させることによって生成する。この試薬の潜在的な利点は、二硫化物形態の対称チオアルキルアミンリンカーが活性化糖の２個の分子と反応することができ、したがって、ジスルフィド結合を還元すると、チオアルキルアミンの分子１個当たりチオール化糖の分子２個を形成することである。別法では、活性化糖をモノマー形態のチオアルキルアミンまたはその塩と反応させることによって、チオール化糖を形成することができる。本発明の方法によって生成されたオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、一般式（Ｉ）によって表され得る。
この態様の一部の実施形態では、ステップｄ）は、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するために活性化チオール化糖を活性化担体タンパク質と反応させる前に、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得ることをさらに含む。多くの実施形態では、活性化担体タンパク質は、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む。
チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートは、反応混合物中に存在する残留活性化官能基と反応し得る１種または複数のキャッピング試薬で処理することができる。そのような残留反応性基は、不完全なコンジュゲーションによるか、または反応混合物中に構成要素の一方が過剰に存在することから、未反応の糖または担体タンパク質構成要素上に存在し得る。その場合、キャッピングは、糖コンジュゲートの精製または単離の際に助けとなり得る。場合によっては、残留活性化官能基は、糖コンジュゲート中に存在し得る。
例えば、活性化担体タンパク質上の過剰なα−ハロアセトアミド基を、完全なキャッピングを保証するために過剰に使用することができるＮ−アセチル−Ｌ−システインなどの低分子量チオールとの反応によって、キャッピングすることができる。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインでのキャッピングはまた、キャッピングされた部位にあるシステイン残基から独特のアミノ酸Ｓ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）を検出することによる、コンジュゲーション効率の確認を可能にし、これは、コンジュゲーション生成物の酸性加水分解およびアミノ酸分析によって決定することができる。このアミノ酸の検出によって、反応性ブロモアセトアミド基が成功裏にキャッピングされたこと、したがって、それらが、あらゆる望ましくない化学反応について利用不可能となったことが確認される。共有原子価およびキャッピングの許容されるレベルは、ＣＭＣＡ／Ｌｙｓでは約１〜１５の間、およびＣＭＣ／Ｌｙｓでは約０〜５の間である。同様に、過剰の遊離スルフヒドリル残基を、ヨードアセトアミドなどの低分子量求電子試薬と反応させることによってキャッピングすることができる。ＣＭＣＡの一部は、担体タンパク質のハロアシル基とのコンジュゲーションに関係していない、ヨードアセトアミドによって直接キャッピングされた多糖チオールに由来し得る。したがって、コンジュゲーションに直接に関係しているチオールの正確なレベルを決定するために、コンジュゲーション後の反応試料（ヨードアセトアミドによるキャッピングの前）をアミノ酸分析（ＣＭＣＡ）によって検査する必要がある。１０〜１２個のチオールを含有するチオール化糖では、典型的には５〜６個のチオールが、多糖チオールとブロモアセチル化タンパク質との間のコンジュゲーションに直接関係していると決定され、４〜５個のチオールは、ヨードアセトアミドによってキャッピングされる。
好ましい実施形態では、第１のキャッピング試薬は、担体タンパク質上の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基と反応するＮ−アセチル−Ｌ−システインである。他の実施形態では、第２のキャッピング試薬は、活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル基と反応するヨードアセトアミド（ＩＡＡ）である。多くの場合に、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システインおよび第２のキャッピング試薬としてのＩＡＡでキャッピングすることを含む。一部の実施形態では、キャッピングステップｅ）は、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む。
一部の実施形態では、上記方法は、例えば、限外濾過／透析濾過によって、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを精製するステップをさらに含む。
好ましい実施形態では、二官能性対称チオアルキルアミン試薬は、シスタミンまたはその塩であり、これを、活性化糖と反応させて、ジスルフィド部分を含有するチオール化糖またはその塩を得る。
そのようなチオール化糖誘導体を還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化多糖を生成する（チオールが保護されている場合）。そのような活性化チオール化糖は、例えば、限外濾過／透析濾過によって単離および精製することができる。別法では、活性化チオール化糖は、例えば、標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法または当技術分野で知られているＤＥＡＥなどのイオン交換クロマトグラフィー方法によって単離および精製することができる。
シスタミン由来のチオール化糖の場合には、還元剤との反応は、ジスルフィド結合を切断して、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖をもたらす。システアミン由来のチオール化糖では、還元剤との反応は任意選択であり、試薬または生成物の酸化によって形成されるジスルフィド結合を還元するために使用することができる。
本発明の方法において使用する還元剤には、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはメルカプトエタノールが含まれる。しかしながら、任意のジスルフィド還元剤を使用することができる。
一部の実施形態では、上記方法は、１個または複数のα−ハロアセトアミド基、好ましくは１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得ることをさらに含む。
活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド部分を含む活性化担体タンパク質と反応させると、活性化チオール化糖の１個または複数の遊離スルフヒドリル基による活性化担体タンパク質のα−ハロ基の求核性置換が生じて、オキソ−ｅＴスペーサーのチオエーテル結合を形成する。
担体タンパク質のα−ハロアセチル化アミノ酸残基は典型的には、担体タンパク質の１個または複数のリシン残基のε−アミノ基に結合する。多くの実施形態では、担体タンパク質は、１個または複数のα−ブロモアセチル化アミノ酸残基を含有する。一実施形態では、担体タンパク質を、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）などのブロモ酢酸試薬で活性化させる。
一実施形態では、上記方法は、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得るステップと、活性化チオール化多糖を活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップとを含み、それによって、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲートを生成する。
本明細書に記載の方法の一部の好ましい実施形態では、細菌莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖である。一部のそのような実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
本明細書において提供する方法の他の好ましい実施形態では、細菌莢膜多糖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖である。一部のそのような実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。
本明細書において提供する方法の他の好ましい実施形態では、細菌莢膜多糖は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するＧＢＳ莢膜多糖である。一部のそのような実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される。ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
本明細書において提供する方法のそれぞれの一部の実施形態では、糖をイミダゾールまたはトリアゾールと配合し、次いで、水約０．２％ｗ／ｖを含有する有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中で、ＣＤＴなどの炭酸誘導体と反応させて、活性化糖を生成した。活性化ステップにおいて配合糖を使用すると、有機溶媒中での糖の溶解性が上昇する。典型的には、糖を、多糖１グラム当たり１，２，４−トリアゾール添加剤１０グラムと配合し、続いて、周囲温度で混合して、配合糖を得る。
したがって、ある種の実施形態では、上記方法は、活性化ステップａ）の前に、糖をトリアゾールまたはイミダゾールと配合して、配合糖を得るステップをさらに含む。一部のそのような実施形態では、配合糖を、シェル凍結（ｓｈｅｌｌ−ｆｒｏｚｅｎ）し、凍結乾燥し、有機溶媒（ＤＭＳＯなど）中で復元して、炭酸誘導体、例えば、ＣＤＴで活性化させる前に、水約０．２％ｗ／ｖを添加する。
一実施形態では、チオール化糖反応混合物を場合によって、Ｎ−アセチル−リシンメチルエステルで処理して、いずれの未反応活性化糖もキャッピングする。一部のそのような実施形態では、キャッピングされたチオール化糖混合物を限外濾過／透析濾過によって精製する。
多くの実施形態では、チオール化糖を還元剤と反応させて、活性化チオール化糖を生成する。一部のそのような実施形態では、還元剤は、トリス（−２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはメルカプトエタノールである。一部のそのような実施形態では、活性化チオール化糖を、限外濾過／透析濾過によって精製する。
一実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを生成する方法は、活性化チオール化糖および担体タンパク質の反応混合物のｐＨを約５℃で約２０時間、約８〜約９のｐＨに調整および維持するステップを含む。
一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートを生成する方法は、生成した後に、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを単離するステップを含む。多くの実施形態では、糖コンジュゲートを限外濾過／透析濾過によって単離する。
別の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを生成する方法は、生成した後に、単離された糖−担体タンパク質コンジュゲートを単離するステップを含む。多くの実施形態では、糖コンジュゲートを限外濾過／透析濾過によって単離する。
また別の実施形態では、活性化糖を生成する方法は、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物の水濃度を、約０．１〜０．４％の間に調整するステップを含む。一実施形態では、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物の水濃度を約０．２％に調整する。
一実施形態では、糖を活性化させるステップは、多糖を、有機溶媒中に莢膜多糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する多糖の量に対して約５モル過剰である量のＣＤＴと反応させることを含む。
別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートを生成する方法は、糖を含む反応混合物の水濃度を決定するステップを含む。そのような一実施形態では、糖を活性化させるために反応混合物に添加されるＣＤＴの量をほぼ、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と等モルであるＣＤＴの量で与える。
別の実施形態では、糖を活性化させるために反応混合物に添加されるＣＤＴの量をほぼ、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と比較して約０．５：１のモル比であるＣＤＴの量で与える。一実施形態では、糖を活性化させるために反応混合物に添加されるＣＤＴの量をほぼ、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と比較して約０．７５：１のモル比であるＣＤＴの量で与える。
一実施形態では、上記方法は、透析濾過によってチオール化多糖を単離するステップを含む。別の実施形態では、上記方法は、透析濾過によって活性化チオール化多糖を単離するステップを含む。
一実施形態では、単離Ｐｎ莢膜多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成する方法において使用する担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７を含む。別の実施形態では、単離Ｍｎ莢膜多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成する方法において使用する担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７を含む。
一部の実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．２〜４の間である。他の実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１．０〜２．５の間である。さらなる実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．４〜１．７の間である。他の実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、約１：１である。一部のそのような実施形態では、糖は細菌莢膜多糖であり、活性化担体タンパク質をＣＲＭ１９７の活性化（ブロモアセチル化）によって生成する。
別の実施形態では、活性化糖を生成する方法は、有機溶媒の使用を含む。多くの実施形態では、有機溶媒は極性非プロトン性溶媒である。一部のそのような実施形態では、極性非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、有機溶媒はＤＭＳＯである。
多くの実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートの単離は、限外濾過／透析濾過のステップを含む。
一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートを生成する方法において使用する糖は、約１０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートを生成する方法において使用する糖は、約５０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。
一実施形態では、莢膜多糖−担体タンパク質糖コンジュゲートを生成する方法において生成する糖コンジュゲートは、およそ５０ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａの間のサイズを有する。別の実施形態では、莢膜多糖−担体タンパク質糖コンジュゲートを生成する方法において生成する糖コンジュゲートは、およそ５００ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａの間のサイズを有する。一実施形態では、莢膜多糖−担体タンパク質糖コンジュゲートを生成する方法において生成する糖コンジュゲートは、およそ１，０００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの間のサイズを有する。
別の態様では、本発明は、本明細書において開示する方法のいずれかによって生成された、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成されたオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
糖のＯ−アセチル化度は、当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、プロトンＮＭＲ（ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９６；８３〜９６、ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３０；１２３３〜１２４７、ＷＯ０５／０３３１４８、またはＷＯ００／５６３５７）によって決定することができる。別の一般的に使用される方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０；２４９〜２６１によって記載されている。また別の方法は、ＨＰＬＣイオン排除クロマトグラフィーに基づく。Ｏ−アセチル化度は、試料中に存在する遊離アセタートの量を推定し、その値を弱塩基加水分解後に放出されるアセタートの量と比較することによって決定される。アセタートは試料の他の構成要素から分解され、２１０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）検出で定量される。別の方法は、ＨＰＬＣイオン排除クロマトグラフィーに基づく。Ｏ−アセチルは、試料中に存在する遊離アセタートの量を推定し、その値を弱塩基加水分解後に放出されるアセタートの量と比較することによって決定される。アセタートは試料の他の構成要素から分解され、２１０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）検出で定量される。
アミノ酸分析によって決定されるコンジュゲーション度
ブロモアセチル活性化化学作用を使用して生成された「ＩＡＡキャッピング前の」コンジュゲート試料の酸性加水分解は、コンジュゲートされた部位からの酸安定なカルボキシメチルチオアルキルアミン（ＣＭＴＡ）、およびキャッピングされた部位にあるシステインからの酸安定なＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の形成をもたらした。ブロモアセチル活性化化学作用を使用して生成された「ＩＡＡキャッピング後の」コンジュゲート（最終）の酸性加水分解はまた、コンジュゲートされた部位およびＩＡＡキャッピングされた部位からの酸安定な（ＣＭＴＡ）、さらには、キャッピングされた部位にあるシステインからの酸安定なＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の形成をもたらした。コンジュゲートされておらず、かつキャッピングされていないリシンはすべて、リシンに再び変換されて、リシンとして検出される。他のアミノ酸はすべて、加水分解条件によって破壊されるトリプトファンおよびシステインを除いて、遊離アミノ酸に再び加水分解された。アスパラギンおよびグルタミンはそれぞれ、アスパラギン酸およびグルタミン酸に変換された。
各加水分解試料および対照のアミノ酸を、イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離し、続いて、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ＮｉｎＲＸ溶液と１３５℃で反応させた。次いで、誘導体化アミノ酸を５７０ｎｍ〜４４０ｎｍの可視範囲で検出した（表１を参照されたい）。各アミノ酸５００ピコモルを含有するアミノ酸の標準セット［Ｐｉｅｒｃｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｈ］を、各分析セットで試料および対照と共に流した。Ｓ−カルボキシメチルシステイン［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］を標準に添加した。
Figure 2017505792
システインおよびシステアミンへのその共有結合、ならびに予測される同様の加水分解に基づく評価のために、リシンを選択した。次いで、得られたアミノ酸のモル数を、タンパク質のアミノ酸組成と比較し、ＣＭＣ、ＣＭＴＡ、またはＣＭＣＡ（システアミンリンカーの場合）での値と共に報告した。ＩＡＡ−ＣＭＴＡ前の値を、コンジュゲーション度の評価のために直接使用し、ＣＭＣ値を、第１のキャッピング度の評価のために直接使用し、ＩＡＡ−ＣＭＴＡ後の値を、ＩＡＡ（第２）キャッピング度の評価のために使用した。
一実施形態では、糖コンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特徴づける。コンジュゲートの分子サイズを、セファロースＣＬ−４Ｂ固定相サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）媒体によって、高圧液体クロマトグラフィー系（ＨＰＬＣ）を使用して決定する。Ｋｄ決定では、クロマトグラフィーカラムを初めに、ボイド体積または合計排除体積を表すＶ０、および粒子間体積としても知られている、試料中で最小の分子が溶離する体積を表すＶｉを決定するために較正する。すべてのＳＥＣ分離は、Ｖ０からＶｉの間で起こる。収集された各画分でのＫｄ値は、次の式によって決定される：Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖｉ）／（Ｖｉ−Ｖ０）［式中、Ｖｅは、化合物の保持体積を表す］。≦０．３を溶離する画分％（主なピーク）が、コンジュゲートＫｄ（分子サイズ分布）を定義する。
免疫原性組成物
「免疫原性組成物」という用語は、対象において免疫応答を誘発するために使用することができる抗原（例えば、微生物またはその構成要素）を含有する任意の医薬組成物に関する。
本明細書において使用する場合、「免疫原性」は、哺乳動物などのホスト対象において体液性もしくは細胞性、またその両方で媒介される免疫応答を誘発する、細菌莢膜多糖、または細菌莢膜多糖を含む糖コンジュゲートもしくは免疫原性組成物などの抗原（または抗原のエピトープ）の能力を意味する。
糖コンジュゲートは、細胞表面のＭＨＣ分子と関連して抗原を提示することによって、ホストを感作するために役立ち得る。加えて、免疫ホストを将来的に防御するために、抗原特異的Ｔ細胞または抗体を生成することができる。したがって、糖コンジュゲートは、ホストを、細菌による感染に関連する１種または複数の症状から防御することができるか、またはホストを、莢膜多糖に関連する細菌での感染による死亡から防御することができる。糖コンジュゲートはまた、受動免疫を対象に付与するために使用することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。糖コンジュゲートは、動物有効性モデルにおける、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に機能的である抗体を生成するために使用することもできる。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１個の抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのターゲットに特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書において使用する場合、内容によって別段に示さない限り、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけではなく、操作抗体（例えば、エフェクター機能、安定性、および他の生物学的活性を改変するためのキメラ、ヒト化、および／または誘導体化）およびその断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体（サメおよびラクダ抗体を含む）、ならびに本明細書に記載の、抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体）および抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変配置も包含することが意図されている。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は、いずれか特定のクラスの抗体である必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに帰属し得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらの数種は、ヒトにおいて、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに区別され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および立体配置はよく知られている。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分のみを含み、その部分は好ましくは、インタクトな抗体が存在する場合に通常はその部分が関連する機能の少なくとも１つ、好ましくは大部分または全部を保持する。
「抗原」という用語は一般に、対象に注射または吸収される組成物を含めて、対象において、抗体の産生もしくはＴ細胞応答、またはその両方を刺激し得る免疫原性組成物中の生物学的分子、通常は、タンパク質、ペプチド、多糖、もしくはコンジュゲート、または免疫原性物質を指す。免疫応答は、全分子に対して、または分子の様々な部分（例えば、エピトープまたはハプテン）に対して生じ得る。この用語は、個々の分子、または抗原分子の均質もしくは不均質な集団を指すために使用され得る。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または特異的な体液性もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。「抗原」には、すべての関連抗原エピトープも含まれる。所与の抗原のエピトープは、当技術分野でよく知られている多くのエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｄ．，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊを参照されたい。例えば、直鎖エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド、タンパク質分子の部分に対応するペプチドを同時に合成し、ペプチドをまだ支持体に結合させたままで、それらのペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。そのような技術は、当技術分野で知られており、例えば、その全体が記述されている場合と同様にそれぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５に記載されている。同様に、配座異性エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴などによって、アミノ酸の空間構造を決定することによって同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照されたい。さらに、本発明の目的では、「抗原」は、そのタンパク質が免疫応答を誘発する能力を維持する限り、天然配列に対して欠失、付加、および置換（一般に、天然では保存的であるが、非保存的であってもよい）などの改変を含むタンパク質を指すためにも使用され得る。これらの改変は、特定部位の突然変異誘発によって、または特定の合成手順によって、または遺伝子操作手法によってなど、計画的であってもよいし、または抗原を産生するホストの変異によってなど、偶然であってもよい。さらに、抗原は、微生物、例えば、細菌に由来するか、それから得るか、もしくはそれから単離することもできるし、または生体全体であってもよい。同様に、核酸免疫化用途においてなど、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、この定義に含まれる。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、隣接する諸エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７ ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２〜３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：４０２ ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｊｕｎ．２８ ｔｏ Ｊｕｌ．３、１９９８）。
「防御」免疫応答は、体液もしくは細胞媒介性、または両方の免疫応答を誘発し、感染から対象を防御するために役立つ免疫原性組成物の能力を指す。得られる防御は、絶対的である必要はなく、すなわち、対象の対照集団、例えば、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与されていない感染動物と比較して、統計的に有意な改善が存在するならば、感染は、完全に防御または撲滅される必要はない。防御は、感染の症状の重症度またはその発症の速度の緩和に限定され得る。一般に、「防御免疫応答」は、各抗原に対する測定可能なあるレベルの機能抗体応答を含む、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体レベルの上昇の誘発を含む。特定の状況では、「防御免疫応答」には、各抗原に対する測定可能なあるレベルの機能抗体応答を含む、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体レベルの２倍の上昇または抗体レベルの４倍の上昇の誘発が含まれ得るであろう。ある種の実施形態では、オプソニン作用性抗体は、防御免疫応答と相関する。したがって、防御免疫応答は、オプソニン化貪食作用アッセイ、例えば、下記のものにおける細菌数の低下率を測定することによってアッセイすることができる。好ましくは、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の細菌数の低下が存在する。
本明細書において互換的に使用される「免疫原性量」および「免疫有効量」という用語は、細胞（Ｔ細胞）もしくは体液（Ｂ細胞または抗体）応答、またはその両方であってよい免疫応答を誘発するために十分な抗原または免疫原性組成物の量を指し、そのような免疫応答は、当業者に知られている標準的なアッセイによって測定することができる。典型的には、免疫有効量は、対象において防御免疫応答を誘発するはずである。
本発明の免疫原性組成物は、免疫原性組成物を全身、皮膚、または粘膜経路を介して投与することによって、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）による細菌感染症に罹患しやすい対象を防御または処置するために予防的または治療的に使用することができるか、または受動免疫を別の対象に付与するために使用することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成するために使用することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路による注射；または経口／消化器、呼吸器、もしくは尿生殖路への粘膜投与を含み得る。免疫原性組成物は、動物有効性モデルにおける、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に機能的である抗体を生成するために使用することもできる。
特定の免疫原性組成物のための構成要素の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確認することができる。初回のワクチン接種の後に、対象は、適切に間隔を空けて１回または複数回の追加免疫化を受けることができる。
ある種の実施形態では、免疫原性組成物は、１種または複数のアジュバントを含む。本明細書において定義するとおり、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強するために役立つ物質である。したがって、アジュバントは多くの場合に、免疫応答を増強するために投与され、当業者によく知られている。組成物の有効性を増強するために適したアジュバントには、これらだけに限定されないが、
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）；
（２）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記で定義）または細菌細胞壁成分などの他の特異的な免疫刺激剤を含むか、または含まない）、例えば、
（ａ）Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、スクアレン５％、Ｔｗｅｅｎ ８０ ０．５％、およびＳｐａｎ ８５ ０．５％（様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（必要ではないが、下記を参照されたい）を場合によって含有）を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、
（ｂ）サブミクロン乳剤にマイクロ流動化されているか、またはより大きな粒径の乳剤を生成するためにボルテックス処理されている、スクアレン１０％、Ｔｗｅｅｎ ８０ ０．４％、プルロニックブロックされたポリマーＬｌ２１ ５％、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照されたい）を含有するＳＡＦ、ならびに
（ｃ）スクアレン２％、Ｔｗｅｅｎ ８０ ０．２％、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載の３−Ｏ−脱アシル化されたモノホスホリ脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ、ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種または複数の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）；
（３）サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ．Ｍａｓｓ．）（米国特許第５，０５７，５４０号）を使用することができるか、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などのそれから生成される粒子；
（４）Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されているアミノアルキルグルコサミンホスファート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体などの細菌リポ多糖、合成脂質Ａ類似体；そのようなＡＧＰの１種は、水性形態または安定な乳剤として製剤化されている５２９としても知られている（以前はＲＣ５２９として知られていた）２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＣｐＧモチーフ（複数可）を含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）である；
（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２などのサイトカイン；
（６）例えば、公開国際特許出願番号ＷＯ００／１８４３４（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照されたい）によってアミノ酸位２９のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンによって置き換えられている野生型または変異体型のコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照されたい）などの細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化変異体；ならびに
（７）組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質
が含まれる。
ムラミルペプチドには、これらだけに限定されないが、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれる。
ある種の実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩などのアルミニウムベースのアジュバントである。具体的な実施形態では、アルミニウムベースのアジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される。具体的な実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
免疫原性組成物は任意選択により、薬学的に許容できる担体を含むことができる。薬学的に許容できる担体には、米国連邦政府、州政府の規制当局、または他の規制当局によって承認されているか、またはヒトを含む対象、さらに非ヒト哺乳動物において使用するために米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に列挙されている担体が含まれる。担体という用語は、医薬組成物をそれと共に投与する希釈剤、添加剤、またはビヒクルを指すために使用することができる。水、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を、特に、注射用液剤のための液体担体として使用することができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載されている。製剤は、投与様式に適合すべきである。
本発明の免疫原性組成物は、複数の莢膜多糖−タンパク質コンジュゲートに加えて、１種または複数の防腐剤をさらに含んでよい。ＦＤＡは、いくつかの例外だけを除いて、複数回投与（多回投与）用バイアル中の生物学的生成物が防腐剤を含有することを要求している。防腐剤を含有するワクチン製品には、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム、ポリオ（非経口））、フェノール（肺炎、チフス（非経口）、ワクシニア）、およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、ＨｅｐＢ、Ｈｉｂ、インフルエンザ、ＪＥ、髄膜炎、肺炎、狂犬病）を含有するワクチンが含まれる。注射用薬物において使用するために承認された防腐剤には、例えば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサールおよび、硝酸フェニル水銀が含まれる。
ある種の実施形態では、非経口投与と適合性である本発明の製剤は、これらだけに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０）、およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、これらだけに限定されないが、Ｂｒｉｊ ５８、Ｂｒｉｊ ３５を含むポリオキシエチレンアルキルエーテル、さらには、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ４０、Ｓｐａｎ ８５、およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１）などの他のものを含む１種または複数の非イオン性界面活性剤を含み、好ましい構成要素は、約０．００１％〜約２％（最高約０．２５％が好ましい）の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜１％（最高約０．５％が好ましい）の濃度のポリソルベート−４０である。
包装および投与形態
対象への本発明の免疫原性組成物の直接送達は、非経口投与（筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、または組織の間質腔）；または口／消化管、呼吸器、もしくは尿生殖路への粘膜投与を介して；または局所、経皮、鼻腔内、眼、耳、肺、または他の粘膜投与によって達成することができる。
一実施形態では、非経口投与は、例えば、対象の大腿または上腕への筋肉内注射による。注射は、針（例えば、皮下針）によってよいが、別法では、無針注射を使用することもできる。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍＬである。別の実施形態では、肺炎または中耳炎を処置するために、鼻腔内投与を使用する（肺炎球菌の鼻咽頭通過がより有効に防御され得るので、その初期段階で感染が減弱される）。
本発明の組成物を、様々な形態で、例えば、注射のために、液体溶液または懸濁液として調製することができる。ある種の実施形態では、組成物を、肺投与用の散剤または噴霧剤として、例えば、吸入器において調製することができる。他の実施形態では、組成物を、坐剤もしくは膣坐剤として、または経鼻、耳、もしくは眼投与のために、例えば、噴霧剤、滴剤、ゲル剤、もしくは散剤として調製することができる。
各免疫原性組成物用量中の糖コンジュゲートの量は、重大な有害作用を伴うことなく免疫防御応答を誘発する量として選択される。そのような量は、糖コンジュゲート中に存在する細菌血清型に依存して様々であり得る。一般に、各用量は、多糖０．１〜１００μｇ、特に０．１〜１０μｇ、より詳細には１〜５μｇを含むであろう。
本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴリンカーを介してＣＲＭ１９７に個々にコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎ莢膜多糖の滅菌液体製剤であり、各０．５ｍＬ用量を、多糖１〜５μｇを含有するように製剤化するが、これは、アルミニウム元素０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）アジュバント；および塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝剤を添加剤としてさらに含有してもよい。
特定の免疫原性組成物での構成要素の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確認することができる。初回のワクチン接種の後に、対象は、適切に間隔を空けて１回または複数回の追加免疫化を受けることができる。
本発明の免疫原性組成物は、単位用量または多回用量形態（例えば、２回用量、４回用量以上）で包装することができる。多回用量形態では、典型的であって、必ずしもではないが、バイアルが、プレフィルドシリンジよりも好ましい。適切な多回用量形式は、これらだけに限定されないが：１用量当たり０．１〜２ｍＬで容器１個当たり２〜１０用量を含む。ある種の実施形態では、用量は、０．５ｍＬ用量である。例えば、本明細書に参照によって組み込まれる国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８を参照されたい。
組成物を、バイアルまたは他の適切な貯蔵容器で提供することができるか、または針を有するか、もしくは有さずに供給され得るプレフィルド送達デバイス、例えば、単一または複数構成要素シリンジ中で提供することができる。必ずしも必須ではないが典型的には、シリンジは、単回用量の本発明の防腐剤含有免疫原性組成物を含有するが、多回用量プレフィルドシリンジも企図される。同様に、バイアルは、単回用量を含み得るが、別法では、複数回用量を含み得る。
有効な投薬体積は、常套的に樹立することができるが、注射用組成物の典型的な用量は、０．５ｍＬの体積を有する。ある種の実施形態では、ヒト対象への投与用に用量を決定する。ある種の実施形態では、用量を、成人、十代、青年、幼児、または乳児（すなわち、１歳以下）ヒト対象に投与するために製剤化し、好ましい実施形態では、注射によって投与することができる。
本発明の液体免疫原性組成物は、凍結乾燥形態で提供される他の免疫原性組成物を復元するためにも適している。免疫原性組成物を、そのような即時復元のために使用すべき場合、本発明は、２個以上のバイアル、２個以上のすぐに充填されるシリンジ、またはそれぞれ１個もしくは複数を備えたキットを提供し、シリンジの内容物を、注射の前にバイアルの内容物を復元するために、またはその逆で使用する。
また別の実施形態では、多回用量形式の容器は、これらだけに限定されないが、一般的な実験室用ガラス器具、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、管、パイプ、バッグ、ジャー、バイアル、バイアルクロージャー（例えば、ゴムストッパー、スクリューキャップ）、アンプル、シリンジ、二室または多室シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、ゴムクロージャー、プラスチッククロージャー、ガラスクロージャー、カートリッジ、および使い捨てペンなどからなる群の１つまたは複数から選択される。本発明の容器は、製造材料によって限定されず、ガラス、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、アルミニウムなど）、およびポリマー（例えば、熱可塑性プラスチック、エラストマー、熱可塑性エラストマー）などの材料が含まれる。特定の実施形態では、上記形式の容器は、ブチルストッパーを備えた５ｍＬ Ｓｃｈｏｔｔ Ｔｙｐｅ １ガラスバイアルである。当業者は、上記形式が、網羅リストでは全くなく、本発明で利用可能な様々な形式に関する当業者のためのガイダンスとして単に役立つものであることを認めるであろう。本発明において使用するために企図されている追加の形式は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、ＶＷＲなどの実験室装置供給者および製造者から公開されているカタログにおいて見出すことができる。
感染に対して免疫応答を誘発し、防御するための方法
本発明はまた、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよびそれを含む免疫原性組成物を予防的または治療的に使用するための方法を含む。例えば、本発明の一態様は、病原細菌、例えば、肺炎球菌または髄膜炎菌細菌に対して免疫応答を誘発する方法であって、病原細菌に由来する細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む免疫有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法を提供する。本発明の一実施形態は、病原細菌による感染に対して対照を防御する方法、または病原細菌に関連する感染疾患または状態を予防、処置、もしくは改善する方法、または病原細菌に起因する感染に関連する少なくとも１つの症状の重症度を低減するか、もしくはその発症を遅延させる方法であって、それぞれの場合に、病原細菌に由来する細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む免疫有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の一実施形態は、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法であって、免疫有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、上記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法は、ヒト、家畜、動物、または農業処置を含む。別の実施形態は、対象において、病原細菌に関連する細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法であって、本明細書に記載の免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成することと、受動免疫を対象に付与するために上記抗体調製物を使用することとを含む方法を提供する。本発明の一実施形態は、外科手術を受ける対象において、細菌感染症を予防する方法であって、外科手術の前に、予防有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
上述の方法のそれぞれの好ましい実施形態では、病原細菌は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などの肺炎球菌または髄膜炎菌細菌である。一部のそのような実施形態では、細菌抗原は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、細菌抗原は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、細菌抗原は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からの莢膜多糖（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖）、または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）からの莢膜多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖など）である。
抗原または免疫原性組成物に対する免疫応答は、その抗原または免疫原性組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞媒介性免疫応答の対象における発生によって特徴づけられる。本発明の目的では、「体液性免疫応答」は、抗体媒介性免疫応答であり、本発明の免疫原性組成物中の抗原を認識し、それに対する多少の親和性で結合する抗体の誘発および発生に関係し、「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔ細胞および／または他の白血球によって媒介されるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩもしくはクラスＩＩ分子、ＣＤ１、または他の非古典的ＭＨＣ様分子と関連して抗原エピトープの提示によって誘発される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）を活性化させる。ＣＴＬは、古典的または非古典的ＭＨＣによってコードされ、細胞表面上に発現されるタンパク質と関連して提示されるペプチド抗原について特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘発および促進するために役立つ。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関係する。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上の古典的または非古典的ＭＨＣ分子に関連して、ペプチドまたは他の抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、かつその活性に焦点を当てるための助けとなるように作用する。「細胞媒介性免疫応答」はまた、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む活性化Ｔ細胞および／または他の白血球によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および他のそのような分子の産生を指す。細胞媒介性免疫応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイによって、感作対象において抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイすることによって、または抗原での再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によってなど、いくつかのアッセイによって決定することができる。そのようなアッセイは、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９〜４１９９；およびＤｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９〜２３７６を参照されたい。
本発明の免疫原性組成物および方法は、下記の１つまたは複数のために有用であり得る：（ｉ）従来のワクチンにおいてのとおり、感染もしくは再感染の予防、（ｉｉ）症状の重症度の低減、もしくはその除去、および／または（ｉｉｉ）病原体または障害の実質的または完全な除去。したがって、処置は、予防的に（感染前）、または治療的に（感染後）行うことができる。本発明では、予防処置が好ましい様式である。本発明の特定の実施形態では、ホスト対象を、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）など）による細菌感染症に対して処置（予防的および／または治療的免疫化を含む）する組成物および方法を提供する。本発明の方法は、予防および／または治療免疫を対象に付与するために有用である。本発明の方法をまた、生物医学的研究用途のために、対象で実行することができる。
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。より詳細には、対象は、ヒト、これらだけに限定されないが、ウシ、ヒツジ、フェレット、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなどを含む家畜および牧場動物、ならびに研究用、動物園、スポーツ用、ならびに家庭用ペットおよび他の飼い慣らした動物などのペットコンパニオン動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましいコンパニオン動物は、イヌおよびネコである。好ましくは、対象はヒトである。
組成物中の特定のコンジュゲートの量は一般に、そのコンジュゲートでコンジュゲートされた多糖およびコンジュゲートされていない多糖の両方の合計量に基づき計算される。例えば、遊離多糖２０％を有するコンジュゲートは、多糖用量１００μｇ中にコンジュゲートされた多糖約８０μｇおよびコンジュゲートされていない多糖約２０μｇを有するはずである。コンジュゲートの用量を計算する場合に、コンジュゲートに対するタンパク質寄与率は通常、考慮されない。コンジュゲートまたは免疫原性組成物の免疫原量は、細菌血清型に応じて様々であり得る。一般に、各用量は、多糖０．１〜１００μｇ、特には０．１〜１０μｇ、より詳細には１〜１０μｇを含むはずである。免疫原性組成物中の異なる多糖構成要素の免疫原量は異なってよく、それぞれ、いずれかの特定の多糖抗原１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、または約１００μｇを含んでよい。
「侵襲性疾患」という用語は、疾患の関連臨床徴候／症状が存在する、通常無菌部位からの細菌の単離に関する。通常無菌身体部位には、血液、ＣＳＦ、胸膜液、心膜液、腹膜液、滑液／関節液、骨、身体内部部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、卵巣）、または他の通常無菌部位が含まれる。侵襲性疾患を特徴づける臨床状態には、菌血症、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、敗血症性ショックなどが含まれる。
免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイか、その特異的ターゲット細胞を溶解するＴ細胞の能力を測定するためのクロム放出アッセイなどの細胞溶解性アッセイか、または血清中での、抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによってＢ細胞活性のレベルを測定することによって測定することができる。免疫応答はまた、本明細書に記載のとおりに、抗原の投与後に誘発された抗原特異的抗体の血清レベルを測定することによって、かつより具体的には、そうして誘発された抗体の、特定の白血球のオプソニン作用能力を増強する能力を測定することによって検出することができる。免疫応答の保護レベルは、免疫化ホストを、投与された抗原で攻撃することによって測定することができる。例えば、免疫応答が望ましい抗原が、細菌であれば、抗原の免疫原量によって誘発される保護レベルは、その細菌細胞で動物を攻撃した後の生存率または死亡率を検出することによって測定される。一実施形態では、保護量は、細菌感染症に関連する少なくとも１つの徴候、例えば、感染症に関連する発熱を測定することによって測定することができる。多抗原もしくは多成分ワクチンまたは免疫原性組成物中の抗原のそれぞれの量は、他の構成要素のそれぞれに関して変わるはずであり、当業者に知られている方法によって決定され得る。そのような方法は、免疫原性および／またはｉｎ ｖｉｖｏ有効性を測定するための手順を含むであろう。
別の態様では、本発明は、本発明の莢膜多糖または糖コンジュゲートに特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。一部のそのような実施形態では、本発明は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、もしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはそれを含む糖コンジュゲートに特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。他のそのような実施形態では、本発明は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、もしくはＹ莢膜多糖、またはそれを含む糖コンジュゲートに特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。他のそのような実施形態では、本発明は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖、それを含むまたは糖コンジュゲートに特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。他のそのような実施形態では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５もしくは８莢膜多糖、またはエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）もしくはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖、またはそれらを含む糖コンジュゲートに特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。一部の実施形態では、抗体を、対象に、本発明の莢膜多糖または糖コンジュゲートを投与することで生成する。一部の実施形態では、本発明は、本発明の莢膜多糖または糖コンジュゲートの１種または複数を対象とする精製または単離抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明の抗体は、動物有効性モデルにおける、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に機能的である。本発明の抗体または抗体組成物は、対象において、病原細菌、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に関連する細菌感染症、疾患、または状態を処置または予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成することと、受動免疫を対象に付与するために上記抗体または抗体組成物を使用することとを含む方法において使用することができる。本発明の抗体はまた、診断方法、例えば、莢膜多糖またはその糖コンジュゲートの存在を検出するか、またはそのレベルを定量するのに有用であり得る。例えば、本発明の抗体はまた、ＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖またはその糖コンジュゲートの存在を検出するか、またはそのレベルを定量するために有用であり得、その糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた細菌莢膜多糖を含む。
当技術分野で知られているいくつかのアッセイおよび動物モデルを、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれか１つの有効性を評価するために使用することができる。例えば、Ｃｈｉａｖｏｌｉｎｉら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００８）、２１（４）：６６６〜６８５）は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）疾患の動物モデルを記載している。Ｇｏｒｒｉｎｇｅら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ｖｏｌ．６６（２００１）、Ｃｈａｐｔｅｒ １７、ＰｏｌｌａｒｄおよびＭａｉｄｅｎ編（Ｈｕｍａｎａａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）は、髄膜炎菌疾患のための動物モデルを記載している。
オプソニン作用活性（ＯＰＡ）アッセイ
ＯＰＡアッセイ手順は、Ｈｕら（Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１２（２）：２８７〜９５）によって以前記載された方法に基づくが、次の変更を伴った。熱不活化血清を緩衝液中で２．５倍連続希釈した。ターゲット細菌をアッセイプレートに添加し、振盪機上、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、子ウサギ補体（３〜４週齢、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、最終濃度１２．５％）および分化ＨＬ−６０細胞を各ウェルに、およそ２００：１のエフェクターとターゲットとの比で添加した。アッセイプレートを振盪機上、３７℃で４５分間インキュベートした。反応を停止させるために、０．９％ＮａＣｌ８０μＬをすべてのウェルに添加し、混合し、１０μＬアリコートを、水２００μＬを含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ ＨＶフィルタープレートのウェルに移した。液体を、真空下でプレートを通して濾過し、ＨｙＳｏｙ培地１５０μＬを各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートし、次いで、Ｄｅｓｔａｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で固定した。次いで、プレートをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色し、一度脱染した。コロニーを画像化し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で数えた。ＯＰＡ抗体力価を、免疫血清を含有しなかった対照ウェルと比較した場合に細菌コロニーの数の５０％低減ポイントを挟む２つの血清希釈の逆数から内挿した。
本発明の特定の実施形態を、ナンバリングした次のパラグラフにおいて述べる：
１．（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲート。
２．一般式（Ｉ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり得、
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであり、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、またはプロピルから選択される］。
３．Ｘが、Ｏであり、ｍが、１である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート。
４．Ｘが、Ｓであり、ｍが、１である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート。
５．ｍが、０である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート。
６．Ｂが、結合である、パラグラフ２から５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
７．Ｂが、Ｏである、パラグラフ２から５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
８．Ｂが、ＣＨ２である、パラグラフ２から５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９．ｍが、０であり、Ｂが、（Ｃ＝Ｏ）である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート。
１０．Ｒが、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、または（ＣＨ２）１０からなる群から選択される、パラグラフ２から９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１１．Ｒが、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンである、パラグラフ２から９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１２．Ｒが、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、およびＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２からなる群から選択される、パラグラフ２から９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１３．上記スペーサーが（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサーではないことを条件とする、パラグラフ１から１２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１４．一般式（ＩＩ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒは、（ＣＨ２）ｎであり、ｎは、３〜１０である］。
１５．ｎが３である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１６．ｎが４である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１７．ｎが５である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１８．ｎが６である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１９．一般式（ＩＩＩ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
２０．Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２１．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２２．Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２３．Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２４．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２５．Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２６．ｎが、１〜５である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
２７．ｎが、１〜４である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
２８．ｎが、１〜３である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
２９．ｎが、１または２である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
３０．ｍが、１〜３である、パラグラフ１９から２３のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
３１．ｍが、１または２である、パラグラフ１９または２３から２５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
３２．ｍが、１である、パラグラフ１９または２３から２５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
３３．一般式（ＩＶ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］。
３４．Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
３５．Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
３６．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
３７．Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
３８．Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
３９．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
４０．Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
４１．ｎが、１〜５である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
４２．ｎが、１〜４である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
４３．ｎが、１〜３である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
４４．ｎが、１または２である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
４５．ｍが、１〜３である、パラグラフ３３または３８から４０のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
４６．ｍが、１または２である、パラグラフ３３または３８から４０のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
４７．ｍが、１である、パラグラフ３３または３８から４０のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
４８．一般式（Ｖ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
Figure 2017505792
 ［式中、Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］。
４９．Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５０．Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５１．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５２．Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５３．Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５４．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５５．Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５６．ｎが、１〜５である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
５７．ｎが、１〜４である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
５８．ｎが、１〜３である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
５９．ｎが、１または２である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
６０．ｍが、１〜３である、パラグラフ４８または５３から５５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
６１．ｍが、１または２である、パラグラフ４８または５３から５５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
６２．ｍが、１である、パラグラフ４８または５３から５５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
６３．糖が、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結された、オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むパラグラフ１に記載の糖コンジュゲート。
６４．糖が、アミン連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結された、オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むパラグラフ１に記載の糖コンジュゲート。
６５．糖が、アミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結された、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むパラグラフ１に記載の糖コンジュゲート。
６６．糖が、多糖またはオリゴ糖である、パラグラフ１から６５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
６７．糖が、細菌に由来する莢膜多糖である、パラグラフ１から６５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
６８．上記莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する、パラグラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
６９．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７０．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型 ２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７１．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、８、９Ｖ、９Ｎ、１２Ｆ、および２２Ｆからなる群から選択される、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７２．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型３３Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７３．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型２２Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７４．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１０Ａ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７５．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１１Ａ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７６．糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜糖である、パラグラフ１から６５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
７７．糖が、多糖である、パラグラフ７５に記載の糖コンジュゲート。
７８．糖が、オリゴ糖である、パラグラフ７５に記載の糖コンジュゲート。
７９．莢膜糖が、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜糖からなる群、好ましくはＭｎ−血清型Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜糖からなる群から選択される、パラグラフ７５から７８に記載の糖コンジュゲート。
８０．莢膜糖が、Ｍｎ−血清型Ｘ莢膜糖である、パラグラフ７５から７８に記載の糖コンジュゲート。
８１．上記莢膜多糖が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する、パラグラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
８２．上記Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖が、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される、パラグラフ８１に記載の糖コンジュゲート。
８３．上記莢膜多糖が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する、パラグラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
８４．上記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である、パラグラフ８３に記載の糖コンジュゲート。
８５．上記莢膜多糖が、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する、パラグラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
８６．上記腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖が、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である、パラグラフ８５に記載の糖コンジュゲート。
８７．上記莢膜多糖が、シアル酸および／またはウロン酸含有細菌多糖に由来する、パラグラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
８８．糖が、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する、パラグラフ１から８７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
８９．多糖が、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する、パラグラフ８８に記載の糖コンジュゲート。
９０．糖コンジュゲートが、５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間の分子量を有する、パラグラフ１から８９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９１．糖コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する、パラグラフ９０に記載の糖コンジュゲート。
９２．多糖が、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する、パラグラフ１から９１のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９３．担体タンパク質が、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合体、無毒化ニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群において選択される、パラグラフ１から９２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９４．担体タンパク質が、ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、およびＨ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄからなる群において選択される、パラグラフ１から９２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９５．担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、パラグラフ１から９２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９６．ＣＲＭ１９７が、オキソ−ｅＴスペーサーを介して多糖に共有結合で連結された２〜２０個のリシン残基を含む、パラグラフ９５に記載の糖コンジュゲート。
９７．ＣＲＭ１９７が、オキソ−ｅＴスペーサーを介して多糖に共有結合で連結された４〜１６個のリシン残基を含む、パラグラフ９５に記載の糖コンジュゲート。
９８．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２から４の間である、パラグラフ１から９７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９９．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．４から１．７の間である、パラグラフ９８に記載の糖コンジュゲート。
１００．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位２５個ごとに起こる、パラグラフ１から９９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１０１．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位１５個ごとに起こる、パラグラフ１００に記載の糖コンジュゲート。
１０２．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位１０個ごとに起こる、パラグラフ１００に記載の糖コンジュゲート。
１０３．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位４個ごとに起こる、パラグラフ１００に記載の糖コンジュゲート。
１０４．上記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、パラグラフ９８から１０３のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１０５．糖の合計量と比較して、遊離糖１５％未満を含む、パラグラフ１から１０４のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１０６．≦０．３で、≧３５％の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有する、パラグラフ１から１０５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１０７．パラグラフ１から１０６のいずれか１つにおいて定義したとおりの少なくとも１つの糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物。
１０８．パラグラフ１から１０６のいずれか１つにおいて定義したとおりの少なくとも１つの糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
１０９．追加の抗原をさらに含む、パラグラフ１０７または１０８に記載の免疫原性組成物。
１１０．追加の抗原が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するタンパク質抗原または莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグラフ１０９に記載の免疫原性組成物。
１１１．追加の抗原が、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグラフ１１０に記載の免疫原性組成物。
１１２．追加の抗原が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するタンパク質抗原または莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグラフ１０９に記載の免疫原性組成物。
１１３．追加の抗原が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグラフ１０９に記載の免疫原性組成物。
１１４．アジュバントをさらに含む、パラグラフ１０７から１１３のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
１１５．アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントである、パラグラフ１１４に記載の免疫原性組成物。
１１６．アジュバントが、リン酸アルミニウムである、パラグラフ１１４に記載の免疫原性組成物。
１１７．アジュバントが、水酸化アルミニウムである、パラグラフ１１４に記載の免疫原性組成物。
１１８．パラグラフ１０７から１１７のいずれか１つで定義した免疫原性組成物のいずれかを充填されている容器。
１１９．バイアル、シリンジ、フラスコ、発酵槽、バイオリアクター、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジ、および使い捨てペンからなる群から選択される、パラグラフ１１８に記載の容器。
１２０．（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）糖を、炭酸誘導体またはシアノゲン誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
１２１．ステップａ）の炭酸誘導体が、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルマートである、パラグラフ１２０に記載の方法。
１２２．ステップａ）の炭酸誘導体が、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）である、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２３．ステップａ）を有機溶媒中で行う、パラグラフ１２０から１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．上記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である、パラグラフ１２３に記載の方法。
１２５．活性化糖を、ヘテロ二官能性チオアルキルアミン試薬またはその塩と反応させることによって、チオール化糖を生成する、パラグラフ１２０から１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．第１のキャッピング試薬が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインである、パラグラフ１２０から１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７．第２のキャッピング試薬が、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）である、パラグラフ１２０から１２６のいずれか１つに記載の方法。
１２８．ステップｅ）が、第１のキャッピング試薬および第２のキャッピング試薬の両方でキャッピングすることを含む、パラグラフ１２０から１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．ステップｅ）が、第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システインおよび第２のキャッピング試薬としてのＩＡＡでキャッピングすることを含む、パラグラフ１２０から１２５のいずれか１つに記載の方法。
１３０．キャッピングステップｅ）が、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応をさらに含む、パラグラフ１２０から１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．ステップｄ）が、活性化チオール化糖を活性化担体タンパク質と反応させる前に、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得ることをさらに含む、パラグラフ１２０から１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３２．活性化担体タンパク質が、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む、パラグラフ１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．上記活性化担体タンパク質が、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む活性化ＣＲＭ１９７担体タンパク質である、パラグラフ１２０から１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）糖を、アルデヒド基を生成するための酸化試薬と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
ｂ）活性化糖を、リンカーのアミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有する二官能性リンカーと反応させて、還元的アミノ化によってチオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
１３５．ステップａ）の糖を、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）／Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）試薬系によって酸化する、パラグラフ１３４に記載の方法。
１３６．（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされたカルボキシル含有糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）活性化糖を生成するためのカルボキシル基含有糖を、カルボジイミドまたはその誘導体と初めに反応させるステップと、
ｂ）活性化糖を、アミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有するヘテロ二官能性リンカーと反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を脱保護剤または還元剤（保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
１３７．カルボジイミド誘導体が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、または１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドである、パラグラフ１３６に記載の方法。
１３８．カルボジイミド誘導体が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である、パラグラフ１３６に記載の方法。
１３９．ステップａ）を有機溶媒中で行う、パラグラフ１３６から１３８のいずれか１つに記載の方法。
１４０．上記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である、パラグラフ１３９に記載の方法。
１４１．カルボン酸活性化ステップａ）を、カルボジイミドおよびチアゾリジノンチオンによって達成する、パラグラフ１３６から１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４２．カルボン酸活性化ステップａ）を、Ｎ−エチル−３−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホン酸塩（Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ）によって達成する、パラグラフ１３６から１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４３．ステップｃ）において生成されたチオール化多糖の精製をさらに含み、精製ステップが透析濾過を含む、パラグラフ１２０から１４２のいずれか１つに記載の方法。
１４４．担体タンパク質を、活性化ブロモ酢酸誘導体で活性化させる、パラグラフ１２０から１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．ブロモ酢酸誘導体が、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）である、パラグラフ１４４に記載の方法。
１４６．透析濾過によって糖コンジュゲートを精製することをさらに含む、パラグラフ１２０から１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．ステップａ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される極性非プロトン性溶媒中で行う、パラグラフ１２０から１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２から４の間である、パラグラフ１２０から１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．４から１．７の間である、パラグラフ１４８に記載の方法。
１５０．糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する莢膜多糖である、パラグラフ１２０から１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．莢膜多糖が、肺炎球菌（Ｐｎ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される、パラグラフ１５０に記載の方法。
１５２．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型３３Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方法。
１５３．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型２２Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方法。
１５４．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１０Ａ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方法。
１５５．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１１Ａ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方法。
１５６．糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜多糖である、パラグラフ１２０から１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５７．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、パラグラフ１２０から１５６のいずれか１つに記載の方法。
１５８．パラグラフ１２０から１５７のいずれか１つに記載の方法によって生成された糖コンジュゲート。
１５９．パラグラフ１５８に記載の糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
１６０．アジュバントをさらに含む、パラグラフ１５９に記載の免疫原性組成物。
１６１．アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される、パラグラフ１６０に記載の免疫原性組成物。
１６２．パラグラフ１０７から１１７または１５９から１６１のいずれか１つに記載の免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法。
１６３．パラグラフ１０７から１１７または１５９から１６１のいずれか１つに記載の免疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において防御免疫応答を誘発する方法。
１６４．医薬品として使用するための、パラグラフ１から１０６のいずれか１つに記載の糖コンジュゲートまたはパラグラフ１０７から１１７もしくは１５９から１６１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１６５．ワクチンとして使用するための、パラグラフ１から１０６のいずれか１つに記載の糖コンジュゲートまたはパラグラフ１０７から１１７もしくは１５９から１６１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１６６．対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法において使用するための、パラグラフ１から１０６のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート、またはパラグラフ１０７から１１７もしくは１５９から１６１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
１６７．対象において細菌感染症を予防する方法において使用するための、パラグラフ１から１０６のいずれか１つに記載の糖コンジュゲートまたはパラグラフ１０７から１１７もしくは１５９から１６１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
上記の開示は概括的に本発明を説明している。次の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に説明の目的で記載されており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
（実施例１）
ｅＴＥＣ連結糖コンジュゲートを調製するための一般プロセス
糖の活性化および二塩酸シスタミンでのチオール化
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含水率に達するように調整する。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣによって決定することができる。二塩酸シスタミンを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を、１モル当量の二塩酸シスタミンと反応させる。別法では、活性化糖を１モル当量の塩酸システアミンと反応させる。チオール化反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、ＣＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
活性化チオール化糖の還元および精製
チオール化糖反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積のＷＦＩに対して行う。１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０による希釈の後に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加する。この還元反応を、５±３℃で２０±２時間を進行させる。活性化チオール化糖の精製を、好ましくは事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対する限外濾過／透析濾過によって行う。別法では、チオール化糖を、標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）手順またはイオン交換クロマトグラフィー方法によって精製する。活性化チオール化糖残余分のアリコートを取り出して、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定する。
活性化チオール化糖の代替の還元および精製
上記の精製手順の代替として、活性化チオール化糖をまた、下記のとおり精製した。
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、５〜１０モル当量の溶液を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して、チオール化糖の透析濾過を行った。活性化チオール化糖残余分のアリコートを取り出して、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定した。
ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製
担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の適切な試薬などのブロモアセチル化剤との反応によってブロモアセチル化する。
活性化前に、担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を先ず、８±３℃、約ｐＨ７に保持する。そのタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をストックのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として、０．２５〜０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。得られたブロモアセチル化（活性化）タンパク質を例えば、限外濾過／透析濾過によって、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を使用し、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）緩衝液を使用して精製する。精製の後に、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイによって推定する。
活性化の程度を、抑制伝導率検出と連動したイオン交換液体クロマトグラフィー（イオンクロマトグラフィー）による全ブロミドアッセイによって決定する。活性化ブロモアセチル化タンパク質上に結合されたブロミドを、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切断し、存在し得るあらゆる遊離ブロミドと共に定量する。アルカリ性２−メルカプトエタノール中で試料を加熱することによって、タンパク質上に残った共有結合で結合した臭素はいずれも、イオンのブロミドへの変換によって放出される。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の活性化および精製
ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭリン酸緩衝０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７（ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用して、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．０を作製した。２０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用して、ＢＡＡＮＳを、１：０．３５（ｗ：ｗ）のＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比で添加した。反応混合物を、３℃〜１１℃の間で３０分〜１時間インキュベートし、次いで、限外濾過／透析濾過によって、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ、７．０を使用して精製した。精製した活性化ＣＲＭ１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイによってアッセイして、タンパク質濃度を決定し、次いで、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。スクロースを、５％ｗｔ／ｖｏｌまで凍結保護物質として添加し、活性化タンパク質を凍結し、コンジュゲーションのために必要になるまで、−２５℃で貯蔵した。
ＣＲＭ１９７のリシン残基のブロモアセチル化は、非常に安定しており、利用可能な３９個のリシンのうち、１５〜２５個のリシンの活性化が生じた。反応は、活性化タンパク質の高い収率をもたらした。
活性化チオール化糖とブロモアセチル化担体タンパク質とのコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃に予備冷却する。続いて、ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化チオール化糖を添加し、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合する。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液で８．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±２時間進行させる。
残留反応性官能基のキャッピング
キャッピング試薬としての２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５℃で３時間反応させることによって、担体タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基をクエンチする。残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５℃で２０時間キャッピングする。
ｅＴＥＣ連結糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション反応（ＩＡＡ−キャッピング後）混合物を、０．４５μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行う。次いで、糖コンジュゲート残余分を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートのアリコートをアッセイのために取り出す。残りの糖コンジュゲートを５℃で貯蔵する。
（実施例２）
Ｐｎ−３３Ｆ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
Ｐｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにする。反応を２３±２℃で１時間進行させた。
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
二塩酸シスタミンを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１モル当量の二塩酸シスタミンを活性化多糖反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。チオール化糖溶液を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈した。希釈反応溶液を、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで、注射用水（ＷＦＩ）を使用して実施した。
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させた。チオール化３３Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、事前冷却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の代替の還元および精製
上記の精製手順の代替として、３３Ｆ活性化チオール化糖を、次のとおりに精製した。
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０を添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用し、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、実施例１において記載したとおり、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃に予備冷却した。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１であった。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を５℃で２０±２時間進行させた。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５℃で２０時間キャッピングした。
ｅＴＥＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５℃で貯蔵した。
結果
Ｐｎ−３３Ｆ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのいくつかのバッチでの反応パラメーターおよび特性決定データを表２において示す。二塩酸シスタミンでのＣＤＴ活性化−チオール化は、糖収率６３〜９０％および遊離糖＜１％〜１３％を有する糖コンジュゲートを生成した。
Figure 2017505792
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのＯＰＡ力価
マウスにおけるＰｎ−３３Ｆ ＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した。４週目および７週目でのＯＰＡ力価（ＣＩ９５％を有するＧＭＴ）を表３において示すが、これは、血清型３３Ｆ Ｐｎ糖コンジュゲートが、マウス免疫原性モデルにおいて、ＯＰＡ力価を誘発したことを実証している。
Figure 2017505792
（実施例３）
Ｐｎ−２２Ｆ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
Ｐｎ−２２Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−２２Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した２２Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥２２Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩをＰｎ−２２Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ−２２Ｆ多糖を、様々な量のＣＤＴで活性化させ、続いて、１モル当量の二塩酸シスタミンでチオール化した。ＣＤＴ活性化を、２３±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにする。反応を２３±２℃で１時間進行させた。
活性化Ｐｎ−２２Ｆ多糖のチオール化
二塩酸シスタミンを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。チオール化糖溶液を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈した。希釈反応溶液を、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで、注射用水（ＷＦＩ）を使用して実施した。
活性化チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５〜１０モル当量を添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させた。チオール化２２Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、事前冷却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。チオール化２２Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
Ｐｎ−２２Ｆ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのコンジュゲーション、キャッピング、および精製
活性化チオール化Ｐｎ２２Ｆ多糖と活性化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション、キャッピング、およびＰｎ−２２Ｆ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの精製を、実施例２に記載のプロセスによって行った。
結果
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−２２Ｆ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表４において示す。
Figure 2017505792
（実施例４）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−１０Ａ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
Ｐｎ−１０Ａ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの調製
ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌莢膜多糖血清型１０Ａ（Ｐｎ−１０Ａ）を含む糖コンジュゲートを、実施例２において記載したプロセスによって調製した。
Ｐｎ−１０Ａ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの特性決定
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−１０Ａ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表５において示す。
Figure 2017505792
Ｐｎ−１０Ａ ＯＰＡ力価
マウスにおけるＣＲＭ１９７とのＰｎ−１０Ａ ｅＴＥＣコンジュゲートに対するＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した。用量を関数としてのＯＰＡ力価を表６において示す。ＯＰＡ力価は、非コンジュゲート血清型１０Ａ多糖に関して、このコンジュゲートで有意に高かった。
Figure 2017505792
（実施例５）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−１１Ａ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
Ｐｎ−１１Ａ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの調製
ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌莢膜多糖血清型１１Ａ（Ｐｎ−１１Ａ）を含む糖コンジュゲートを、実施例２において記載したプロセスによって調製した。
Ｐｎ−１１Ａ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの特性決定
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−１１Ａ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表７において示す。
Figure 2017505792
Ｐｎ−１１Ａ ＯＰＡ力価
マウスにおけるＣＲＭ１９７とのＰｎ−１１Ａ ｅＴＥＣコンジュゲートに対するＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した。用量を関数としたＯＰＡ力価を表８に示す。
Figure 2017505792
（実施例６）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ ＲＡＣ／水性コンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ ＲＡＣ／水性糖コンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートを、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生成するために成功裏に適用されている水性相での還元的アミノ化（ＲＡＣ／水性）を使用して調製した（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照されたい）。この手法は、２ステップを含む。第１のステップは、ビシナルなジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖の酸化である。第２のステップは、活性化多糖をＣＲＭ１９７のリシン（Ｌｙｓ）残基にコンジュゲートすることである。
簡単には、凍結多糖を解凍し、酸化を、リン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ６．０で、種々の量の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を添加することによって実施した。活性化多糖の濃縮および透析濾過を実施し、精製した活性化多糖を４℃で貯蔵した。活性化多糖を、ＣＲＭ１９７タンパク質と配合した。多糖およびＣＲＭ１９７の十分な混合を行い、その後、ボトルをドライアイス／エタノール浴中に入れ、続いて、多糖／ＣＲＭ１９７混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥した混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で復元した。１．５モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３℃で２０時間、およびさらに３７℃で４４時間インキュベートすることによって、コンジュゲーション反応を開始した。反応物を、１倍体積の０．９％生理食塩水で希釈し、２Ｍ当量のホウ水素化ナトリウムを使用して２３℃で３時間キャッピングした。反応混合物を１倍体積の０．９％生理食塩水で希釈し、次いで、精製する前に、０．４５μｍフィルターを通して濾過した。コンジュゲートの濃縮および透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ ＵＦ膜カセットを使用して実施した。
上記プロセスを使用し、種々のパラメーター（例えば、ｐＨ、反応の温度、および多糖の濃度）を変えることによって、数種のコンジュゲートを得た。
典型的な多糖収率は、２０００〜３５００ｋＤａの範囲のコンジュゲートＭＷで、これらのコンジュゲート約５０％および遊離糖１５％であった。
しかしながら、天然の血清型３３Ｆ多糖は、５−ガラクトフラノシル残基のそのＣ２上にＯ−アセチル基を有し、アセチル官能基の約８０％が、水性相での還元的アミノ化を使用するコンジュゲーションプロセスの間に除去されることが見出された。５員環構造（５−ガラクトフラノシド）上のＯ−アセチル基は移動して、水性相プロセスでの還元的アミノ化化学作用の使用で容易に除去され得ることが観察された。
Ｐｎ−３３Ｆ ＲＡＣ／水性糖コンジュゲート安定性の評価
上記プロセスによって調製された代表的なＲＡＣ／水性コンジュゲートのアリコートをポリプロピレン管に分配した。これらの管を、２５℃または３７℃のいずれかで貯蔵し、安定性を最高３．５カ月モニターした。各安定性時点で、遊離糖％レベルを評価した。両方の温度での安定性データを表９にまとめる。表９において示すとおり、遊離糖％レベルは、２５℃および３７℃でかなり上昇した。貯蔵中の遊離糖％レベルの上昇は、コンジュゲートにおける多糖分解の有望なインジケーターである。
Figure 2017505792
血清型３３Ｆ多糖を、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって成功裏に活性化させ、続いて、水性還元的アミノ化化学作用を利用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたが、促進条件下での遊離糖％安定性結果は、コンジュゲーション中にアセチル官能基（免疫原性のための重要な多糖エピトープ）を維持することができないことと合わせて、ＲＡＣ／水性プロセスが、血清型３３Ｆコンジュゲーションのための最適なプロセスではないことを示唆した。
（実施例７）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ糖コンジュゲートの調製
ＲＡＣ／水性プロセスと比較して、ＤＭＳＯ（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化によって行われたコンジュゲーションは一般に、脱Ｏ−アセチル化の可能性がかなり低い。実施例６において記載したＲＡＣ／水性プロセスを使用してのＯ−アセチル官能基の維持に関連した問題を考慮して、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生成するために成功裏に適用されているＲＡＣ／ＤＭＳＯ溶媒を使用する代替の手法（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照されたい）を評価した。
活性化多糖１グラム当たりスクロース２５グラムの比を使用して、活性化多糖を、スクロース（ＷＦＩ中５０％ｗ／ｖ）と配合した。構成要素を十分に混合し、その後、ドライアイス／エタノール浴中でシェル凍結した。次いで、配合した混合物のシェル凍結ボトルを、乾燥するまで凍結乾燥した。
凍結乾燥した活性化多糖をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。復元のために、ＤＭＳＯを、凍結乾燥したＣＲＭ１９７に添加した。復元された活性化多糖を、復元されたＣＲＭ１９７と反応容器中で合わせた。ＮａＣＮＢＨ３を反応混合物に加えることによって、コンジュゲーションを開始した。反応物を２３℃で２０時間インキュベートした。コンジュゲーション（キャッピング）反応の終了を、ＮａＢＨ４の添加によって達成し、反応をさらに３時間継続した。反応混合物を４倍体積の５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０緩衝液で希釈し、次いで、精製の前に、５μｍフィルターを通して濾過した。コンジュゲートの濃縮および透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を使用して実施した。透析濾過を、４０倍透析体積の５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０緩衝液に対して行った。残余分を、０．４５および０．２２μｍフィルターを通して濾過し、分析した。
上記プロセスを使用し、種々のパラメーター（例えば、糖−タンパク質投入比、反応濃度、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭ当量、および含水率）を変えることによって、数種のコンジュゲートを得た。ＲＡＣ／ＤＭＳＯプロセスによって調製されたコンジュゲートから生じた全データは、ＲＡＣ／水性プロセスと比較して優れていることを実証するものであり、良好なコンジュゲーション収率、低い遊離糖％（＜５％）、およびより高いコンジュゲーション度（コンジュゲートされたリシン）でのコンジュゲートの調製を可能にした。加えて、ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲーションプロセスを通じて、アセチル官能基の８０％超を維持することが可能であった。
Ｐｎ−３３Ｆ ＲＡＣ／ＤＭＳＯ糖コンジュゲート安定性の評価
上記プロセスによって調製された代表的なＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートのアリコートをポリプロピレン管に分配し、これらの管を、４℃または２５℃のいずれかで貯蔵し、安定性を遊離糖について３カ月間モニターした。表１０に示すとおり、４℃で貯蔵された試料は、３カ月で４．８％の遊離糖の上昇を示した。しかしながら、２５℃で貯蔵された試料は、３カ月で１５．４％の遊離糖％の上昇を示した。ＲＡＣコンジュゲート中の遊離糖％の上昇は、特に２５℃では、コンジュゲートの分解による。
Figure 2017505792
ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの別のロットの安定性を、４℃、２５℃、および３７℃でも研究した。アリコートをポリプロピレン管に分配し、遊離糖％の潜在的な傾向についてモニターした。表１１において示すとおり、４℃で貯蔵した試料は、２カ月で遊離糖％の４．７％の上昇を示した。遊離糖の上昇は、２５℃および３７℃でかなり高く、コンジュゲートの潜在的な分解を示した。
Figure 2017505792
ＲＡＣ／ＤＭＳＯプロセスによって生成されたコンジュゲートはＯ−アセチル基を維持していたが、特に２５℃超で観察された遊離糖％の上昇は、この経路を使用する潜在的な不安定性を示した。ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの潜在的な不安定性のこの観察を考慮して、ＲＡＣ／ＤＭＳＯは、血清型３３Ｆコンジュゲーションのために最適とは考えられず、代替の化学作用経路を、より安定なコンジュゲート（ｅＴＥＣコンジュゲート）を生成するために開発した。
（実施例８）
追加のＰｎ−３３Ｆ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
追加のＰｎ−３３Ｆ ｅＴＥＣコンジュゲートを、実施例２に記載のプロセスを使用して生成した。Ｐｎ−３３Ｆ ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのこれらの追加のバッチのための反応パラメーターおよび特性決定データを表１２において示す。
Figure 2017505792
表１２において示したとおり、数種のＰｎ３３Ｆコンジュゲートを、上記のｅＴＥＣコンジュゲーションを使用して得た。ｅＴＥＣ化学作用は、高い収率、低い遊離糖％、および高いコンジュゲーション度（コンジュゲートされたリシン）でのコンジュゲートの調製を可能にした。加えて、ｅＴＥＣコンジュゲーションプロセスを使用すると、アセチル官能基８０％超を維持することが可能であった。
（実施例９）
Ｐｎ−３３Ｆ ｅＴＥＣ糖コンジュゲート安定性：遊離糖％の傾向の評価
コンジュゲートバッチ３３Ｆ−２Ｂ（表２を参照されたい）のアリコートをポリプロピレン管に分配し、それぞれ４℃、２５℃、および３７℃で貯蔵し、％遊離糖％の傾向についてモニターした。データ（遊離糖％）を表１３において示す。この表において示すとおり、遊離糖％の有意な変化はなかった。
Figure 2017505792
別のコンジュゲートロット（バッチ３３Ｆ−３Ｃ）の促進安定性も、３７℃で最高１カ月行った。表１４において示すとおり、３７℃で最高１カ月は、遊離糖％に有意な変化はなかった。
Figure 2017505792
ｅＴＥＣコンジュゲートの安定性をさらに確認するために、４℃で貯蔵された追加のコンジュゲートバッチ（３３Ｆ−３Ｃおよび３３Ｆ−５Ｅ（表２および表１２を参照されたい））を最高約１年、遊離糖％の潜在的な傾向についてモニターした。表１５において示すとおり、４℃で最高約１年の長期間貯蔵されたコンジュゲートについて、遊離糖％レベルの有意な変化はなかった。
Figure 2017505792
ＲＡＣ／水性およびＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートと対照的に、３３Ｆ ｅＴＥＣ化学作用によって生成された血清型３３Ｆコンジュゲートは、様々な温度での遊離糖傾向（実時間および加速）によってモニターされたとおり、顕著な分解を伴うことなく、有意により安定であることが実証された。
（実施例１０）
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲートを調製するための一般プロセス
糖の活性化およびメルカプトプロピオニルヒドラジド（ＭＰＨ）スペーサーでのチオール化
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含水率に達するように調整する。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣによって決定することができる。ＭＰＨを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を、１〜３モル当量のＭＰＨと反応させる。チオール化反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、ＣＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、１〜５モル当量の溶液を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製
担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の適切な試薬などのブロモアセチル化剤との反応によってブロモアセチル化する。
活性化前に、担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を先ず、８±３℃、約ｐＨ７に保持する。そのタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をストックのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として、０．２５〜０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）の比で添加する。反応物を、５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。得られたブロモアセチル化（活性化）タンパク質を例えば、限外濾過／透析濾過によって、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を使用し、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）緩衝液を使用して精製する。精製の後に、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイによって推定する。
活性化の程度を、抑制伝導率検出と連動したイオン交換液体クロマトグラフィー（イオンクロマトグラフィー）による全ブロミドアッセイによって決定する。活性化ブロモアセチル化タンパク質上に結合されたブロミドを、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切断し、存在し得るあらゆる遊離ブロミドと共に定量する。アルカリ性２−メルカプトエタノール中で試料を加熱することによって、タンパク質上に残った共有結合で結合した臭素はいずれも、イオンのブロミドへの変換によって放出される。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の活性化および精製
ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭリン酸緩衝０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７（ＰＢＳ）で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用して、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．０を作製した。２０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用して、ＢＡＡＮＳを、１：０．３５（ｗ：ｗ）のＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比で添加した。反応混合物を、３℃〜１１℃の間で３０分〜１時間インキュベートし、次いで、限外濾過／透析濾過によって、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ、７．０を使用して精製した。精製した活性化ＣＲＭ１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイによってアッセイして、タンパク質濃度を決定し、次いで、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。スクロースを、５％ｗｔ／ｖｏｌまで凍結保護物質として添加し、活性化タンパク質を凍結し、コンジュゲーションのために必要になるまで、−２５℃で貯蔵した。
ＣＲＭ１９７のリシン残基のブロモアセチル化は、非常に安定しており、利用可能な３９個のリシンのうち、１５〜２５個のリシンの活性化が生じた。反応は、活性化タンパク質の高い収率をもたらした。
活性化チオール化糖とブロモアセチル化担体タンパク質とのコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃±３℃に予備冷却する。続いて、ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化チオール化糖を添加し、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合する。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液で８．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、５±３℃℃で２０±２時間、進行させる。
残留反応性官能基のキャッピング
キャッピング試薬としての２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインヒドロクロリドと５℃で３時間反応させることによって、担体タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基をクエンチする。残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングする。
オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション反応（ＩＡＡ−キャッピング後）混合物を、０．４５μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行う。次いで、糖コンジュゲート残余分を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートのアリコートをアッセイのために取り出す。残りの糖コンジュゲートを５±３℃で貯蔵する。
（実施例１１）
糖の活性化およびＬ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドスペーサーでのチオール化による（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲートの調製
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含水率に達するように調整する。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣによって決定することができる。Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を、１〜２モル当量のＬ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドと反応させる。チオール化反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、ＣＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、５〜１０モル当量の溶液を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
ブロモアセチル化担体タンパク質との活性化チオール化糖のコンジュゲーション、キャッピング、およびｅＴＡＣコンジュゲートの精製は、上記実施例１０において記載した一般手順に従う。
（実施例１２）
糖の活性化および２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペーサーでのチオール化による（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲートの調製
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含水率に達するように調整する。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣによって決定することができる。ＡＥＥＴを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を、１〜２モル当量のＡＥＥＴと反応させる。チオール化反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、ＣＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
ブロモアセチル化担体タンパク質との活性化チオール化糖のコンジュゲーション、キャッピング、およびｅＴＡＣコンジュゲートの精製は、上記実施例１０において記載した一般手順に従う。
（実施例１３）
糖の活性化および４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドスペーサーでのチオール化による（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲートの調製
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含水率に達するように調整する。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣによって決定することができる。４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を、１〜２モル当量の４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドと反応させる。チオール化反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、ＣＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
ブロモアセチル化担体タンパク質との活性化チオール化糖のコンジュゲーション、キャッピング、およびｅＴＡＣコンジュゲートの精製は、上記実施例１０において記載した一般手順に従う
（実施例１４）
メルカプトプロピオニルヒドラジド（ＭＰＨ）を使用するＰｎ−３３Ｆオキソ−ｅＴＡＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
メルカプトプロピオニルヒドラジド（ＭＰＨ）スペーサーでのＰｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得る。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥する。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定する。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成する。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）をＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製する。Ｐｎ３３Ｆ多糖を、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させる。ＣＤＴ活性化を２３±２℃で１時間実施する。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定する。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＴをいずれもクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、最終含水率が、合計水分１．２％であるようにする。反応を、２３±２℃で１時間進行させる。
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
ＭＰＨを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１〜２モル当量のＭＰＨを活性化多糖反応溶液に添加する。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させる。反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで行う。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出す。
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させる。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却する。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行させる。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応のブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインヒドロクロリドと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
オキソ−ｅＴＡＣ−連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過する。３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施する。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行う。次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５±３℃で貯蔵する。
（実施例１５）
Ｌ−シスチンジメチルエステルを使用するＰｎ−３３Ｆ オキソ−ｅＴＡＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドスペーサーでのＰｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにした。反応を２３±２℃で１時間進行させた。
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１モル当量のＬ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドを活性化多糖反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。チオール化糖溶液を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈した。希釈反応溶液を、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで、注射用水（ＷＦＩ）を使用して実施した。
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させた。チオール化３３Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、事前冷却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の代替の還元および精製
上記の精製手順の代替として、３３Ｆ活性化チオール化糖をまた、次のとおりに精製した。
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用し、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１であった。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行させた。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量の塩酸システアミンと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
オキソ−ｅＴＥＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５±３℃で貯蔵した。
結果
Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドスペーサーを使用する代表的なＰｎ−３３Ｆ オキソ−ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表１６において示す。
（実施例１６）
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）を使用するＰｎ−３３Ｆ オキソ−ｅＴＡＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペーサーでのＰｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定する。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにした。反応を２３±２℃で１時間進行させた。
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
ＡＥＥＴを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１〜２モル当量のＡＥＥＴを活性化多糖反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍の透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１であった。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行させた。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインヒドロクロリドと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
オキソ−ｅＴＡＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５±３℃で貯蔵した。
結果
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペーサーを使用する代表的なＰｎ−３３Ｆ オキソ−ｅＴＡＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表１６において示す。
（実施例１７）
４−アミノ−１−ブタンチオール（ＡＢＴ）を使用するＰｎ−３３Ｆ オキソ−ｅＴＡＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドスペーサーでのＰｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにした。反応を２３±２℃で１時間進行させた。
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１〜２モル当量の４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドを活性化多糖反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍の透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行させた。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインヒドロクロリドと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
オキソ−ｅＴＡＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５±３℃で貯蔵した。
結果
４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリド（ＡＢＴ）スペーサーを使用する代表的なＰｎ−３３Ｆ オキソ−ｅＴＡＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表１６において示す。
Figure 2017505792
これらのリンカーのそれぞれを用いて、分子量、高い収率、低い遊離糖レベル、および低い遊離タンパク質レベルを含む良好な品質系数値を有する多糖−タンパク質コンジュゲートが生成された。
（実施例１８）
第一級ヒドロキシル酸化を介して（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）連結糖コンジュゲートを調製するための一般プロセス
多糖の第一級ヒドロキシル基の酸化
多糖中の第一級アルコールの酸化を、水性または有機溶媒中でＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ系を使用して達成した。ＮＣＳ共酸化剤の量を調整することによって、様々な酸化度（ＤＯ）まで、多糖を酸化させた。一般に、０．５〜２．５モル当量のＮＣＳを、ターゲットの酸化度を達成するために使用した。酸化反応を典型的には、炭酸水素塩／炭酸塩緩衝液（０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．６）、またはｐＨ６．５、７．０、７．５、および８．０のリン酸ナトリウム緩衝液中で行い、２時間で完了する。一部の活性化実験では、糖の過剰酸化を回避するために、ｎ−プロパノールなどの第一級アルコールを使用して、試薬をクエンチした。
具体的な例では、血清型３３Ｆ多糖を反応容器に、４．０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、炭酸水素塩／炭酸塩緩衝液（０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．６）と１：１ｖ／ｖの比で混合した。撹拌混合物に、≦０．１モル当量のＴＥＭＰＯを添加した。０．６〜１．０モル当量のＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を添加することによって、反応を開始した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、その後、活性化多糖を、透析濾過によってＷＦＩで、３０Ｋ限外濾過膜を使用して精製した。精製した多糖を収集し、アルデヒド（３−メチル−２−ベノチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）アッセイを使用）および多糖（アントロンアッセイを使用）の定量的測定によって、酸化度（ＤＯ）を決定した。
還元的アミノ化化学作用を使用する酸化多糖のチオール化
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペーサーを使用する活性化（表１７の第３欄）
酸化および精製された血清型３３Ｆ多糖を反応容器に添加し、続いて、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を０．１Ｍの最終緩衝液濃度まで添加した。この溶液に、１Ｍ当量の２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ）（ＡＥＥＴ）を添加し、均一な溶液を得るために十分に混合した。希ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを６．８に調整した。これに、１．５モル当量のＮａＣＮＢＨ３の添加を続けた。反応混合物を、室温で（２３℃）４８時間撹拌した。次いで、反応混合物を１倍０．９％生理食塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を、２モル当量のホウ水素化ナトリウムで「キャッピング」した。ホウ水素化ナトリウムも、反応中に形成したジスルフィドのいずれも還元するための還元剤として機能する。キャッピング反応時間は典型的には、３時間であった。
シスタミンスペーサー（表１７の第２欄）を使用しての活性化
酸化および精製血清型３３Ｆ多糖を反応容器に添加し、続いて、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を０．１Ｍの最終緩衝液濃度まで添加した。この溶液に、１Ｍ当量の二塩酸シスタミン溶液を添加し、均一な溶液を得るために十分に混合した。希ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを６．８に調整した。これに、１．５モル当量のＮａＣＮＢＨ３の添加を続けた。反応混合物を、室温で（２３℃）４８時間撹拌した。別法では、活性化糖を１Ｍ当量の塩酸システアミンと反応させた。次いで、反応混合物を１倍０．９％生理食塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を、２モル当量のホウ水素化ナトリウムで「キャッピング」した。ホウ水素化ナトリウムも、反応中に形成したジスルフィドのいずれも還元するための還元剤として機能する。キャッピング反応時間は典型的には、３時間であった。
活性化チオール化糖の精製
糖中に存在する残りのジスルフィド結合をいずれも、（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオエリトリトール（ＤＴＴ）などの適切な還元剤を使用して還元した。チオール化糖反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍の透析体積のＷＦＩに対して行った。１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加した。この還元反応を、５±３℃で２０±２時間進行させた。活性化チオール化糖の精製を、好ましくは限外濾過／透析濾過によって、事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。別法では、チオール化糖を、標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）手順またはイオン交換クロマトグラフィー法によって精製した。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出した。
別の例では、糖鎖の末端の還元を利用してアミノチオール試薬と反応させるために、低分子量糖を使用する。低分子量糖は、高分子量多糖の化学的加水分解または機械的均質化によって調製する。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのチオール化３３Ｆのコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。続いて、ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化チオール化糖を添加し、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１であった。反応ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液で８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±２時間進行させた。タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、キャッピング試薬として、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５±３℃で３時間反応させることによってクエンチした。残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
コンジュゲーション反応（ＩＡＡ−キャッピング後）混合物を、５μｍフィルターを通して濾過し、次いで、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜を使用して、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して精製した。次いで、精製コンジュゲートを、０．４５／０．２２μｍフィルターを通して濾過して、原末コンジュゲートを得た。
結果
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）またはシスタミンのいずれかをスペーサーとして使用し、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた代表的なＰｎ−３３Ｆ ｅＴＡＡＮでの特性決定およびプロセスデータを表１７に示す。
Figure 2017505792
これらのリンカーのそれぞれを用いて、分子量、高い収率、低い遊離糖レベルを含む良好な品質系数値を有する多糖−タンパク質コンジュゲートが生成された。
（実施例１９）
多糖のビシナルなジオールの酸化を介して（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）連結糖コンジュゲートを調製するための一般プロセス
別法では、糖を、過ヨウ素酸塩を使用してビシナルなシスジオールを酸化させることによって活性化させることができる。具体的な例では、血清型３３Ｆ多糖を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、２５ｍＭ緩衝液中で２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで溶かした。０．２Ｍ当量の過ヨウ素酸ナトリウム（水中の５０ｍｇ／ｍＬ溶液）を添加することによって、反応を開始した。１８時間後に、活性化多糖をＷＦＩで、３０Ｋ限外濾過膜を使用して、透析濾過によって精製した。精製した多糖を収集し、アルデヒド（３−メチル−２−ベノチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）アッセイを使用）および多糖（アントロンアッセイを使用）の定量的測定によって、酸化度（ＤＯ）を決定した。
酸化多糖のチオール化およびコンジュゲーションを、上記のとおり実施例１８において記載した手順によって実施した。
結果
スペーサーとして２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）またはシスタミンのいずれかを使用して、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた代表的なＰｎ−３３Ｆ ｅＴＡＡＮ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表１８に示す。
Figure 2017505792
これらのリンカーのそれぞれを用いて、分子量、高い収率、低い遊離糖レベル、および低い遊離タンパク質レベルを含む良好な品質系数値を有する多糖−タンパク質コンジュゲートが生成された。
（実施例２０）
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）連結糖コンジュゲートを調製するためのプロセス
Ｐｎ−２Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得る。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥する。凍結乾燥したＰｎ−２２Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。この溶液に、塩酸シスタミン（１．０ｍ当量）を、続いて、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（１．１ｍ当量）およびＨＯＢｔ（１．１ｍ当量）を添加する。次いで、混合物を２３±２℃で１８±２時間撹拌し、その後、事前冷却しておいたリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０に注ぐことによって１０倍希釈する。希釈溶液を５μｍフィルターを通して濾過する。誘導体化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで、注射用水（ＷＦＩ）に対して実施する。残余分を収集する。
活性化チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンの溶液（ＴＣＥＰ、５モル当量）を添加する。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させる。チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施する。透析濾過を、事前冷却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行う。チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出す。
チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、実施例１において記載したとおり、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−２２Ｆ多糖と反応させる。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却する。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、０．９±０．１の糖／タンパク質投入比を使用して、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合する。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行させる。
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チオール化Ｐｎ８−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングする。
ｅＴＡＡＤ連結Ｐｎ−２２Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過する。Ｐｎ−２２Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施する。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行う。次いで、Ｐｎ−２２Ｆ糖コンジュゲート１００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５±３℃で貯蔵する。
（実施例２１）
チアゾリジノン活性化経路を介して（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）連結糖コンジュゲートを調製するプロセス
Ｐｎ−２２Ｆ多糖の誘導体化
Ｐｎ−２Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得る。混合物をドライアイス−エタノール浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥する。凍結乾燥したＰｎ−２２Ｆ多糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。この溶液に、ＤＭＳＯ中のチアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）（０．３Ｍ当量）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（０．３ｍ当量）溶液を添加する。次いで、混合物を２３±２℃で１８±２時間撹拌する。この溶液に、０．２Ｍ当量のシスタミンヒドロクロリドを添加し、反応をさらに１８時間継続する。チオール化多糖を水で緩衝液交換する。
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンの溶液（ＴＣＥＰ、５モル当量）を添加する。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させる。チオール化Ｐｎ８多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施する。透析濾過を、事前冷却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行う。チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出す。
チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
Ｐｎ−２２Ｆチオール化多糖のコンジュゲーションを、上記の実施例２０において概説したとおりに実施する。
明細書において上述した刊行物および特許出願はすべて、本発明が関する分野の当業者のレベルを示すものである。刊行物および特許出願はすべて、それぞれ個々の刊行物および特許出願が具体的に、かつ個別に、参照によって組み込まれると示されている場合と同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
上述の発明を、理解を明確にする目的で、多少詳細に説明および例示によって記載してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある種の変化および変更を実施することもできる。

Claims (32)

  1. （（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲート。
  2. 一般式（Ｉ）を有する、請求項１に記載の糖コンジュゲート：
    Figure 2017505792
     ［式中、
    Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
    Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり得、
    Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであり、前記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、またはプロピルから選択される］。
  3. Ｘが、Ｏであり、かつｍが、１であるか、または
    Ｘが、Ｓであり、かつｍが、１であるか、または
    ｍが、０である、請求項２に記載の糖コンジュゲート。
  4. Ｂが、結合であるか、または
    Ｂが、Ｏであるか、または
    Ｂが、ＣＨ２である、請求項２から３のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  5. ｍが、０であり、Ｂが、（Ｃ＝Ｏ）である、請求項２に記載の糖コンジュゲート。
  6. Ｒが、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、もしくは（ＣＨ２）１０からなる群から選択されるか、または
    Ｒが、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであるか、または
    Ｒが、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、およびＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２からなる群から選択される、請求項２から５のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  7. 前記スペーサーが（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサーではないことを条件とする、請求項１からの６のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  8. 一般式（ＩＩ）を有する、請求項１に記載の糖コンジュゲート：
    Figure 2017505792
     ［式中、Ｒは、（ＣＨ２）ｎであり、ｎは、３〜１０である］。
  9. ｎが、３、４、５、または６である、請求項１４に記載の糖コンジュゲート。
  10. 一般式（ＩＩＩ）を有する、請求項１に記載の糖コンジュゲート：
    Figure 2017505792
     ［式中、Ｒは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
    ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
  11. Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択されるか、または
    Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択されるか、または
    Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択される、請求項１０に記載の糖コンジュゲート。
  12. 一般式（ＩＶ）を有する、請求項１に記載の糖コンジュゲート：
    Figure 2017505792
     ［式中、Ｒは、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
    ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］。
  13. Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択されるか、または
    Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択されるか、または
    Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択される、請求項１２に記載の糖コンジュゲート。
  14. 一般式（Ｖ）を有する、請求項１に記載の糖コンジュゲート：
    Figure 2017505792
     ［式中、Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
    ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］。
  15. Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、かつｎが、１〜１０から選択されるか、または
    Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択されるか、または
    Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択されるか、または
    Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、かつｍが、１〜４から選択される、請求項１４に記載の糖コンジュゲート。
  16. オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖であって、糖が、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結された糖；または
    オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖であって、糖が、アミン連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結された糖；または
    オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖であって、糖が、アミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結された糖
    を含む、請求項１に記載の糖コンジュゲート。
  17. 糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する莢膜多糖である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  18. 前記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される、請求項１７に記載の糖コンジュゲート。
  19. 糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）に由来する莢膜糖である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  20. 糖が、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  21. 糖コンジュゲートが、５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  22. 担体タンパク質が、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合体、無毒化ニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群において選択されている、請求項１から２１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  23. 担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  24. 糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が０．２〜４の間である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
  25. 請求項１から２４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
  26. アジュバントをさらに含む、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
  27. （（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
    ａ）糖を、炭酸誘導体またはシアノゲン誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
    ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
    ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
    ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
    ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
    を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
  28. （（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
    ａ）糖を、アルデヒド基を生成するための酸化試薬と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
    ｂ）活性化糖を、リンカーのアミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有する二官能性リンカーと反応させて、還元的アミノ化によってチオール化糖を生成するステップと、
    ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
    ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
    ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
    を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
  29. （（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされたカルボキシル含有糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
    ａ）活性化糖を生成するためのカルボキシル基含有糖を、カルボジイミドまたはその誘導体と初めに反応させるステップと、
    ｂ）活性化糖を、アミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有するヘテロ二官能性リンカーと反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
    ｃ）チオール化糖を脱保護剤または還元剤（保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
    ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
    ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
    を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
  30. 医薬品として使用するための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート、または請求項２５もしくは２６に記載の免疫原性組成物。
  31. ワクチンとして使用するための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート、または請求項２５もしくは２６に記載の免疫原性組成物。
  32. 対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法において使用するための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の糖コンジュゲートまたは請求項２５もしくは２６に記載の免疫原性組成物。
JP2016551278A 2014-02-14 2015-02-06 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート Withdrawn JP2017505792A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461939845P 2014-02-14 2014-02-14
US61/939,845 2014-02-14
PCT/IB2015/050919 WO2015121783A1 (en) 2014-02-14 2015-02-06 Immunogenic glycoprotein conjugates

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018139094A Division JP6714051B2 (ja) 2014-02-14 2018-07-25 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2017505792A true JP2017505792A (ja) 2017-02-23

Family

ID=52682783

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016551278A Withdrawn JP2017505792A (ja) 2014-02-14 2015-02-06 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート
JP2018139094A Active JP6714051B2 (ja) 2014-02-14 2018-07-25 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018139094A Active JP6714051B2 (ja) 2014-02-14 2018-07-25 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート

Country Status (6)

Country Link
US (3) US10668164B2 (ja)
EP (2) EP3443983B1 (ja)
JP (2) JP2017505792A (ja)
CA (1) CA2939416A1 (ja)
ES (2) ES2701169T3 (ja)
WO (1) WO2015121783A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020523323A (ja) * 2017-06-10 2020-08-06 インベントプライズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 改善された免疫原性及び結合活性を提供する２価又は多価コンジュゲート多糖を含む多価コンジュゲートワクチン

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3421051T (pt) 2012-08-16 2020-06-26 Pfizer Processos e composições de glicoconjugação
KR102049826B1 (ko) * 2014-01-21 2019-12-03 화이자 인코포레이티드 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 및 그의 접합체
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3443983B1 (en) 2014-02-14 2022-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
SG11201708242YA (en) 2015-05-04 2017-11-29 Pfizer Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
TWI756893B (zh) 2015-07-21 2022-03-01 美商輝瑞股份有限公司 包含經共軛之莢膜糖抗原的致免疫性組成物、包含該致免疫性組成物之套組及彼等之用途
CN109890413B (zh) 2016-09-02 2024-04-16 赛诺菲巴斯德股份有限公司 脑膜炎奈瑟氏菌疫苗
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
GB201711637D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
GB201711635D0 (en) * 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
EP3678655A4 (en) * 2017-09-07 2021-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTIPNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN POLYSACCHARIDE-CARRIER PROTEIN IMMUNOGENIC CONJUGATES
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
CA3142692A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 Merck Sharp & Dohme Corp. An immunogenic serotype 35b pneumococcal polysaccharide-protein conjugate and conjugation process for making the same
CN115362177A (zh) 2020-02-21 2022-11-18 辉瑞公司 糖类的纯化

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60248622A (ja) * 1984-05-10 1985-12-09 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテツド 細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物
JPH0565300A (ja) * 1991-01-28 1993-03-19 Merck & Co Inc 肺炎連鎖球菌多糖結合体ワクチン
JP2001509144A (ja) * 1996-12-16 2001-07-10 デ・シュタート・デア・ネーダーランデン、フェルテゲンウールディクト・ドール・デ・ミニスター・バン・ベルツィン、フォルクスゲゾンドハイド・エン・カルツール 多糖類をタンパクに結合する方法
JP2006511465A (ja) * 2002-08-30 2006-04-06 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 改変された糖類、それらの結合体、およびそられの製造
JP2013518891A (ja) * 2010-02-09 2013-05-23 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション １５価肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートワクチン組成物

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1247080A (en) 1983-03-08 1988-12-20 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
CA2063271A1 (en) 1989-07-14 1991-01-15 Subramonia Pillai Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
IL98715A0 (en) 1990-08-13 1992-07-15 American Cyanamid Co Filamentous hemaglutinin of bodetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
US5769047A (en) 1991-12-23 1998-06-23 Zoche; Michael Engine with oil separator
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
EP0643559B1 (en) 1992-05-06 1999-04-14 The President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
ES2231770T3 (es) 1993-03-05 2005-05-16 Wyeth Holdings Corporation Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica.
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6027925A (en) 1997-06-12 2000-02-22 Shin-Etsu Bio, Inc. Production of non-native bacterial exopolysaccharide in a recombinant bacterial host
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
MXPA01003228A (es) 1998-09-30 2003-06-24 American Cyanamid Co Holotoxina de colera mutante como un coadyuvante.
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
CN100398653C (zh) 1998-12-23 2008-07-02 益得生物医学公司 新颖的链球菌抗原
US6936258B1 (en) 1999-03-19 2005-08-30 Nabi Biopharmaceuticals Staphylococcus antigen and vaccine
JP2002541808A (ja) 1999-04-09 2002-12-10 テクラブ， インコーポレイテッド ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
EP1303612A2 (en) 2000-06-20 2003-04-23 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
WO2002091998A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
JP2005508143A (ja) 2001-06-07 2005-03-31 ワイス・ホールデイングス・コーポレーシヨン アジュバントとしてのコレラホロトキシンの突然変異形
CN1297316C (zh) 2001-06-07 2007-01-31 惠氏控股有限公司 作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式
WO2003054007A2 (en) 2001-12-20 2003-07-03 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
EP1601381A2 (en) 2003-03-07 2005-12-07 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
ES2295836T3 (es) 2003-03-13 2008-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Procedimiento de purificacion de citolisina bacteriana.
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
KR102220506B1 (ko) 2005-04-08 2021-03-02 와이어쓰 엘엘씨 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US8075915B2 (en) * 2005-09-28 2011-12-13 Gilbert Buchalter Composition and method of transmitting ultrasonic and electrical impulses using a physiologically compatible conductive agent
KR101515078B1 (ko) * 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
US20070253985A1 (en) 2006-04-26 2007-11-01 Wyeth Novel processes for coating container means which inhibit precipitation of polysaccharide-protein conjugate formulations
WO2008157590A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 Baxter International Inc. Modified polysaccharides for conjugate vaccines
ES2552366T3 (es) 2007-06-26 2015-11-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna que comprende conjugados de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae
PT3421051T (pt) * 2012-08-16 2020-06-26 Pfizer Processos e composições de glicoconjugação
EP3443983B1 (en) 2014-02-14 2022-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60248622A (ja) * 1984-05-10 1985-12-09 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテツド 細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物
JPH0565300A (ja) * 1991-01-28 1993-03-19 Merck & Co Inc 肺炎連鎖球菌多糖結合体ワクチン
JP2001509144A (ja) * 1996-12-16 2001-07-10 デ・シュタート・デア・ネーダーランデン、フェルテゲンウールディクト・ドール・デ・ミニスター・バン・ベルツィン、フォルクスゲゾンドハイド・エン・カルツール 多糖類をタンパクに結合する方法
JP2006511465A (ja) * 2002-08-30 2006-04-06 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 改変された糖類、それらの結合体、およびそられの製造
JP2013518891A (ja) * 2010-02-09 2013-05-23 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション １５価肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートワクチン組成物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EINHORN, J. ET AL.: ""Efficient and Highly Selective Oxidation of Primary Alcohols to Aldehydes by N-Chlorosuccinimide Me", J. ORG. CHEM., vol. 61, no. 21, JPN6017034801, 18 October 1996 (1996-10-18), pages 7452 - 7454, XP000627291, ISSN: 0003724564, DOI: 10.1021/jo9609790 *
ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ, vol. 59, no. 3, JPN6018001853, 1991, pages 843 - 851, ISSN: 0003724562 *
ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ, vol. 110, no. 47, JPN6018001856, 2013, pages 19077 - 19082, ISSN: 0003724563 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020523323A (ja) * 2017-06-10 2020-08-06 インベントプライズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 改善された免疫原性及び結合活性を提供する２価又は多価コンジュゲート多糖を含む多価コンジュゲートワクチン
JP7132954B2 (ja) 2017-06-10 2022-09-07 インベントプライズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 改善された免疫原性及び結合活性を提供する２価又は多価コンジュゲート多糖を含む多価コンジュゲートワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019001790A (ja) 2019-01-10
WO2015121783A1 (en) 2015-08-20
JP6714051B2 (ja) 2020-06-24
EP3104886B1 (en) 2018-10-17
CA2939416A1 (en) 2015-08-20
EP3104886A1 (en) 2016-12-21
EP3443983A1 (en) 2019-02-20
US11707529B2 (en) 2023-07-25
US20170007713A1 (en) 2017-01-12
ES2930318T3 (es) 2022-12-09
US20200246475A1 (en) 2020-08-06
US20240033367A1 (en) 2024-02-01
US10668164B2 (en) 2020-06-02
EP3443983B1 (en) 2022-07-20
ES2701169T3 (es) 2019-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11723965B2 (en) Glycoconjugation processes and compositions
US11707529B2 (en) Immunogenic glycoprotein conjugates
JP6153581B2 (ja) 組成物および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170413

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180129

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180405

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180620

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20180726