FI107370B - Menetelmä pneumokokkipolysakkaridikonjugaattirokotteen valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 107370

Menetelmä pneumokokkipolysakkaridikonjugaattirokotteen valmistamiseksi

Patogeeniset bakteerit, joille on annettu luokitus 5 Streptococcus pneumoniae (pneumokokki, Pn) , on jaettu edelleen 84 antigeeniseksi serotyypiksi, jotka perustuvat organismin kapselipolysakkaridiin (Pn-Ps). Näistä organismeista johtuviin tautitiloihin kuuluvat keuhkokuume, aivokalvontulehdus, välikorvantulehdus, bakteremia ja krooni-10 sen keuhkoputkentulehduksen, sivuontelontulehduksen, niveltulehduksen ja sidekalvontulehduksen äkillinen paheneminen. Näistä taudeista ylivoimaisen osan aiheuttaa kuitenkin rajoitettu alajoukko 84 tunnetusta isolaatista. Täten polyvalentti rokote, joka sisältää organismin ylei-15 simpien ja patogeenisimpien isolaattien Pn-Ps:n, voi antaa suojan tämän luokan yleisimmin raportoitujen patogeenien hyvin suurta prosenttiosuutta vastaan.

On tuotettu polyvalentteja rokotteita, jotka aiheuttavat tehokkaasti suojaavia immuunivasteita pneumokokke-20 ja vastaan aikuisilla. Esimerkiksi "PNEUMOVAXR 23" (Pneu mococcal Vaccine Polyvalent, MSD; katso PDR, 1990 laitos, s. 1431) on nestemäinen koostumus, joka sisältää 50 μg/ml kutakin 23 erilaista, konjugoimatonta pneumokokkipolysak-karidia, jotka kaikki on talletettu ATCC:iin ja jotka tar-25 joavat yhden mahdollisen tämän keksinnön mukaisen lähtöma- teriaalilähteen. "PNEUMOVAXR 23" sisältää kunkin seuraavas-ta vapaasta, ts. konjugoimattomasta, polysakkaridista: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F ja 33F, jotka muodostavat 30 noin 90 % veriperäisistä pneumokokki-isolaateista. Kuiten kin tällaiset rokotteet ovat vähiten tehokkaita siinä väestön osassa, jolla on suurin riski saada pneumokokki-infektioita: B-soluperäisestä immuniteettivajavaisuudesta kärsivät yksilöt, ikääntyneet ihmiset ja kahta vuotta nuo-35 remmat pikkulapset, joiden immuunisuoja on riippuvainen T-solujen immuunivasteesta. Koska konjugoimattomat poly- 2 107370 sakkaridit ovat huonoja T-solujen immuunivasteiden laukaisijoita, Pn-Ps:ien muuttaminen sellaisiksi immunogeeneik-si, jotka pystyvät laukaisemaan T-soluvasteet, on ratkaisu, jolla tuotetaan riittävä suoja tälle kohdeväestölle.

5 Käyttö ei kuitenkaan ole rajoittunut tähän yksilöiden ryhmään. Esimerkiksi rokotteen, joka sisältää yhden tai useamman uusista konjugaateista, anto naaraspuoliselle nisäkkäälle ennen raskautta tai sen aikana saa aikaan äidissä vasta-aineita, jotka voivat passiivisesti suojata kehitty-10 vää sikiötä ja imeväistä pikkulasta, vaikka rokotetta ei annetakaan suoraan sikiölle tai pikkulapselle. Tällaisten konjugaattirokotteiden pitäisi myös osoittautua hyödyllisiksi, kun halutaan saada esiin vasta-aineita äärimmäistä passiivista suojaa varten riskipopulaatioissa, kuten vas-15 tasyntyneissä tai tartunnan saaneiden yksilöiden sisaruksissa.

Sellaisten polysakkaridien, joiden on havaittu itsessään olevan huonosti immunogeenisia, on osoitettu olevan varsin hyviä immunogeeneja sen jälkeen, kun ne on kon-20 jugoitu immunogeeniseen proteiiniin PRO, [Marburg ym., US-patentti nro 4 695 624; Schneerson ym., New Dev, with Hum. & Vet. Vaccines, 77-94 (1980); Schneerson ym., J.

Exptl. Med., 152, 361 (1980); Anderson, Infection and

Immunity, 39, 233 (1983)]. Sellaisten konjugaattien tuota- . 25 nnossa suuri ongelma on kuitenkin polysakkaridilähtömate- « · riaalin viskoosi ja epähomogeeninen luonne, ja tästä johtuva hankaluus määritellä konjugaattituote kemiallisesti. Niinpä vaaditaan menetelmä, jossa lähtömateriaalit ovat niin hyvin määriteltyjä kuin mahdollista ja kukin syn-30 teesireitin vaihe voidaan määrittää muodostuneen välituotteen perusteella. Tässä paljastettu menetelmä tyydyttää tämän vaatimuksen tarjoamalla hyvin immunogeenisia konju-gaatti-immunogeeneja niitä yhteenkuuluvia patogeenejä vastaan, joista Pn-Ps on peräisin. Konjugaatit ovat hyödylli-35 siä kahta vuotta nuoremmissa pikkulapsessa.

3 107370

Marburg ym. [J. Am. Chem. Soc., 108, 5282 (1986) ja US-patentit 4 695 624, 4 830 852 ja 4 882 317] paljastivat keinon, jolla voidaan konjugoida polysakkarideja ja immu-nogeenisia proteiineja bigeneeristen väliryhmien välityk-' 5 sellä. PRO derivatisoitiin niin, että siinä on esillä nuk- leofiilisiä tai elektrofiilisiä kiinnitysryhmiä (PRO*), kun taas toisena osapuolena oleva Ps funktionalisoitiin niin, että siinä on esillä reaktiivisuudeltaan vastakkaisia lisäryhmiä (Ps*). Kun Ps* yhdistettiin PRO*:n kanssa, 10 muodostui bigeneerisiä väliryhmiä, jotka liittivät Ps:n kovalenttisesti PRO:hon (Ps-PRO). Happohydrolyysissä bi-geneerinen väliryhmä poistuu epätavallisena aminohappona, joka kvantitoidaan aminohappoanalyysissä, ja näin ollen se tarjoaa keinon todistaa kovalenttisuus.

15 Tämä keksintö paljastaa menetelmän, jota on paran nettu siihen verrattuna, joka paljastetaan US-patenteissa 4 695 624, 4 830 852 ja 4 882 317. Parannuksiin kuuluu sellaisen Pn-Ps-lähtömateriaalin valmistus, jolla on spe-sifisempiä, paremmin toistettavissa ja hallittavissa ole-20 via fysikaalisia ominaisuuksia epäpuhtaiden Pn-Ps-valmis-teiden tarjoamiin ominaisuuksiin verrattuna, mukaanlukien: suurempi liukoisuus, suurempi suodatettavuus, suurempi puhtaus (kontaminaation ryhmäspesifisellä C-polysakkari-dilla (C-Ps) väheneminen), ja pienentynyt molekyylipaino, ; 25 polydispergoitumisaste ja viskositeetti. Tässä paljastet tavat tuloksena olevat konjugaatit ovat niihin verrattuna, joita 4 695 624:n menetelmä tarjoaa, parempia lisääntyneen konsistenssin ja valmistamisen helppouden, paremman antigeeni suuden ja lopputuotteen paremman puhtauden suhteen. 30 Erityisen merkittävä on ryhmäspesifisen C-polysakkaridin *. 3-20 -kertainen väheneminen ja peptidoglykaanin vähe neminen Pn-Ps:ssä ennen konjugaatiota verrattuna Pn-Ps-valmisteisiin ennen konjugaatiota patentissa 4 695 624. Vaikka C-polysakkaridiepäpuhtauden läsnäolo ei häiritse-35 kään immuuniresponsseja tyyppispesifisiä antigeenejä vas- 4 107370 taan, C-Ps voisi ottaa osaa konjugaatioreaktioon, ja tehdä siitä tyyppispesifisen Ps:n suhteen vähemmän spesifisen ja kontrolloidun. Lisäksi C-polysakkaridi-vasta-aineiden tuotanto voi korreloida kudostuhoon, joka on havaittu joissa-5 kin selvittämättä jääneissä pneumokokki-infektoissa.

Uuden konjugaattituotteen lisäksi tämä keksintö paljastaa uuden menetelmän, jolla voidaan tuottaa osittain hydrolysoituja, hyvin puhtaita pneumokokkipolysakkaridi-välituotteita, uusia koostumuksia, jotka sisältävät yhdes-10 tä kymmeneen eri konjugaattia, ja keksinnön käyttömenetelmiä. Erityisen kiinnostavia ovat kapselipolysakkaridit, jotka ovat mukana "PNEUMOVAX8 23":ssa (Pneumococcal Vaccine Polyvalent, MSD; katso PDR, 1990 laitos, s. 1431). Edullisin alalaji ovat Streptococcus pneumoniae -alatyyppien 6B, 15 23F, 19F, 14, 18C, 4 ja 9V kapselipolysakkaridit, sillä tämän pneumokokki-alatyyppien pienen ryhmän arvioidaan olevan vastuussa 75 - 85 % osuudella pikkulasten ja lasten pneumokokki-infektioissa. Tässä annetut menetelmät ovat sovellettavissa suureen kokoelmaan pneumokokki- ja muita 20 bakteeripolysakkarideja.

Kemiallisesti hyvin määritetty pneumokokkipolysak-karidi (Pn-Ps) valmistetaan hydrolysoimalla epäpuhdas Pn-Ps-valmiste osittain, päätepisteeseen, jonka on ennalta määritelty säilyttävän Pn-Ps:n antigeenisen eheyden. Osit-25 tain hydrolysoitua Pn-Ps:a puhdistetaan merkittävästi, ja se on hyödyllinen, kun halutaan valmistaa Pn-Ps-immuno-geeninen proteiini (PRO) -konjugaatteja (Pn-Ps-PRO).

Keksinnön mukaiset uudet ja hyvin antigeeniset Pn-Ps-PRO -konjugaatit, jotka sisältävät Neisseria menin-30 gitidis b:n ulkomembraaniproteiinikompleksin (OMPC), tai *. sen geeniteknologisin menetelmin valmistettuja tai puhdis- tettuja alayksiköitä, kuten MIEP:n, tai muita immunogeeni-sia kantajaproteiineja, jotka on kovalenttisesti liitetty osittain hydrolysoituihin ja suuresti puhdistettuihin, 35 yleisistä pneumokokki-isolaateista peräisin oleviin Pn- 5 107370

Ps-välituotteisiin, ovat hyödyllisiä haluttaessa estää pneumokokki-infektioita nisäkkäissä. Konjugaatit ovat erityisen hyödyllisiä rokotekoostumuksissa kun halutaan stimuloida nisäkkäissä immuunivaste pneumokokkeja vastaan, 5 erityisesti B-soluperäisestä immuniteettivajavaisuudesta kärsivissä yksilöissä, ikääntyneissä ihmisissä ja kahta vuotta nuoremmissa ihmispikkulapsissa, koska konjugaatit saavat aikaan T-soluvasteen. Pn-Ps-OMPC- ja Pn-Ps-MIEP -konjugaatit tehdään menetelmällä, joka sisältää seuraavat 10 vaiheet: eristetään kapseli-Ps Streptococcus pneumoniae -viljelmistä (Pneumokokki, Pn), Pn-Ps hydrolysoidaan osittain tai rikotaan fysikaalisesti, fraktioidaan mainittu Pn-Ps, jolloin saadaan molekyylikooltaan, polydispergoitu-misasteeltaan ja viskositeetiltaan pienentynyt Pn-Ps-tuo-15 te, ja sitten konjugoidaan kovalenttisesti Pn-Ps OMPC:iin tai MIEPjiin.

Tämän keksinnön tavoite on tarjota uusia, osittain hydrolysoituja ja hyvin puhdistettuja antigeenisesti tyyp-pispesifisiä pneumokokkikapselipolysakkarideja (Pn-Ps), 20 jotka ovat hyödyllisiä välituotteina valmistettaessa T-soluriippuvaisia Pn-Ps:n ja immunogeenisten proteiinien konjugaatteja. Toinen tavoite on tarjota Pn-Ps:n ja immunogeenisten proteiinien T-soluriippuvaisia konjugaat-teja, jotka ovat hyödyllisiä rokotekoostumuksissa, joilla • 25 voidaan estää pneumokokki-infektioita, erityisesti kahta vuotta nuoremmilla pikkulapsilla ja B-soluperäisestä immuniteettivajavaisuudesta kärsivillä ihmisillä. Vielä eräs tavoite on tarjota menetelmä, joka on parannettu siihen verrattuna, joka tarjottiin US-patentissa nro 4 695 624, 30 jolla muodostetaan kovalenttisia pneumokokkipolysakkaridi- » *. immunogeeninen proteiini -konj ugaatte ja (Pn-Ps-PRO), jossa parannus koostuu lähtö-Pn-Ps:n, välituotteiden ja lopputuotteen paremmasta kemiallisesta määrittelystä ja puhtaudesta, ja itse menetelmän suorittamisen lisääntyneestä 35 toistettavuudesta ja helppoudesta. Vielä eräs tavoite on 6 107370 tarjota kemiallisesti määriteltyjä Pn-Ps-Pro -konjugaat-teja, parannetun menetelmän mukaisesti, jotka osoittavat T-soluriippuvuutta, ja ovat hyödyllisiä haluttaessa saada aikaan suojaava seerumivasta-aine patogeenisiä pneumokok-5 keja vastaan, erityisesti kahta vuotta nuoremmilla pikkulapsilla ja immuniteettivajavaisuudesta kärsivillä yksilöillä. Vielä eräs tavoite on tarjota hoitomenetelmä, joka käyttää näitä konjugaatteja immunologisesti tehokkaina määrinä rokoteformulaatioissa, jolloin estetään pneumo-10 kokkien aiheuttamia tauteja kuten välikorvantulehdus, aivokalvontulehdus, keuhkokuume, bakteremia ja kroonisen keuhkoputkentulehduksen, sivuontelontulehduksen, niveltulehduksen ja sidekalvontulehduksen äkillinen paheneminen.

A. Uusi Pn-Ps-PRO -konjugaatti ja polysakkaridi-15 välituotteet: Tämän keksinnön mukaisella Pn-Ps-PRO -konjugaatti-tuotteella on Pn-Ps:n suhde PROiiin välillä 0,05 ja 0,5 mg polysakkaridia/mg proteiinia, suuri kovalenttisuusaste, minimaalinen vapaan Pn-Ps:n aiheuttama kontaminaatio kon-20 jugaatissa ja ainutlaatuiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, jotka uudet ainesosana olevat polysakkaridit sille antavat.

Konjugaatti sisältää immunogeenisen proteiinin (PRO), joka on kovalenttisesti liitetty väliryhmän väli-• 25 tyksellä uuteen, osittain hydrolysoituun ja erittäin puh taaseen pneumokokki-kapselipolysakkaridiin (Pn-Ps). Immu-nogeeninen proteiini on edullisesti ulkomembraaniprote-iinikompleksi (OMPC), joka on peräisin Neisseria meningitidis b -viljelmästä. Yksi menetelmä OMPC:n valmistami-30 seksi on olennaisesti sama kuin US-patentissa 4 271 147 ja esimerkissä 1 tarjottu. Vaihtoehtoisesti OMPC:n alayksikkö, kuten MIEP, joka tuotetaan OMPC:n dissosiaatiolla tai sen rekombinanttiekspressiolla, on myös edullinen. Eräs menetelmä tämän tavoitteen saavuttamiseen annetaan USSN-35 hakemuksissa 555 978, 555 329 ja 555 204 (Merckin hakemus- 7 107370 numerot vastaavasti 18 110, 18 159 ja 18 160, jätetty 19. heinäkuuta 1990) ja esimerkissä 2, 16-23.

Uusi, osittain hydrolysoitu ja erittäin puhdas pneumokokkikapselipolysakkaridi (Pn-Ps) on antigeeninen 5 polysakkaridivalmiste, joka on peräisin yhden pneumokok-kialatyypin viljelmästä (kuten alla kuvataan kohdassa, jossa kuvataan uutta konjugaatiomenetelmää ja esimerkeissä 3 - 10). Pn-Ps:n keskimääräinen molekyylipaino on välillä lxlO5 - lxlO6 daltonia, keskimäärin vähemmän kuin noin 10 1 000 toistuvaa yksikköä per molekyyli, C-polysakkaridi- kontaminaation taso vähemmän kuin noin 3 % ja antigeeni-suusindeksi välillä 0,4 - 1,1 ja edullisesti välillä 0,7 -1,1. Viimeksi mainittu parametri on pneumokokin vastaisen tyyppispesifisen vasta-aineen sitoutumisen suhteellinen 15 määrä, joka havaitaan uuden Pn-Ps:n massayksikköä kohden, verrattuna ATCC:iin talletettuun epäpuhtaaseen Pn-Ps:iin. Lisäksi uusi Pn-Ps soveltuu konjugaatioon immunogeenisen proteiinin kanssa, jolloin tuotetaan keksinnön mukainen Pn-Ps-PRO -tuote. Joitakin kahden erilaisen Pn6B-Ps:n ja 20 kahden erilaisen Pn23F-Ps-valmisteen fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia esitetään edempänä taulukossa 1, kun taas seuraava kuvaus paljastaa, miten nämä ominaisuudet mitataan. Edempänä paljastettava menetelmä tarjoaa metodin, jolla valmistetaan Pn-Ps-välituotteita ja Pn-Ps- ,· 25 PRO -konjugaatteja, joissa on suuri joukko eri pneumokok- kialatyyppejä, mukaanlukien, näihin rajoittumatta, ne jotka on valittu alatyypeistä 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F ja 33F. Kuten yllä on mainittu, pneumokokkipolysakka-30 ridien edullisen alaryhmän muodostavat ne, jotka ovat pe-. räisin pneumokokkialatyypeistä 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F. Ammattimiehille on ilmeistä, että minkä tahansa näistä polysakkarideista lisäksi tai sijasta tilalle voidaan tuoda muita sen mukaan, kuin tarve riskiväestössä vaatii. 35 Täten Pnl-Ps:ia ja Pn5-Ps:ia voidaan kohdella kuten Pn4- 8 107370

Ps:ia tai Pn9V-Ps:ia, kuten voitaisiin Neisseria meningitidis B:n, C:n tai B-ryhmän streptokokin polysakkarideja, kun taas Pn7F-Ps:ia voidaan kohdella kuten Pnl4-Ps:ia, kuten edelleen alla kuvataan, ja sisällyttää multivalent-5 tiin rokotteeseen. Ammattimiehille on myös selvää, että sisällyttämällä mukaan Pn6B-Ps, ristireagoivat vasta-aineet voivat tarjota suojan Pn6A:ta vastaan. Tämä pitää paikkansa myös monien muiden pneumokokkiaiatyyppien suhteen.

10 Multivalenttisia rokotteita ovat ne, jotka sisältä vät eri Pn-Ps-PRO -konjugaattien seoksia, joista kukin on valmistettu erikseen kunkin Pn-Ps-alatyypin kanssa. Lisäksi multivalentteja rokotteita ovat ne, joissa useat erilaiset Pn-Ps-alatyypit kaikki konjugoidaan tiettyyn 15 PRO:iin samaan aikaan tai peräkkäin.

1. Uusien polysakkaridivälituotteiden karakterisointi:

Osittain hydrolysoitujen, puhdistettujen pneumo-kokkikapselipolysakkaridivälituotteiden fysikaaliset ja 20 kemialliset ominaisuudet riipuvat siitä pneumokokkiala- tyypistä, josta se oli peräisin, ja käsittelyistä, jotka ne käyvät läpi tässä paljastetun menetelmän mukaisesti. Yleensä Pn-Ps-välituotteilla on 2 - 10 kertaa pienempi molekyylikoko ja polydispergoitumisaste verrattuna epä-. 25 puhtaaseen, bakteeriviljelmästä peräisin olevaan polysak karidiin. Pienentynyt koko antaa käsitellä paremmin polysakkaridia konjugaation aikana ja antaa poistaa konjugaation jälkeisen vapaan Ps-Pn:n, antaa korkeamman Pn-Ps:n puhtauden/homogeenisuuden, alemman Pn-Ps:n molekyylikoon 30 polydispergoitumisasteen ja olennaisesti muuttumattoman antigeenisuuden. Nämä uudet Pn-Ps-ominaisuudet antavat « merkittävän panoksen hyvin määritellyn, hyvin tyyppispe-sifisen, antigeenisen Pn-Ps-PRO -tuotteen toistettavalle muodostamiselle.

9 107370 i. Pn-Ps:n molekyylipaino ja polydispergoitumisaste:

Mittaamalla molekyylipainon painotettu keskiarvo Μ„ diffuusio-, sedimentaatio- tai kromatografisin keinoin ja 5 molekyylipainon aritmeettinen keskiarvo M„ sellaisen kolli-gatiivisen ominaisuuden perusteella kuten viskositeetti, jäätymispisteen alenema tai kiehumispisteen kohoama, Pn-Ps-valmisteen polydispergoitumisaste saadaan suhteena Mjj/Mjj. Mitä lähemmäksi tämä luku tulee ykköstä, sitä homo-10 geenisempi polysakkaridivalmiste on. Monien Pn-Ps-valmis-teiden polydispergoitumisaste annetaan tässä ja paljastetaan myös edullinen menetelmä, jolla saavutetaan tämä tehostunut homogeenisuusaste.

J akaantumi skerroin, 15 Kd = Ve-Vo Vo= pylvään huokostilavuus.

Vi-Vo Vi = kokonaisläpäisytilavuus.

Ve = näytteen eluutiotilavuus.

Kd = näytteen jakaantumiskerroin kullekin epäpuhtaalle ja osittain hydrolysoidulle Pn-Ps-20 valmisteelle mitataan sinänsä tunnetulla tavalla näytteestä polysakkaridia kokoeksluusiokromatografiällä (SEC) tai korkean suorituskyvyn kokoeksluusiokromatografiällä (HPSEC). Näin saatu Kd on polysakkaridivalmisteen keskimääräisen hydrodynaamisen tilavuuden mitta. Koska Pn-Ps:n 25 molekyylikoko pienenee paljastetun menetelmän mukaisen fysikaalisen rikkoutumisen tai lämpö- tai ultraäänihydro-lyysin johdosta, Pn-Ps:n eluutiotilavuus, Ve, kasvaa ja niin myös KD.

Edullinen pylvään matriisi tähän tarkoitukseen on 30 SEPHAROSE CL2B -geeli (Pharmacia nro 17-0120-01). Pylvään huokostilavuus (VO) määritetään Blue Dextran 2000:11a (Pharmacia nro 17-0360-01) ja kokonaisuusläpäisytilavuus (Vi) natriumkloridisuolapiikistä. Erään menetelmän mukaisesti Pn-Ps-näyte valmistetaan tislattuun veteen pitoisuu-35 dessa 2,5 mg/ml ja käytetään 1 ml:n injektiotilavuutta.

l0 107370

Suhteen V0/Vi pitäisi olla välillä 0,32 - 0,37. Dextran T500:n (Pharmacia nro 17-0320-01) kd pitäisi olla välillä 0,37 - 0,49. Edullinen HPSEC-järjestelmä sisältää 7,5 x 600 mm: n TSK G6000 PW-pylvään, joka on lämmitetty 5 50 °C:seen.

Hyvin edullisessa menetelmässä SEC tai HPSEC on yhdistetty differentiaalirefraktometriin, joka seuraa analysoitavan aineen suhteellista konsentraatiota eluutioti-lavuuden funktiona, ja differentiaaliviskosimetriin, joka 10 seuraa analysoitavan aineen spesifistä viskositeettia eluutiotilavuuden funktiona. Monodispergoitujen polyety-leenioksidistandardien sarjan analyysistä muodostetaan yleispätevä kalibraatiokäyrä [log (rajaviskositeetti kertaa molekyylipaino) retentiotilavuuden funktiona]. Kon-15 sentraatiota ja spesifisiä viskositeettiprofiileja voidaan käyttää laskemaan näytteelle profiili molekyylipainosta eluutiotilavuuden funktiona, jota käytetään vuorostaan laskemaan arvot Mn:lle ja M„:lle, joista lasketaan polydis-pergoitumisasteindeksi (Μ„/Μη) [Yau, W.W. ja Rementer, 20 S.W., J. Liq. Chromatog., 13, 627-675 (1990); Nagy, J,

Liq. Chromatog♦, 13, 677-691 (1990); Benoit, ym. J. Ch. Phys. Tome., 63, 1507-1514 (1966)]. Tässä keksinnössä ra-javiskositetti mitattiin 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,2.

25 Kun Pn-Ps-valmisteen keskimolekyylipaino on määri tetty, toistuvien yksiköiden keskimääräinen luku molekyyliä kohti määritetään helposti jakamalla polymeerin molekyylipaino toistuvan yksikön molekyylipainolla (katso taulukko II).

30 ii. Pn-Ps-tyyppispesifisen antigeenisuuden säilymi nen:

On tärkeää, että kullekin epäpuhtaalle Pn-Ps:lle, joka joutuu fysikaalisen rikkomisen tai kemiallisen, lämpö-, ultraääni- tai entsymaattisen hydrolyysin alaiseksi, 35 määritetään päätepiste jossa antigeeninen eheys alkaa ha- xi 107370 jota. Tämä päätepiste määritetään mukavasti korreloimalla viskositeetti millä tahansa monista sinänsä tunnetuista immunologisista testeistä. Edullisessa menetelmässä näyte polysakkaridiliuosta mitataan Ouchterlonyn kaksoisimmuno-5 diffuusiotestillä käyttäen pneumokokin alatyypille spesifistä vasta-ainetta. Sellaisen valkoisen presipitiinijuovan ilmaantuminen agariin, joka liittyy viereiseen kaivoon sijoitetun epäpuhtaan Pn-Ps-näytteen presipitiinijuovaan diffuusioajan jälkeen, tarjoaa reaktanttien kvalitatiivi-10 sen identiteetin, ja todisteen siitä, että polysakkaridin antigeeninen eheys säilyy koskemattomana. Kvantitatiivi-sempaan immunologiseen määritykseen päästään nefelometri-sellä nopeusanalyysillä tai RIA:lla.

Nopeusnefelometria mittaa muutosta tai muutos-15 nopeutta sen valon intensiteetissä, joka siroaa antigeeni-vasta-aine-kompleksien muodostumisen aikana. Reaktio suoritetaan reaktiokammiossa, jonka läpi viedään valonsäde. Tässä tapauksessa kompleksit muodostetaan immunopresipi-tiinireaktiolla, joka tapahtuu liuoksessa kun spesifinen 20 vasta-aine (Ab) reagoi spesifisen antigeeninsa (Ag), ts. Pn-Ps:n kanssa. Koska Ag-Ab-kompleksin muodostuminen riippuu Ag- ja Ab-molekyylien läsnäolosta optimaalisissa suhteissa, kompleksin muodostumisaste vakiomäärälle Ab: ta kasvaa Ag:n määrän myötä maksimitasoon saakka; suuremmat 25 määrät Ag:ta johtavat siihen, että muodostuu vähemmän kompleksia. Niinpä kun pidetään yllä vakiotaso Ab:ta ja mitataan valon siroamista Ag-konsentraatioiden lisääntyessä, saadaan aikaan standardikäyrä. On mahdollista laskea Ag-konsentraatio Ps:n (tai derivatisoidun Ps:n) valmis-30 teelle, kun näytteet saatetaan reagoimaan niille spesifis-·. ten Ab:iden kanssa samoissa oloissa, joita käytettiin standardikäyrää kehitettäessä.

Vertaamalla konsentraatiota, joka on laskettu im-munologisesti nopeusnefelometrialla, kemiallisesti tai 35 fysikaalisesti (kolorimetrialla, taitekertoimesta, tai 12 107370 monosakkaridien totaalihydrolyysillä ja kvantitaatiolla -katso alla) saatuun konsentraatioon saadaan antigeeni-suusindeksi Ps-näytteille. Polysakkaridien kuivapainoana-lyysi on sovelias vain jos jauhevalmisteen haihtuva osuus 5 tiedetään. Polysakkaridit ovat pahamaineisen hygroskooppi sia ja voivat sisältää haihtuvia aineita minkä tahansa määrän välillä 5 - 30 %. Sinänsä kuivapainomittaukset itsessään eivät ole erityisen luotettavia. Eräs polysakkari-dikonsentraation määritysmenetelmä, jota käytetään koh-10 tuullisella tarkkuudella määrittämään polysakkaridikon- sentraatio, on kolorimetrinen määritys, jossa määritys kalibroidaan tutkittavan polysakkaridin standardiliuoksel-la. Esimerkiksi Pn6B-Ps, Pnl8C-Ps, Pnl9F-Ps ja Pn23F-Ps voidaan kaikki kvantitoida Dischen ja Shettlesin metyyli-15 pentoosimäärityksellä [J. Biol. Chem., 175, 595-603 (1948)]. Pn4-Ps, Pn9V-Ps, Pnl4-Ps ja Pnl9F-Ps voidaan kvantitoida heksosamiinipitoisuuden perusteella ja Pn9v voidaan myös kvantitoida uronihappopitoisuuden perusteella. Fenoli-rikkihappomääritys [Dubois ym. Anal♦ Chem., 28, 20 350-356 (1956)] on hyödyllinen kvantitoitaessa kaikkia näitä Pn-Ps-valmisteita osana menetelmän aikaista testausta konjugaatin valmistuksen aikana. Toinen käytetty menetelmä on käyttää taitekerroinsignaalia analysoitavan aineen massan mittana, myöskin kalibroituna tutkittavan po-25 lysakkaridin standardiliuoksella. Vaikkakin kolorimetristä määritystä käytetäänkin seuraamaan näytteiden polysakkaridipa toisuutta derivatisointi- ja konjugaatiomenetelmän aikana, jäljempää metodia käytetään silloin, kun karakterisoidaan fysikaalisesti polysakkaridivalmiste yleispä-30 tevällä HPSEC-kalibraatioanalyysillä, ja antigeenisuusin- '. deksin laskemista varten. Epäpuhtaalle lähtömateriaali-

Pn-Ps:lle annetaan antigeenisuusindeksiarvoksi 1,0. Suhteellinen antigeenisuusindeksi lasketaan koenäytteille, ja arvoa 0,4 - 1,1 pidetään tyydyttävänä. On mahdollista saa-35 da suurempi antigeenisuusindeksi kuin 1,0 jos polysakka- 13 107370 ridi puhdistuu merkittävästi hydrolyysin ja fraktiointi-vaiheen aikana. On myös teoreettisesti mahdollista, että koon pieneneminen yksin voisi nostaa valmisteen antigeeni-suusindeksiä lisäämällä polysakkaridimolekyylien taipui-5 suutta ja täten vähentää eteeristä häiriötä antigeenisten epitooppien ympärillä. Nämä määritykset suoritetaan menetelmän aikaisena tarkistuksena hydrolysoiduille, fraktioiduille ja derivatisoiduille Ps-näytteille. Näytteet, joiden suhteelliset antigeenisuudet ovat < 0,4 hylätään, ts. 10 niitä ei konjugoida. On saatavilla Pn-Ps-vasta-ainevalmis-teita, jotka ovat hyödyllisiä karakterisoitaessa pneumo-kokkipolysakkarideja. Pn-Ps-vasta-ainelähteisiin kuuluvat Health Research, Inc., Albany, NY., ja Staten Serum Institute. Vaihtoehtoisesti tähän tarkoitukseen voidaan val-15 mistaa tyyppispesifisiä Pn-Ps-vasta-aineita sinänsä tunnetulla tavalla käyttäen kaupallisesti saatavissa olevaa epäpuhdasta Pn-Ps:ia immunogeenina [Baker ym. Immunology 20, 469 (1971); Brooke M.S., J. Immunol., 95, 358 (1966); Kearney, R. ja Halladay, W.J., Aust. J. Exp. Biol. Med. 20 Sei., 48, 227 (1970); Schneerson, R. ym., Prog. Allergy, 33, 144 (1983); Robbins, J. B., Infect. Immun., 26, 1116 (1979)].

Lisäosoitus säilyneestä antigeenisestä eheydestä on Pn-Ps-valmisteen oikean kemiallisen koostumuksen säilymi-.. 25 nen. Esimerkiksi Pn6B-Ps:llä on toistuva yksikkö [a-Gal- (1-3)-a-Glu( 1-3)-a-L-Rha/' (1-4)-D-Ribitoli-5-P04(2)] niin että hiilihydraattikomponenttien ribitoli:ramnoosi:galak-toosi;glukoosi moolisuhde on noin 1:1:1:1. Tämä suhde voidaan määrittää esimerkiksi hydrolysoimalla polysakkaridi 30 36 % fluorivetyhapolla noin 2 tuntia 45 - 65 °C:ssa, jonka jälkeen seuraa 2 M trifluorietikkahappo 10 - 20 tuntia » · 100 °C:ssa ja korkean suorituskyvyn anioninvaihtokromato-grafia pulssiamperometrisella detektiolla. Neljä piikkiä, jotka edustavat arviolta yhtäsuuria moolimääriä hiilihyd-35 raattikomponentteja, on täten säilyneen eheyden merkki.

14 107370

Kaikilla tämän keksinnön mukaisilla uusilla Pn-Ps-yhdis-teillä olennaisesti teoreettiset hiilihydraattikomponent-tien suhteet säilyvät noin 20 % rajoissa. Eroavuudet teoreettisista arvoista johtuvat enimmäkseen menetelmän tason 5 rajoituksista. Täten totaalihydrolyysissä:

Pn23F-Ps:lla on suhde glyseroli:ramnoosi:galaktoosi:glukoosi noin 1:2:1:1;

Pnl4F-Ps:lla on suhde N-asetyyliglukosamiini:galaktoosi: glukoosi noin 1:2:1; 10 Pnl9F-Ps:lla on suhde ramnoosi:N-asetyylimannosamii- ni:glukoosi noin 1:1:1;

Pnl8C-Ps:lla on suhde glukoosi:galaktoosi:ramnoosiglyseroli :asetaatti noin 3:1:1:1:1;

Pn9V-Ps:lla on suhde glukoosi:galaktoosi:N-asetyyliman-15 nosamiini:glukuronihappo:galakturonihappo:asetaatti noin 2:1:1:1:1:1:1,7; ja

Pn4-Ps:lla on suhde N-asetyylimannosamiini:N-asetyylifu-kosamiini:galaktosamiini:galaktoosi:pyruvaatti noin 1:1:1:1:1. Lisäksi Pn4-Ps:n on hiljattain havaittu sisäl-20 tävän lisäkomponentin, joka on tunnistettu HPLC-analyysil- lä, joka näyttää olevan 2-aminopneumosamiini (2-amino-2,6-dideoksitaloosi), kuten Pn5-Ps [Barker ym., Carbohydrate Res., 224-233 (1966)]. Pnl9F-Ps:lla on myös lisäkomponent-ti, mahdollisesti heksosamiini, jota ei ole raportoitu .. 25 kirjallisuudessa, ja jonka tarkka tunnistus on vielä kes ken. Nämä ja muut teoreettiset polysakkaridin toistuvan osan koostumukset raportoidaan seuraavissa viitteissä: J.E.G. van Dam ym., Carbohyd. Res 187, 267 (1988); H.J. Jennings, Adv. Carbohyd. Chem. 41, 155 (1983) ja sen viit-30 teet; J.C. Richards ja M. Perry, Biochem. Cell. Biol. 66, 758 (1988). Hiilihydraattikomponenttien lisäksi useissa mielenkiintoisissa Pn-Ps:issa on fosfaatti-, asetaatti- ja pyruvaattisivuryhmiä, joilla joistakin on immunodominant-tisia piirteitä. Sellaisenaan näitäkin komponentteja voi-35 daan seurata (katso esimerkki 30). Monosakkaridien kvanti- 15 107370 taatio on myös hyödyllinen keino kvantitoida näytteen po-lysakkaridikonsentraatio.

Kohdepolysakkaridien antigeenisuuden lisäelementti on niin sanotun "komformationaalisen epitoopin" säilyminen 5 polysakkarididissa [katso esimerkiksi Wessels, M.R. ja Kasper, D.L., J. Exp. Med., 169, 2121-2131 (1989)]. Tämä antigeenisuuden taso näyttää ekspressoituvan vain sak-karidin suurimolekyylipainoisissa muodoissa, ja tässä kuvatut menetelmät on suunnattu myös polysakkaridin tämän 10 tason immunogeenisuuden säilyttämiseen.

iii. C-polysakkaridin minimaalinen kontaminaatio: Toinen kriittinen parametri on C-polysakkaridikon-taminaatiotaso. Tämä arvo voidaan osoittaa polysakkaridi-valmisteen totaalihappohydrolyysillä, hydrolysaatin kro-15 matografiällä ja koliinin konduktometrisellä detektiolla [Hermans ym., Red. Tr av. Chim. Pays-Bas, 107, 600 (1988)]. Vaihtoehtoisesti koliini voidaan analysoida NMRtllä hydrolysoimattomasta polysakkaridista. NMR-tekniikka käyttää koliinisignaalin ja ramnoosimetyylisignaa-20 Iin suhdetta (ramnoosia sisältäville Pn-Ps:ille; eri signaalia muille Pn-Ps:ille) C-Ps-pitoisuuden laskemiseksi. Kromatografinen menetelmä käyttää koliinisignaalin ja joko johtokykymittauksella määritetyn polysakkaridipitoisuuden tai yhden Pn-Ps-komponentin piikin suhdetta C-Ps-pitoisuu-.. 25 den laskemiseksi. Kummalla menetelmällä tahansa koliinin tunnettujen konsentraatioiden standardit mahdollistavat läsnäolevan koliinin tason suoran laskeminen polysakkari-divalmisteessa käyttäen C-Ps:n teoreettista toistuvaa rakennetta (Herman ym. [koko viite edellä], C-Ps:n konsent-30 raatio polysakkaridivalmisteessa määritetään. Pn-Ps-näyt- teiden polysakkaridikonsentraatiot mitataan sinänsä tunne- • * tulla tavalla. Esimerkiksi polysakkaridin totaalikonsent-raatio voidaan määrittää polysakkaridin totaalihydrolyy-sillä ja mittaamalla spesifisen monosakkaridin konsentraa-35 tio. Vertaamalla C-Ps-konsentraatiota polysakkaridin to- ie 107370 taalikonsentraatioon, C-polysakkaridikontaminaatioaste (w/w) määritetään. C-polysakkariditasoja, jotka ovat alle 3 % (w/w) totaalipolysakkaridista, pidetään hyväksyttävinä, mutta vielä edullisempia ovat tasot alle 1 %.

5 Kahden Pn6B-Ps-erän ja kahden Pn23F-Ps-erän kemial liset ja fysikaaliset ominaisuudet on esitetty yhteenvetona taulukossa I alla. Nämä tulokset osoittavat tässä kuvatun uuden menetelmän tuloksena olevien eräkohtaisten parametrien toistettavuuden: 10 Taulukko 1

Hydrolysoitujen ja fraktioitujen Pn-Ps:ien ominaisuuksia

Pn-Ps-valmiste 6B-1 6B-2 23F-1 23F-2

Viskositeetti lopputuotteessa 1,094 1,147 1,350 1,376 15 Kd (HPSEC) 0,62 0,62 0,49 0,49

Kd (CL-2B) 0,64 0,60 0,41 Ei hav.

Monosakkaridi T T T T

Antigeenisuus:

Ouchterlony T T T T

20 Nephelose T T T T

(Fenoli:rikkihappo) T T T T

T: tyydyttävä

Seuraavassa taulukossa II esitetään useiden epäpuh-' 25 taiden pneumokokkipolysakkaridien ja vastaavien uusien hydrolysoitujen ja fraktioitujen (Hyd+frak) tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden kemiallisia ja fysikaalisia parametreja. Esitetyt luvut ovat arvioita koevirheen ja de-tektiorajojen puitteissa valmistettaville monimutkaisille 30 polysakkaridiyhdisteille.

* ♦« M* 17 107370 — no n n n o o n •H I Jr ,n on λ V on AV oo av av

“ οΛΑ AV AV AV

"J --, OO oo oooo

- " . b . OO OO OOOO

5 I I, _1 '7] oo OO oo oo oo oo oo

Ö ω £ m -!rt n o o ° ° o O

Ή h V ·η 5 c C VO VO H H 00 00 H H 1-(^ H H H H

β AV AV AV Av AV AV AV

>ι I

ή i d «) vf invf m vf tn^f ιη·ί o^t W p 0) -- -- -- -- -- -- -- C -H -H P hh oh oh oh oh oh oh

® T3 O ID J

^ ii ii i« ιι ιι ιι ii Μ Ή M ID j ® OQI-HS oo in o oo oo h· o coo oo τ' pi pj «w* h ^ «. \ «I *k «» s *» «* ^ »» V** ^ «—IrHrHf-liHrHr-IrHr-IrHrlr|(Nrl Ή

Ö C

·£ 2 - ^ o\o >1 o"o A°o A° o A°o A°o A° o A°o

(/) (0 C ' λ] H r—» I I /—. H * I f—> 1 I f—i H q * I

ft ft'H X S X ox O X O* ox ox

I -H +J O +| TJ· 01 VO 01 VO 00 VO ' VO N VO

(£ P „ I +l I +l I +‘ . +* I +l I +1 I

rH (1)/0 O m m m m m m C, ϋΕ'Η Η" Ο " Ο "0 Ό"0 0¾ O-V o " φ <u p ,¾ X 2 h5 H 3 H 2 H° hS H 2 -η h -h (/) n g x g x g x g x g x g xg B siö® ^ Ο σ' ,¾ σ' o ^ o ^>o ^ o ^ o

-H

O 2 o\° A° A° A5 oV> o\° A» "rl | i) — m m « e n n m 4-» ' Tj oo oo oo oo oo oo oo

-¾ g rn rl (N H OH OH OH OH OH OH

rt & XXXXXXX

M -ho o +i n +1 t-. +i r- -f i h +i vo +i vo +i co + XpH P o' o' o1 o1 o' o1 o' rH (0 (0 Hm Hm Hm Hm Hm Hm Hm

H M ft-H X O X O x O X O X O X O X O

UI (1) »X OH H* H HH HH Γ--Η OH OH

-r> H C li) -X -X -X -X -X -X -X

H O O 0) H· H HO HO H H· CO O HO O vt

jj S C ,X

'o AP A» A» A° o\° A° o\o (/) >

V, o OO OO OO OVO OO OO OO

,_j X -H H - H - H - H - H — H - H —

Q /0 (fl P O O O H O O O

t. -H -HP +1 +1 +1 +1 -H +1 +1

d ID >111 I I I I I I I

.X a) h· r- o o o n n

rj 3 -njJ OO VO O OO VO VO OO OO HO

♦· ^ d <0 -H ..............

£ 01 CP CO H* H (MH OH HO OH OH ^ H

0) -H

-H 5 (/) d oooooooooooooo

3 -H OOOOOOOOOOOOOH

rjg- - - ·»- -- -- - - - - o x; oooooooooooooo «d _ -m <ö G +i +i +i +i +i +i +i +i +i +1 +i +i +i +i -H d C tn cu oo oo on oo oo h· n vo

ΗΦ-Η-Η OVO H· VO O VO O VO O VO H· VD n O

H <0 H d -- -- -- -- -- -- - -

-H H K OO OO OO OO OO OO OO

O n) nl • * V +J -H ···· «··· ·«·· id G ·· «· ........ w · w · w · ppo) ···· to· ω· ιο· mi! πΐϋ ιβϋ H ft Ai j). (¢,¾ mx mx Old Did Όιί

3 :ed idi! ·0κ) ¢(0 ΌιιΙ ÄIm ÄM

ndftid -h -ö/oiiP.dP.CP d <h d <p d *η Η W ·Π ft £ J-l d <Η d <4-1 d <4-4 ft+ ft + ft +

ft d P ft+ ft+ 0. + :(Ö <0 :ΐβ Ό :<d TJ

I HH ft + :/0¾ (0¾ :10¾ ft >1 ft>i ft >i w>i -.(0¾ ft>, ft>, ft>. (1)¾ 0)¾ mx: ftp ft >i <D jd <d jd <u jd ιι ιι ι i I/O 0) jC II II II UOftftftft C H II pQpq >> COCO oo oo

Ph fd tJ* ^ VO VO 0\ rH H H <—I f—I iH N M

is 107570 2. Uuden Pn-Ps-PRO-konjugaatin karakterisointi: i. Pn-Ps:n identiteetin ja määrän analyysi:

On hyvin hyödyllistä tarkistaa Pn-Ps:n määrä ja kemiallinen eheys lopullisessa konjugaatissa riippumat-5 tomalla tekniikalla, jotta saadaan varmistettua antigeeni-suus (eheys) ja laskettua suhde Pn-Ps/PRO. Yksi menetelmä sisältää totaalihydrolyysin, joka käyttää 2 M TFA:ta 100 °C:ssa 5-16 tunnin ajan, riippuen kullekin Pn-Ps:lle optimaalisesta hydrolyysiajasta. Yhtä suuret määrät Pn-Ps-10 PRO -konjugaattia ja PRO-hydrolysaattia (perustuen Lowryn proteiiniin) analysoidaan korkean suorituskyvyn anionin-vaihtokromatografiässä pulssiamperometrisella detektiolla jolloin saadaan monosakkaridiprofiilit. PRO:n profiili "vähennetään" Pn-Ps-PRO -konjugaatin profiilista käyttäen 15 asianmukaista tietokoneohjelmaa kuten Nelson-ohjelmaa, jotta saataisiin erotettua PRO:n tuomat lipopolysakkaridit esimerkiksi OMPC:ssä läsnäolevasta lipopolysakkaridista (LPS). Pn-Ps:n määrä konjugaatissa lasketaan sitten vertaamalla tunnetun määrän derivatisoitua Pn-Ps-hydrolysaat-20 tia ja korjattujen Pn-Ps-PRO -konjugaattien profiilia. Suhde Pn-Ps/PRO mitataan myös tällä tavalla.

ii. Konjugaatiota ja "cap"-rakenteen liittämistä osoittavien uusien aminohappojen analyysi

Sen jälkeen kun on konjugoitu Pn-Ps PRO:iin, kon-25 jugaattinäytteet hydrolysoidaan 6 N HCl:ssa ja pannaan aminohappoanalyysiin. Tämä menetelmä havaitsee ainutlaatuisten aminohappojen kuten S-karboksimetyylihomokysteii-nin (S-CMHC) ja S-karboksimetyylikysteamiinin (S-CMCA) läsnäolon ja määrän. Edellinen aminohappo syntyy osana 30 kemiallista liitosta kemiallisessa reaktiossa derivatisoi-dun Pn-Ps:n ja PRO:n välillä kuten edempänä menetelmäosas-sa kuvataan, ja sitä pidetään varmana todisteena deriva-tisoidun Pn-Ps:n ja PRO:n välisestä kovalenttisesta sidoksesta. Sellaisen kovalenttisen sidoksen muodostuminen on 35 olennaista konjugaattirokotteen immunogeenisuudelle T-so- 19 107370 lujen suhteen. Välittömästi sen jälkeen, kun konjugaatio-reaktio on mennyt loppuun, reagoimattomiin bromiasetami-diosiin liitetään "cap"-rakenne N-asetyylikysteamiinilla. Tämän sidoksen hydrolyysi johtaa S-karboksimetyylikyste-5 amiinin (S-CMCA) vapautumiseen, joka havaitaan myös amino-happoanalyysissä. Tämän aminohapon havaitseminen vahvistaa, että "cap"-rakenne on saatu onnistuneesti aikaan reaktiivisiin bromiasetomidiryhmiin, täten poistaen ne minkä tahansa epäsuotavan kemiallisen reaktion saatavilta. 10 Hyväksyttävät kovalenttisuuden ja "cap"-rakenteen muodostumisen tasot ovat noin välillä 1 - 15 % S-CMHC/Lys:lle ja noin 0 - 5 % S-CMCA/Lys:lie.

iii. Aluminiumhydroksidiin adsorboidun rokotteen analyysi 15 Edullisessa suoritusmuodossa Pn-Ps-PRO -konjugaatti adsorboidaan aluminiumhydroksidiin (aluminiumhydroksidi-geeli, A1(0H)3) (katso kohta C alla), mikä johtaa immuunivasteen tehostumiseen rokotetta kohtaan. Muihin mahdollisiin rokoteformulaatioihin kuuluvat formulaatio fysi-20 ologisesti soveliaissa laimennusaineissa ja muiden adju-vanttien, immunomodulaattoreiden ja inerttien apuaineiden käyttö kuin aluminiumhydroksidigeeli. Tämän aluminiumhydroksidiin adsorboidun materiaalin analyysi saadaan käytettäväksi seuraavasti.

.. 25 Aluminiumhydroksidiin adsorboidun Pn-Ps-PRO:n koos tumus ja stabiilisuus voidaan analysoida sen jälkeen kun konjugaatti on desorboitu alunasta. Tämä saadaan aikaan dialysoimalla aluminiumhydroksidiin adsorboitu Pn-Ps-PRO 3 % natriumsitraattiliuosta vastaan 16 tuntia huoneenläm-30 mössä. Tuloksena oleva liukoinen aluminiumsitraattisuola kulkee ulos dialyysimembraanista ja jättää jäljelle Pn-Ps-PRO: n. Tämä menetelmä on tärkeä, jotta saadaan vahvistettua, että Pn-Ps-PRO:ta on oikea määrä aluminiumhydroksidiin adsorboidussa formulaatiossa. Kuitenkin jotkin for-35 mulaatiot kuten Pn6B-Ps-0MPC ja Pn23F-Ps-0MPC sisältävät 20 107370 100, 50, 20 ja 10 pg Pn-Ps/ml (katso kohta C alla), selvästi kemiallisten detektiomenetelmien alle jäävät pitoisuudet. Näin ollen, jotta saadaan suoritettua hiilihydraattien koostumusanalyysit, adsorboidut Pn-Ps-OMPC-rokot-5 teet ajetaan ensin sakaksi jotta saadaan poistettua vesipitoinen neste, ja sakka resuspendoidaan yhteen viidesosaan alkuperäisestä tilavudesta ennen sitraatilla liuotusta. Dialyysin jälkeen liuotettu Pn-Ps-OMPC on läsnä pitoisuuksina 500, 250, 100 ja 50 pg Pn-Ps/ml. Nämä pi-10 toisuudet ovat sitten soveltuvia sekä Pn-Ps- että proteiinianalyysiin jolloin saadaan vahvistettua annostasot.

Sitraatti-desorboiduista näytteistä analysoidaan myös vapaan Pn-Ps:n mahdollinen läsnäolo, seikka mikä on tärkeä immunogeenisuudelle ja tuotannon yhdenmukaisuudel-15 le. Tämä analyysi suoritetaan kromatografiällä SEPHAROSE CL-2B tai SEPHACRYL S1000SF -koonmäärityspylväässä, jossa Pn-Ps-OMPC voidaan erottaa Pn-Pslista. Vapaan Pn-Ps:n läsnäolo ja määrä mitataan antigeenisestä nopeusnefelometri-alla. Vapaan Pn-Ps:n kontaminaatiotaso Pn-Ps-OMPC:ssa on 20 vähemmän kuin 15 % läsnäolevan Pn-Ps:n kokonaismäärästä.

iv. Pyrogeenitesti: merkittävän pyrogeenisuuden poissaolo: Tämän keksinnön mukaisesta konjugaattituoteesta testataan, ettei sillä ole haitallisia ruumiinlämpöä ko-.. 25 hottavia vaikutuksia. Konjugaattituotteet on tuotettu täs sä paljastetun menetelmän mukaisesti ja niiden pyrogeenisuuden on havaittu olevan hyväksyttävillä tasoilla. Menetelmä (laskimonsisäinen)

Pn-Ps-konjugaattirokote testataan kuten on kuvattu 30 21 CFR:ssä, osa 610.13(b) 1) Menetelmä (lihaksensisäinen)

Toinen pyrogeenisuuden mitta on kanin lihaksensisäinen testi. Tämä testi jäljittelee tarkemmin tuotteen kliinistä käyttöä ja sen arvellaan heijastavan tarkemmin 35 tuotteen näennäistä endotoksiinirasitusta.

2l 107370

Kukin kani saa 1,0 ml rokotetta lihaksensisäisenä injektiona. Testi suoritetaan ainakin kolmea kania käyttäen. Ruumiinlämpöä tarkkaillaan viiden tunnin ajan injektion jälkeen. Muut testin menettelytavat ovat 21 CFRtssä 5 osassa 610.13(b) kuvatun mukaisia. (Testiannos pohjautuu polysakkaridikonsentraatioon.) v. Kovalenttisen sidoksen luonne:

Pn-Ps-PRO -konjugaatit, kuten Pn-Ps-OMPC ja Pn-Ps-MIEP, voidaan kytkeä yhteen sellaisten bigeneeristen väli-10 ryhmien välityksellä, jotka sisältävät tioeetteriryhmän ja primaarisen amiinin, jotka muodostavat hydrolyysiherkkiä kovalenttisia sidoksia polysakkaridin ja PRO:n, kuten OMPC:n tai MIEP:n, välillä. Tämän keksinnön mukaisia edullisia konjugaatteja ovat ne, jotka voidaan kuvata kaavoil-15 la Pn-Ps-A-E-S-B-PRO tai Pn-Ps-A'-S-E'-B»-PRO. A-E-S-B ja A'-S-E'-B' ovat rakenteeltaan bigeneerisiä väliryhmiä, jotka sisältävät hydrolyysille stabiileja, kovalenttisia tioeetterisidoksia ja jotka muodostavat kovalenttisia sidoksia (kuten hydrolyysiherkkiä esteri- tai amidisidok-20 siä) makromolekyylien PRO ja Pn-Ps kanssa. Väliryhmässä A-E-S-B S on rikki? E on sellaisen tiofiilisen ryhmän transformaatiotuote, joka on saatettu reagoimaan tioliryh-män kanssa ja jota esittää kaava 25 o o K, 9? —'=Cch2)pnJ^ -cch- ,

O

30 jossa R on H tai CH3 ja p on 1 - 3; A on 35 -IJ(CH2)mY(CH2)n-NH-, 22 107370 jossa W on O tai NH, m on O - 4, n on O - 3 ja Y on CH2, O, S, NR' tai CHC02H, jossa R' on H tai Ct- tai C2-alkyyli, niin että jos Y on CH2, silloin m ja n eivät voi olla yhtä aikaa nolla, ja jos Y on O tai S, silloin m on suurempi 5 kuin 1 ja n on suurempi kuin 1; B on -(CH2)pCH(CH2)qD-,

Z

O

f« 10 jossa q on 0 - 2, Z on NH2, CHCOR, COOH tai H, jossa R' ja

O H O O

'1 II M n p ovat yllä on määritelty, ja D on C, NR' tai N-C(CH2)2C.

W

15 Väliryhmässä A'-S-E’-B' S on rikki; A' on -CNH(CH2)aR"-, HOY' llll jossa a on 1 - 4 ja R" on CH2 tai NCCH(CH2)p, jossa Y' on NH2 tai NHCOR' ja W, p ja R' ovat yllä määritellyn mukaisia 20 ja E' on sellaisen tiofiilisen ryhmän transformaatiotuote,

joka on saatettu reagoimaan tioliryhmän kanssa ja jota R

esittää jossa R on yllä määritellyn mukainen ja B'

25 O

on -(1-, tai E' on

O

Λ 30 I N—

O

O

li .. 35 ja B' on -(CH2)pC-, jossa p on 1 - 3. Lisäksi bigeneeristen väliryhmien A-E-S-B ja A'-S-E'-B' komponentit E-S-B ja A'-S-E' ovat määritettävissä ja kvantitoitavissa, ja tämä identifiointi heijastaa sen konjugaattisidoksen kovalent-tisuutta, joka kytkee kovalenttisesti modifioidusta poly 23 107370 sakkaridista lähtöisin olevan tioeetteririkin puolen funk-tionalisoidusta proteiinista lähtöisin olevan väliryhmän puolen kanssa.

Tämän keksinnön mukaiset konjugaatit Pn-Ps-A-E-S-5 B-PRO voivat sisältää väliryhmiä, joiden komponentteihin kuuluu muiden muassa seuraavien johdannaisia: hiilidioksidi, 1,4-butaanidiamiini ja S-karboksimetyyli-N-asetyyliho-mokysteiini; hiilidioksidi, 1,5-pentaanidiamiini ja S-kar-boksimetyyli-N-asetyylihomokysteiini; hiilidioksidi, 10 3-oksa-l,5-pentaanidiamiini ja S-karboksimetyyli-N-asetyy- lihomokysteiini; hiilidioksidi, 1,4-butaanidiamiini ja S-karboksimetyyli-N-asetyylikysteiini; hiilidioksidi, 1,3-propaanidiamiini ja S-karboksimetyyli-N-bentsoyyli-homokysteiini; hiilidioksidi, 3-atsa-l,5-pentaanidiamiini 15 ja S-karboksimetyyli-N-asetyylikysteiini; hiilidioksidi, 1,2-etaanidiamiini, glysiini ja S-(sukkin-2-yyli)-N-ase-tyylihomokysteiini. Tämän keksinnön mukaiset konjugaatit Pn-Ps-A’-S-E1-B'-PRO voivat sisältää väliryhmiä, joiden komponentteihin kuuluu muiden muassa seuraavien johdannai-20 siä: hiilidioksidi ja S-karboksimetyylikysteamiini; hiili dioksidi ja S-(a-karboksietyyli)kysteamiini; hiilidioksidi ja S-karboksimetyylihomokysteamiini; hiilidioksidi, S-(sukkin-2-yyli)kysteamiini ja glysiini; hiilidioksidi ja S-karboksimetyylikysteiini.

25 B. Menetelmä, jolla voidaan tehdä uusia Pn-Ps-väli- tuotteita ja Pn-Ps-PRO -konjugaatteja: Tätä menetelmää paljastettaessa useita vaiheita kuvataan erikseen: I. Polysakkaridin valmistus: 30 a) Epäpuhtaan pneumokokkipolysakkaridin, Pn-Ps:n, eristys; • · b) Epäpuhtaan Pn-Ps:n osittainen hydrolysointi tai mekaaninen rikkominen; c) Osittain hydrolysoidun Pn-Ps:n fraktiointi koon 35 ja puhtausasteen mukaan; 24 107370 II. Konjugaatio: a) Fraktioidun Pn-Ps:n funktionalisointi, jolloin muodostuu elektrofiilinen tai nukleofiilinen reaktantti Pn-Ps*, joka edullisesti sisältää noin 21 reaktiivista 5 bromiasetyyliryhmää 100 toistuvaa Pn-Ps-oligosakkaridi-yksikköä kohden.

b) Immunogeenisen proteiinin (PRO) eristys, edullisesti Neisseria meningitidis B:n OMPC tai sen alayksikkö; c) PRO:n funktionalisointi, jolloin saadaan aikaan 10 nukleofiilinen tai elektrofiilinen reaktantti PRO*, edullisesti OMPC tai sen alayksikkö, kuten MIEP, jossa on reaktiivisia sulfhydryyliosia; d) Vaiheen a polysakkaridin (Pn-Ps*) konjugaatio vaiheen c proteiiniin (PRO*); 15 e) "Cap"-rakenteen liittäminen Pn-Ps-PRO -konju- gaattiin jäljelle jääneiden funktionaalisten ryhmien poistamiseksi; f) Konjugaattituotteen eristys.

I. a) Epäpuhtaan pneumokokkipolysakkaridin, Pn- 20 Ps:n, eristys:

Pneumokokkikapselipolysakkarideissa on kemiallisia ja antigeenisiä eroja, mikä johtuu kunkin kapselipolysakkaridi serotyypin toistuvan oligosakkaridiyksikön koostumuksesta ja sidoksista. Polysakkaridien eristyksen täytyy 25 edetä hieman eri reittejä kunkin polysakkaridin fysikaalisista ominaisuuksista riippuen. Yleensä kuitenkin bakteereja viljellään ja Pn-Ps otetaan talteen sinänsä tunnetulla tavalla [Esimerkki 3, ja Williams, C.A. ja Chase, M.W., Methods in Immunology and Immunochemistry, Voi. I, 30 Academic Press (1967)], kun taas itse patogeenit ovat saa-tavilla ATCC:ltä. Lyhyesti, sen jälkeen kun bakteereja on > · kasvatettu suuressa mittakaavassa soveliaassa elatusai-neessa, jonka alalla tiedetään sopivan pneumokokkien kasvatukseen, bakteereja tappava aine, kuten fenoli tai tolu-35 eeni, lisätään organismien tappamiseksi (esimerkki 3).

25 107370

Sitten suoritetaan kahdessa vaiheessa polysakkaridin alkoholitraktiointi. Ensimmäisessä vaiheessa käytetään matalaa alkoholipitoisuutta soluroskan ja muiden ei-toi-vottujen epäpuhtauksien saostamiseksi, epäpuhtaan Pn-Ps:n 5 pysyessä sillä välin liuoksessa. Kun sen jälkeen lisätään vesiliukoista alkoholia ennalta määriteltyyn konsentraa-tioon asti, saostuu kapselipolysakkaridi samalla kun vielä muita epäpuhtauksia jää supernatanttiliuokseen. Vettä sisältävään väliaineeseen resuspension jälkeen poistetaan 10 kontaminoivat proteiinit ja nukleiinihapot tunnetuilla menetelmillä kuten proteolyyttisellä tai nukleaasidiges-tiolla tai uuttamalla liuottimilla. Epäpuhdas polysakkaridi otetaan talteen alkoholisaostuksella ja kuivataan, jolloin muodostuu epäpuhtaan Pn-Ps:n jauhe (esimerkki 3). 15 I. b) Epäpuhtaan Pn-Ps:n osittainen hydrolyysi tai mekaaninen rikkominen:

Epäpuhdasta polysakkaridia, joka on valmistettu olennaisesti yllä kuvatulla tavalla [katso myös esimerkki 3 alla], on käytetty konjugoimattomassa tilassa formuloi-20 taessa pneumokokkirokotteita, jotka on suunnattu käyttöön aikuisille ja yli kaksivuotiaille lapsille. Seuraavat menetelmän vaiheet tuottavat uuden, osittain hydrolysoidun, puhdistetun Pn-Ps-tuotteen, jolla on ainutlaatuisia ja määriteltyjä kemiallisia ja fysikaalisia ominaisuuksia ^ 25 (ks. taulukko II), jotka ovat hyödyllisiä konjugaattiro kotteiden valmistuksessa. Epäpuhtaan Pn-Ps:n koon pienentäminen vaikuttaa osaltaan seuraavien puhdistusvaiheiden onnistumiseen, jolloin saadaan erittäin puhdas Pn-Ps-tuo-te. Lisäksi kun sitä käytetään konjugaattien valmistuk-30 sessa, konjugaatio on tehokkaampi, kun käytetään tämän keksinnön mukaista uutta Pn-Ps:ää. Tämä johtuu siitä, että • · epäpuhtaiden polysakkaridimateriaalien vesiliuokset ovat hyvin viskooseja, huonoliukoisia, ja niiden konjugaatit ovat pitkälti liukenemattomia ja suodatuskelvottornia. Itse 35 konjugaatiomenetelmä on vaikea suorittaa, mikä johtaa huo- 26 1 0 7 3 7 0 noon konjugaattisaantoon. Lisäksi konjugoimattoman Pn-Ps:n poisto lopullisesta konjugaatista helpottuu, kun Pn-Ps ennen konjugaatiota on kooltaan ja viskositeetiltaan pienempi ja paremmin liukeneva. Tämä on merkittävää sikäli, 5 että vapaan Pn-Ps:n läsnäolo konjugaattivalmisteissa vaikeuttaa annettavan konjugaatti-Pn-Ps:n todellisen annoksen arvioimista, ja koska nimenomaan konjugoidulla Pn-Ps:llä on merkittävää T-soluja stimuloivaa vaikutusta, konjugoimattoman Pn-Ps:n läsnäolo edustaa immunologisesti "rele-10 vantin" Pn-Ps:n vähenemistä.

Yllämainitulla tavalla valmistettu kuiva, epäpuhdas kapselipolysakkaridi voidaan myös puhdistaa esimerkiksi anioninvaihtokromatografialla tai muulla kromatografisella menetelmällä ennen osittaista hydrolyysiä tai sen jälkeen 15 kuten esimerkissä 6 Pnl4-Ps:lle esitetään. Kromatografista adsorptio-desorptiota voidaan käyttää joko positiivisesti tai negatiivisesti. Positiivisessa moodissa Pn-Ps adsorboidaan hartsiin, mikä jättää liuokseen epäpuhtaudet, jotka pestään pois ennen Pn-Ps:n desorptiota. Negatiivisessa 20 moodissa epäpuhtaudet adsorboidaan pois Pn-Ps-liuoksesta ja heitetään pois, mikä jättää Pn-Ps:n puhdistetussa tilassa liuokseen. Vaihtoehtoisesti Pn-Ps voidaan alistaa suoraan osittaiseen lämpöhydrolyysiin, kuten esimerkissä 4 Pn6B-Ps:lle esitetään tai ultraäänihydrolyysiin kuten esi-• 25 merkissä 6 Pnl4-Ps:lle esitetään. Myös muita hydrolyysi- keinoja, kuten kemiallisia, entsymaattisia tai fysikaalisia (ts. korkeapainekammio), tunnetaan.

Osittainen hydrolyysi saadaan aikaan rajoitetulla lämpökäsittelyllä vesipitoisessa väliaineessa, edullisesti 30 50 - 110 °C:ssa noin 1-48 tunnin ajan. Vaihtoehtoisesti ** toistetaan rajoitettua korkeaenergistä, 5 sekunnista 5 mi- • · nuuttiin kestävää ultraäänikäsittelyä, jäähdytysjaksoin, niin monta kertaa kuin on välttämätöntä jotta päästään haluttuun viskositeettiin tai Kd-päätepisteeseen. Ultraää-35 nihydrolyysimenetelmä on edullinen lämpöhydrolyysiin ver- >* 27 107370 rattuna polysakkarideille, joilla on kompleksisia rakenteita (katso alla). Muut alalla tunnetut soveliaat menetelmät, joilla saadaan aikaan polysakkaridien osittainen hydrolyysi, ovat myös sovellettavissa. Esimerkiksi keski-5 määräisen Pn-Ps-ketjun koon pienentämiseksi voidaan myös käyttää rajoitettua kemiallista hydrolyysiä hapolla, endo-lyyttistä entsyymikäsittelyä tai fysikaalista rikkomista sekoittimessa, myllyssä.

Edullisessa suoritusmuodossa Pn-Ps alistetaan fysi-10 kaaliselle rikkoutumiselle viemällä se homogenisoi jän läpi noin 0 °C - 30 °C:n välillä ja paineilla noin 13,8 - 103,5 MPa välillä, jonka on ennalta määritelty tuottavan Pn-Ps-tuotteen, jolla on halutut koko-, polydispergoitumisaste-ja antigeenisuusominaisuudet (katso esimerkki 10).

15 Hydrolyysin tavoitepäätepiste, joka mitataan muka vasti liuoksen viskositeetin tai korkean suorituskyvyn kokoeksluusiokromatografian avulla, määritetään ennalta kullekin polysakkaridille pilottiskaalassa niin, että polysakkaridin antigeenisuutta ei poisteta. Kuten yllä on 20 esitetty, tyydyttävänä pidetään sellaista nimellistä kykyä sitoa pneumokokkityyppispesifistä vasta-ainetta, joka on vähintään 70 % siitä sitoutumisesta, joka nähdään vastaavalla pitoisuudella epäpuhdasta Pn-Ps-lähdemateriaalia. Tämä ei tarkoita sitä, etteikö menetelmällä voitaisi saada 25 aikaan Pn-Ps:ia, jolla on merkittävästi pienempi M„, M„ tai toistuvien yksiköiden lukumäärä molekyyliä kohden (taulukko II), ja että sellaiset Pn-Ps:t, jotka eivät kenties reagoi yllä esitetyn 70 % cutoff-rajan yläpuolella nopeus-nefelometriamäärityksen ollessa kyseessä, voivat olla 30 eläimissä immunogeenisia konjugoituina. Tällä tarkoitetaan, että huolimatta siitä, että ilmeinen kyky sitoa • · tyyppispesifistä Pn-Ps-vasta-ainetta puuttuu, molekyyli-painoltaan pienet Pn-Ps:t konjugoidussa tilassa voivat tulla nisäkkään immuunijärjestelmän tunnistamiksi ja hyvä 35 tyyppispesifinen pneumokokin vastainen vaste voidaan saa- 28 1 0 7 3 7 0 da aikaan. Tässä tapauksessa termi "antigeeninen" pitäisi korvata termillä "immunogeeninen" toimivana hyväksymisen tai hylkäämisen kriteerinä kullekin Pn-Ps-valmisteelle. Käytännössä on kuitenkin mukavinta hyödyntää menetelmän 5 kontrollina pikemminkin in-vitro -antigeenisuusparametria kuin in-vivo immunogeenisuusparametria.

Yleensä sama koonpienennysmenettely soveltuu useimmille polysakkarideille. Kuitenkin siinä missä Pn6B-Ps säilyttää antigeenisuutensa pitkäaikaisessa lämmön avulla 10 tapahtuvassa koon pienentämisessä, Pn23F-Ps voi menettää rakenteellisen eheyden (glyseroli-fosfaatti-sivuketjujen poistuminen), ja se vaatii hellävaraisempaa koon pienentämistä, mikä voidaan saada aikaan ultraääni- tai fysikaalisin rikkomiskeinoin. Fysikaalinen rikkominen, esimerkik-15 si Gaulinin homogenisoijassa, on edullinen menetelmä useista syistä. Ensiksikin menetelmän mittakaavaa voidaan kasvattaa ylöspäin. Toiseksi ultraääni- ja lämpöhydrolyy-simenetelmät vaativat yleensä tämän jälkeen hydrolysoitujen Pn-Ps:ien fraktioinnin, jotta saavutetaan polydisper-20 goitumisaste välillä 1,0 - 1,5. Fysikaalinen rikkomis-menetelmä kuitenkin tuottaa yleensä Pn-Ps-tuotteen, jolla on tälle välille sijoittuva polydispergoitumisaste ilman lisäfraktiointia, vaikkakin fraktiointia voidaan tarvittaessa käyttää, jolloin puhtautta saadaan edelleen parannet-... 25 tua ja CP-kontaminaatiota vähennettyä. Kolmanneksi fysi kaalisella rikkomismenetelmällä voi olla etuna suurempi toistettavuus mille tahansa määrätylle Pn-Ps:lie verrattuna ultraääni- tai lämpöhydrolyysikeinoihin. Neljänneksi fysikaalisella rikkomismenetelmällä näyttää olevan jonkin 30 verran etua sellaisen Pn-Ps-tuotteen tuottamisessa, joka säilyttää enemmän antigeenisuutta määrättyä kokoa silmäl- • · läpitäen, verrattuna samankokoiseen Pn-Ps:iin, joka on tuotettu ultraääni- tai lämpöhydrolyysillä.

Viskositeetti, joka liittyy Pn-Ps:n keskimääräiseen 35 molekyylipainoon, on mukava menetelmän aikainen parametri 29 107370 tarkkailtavaksi, ja sitä voidaan seurata helposti hydro-lyysin aikana koon pienemisasteen rajoittamiseksi ja kontrolloimiseksi. Sellaisia Pn6B-Ps- ja Pn23F-Ps-eriä, joita on kemiallisesti ja fysikaalisesti mahdotonta erottaa toi-5 sistaan, on valmistettu yksinkertaisesti vähentämällä polysakkaridin kokoa viskositeettiin saakka, joka on vakio ja tavoiteloppupiste (katso taulukko I yllä). Tällainen menetelmän aikaisten viskositeettimittausten käyttö soveltuu suurelle joukolle epäpuhtaita polysakkarideja, mikä 10 sallii niiden koon vähentämisen hydrolyysillä lopputulok sena olevien Pn-Ps:ien antigeenisten ominaisuuksien muuttumatta. Kuten yllä on kuvattu, antigeenisuuden säilyminen voidaan todeta helposti esimerkiksi Ouchterlonyn kaksois-diffuusiomäärityksellä, nopeusnefelometrialla tai muilla 15 sinänsä tunnetuilla tavoilla.

Tavoiteloppupisteviskositeetit useiden Pn-Ps-prepa-raattien 1 mg/ml liuoksille 0,9 % natriumkloridissä (suolaliuoksessa) annetaan taulukossa III alla. Nämä arvot ovat samalla tavalla sovellettavissa muista pneumokokki- 20 alatyypeistä peräisin olevaan Pn-Ps:iin:

Taulukko III

Liuoksen viskositeetti epäpuhtaalle ja hydrolysoidulle Pn-Ps:lle: 25 ·· Pn-Ps alatyyppi Epäpuhtaan Pn-Ps:n Tavoiteloppu- viskositeetti kohdan (senttistokea) viskositeetti (senttistokea) 30

Pn4-Ps 1,8 1,5-1,00

Pn6B-Ps 1,4 1,3-1,00

Pn9V-Ps 1,4 1,3-1,00

Pnl4-Ps 1,2 1,1 - 0,95 35 Pnl8C-Ps 2,0 1,5-1,00

Pnl9F-Ps 1,4 1,3-1,00

Pn23F-Ps 1,6 1,5 - 1,00 30 107370

Joidenkin pneumokokkipolysakkaridien tapauksessa on edullista ottaa mukaan lisäpuhdistusvaihe, kuten ionin-vaihtovaihe ennen osittaista hydrolyysiä tai sen jälkeen. Pnl4-Ps:n tapauksessa tämä vaihe saadaan aikaan adsorboi-5 maila anioniset epäpuhtaudet WHATMAN DE52-hartsiin eräkä-sittelynä ennen osittaista ultraäänihydrolyysiä. Polysakkaridi, joka on neutraali käsittelyn heikosti happamassa pH:ssa, saadaan supernatanttifraktiona, joka on valmis hydrolyysiin.

10 Pn6B-Ps-valmisteiden molekyylipainoarvot ovat noin 900 kilodaltonia (kDa) ennen ja noin 300 kDa koon pienentämisen ja fraktioinnin jälkeen. Pn23F-Ps:lle vastaavat arvot ovat noin 1000 kDa tai enemmän ennen, ja noin 400 -500 kDa jälkeen. Täten Pn-Ps:n koon pieneneminen noin 500 15 kilodaltoniin plus miinus noin 300 kilodaltonia on sovelias tavoite menetelmän tälle vaiheelle kullekin Pn-Ps-alatyypille.

Osittain hydrolysoidun materiaalin uudelleen saos-taminen ennalta määrätyillä alkoholikonsentraatioilla mah-20 dollistaa osittain hydrolysoitujen Pn-Ps:ien talteensaami-sen ja jatkopuhdistuksen, kuten on kuvattu alajaksossa c edempänä.

I. c) Osittain hydrolysoitujen Pn-Ps:ien fraktioin- ti koon ja puhtauden mukaan: 25 Pn-Ps-valmisteen polydispergoitumisaste on osoitus ei pelkästään alatyyppispesifisen Pn-Ps:n ketjun pituuden vaihtelusta, se on merkki myös siitä, että ryhmäspesifistä C-polysakkaridia, samoin kuin muita epäpuhtauksia, voi olla jäljellä Pn-Ps-valmisteessa. Kuten yllä on mainittu, 30 jäännös-C-polysakkaridiepäpuhtaus ei ole hyödyllinen, ja se voidaan jopa korreloida haitallisten immuunivasteiden · kanssa.

Keskimääräisen polysakkaridimolekyylikoon kapean alueen (alentuneen polydispergoitumisasteen) valikointi 35 saavutetaan vaivattomasti perustuen differentiaaliseen 31 107370 liukoisuuteen alkoholiin, kuten etanoliin ja edullisesti isopropanoliin (IPA), koon vähentämisen jälkeen. Tämän valikoinnin perusta on se, että määrätylle Pn-Ps-valmis-teelle alkoholiliukoisuus on kääntäen verrannollinen ket-5 jun pituuteen, joka vuorostaan on verrannollinen molekyy-lipainoon. Täten menetelmää on sovellettu menestyksekkäästi siihen, että eristetään kvantitatiivisesti vakiokokoi-sia molekyylipopulaatioita, joilla on merkittävästi lisääntynyt homogeenisuus verrattuna alkuperäiseen kooltaan 10 pienennettyyn Pn-Ps:iin. IPA-fraktiointien menetelmän ai kaisen kontrollin tarjoaa pilottikokeen suorittaminen, joka ennustaa sen IPA-alueen, jolla Pn-Ps saostuu. Käytetään vasta-aineella ohjattua Nephelose-määritystä, jolla tarkkaillaan fraktiointia Pn-Ps:n kvantitatiivisen talteen 15 keräämisen varmistamiseksi. Tämän parannuksen myötä C-po-lysakkaridin, ryhmäspesifisen polysakkaridin, joka on yleinen monille eri pneumokokki-isolaateille, aiheuttama kontaminaatio vähenee noin 3-20 -kertaisesti epäpuhtaissa Pn-Ps-valmisteisissa tavattavaan tasoon verrattuna. 20 Lisäksi Pn-Ps-valmisteen molekyylikoon polydispergoitumis- aste vähenee samalla noin välille 1,0 ja 1,4.

Vaihtoehtoinen lähestymistapa kooltaan pienennetyn Pn-Ps:n IPA-fraktioinnille on vesiliukoisen, kooltaan pienennetyn Pn-Ps:n kromatografia soveliaan kokoeksluusio-.. 25 hartsin läpi, esimerkiksi CL-2B-hartsin tai minkä muun tahansa hartsin, joka pystyy ottamaan sisäänsä ja fraktioimaan polysakkaridin molekyylipainoalueella 200 - 1000 kilodaltonia. Jäykkää kokoeksluusiomatriisia käyttävä HPSEC on mukava tässä suhteessa viipeen pienentämiseksi ja 30 resoluution kasvattamiseksi. Pylväästä eluoituvien frakti oiden valikointi ennalta määrätyn viskositeetin tai reten-tioajan perusteella tai suoraan pylvääseen kytketyllä de-tektiolla tuottaa Pn-Ps-molekyylien populaation, jolla on yllä paljastetut suotavat koko-, viskositeetti- ja puh-35 tausominaisuudet.

32 107370

Pn-Ps-valmisteet, jotka on viety IPA- tai kromatografisen fraktioinnin lisävaiheiden läpi, käyttäytyvät yh-teneväisemmin kemiallisten liitosvaiheiden aikana ja näin ollen tuottavat konjugaatteja, joilla on toistettavissa 5 olevat ominaisuudet. Samaan aikaan saadaan myös merkittäviä lisäyksiä Pn-Ps:n puhtaudessa, erityisesti CP:ien tasot vähenevät suuresti.

Yllä kuvattujen käsittelyjen ja mittausten tuloksina, Pn-Ps-välituotteiden edulliset ominaisuudet esite-10 tään yhteenvetona taulukossa II yllä.

II. a) Fraktioidun Pn-Ps:n funktionalisointi, jolloin muodostuu elektrofiilinen tai nukleofiilinen reaktantti Pn-Ps*, jolla on edullisesti noin 10 -40 reaktiivista bromiasetyyliryhmää 100 Pn-Ps-mo-15 nomeeriyksikköä kohden:

Pn-Ps edeltävästä vaiheesta I c on riittävän homogeeninen ja sillä on ominaisuuksia, kuten parantunut liukoisuus ja vähentynyt viskositeetti, jotta Pn-Ps on konjugaatioon sovelias. Ammattimiesten saatavilla on monia 20 eri järjestelmiä konjugaattien valmistamiseksi polysakkarideista ja muista rakenneosista. Tässä paljastettu menetelmä on vain yksi mahdollinen reitti, jolla voidaan hyödyntää tämän keksinnön mukainen uusi, osittain hydrolysoitu ja fraktioitu Pn-Ps-välituote konjugaattien muodostami-25 sessa, ja sitä ei pitäisi tulkita ainoaksi keinoksi käyttää Pn-Ps-välituotetta.

S. Marburgin ym. paljastama bigeneeristä väliryh-mää käyttävä menetelmä [US-patentti 4 695 624; Am.

Chem. Soc. 108, 5282 (1986)] on edullinen menetelmä frak-30 tioidun ja kooltaan pienennetyn Pn-Ps:n konjugoimiseksi immunogeeniseen proteiiniin. Pn-Ps funktionalisoidaan • · < niin, että siinä on elektrofiilisiä tai nukleofiilisiä ryhmiä. Tuloksena oleva Pn-Ps* kykenee sitten reagoimaan käänteisesti funktionalisoidun proteiinin, PRO*:n, kanssa. 35 Tämän keksinnön mukainen menetelmä sisältää myös sellaisen 33 107370 nukleofiilin tai bis-nukleofiilin valinnan, joka reagoi aktivoidun polysakkaridin kanssa niin, että muodostuu ko-valenttisesti muokattu polysakkaridi, jossa on kiinnittämistä varten elektrofiiliset kohdat tai tioliryhmät, mikä 5 näin ollen poistaa tarpeen funktionalisoida edelleen bis-nukleofiililla muokattu polysakkaridi ennen kuin kovalent-tisesti muokattu polysakkaridi saatetaan reagoimaan kova-lenttisesti muokatun proteiinin kanssa. Proteiinin funk-tionalisointi kummaan tahansa rakenneosan muotoon voidaan 10 myös saada aikaan useammassa kuin yhdessä vaiheessa, riippuen näiden vaiheiden reaktanttien valinnasta.

Mikä tahansa onkin Pn-Ps*:n haluttu funktionaalisuus, kooltaan pienennetty fraktioitu Pn-Ps täytyy ensin liuottaa liuottimeen, joka ei häiritse funktionalisointi-15 menetelmää. Koska juuri Pn-Ps:n hydroksyyliryhmät ovat helpoimmin funktionalisoitavissa, on kriittisen tärkeää poistaa Pn-Ps vedestä jotta funktionalisointi saataisiin alkuun. Happamien Pn-Ps-vetyjen korvaaminen hydrofobisella kationilla, kuten tetra- tai tributyyliammoniumilla mah-20 dollistaa sen, että Pn-Ps muuttuu liukoiseksi ei-vesipi-toisiin liuottimiin, kuten DMSO tai DMF. Luonnollisesti ei ole tarpeen suorittaa tätä vaihdosta sellaisille Pn-Ps:lie jotka ovat neutraaleja (esim. Pnl4-Ps:lle tai Pn7F-Ps:lle). Kun se on saatu ei-vesipitoiseen liuokseen, Pn-• ^ 25 Ps voidaan saattaa reagoimaan bis-elektrofiilin kuten kar- bonyylidi-imidatsolin kanssa, jolloin muodostuu imidat-soyylidiuretaani. Funktionaalisten ryhmien lukumäärää sataa Pn-Ps-monomeeriyksikköä kohden kontrolloidaan tässä kohtaa niin, että lisätään karbonyylidi-imidatsolireagens-30 siä rajoitettu määrä, noin 1/5 verrattuna Pn-Ps-monomeeri- - ” en kokonaismäärään molaarisesti laskettuna, niin että kes- • · kimäärin vain noin 10 - 40 sadasta Pn-Ps-monomeeriyksikös-tä derivatisoituu. Tämä molekyylilaji on altis nukleofii-liselle substituutiolle joko sellaisten reagenssien toi-35 mesta kuten i) kysteamiini-dihydrokloridi, joka sallii 34 1 0 7 3 7 0 nukleofUlisten Pn-Ps*-johdannaisten muodostumisen, tai ii) 1,4-butaanidiamiini, joka sallii elektrofiilisten Pn-Ps*-johdannaisten muodostumisen, kuten paljastetaan US-patentissa 4 695 624 ja artikkelissa Marburg ym., Am. 5 Chem. Soc. 108, 5282 (1986).

Hiljattain on havaittu, että koska jotkin happamat pneumokokkipolysakkaridit, kuten Pn9V-Ps, Pn4-Ps, Pnl-Ps, Pn5-Ps ja Neisseria meningitidis B:n ja C:n polysakkaridit ilmentävät vapaita karboksyylihapporyhmiä, samoin kuin 10 vapaita hydroksyyliryhmiä, näiden polysakkaridien konju gaation kemiallinen menetelmä etenee hieman eri tavalla verrattuna neutraaleihin polysakkarideihin tai polysakka-rideihin, jotka ovat anionisia fosfodiesterisidosten, kuten polyribosyyliribitolifosfaatissa, läsnäolon vuoksi. 15 Yleensä karboksylaattivapaiden polysakkaridien konjugaa tion kemiallinen menetelmä etenee niin, että vapaat poly-sakkaridihydroksyylit muutetaan uretaanisidoksiksi, ts. Pn-Ps-OH:sta yhdisteeksi Pn-Ps-0-|j-I^-Ra, 20 jossa Ra edustaa loppua atomiketjusta, joka kytkee polysakkaridin proteiiniin. Kuitenkin karboksyylihappoja sisältävissä polysakkarideissa, kuten Pn-9V-Ps:ssa, joka sisältää glukuronaattia, tai Pn4-Ps:ssa, joka sisältää pyruvaatti-25 ryhmiä, kemiallinen menetelmä etenee yhdisteestä • ·

Pn-Ps-f-OH Yhdisteeseen Pn-PsJUL-Ra, jossa Ra taaskin edustaa loppua siitä atomiketjusta, joKa 30 liittää polysakkaridin proteiiniin. Mitä näin ollen havai-.. taan on se, että uretaanin esterifunktionaalisuus ei joko ·* muodostu karboksyylihappoja sisältävässä polysakkaridissa, tai lisäksi näihin kohtiin muodostuu yksinkertainen ami-disidos. Konjugaation kemiallinen menetelmä etenee nopeam- 35 107370 maila vauhdilla, mikä johtuu karboksyylihappofunktionaali-suuksien läsnäolosta.

Koska karboksyylihappofunktionaalisuuksien ajatellaan olevan merkittävästi osallisena tämän anionisten po-5 lysakkaridien luokan antigeenisuudessa ja immunogeenisuu-dessa, konjugaation kemiallista menetelmää täytyy kontrolloida huolellisesti näille polysakkarideille. Korkeiden polysakkaridi-proteiini -suhteiden tarve lopullisessa kon-jugaatissa täytyy tasapainottaa antigeenisen eheyden säi-10 lyttämisen tarpeen kanssa. Tämä tavoite saavutetaan rajoittamalla alkuperäisen karbonyylidi-imidatsoli-välit-teisen aktivaation määrää. Amidin muodostuttua seuraava vaihe, johon kuuluu kysteamiinidihydrokloridi tai 1,4-bu-taanidiamidi, voi edetä kuten yllä on mainittu ja edel-15 leen alla käsitellään.

Vaihtoehtoisesti karboksyyliryhmät voidaan suojata palautuvasti, ja sitten niiden suojaus voidaan poistaa, käyttämällä trimetyylisilyyliä tai vastaavia suojausryh-miä jotka voidaan myöhemmin poistaa heikosti emäksisillä 20 olosuhteilla, tai käyttämällä 2,4-dimetoksibentsyylieste- reitä, jotka olisivat happolabiileita. Tässä tapauksessa konjugaation kemiallinen menetelmä voi edetä tavanomaisella tavalla polysakkaridin hydroksyyliryhmien kautta.

1. NukleofUlisen Pn-Ps*:n tuotanto 25 Yllä saatu karbonyylidi-imidatsoliaktivoitu, kool taan pienennetty ja fraktioitu Ps voidaan saattaa reagoimaan vesipitoisissa tai muissa liuottimissa sellaisten reagenssien kanssa kuten on paljastettu US-patentissa 4 695 624. Edullinen reagenssi on kysteamiinidihydroklori-30 di. Tämän jälkeinen ylimääräisen kysteamiinin poisto ja pelkistys ditiotreitolilla tai ditioerytreitolilla tuot- « · taa nukleofiilisen sulfhydryylifunktionalisoidun Pn-Ps:n. Tämä Pn-Ps*-johdannainen pystyy reagoimaan elektrofiilisen PRO*:n kanssa, esimerkiksi sellaisen, missä proteiinia on 36 107370 modifioitu niin, että siinä on esillä liittämistä varten bromiasetyyliryhmiä.

2. Elektrofiilisen Pn-Ps*:n tuotanto:

Yllä saatu karbonyylidi-imidatsoliaktivoitu, kool-5 taan pienennetty ja fraktioitu Ps voidaan saattaa reagoimaan vesipitoisissa tai muissa liuottimissa sellaisten reagenssien kanssa kuten on paljastettu US-patentissa 4 695 624, edullisesti 1,4-butaanidiamiinin (BuA2) kanssa. Tämän jälkeinen Pn-Ps-BuA2:n asylaatio p-nitrofenyylibro-10 miasetaatilla tai vastaavalla reagenssilla saa aikaan elektrofiilisen Pn-Ps-BuA2-BrAc-johdannaisen, joka kykenee reagoimaan nukleofiilisen PRO*:n, kuten sulfhydryyleillä modifioidun proteiinin kanssa. Derivatisointiaste mitataan tässä kohdassa NMR:llä ja vertaamalla 1,4-butaanidiamiini-15 integraalia soveliaaseen monosakkaridisignaaliin kuten ramnoosin metyyliin. Edulliset derivatisointiasteet ovat välillä 10 - 40 %, ja edullisimmin noin 20 %.

11. B) Immunogeenisen proteiinin (PRO), edullisesti Neisseria meningitidis B:n 0MPC:n tai sen alayksi-20 kön, eristys:

Proteiiniosan pitäisi käyttäytyä immunologisena tehostajana. Proteiinia valittaessa on suotavaa välttää niitä, jotka johtavat vastaanottajan immuunivasteen epäspesifiseen aktivaatioon (reaktogeenisuuteen). US-paten-25 tissa 4 695 624 Marburg ym. käyttivät Neisseria meningitidis -bakteerista peräisin olevaa ulkomembraaniproteiini-kompleksia (OMPC) polysakkaridi-proteiini -konjugaattien valmistamista varten. OMPC on osoittautunut soveliaaksi tässä keksinnössä, vaikkakin muita immunogeenisia prote-30 iineja kuten tetanus- tai difteriatoksoidia tai pertussi-nogeenia, voidaan käyttää.

• ·

On keksitty erilaisia menetelmiä, joilla voidaan puhdistaa OPMC gram-negatiivisista bakteereista [Frasch ym. J. Exp. Med. 140, 87 (1974); Frasch ym. J. Exp. Med. 35 147, 629 (1978); Zollinger ym. US-patentti 4 707 543 37 107370

(1987); Helting ym. Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. C 89, 69 (1981); Helting ym. US-patentti 4 271 147]. Tässä käytetty OMPC valmistettiin kuten esimerkissä 1 kuvataan. Lisäksi edullinen on myös proteiinialayksikkö, joka on 5 eristetty dissosioimalla OMPC tai ekspressoimalla rekom-binanttimenetelmin materiaali, joka koodittaa OMPC:n ainesosana olevaa proteiinia, erityisesti päämembraaniprote-iinia (johon viitataan myös nimellä mitogeeninen induktio-proteiini, MIP, tai immuniteettia tehostava pääproteiini, 10 MIEP). Yksi keino saada alayksikköproteiinit on paljastettu esimerkissä 2, 16-23 ja US-patenttihakemuksissa USSN

555 978, 555 329, 555 204 ja 639 457 (vastaavasti Merckin hakemukset 188110, 18159 ja 18160, jätetty 19. heinäkuuta 1990 ja 18160IA, jätetty 10. tammikuuta 1991).

15 II. c) PRO:n funktionalisointi, jotta saadaan ai kaan nukleofiilinen tai elektrofiilinen reaktantti PRO*, edullisesti OMPC tai sen alayksikkö, jossa on reaktiivisia sulfhydryyliosia:

Seuraavaksi PRO, joka on eristetty kuten yllä koh-20 dassa II b on kuvattu, funktionalisoidaan niin, että siinä on joko elektrofiilisia tai nukleofiilisia ryhmiä. Tuloksena oleva PRO* kykenee sitten reagoimaan käänteisesti funktionalisoidun Pn-Ps*:n kanssa, joka on valmistettu kuten kohdassa Ha yllä on kuvattu.

; 25 1. Elektrofiilisten PRO*-johdannaisten muodostami- nen

Eristetty PRO, esimerkiksi Neisserian OMPC tai MIEP 0MPC:stä, saatetaan edullisesti reagoimaan sellaisen rea-genssin, kuten N-(bromiasetyyli)-6-aminokapronihapon p-30 nitrofenyyliesterin kanssa, joka pystyy reagoimaan PROrssa '*· olevien lysiinin 6-aminoryhmien kanssa. Tuloksena oleva bromiasetyloitu PRO* kykenee reagoimaan nukleofiilisten Pn-Ps*:ien johdannaisten, kuten edellä kohdassa II a 1 valmistettujen, kanssa.

38 107370 2. Nukleofiilisten PRO*-johdannaisten muodostaminen Eristetty PRO, esimerkiksi Neisserian OMPC tai MIEP, saatetaan reagoimaan sellaisen reagenssin kuten N-asetyylihomokysteiinitiolaktonin kanssa niin, että saadaan 5 proteiinin sulfhydryylijohdannainen. Tämä nukleofiilinen johdannainen kykenee reagoimaan elektrofiilisen Pn-Ps*:n, kuten edellä kohdassa II a 2 valmistetun, kanssa. Menetelmän tämän vaiheen tyypilliset tulokset tuottavat sulfhyd-ryylitiittereitä välillä noin 0,1 - 0,3 pmoolia/mg prote-10 iinia.

II. d) Vaiheen II a polysakkaridin (Pn-Ps*) konju-goiminen vaiheen II c proteiinin (PRO*) kanssa:

Kun on muodostettu reaktiiviset molekyylilajit Pn-Ps* ja PRO* edellä olevien vaiheiden II a ja II c mukai-15 sesti, käänteisesti aktivoidut reaktiokumppanit saatetaan kontaktiin toistensa kanssa noin 1:1-massasuhteessa. Reak-tioseoksen pitäisi olla typellä ilmasta puhdistettu, tiiviisti suljettu, ja sen pitäisi antaa reagoida huoneenlämpötilassa noin neljä päivää välillä 17 - 40 °C. Esimerk-20 keihin tällaisista reaktioista kuuluu: OH 0 NHCOCH3

Pn-Ps-CHCH2CH2CH2CH2NHCCH2Br + HSCH2CH2CHC0-PR0 25 OH 0 MHCOCH3

Pn-PsCKCH2CH2CHzCH2NHCCH2SCH2CH2CHC0PR0, 30 . jossa aktivoitu polysakkaridi, joka on saatettu reagoimaan ·’ 4-bromiasetamidibutyyliamiinin kanssa, saatetaan reagoi maan sellaisen proteiinin kanssa, joka on saatettu reagoimaan N-asetyylihomokysteiinitiolaktonin kanssa, niin että 35 muodostuu konjugaatti, ja: 39 107370 OH HO n „ III III A H ''

Pn-Ps-CNY” -NCCH2Nf 7] + HSCH2CH2NHCCH2CH2C-PRO

5 A

o

10 OH HO o O O

III III A 11 11

Pn-Ps-CNY“ -NCCH2Ny / CH2CH2NHCCH2CH2C-PRO

H/ o s 15 (jossa Y” on C2-C8 alkyyliradikaali), jossa aminoderivati-soitu polysakkaridi, joka on saatettu reagoimaan aktivoidun maleimidohapon kanssa, saatetaan reagoimaan sellaisen karboksiaktivoidun proteiinin kanssa, joka on aminoitu 20 aminotiolilla, niin että muodostuu konjugaatti.

Samaan tapaan mitkä tahansa kovalenttisesti muokatut polysakkaridit, joissa on liittämistä varten tioliryh-miä, voidaan saattaa reagoimaan bakteeriproteiinin OMPC tai MIEP kanssa, joissa on liittämistä varten elektrofii-25 liset keskukset, jolloin saadaan kovalenttinen konjugaat- • · ti. Esimerkki tällaisesta reaktiosta on: 30 Pn-Ps-CNHCH2CH2SH + PR0-i:CH2CH2f-)KCH2)4NHC0CH2Bi:— ? Pn-pJL2CH2s J<CH2>4JcH2ce2LRo.

40 107370 jossa aktivoitu polysakkaridi, joka on saatettu reagoimaan aminotiolin kanssa, saatetaan reagoimaan sellaisen karbok-siaktivoidun proteiinin kanssa, joka on saatettu reagoimaan diamiinin monohalogeeniasetyylijohdannaisten kanssa, 5 niin että muodostuu konjugaatti. Hyvin edullinen, tämän keksinnön mukainen sidos on väliryhmä, jolla on kaava: PR0-N-C0CHCH2CH2SCH2C0NH(CH2)4 NHC—0—PnPs, H NHCOCH3 ö 10 polysakkaridin hydroksyyleihin tuleville sidoksille, tai PR0-N-C0CHCH2CH2SCH2C0NH(CH2)4 NHC-PnPs, H NHCOCH3 6 15 tapauksessa, jossa polysakkaridit sisältävät karboksyyli-happoryhmiä.

Jos sattuisi niin, että olisi tarve eliminoida ylimääräisten halogeeniasetyyliryhmien elektrofiilinen aktiivisuus, konjugaatin reaktio molekyylipainoltaan pienen 20 tiolin, kuten N-asetyylikysteamiinin, kanssa saavuttaa tämän tarkoituksen. Tämän reagenssin, N-asetyylikysteamiinin, käyttö sallii myös varmistuksen, jolla selvitetään käytetyt haloasetyyliosista, koska muodostuva S-karbok-simetyylikysteamiini voidaan havaita ainutlaatuisesta 25 Spackmanin, Mooren ja Steinin menetelmällä.

XI. e) "Cap"-ryhmän liittäminen Pn-Ps-PRO-konju-gaattiin jäljelle jääneiden funktionaalisten ryhmien poistamiseksi: Jäljelle jääneet elektrofiiliset ryhmät joko 30 PRO*:ssa tai Pn-Ps*:ssa sammutetaan reaktion lopussa li-• säämällä konjugaatin jäljelle jääneisiin reaktiivisiin ryhmiin verrattuna noin 2-10 -kertainen molaarinen ylimäärä molekyylipainoltaan pientä nukleofiilia, esimerkiksi N-etyylimaleimidiä (NEM) "cap"-ryhmän liittämiseksi jäl-35 jelle jääneisiin vapaisiin sulfhydryyleihin tai elektro- 41 107370 fiiliin, esimerkiksi N-asetyylikysteamiinia "cap"-ryhmän liittämiseksi jäljelle jääneisiin bromiasetyyliosiin.

II.f) Konjugaattituotteen eristys:

Konjugaattituote, johon on liitetty "cap"-ryhmä, 5 erotetaan konjugoimattomista PRO:sta, Pn-Ps:ista ja muista reaktanteista ultrasentrifugoinnilla tai diafiltraatiolla. Konjugaattisakka resuspendoidaan vesipohjaiseen puskuri-pesuun, jossa voi olla mukana detergenttikäsittely, kuten 0,5 % deoksikoliini, ja suola, kuten 0,1 M Tris pH 7 - 9, 10 ja noin 10 mM EDTA, jäljelle jääneiden pyrogeenien poistamiseksi, ja annetaan seistä 1-25 tuntia huoneenlämpö-tilassa. Konjugaatti ajetaan uudestaan sakaksi, resuspendoidaan vesipohjaiseen puskuriin ilman detergenttiä ja ajetaan sitten uudestaan sakaksi ultrasentrifugoinnilla 15 noin 100 000 x g:ssä kiinteäkulmaista roottoria käyttäen noin kahden tunnin ajan noin 1-20 °C:ssa, tai ne alistetaan mihin tahansa monista muista puhdistusmenetelmistä, mukaanlukien diafiltraatiogeelipermeaatio, ioninvaihtok-romatografia, gradienttisentrifugointi tai muu differenti-20 aaliadsorptiokromatografia, jotta saataisiin poistettua ei-kovalenttisesti sitoutuneet polysakkaridit ja proteiinit, käyttäen Ps-, Pro- ja nopeusnefelometriamäärityksiä samoin kuin kovalenttisuusmääritystä bigeneeriselle väli-ryhmälle (katso alla) iji vitro -menetelminä, joilla seura-25 taan haluttua biologista aktiivisuutta.

Reagenssien lisäseparaatio voidaan saada aikaan kokoeksluusiokromatografiällä pylväässä, tai hyvin suurten, liukenemattomien proteiinien tapauksessa eristys voidaan saada aikaan ultrasentrifugoinnilla. Konjugaatin re-30 suspensiota steriiliin veteen ja seisotusta noin päivän ajan 4 °C:ssa, jotta tehtäisiin mahdolliseksi täydellinen : » liukeneminen, seuraa sentrifugointi pienellä nopeudella liukenemattomien partikkelien poistamiseksi. Supernatant-tiliuos sisältää lopullisen tuotteen joka voidaan sterii-35 lisuodattaa, formuloida rokotekoostumuksiksi immunologi- 42 107370 sesti tehokkaina annostasoina ja pakata steriilisti pulloihin.

Konjugaatin analysointi, jolla vahvistetaan konju-gaatin kovalenttisuus ja näin ollen stabiilisuus, suori-5 tetaan hydrolysoimalla konjugaatti (edullisesti 6 N HClrlla 110 °C:ssa 20 tuntia), sitten analysoimalla kvantitatiivisesti ainutlaatuinen aminohappo hydrolyysille stabiilista väliryhmästä, joka sisältää tioeetterisidok-sen, ja proteiinin ainesosina olevat aminohapot. Proteii-10 nin aminohappojen osuus voidaan tarvittaessa poistaa vertaamalla mukana olevalle proteiinille kuuluvaan aminohap-postandardiin, ja jäljelle jäävä aminohappoarvo heijastaa konjugaatin kovalenttisuutta, tai väliryhmän aminohappo voidaan suunnitella niin, että se näkyy analyysissä prote-15 iinin aminohappostandardin ulkopuolella. Kovalenttisuus-määritys on myös hyödyllinen puhdistusmenetelmien tarkkailussa, jolloin sillä osoitetaan biologisesti aktiivisten komponenttien pitoisuuden nousu. Yllä olevissa esimerkeissä yhdisteen 20 OH jj NHCOCH3

PeCHC^CE^ CH2 CH2MÖCH2SCH2CH2CHCOPRO

hydrolyysi johtaa S-karboksimetyylihomokysteiinin 25 H02CCH2SCH2CH2CHC02H; •« vapautumiseen; yhdisteen OH HO n III III A o o

30 Pn-Ps-CNY" -NCCH,N( ,) Il II

\ V y:H2CH2NHCCH2CH2C-PRO

O s hydrolyysi johtaa aminodikarboksyylihapon H02CCH2CHSCH2CH2NH2;

35 H02C

vapautumiseen; ja yhdisteen 43 107370 piL2ca2SC=Jf<CH2>4NBL2CH2?PR0 5 hydrolyysi johtaa S-karboksimetyylikysteamiinin, H2NCH2CH2-SCH2C02H, vapautumiseen siten että molekyyli Ps-A-E-S-B-PRO katkeaa peptidisidosten ja muiden hydrolyyttisesti epästabiilien sidosten kohdalta. Kromatografisia menetel-10 miä, kuten Spackmanin, Mooren ja Steinin menetelmiä, voidaan sitten soveltaa mukavasti ja aminohappoainesosien suhde voidaan määrittää.

IgG-vasta-aineen optimaalinen tuotto vaatii B- ja T-lymfosyyttien yhteistyötä ja spesifisyyttä halutun anti-15 geenin suhteen. T-lymfosyytit eivät kykene tunnistamaan polysakkarideja, mutta voivat antaa apua polysakkaridin vastaisille IgG-vasta-aineresponsseille, jos polysakkaridi on kovalenttisesti kytketty proteiiniin, jonka T-solu kykenee tunnistamaan.

20 C. Rokoteformulaatiot ja hyöty:

Edullisessa suoritusmuodossa konjugaattituote adsorboidaan aluminiumhydroksidigeeliin. Tämä saadaan aikaan esimerkiksi valmistamalla konjugaattikantaliuos, joka vastaa 20 pg/ml Pn-Ps-konsentraatiota. Osa voidaan laimentaa 25 1:1/ 1:5 ja 1:10 steriilillä vedellä. Osia kustakin näistä ’ · * näytteistä, mukaanlukien osa 20 pg/ml kantaliuoksesta, laimennetaan 1:1 aluminiumhydroksidilaimennusaineella, joka sisältää 0,85 mg/ml AI3*, 1,7 % NaCl (w/v) ja 100 pg/ml tiomersaalia. Liuoksen pH säädetään noin arvoon 30 7,5 1 N NaOH:lla, mikä johtaa liuoksiin joiden Pn-Ps-kon- •t sentraatio on 10, 5, 2 ja 1 pg/ml. Kullekin näistä for- mulaatioista annokset välillä 0,1 - 0,75 ml ovat soveliaita antamiseen eri ikäisille ja painoisille vastaanottajille. Kuvatulla tavalla formuloidun rokotteen on havaittu 35 saavan aikaan merkittäviä, alatyyppispesifisiä, pneumokok- 107370 44 keja vastaan suunnattuja polysakkaridi-immuunivasteita 2 -3 kuukautta vanhoissa imeväisikäisissä apinoissa Pn6B-Ps-OMPC:lie, Pnl4-Ps-OMPC:lle, Pnl9F-Ps-OMPC:lle ja Pn23F-Ps-OMPC:lle. Pn-Ps-OMPC-konjugaattirokotteen on lisäksi 5 havaittu olevan T-soluriippuvainen kateenkorvattomilla hiirillä.

Tämän paljastuksen perusteella pitäisi olla selvää, että muilla polysakkarideilla, joilla on sellaisia ominaisuuksia kuten tässä määritellään, ja menetelmillä joilla 10 tehdään Ps:ia, joilla on nuo ominaisuudet, on hyödyllistä sovellutusta valmistettaessa muitakin konjugaatteja kuin niitä, jotka sisältävät osittain hydrolysoituja ja fraktioituja pneumokokkipolysakkarideja. Näitä konjugaatteja voitaisiin sitten käyttää estämään tauteja, joita aiheut-15 tavat muut patogeeniset organismit. Esimerkiksi B-ryhmän streptokokkeja, vastasyntyneiden aivokalvontulehduksen aiheuttajaa, Neisseria meningitidis B:tä tai C:tä, pikkulasten aivokalvotulehduksen aiheuttajaa, tai E. colia, tärkeää virtsatie- ja muiden opportunististen infektioiden 20 aiheuttajaa, voitaisiin käyttää polysakkaridilähteinä. Nämä polysakkaridit, samoin kuin Pn-Ps ja niiden kovalent-tiset konjugaatit, voivat myös tarjota merkittäviä komponentteja yhdistelmärokoteformulaatioita varten. Sellaiset yhdistelmät voivat sisältää esimerkiksi immunologisesti . 25 tehokkaita määriä adjuvanttia, kuten Freundin, Ribin tai immunomodulatorisia yhdisteitä, kuten interleukiineja, interferoneja (katso esimerkiksi yhdisteet jotka on lueteltu artikkeleissa Market Letter, 30. marraskuuta 1987, s. 26-27; Genetic Engineering News, tammikuu 1988, voi. 8, 30 s. 23) tai vielä muita immunogeeneja. Edullisessa suori-·· tusmuodossa yhteen tai useampaan rokotteeseen hepatiitti B:tä, hepatiitti A:ta, ei-A-ei-B-hepatiittia, AIDS:ia, kurkkumätää, hinkuyskää, jäykkäkouristusta, tuhkarokkoa, sikotautia, vihurirokkoa, vesirokkoa, poliota, tai Haemo-35 philus influenzae b:tä vastaan sisällytetään koostumus, 45 107370 joka sisältää immunologisesti tehokkaita määriä tämän keksinnön mukaista konjugaattia. Edulliset lisärokotteet, valittuna äsken mainituista, voivat olla PevaxHIB*, Recom-bivax HBr, M-M-Rr ja DTP-kolmoisrokote.

5 Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön paljastami seksi edelleen, eikä niitä pidä tulkita keksintöä rajoittaviksi .

Esimerkki 1

Neisseria meningitidis Bll serotyyppi 2:n OMPC:n 10 valmistus A. Fermentointi 1. Neisseria meningitidis ryhmä Bll

Putki, joka sisältää kylmäkuivatun Neisseria meningitidis -viljelmän [saatu tri M. Artensteinilta, Walter 15 Reed Army Institute of Research (WRAIR), Washington, D.C.], avattiin ja lisättiin Eugonbrothia (BBL). Viljelmä vedettiin viivoiksi Muellerin-Hintonin agarvinopinnoille ja inkuboitiin 37 °C:ssa, 5 % C02/ 36 tuntia, jossa vaiheessa kasvu kerättiin 10 % "skim milk" -elatusaineeseen 20 (Difco) ja pakastettiin eriin jaettuna -70 eC:seen. Orga nismin identiteetti vahvistettiin agglutinoimalla WRAIR: in toimittamalla spesifisellä antiseerumilla ja Difcon toimittamalla tyypitysseerumilla.

Ampulli toisen pasaasin viljelmää sulatettiin ja ; 25 vedettiin kymmenelle Columbia Sheep Blood -agarmaljalle (CBAB-BBL). Maljoja inkuboitiin 37 °C:ssa, 5 % C02, 18 tuntia, jonka jälkeen kasvu kerättiin 100 mitään 10 % "skim milk" -elatusainetta, otettiin 0,5 ml kokoisia näytteitä, ja nämä pakastettiin -70 “Ctseen. Organismi tunnistettiin 30 positiivisesti agglutinaatiolla spesifisellä antiseerumilla, sokerien fermentoinnilla ja gram-värjäyksellä.

• · Tästä sukupolvesta peräisin oleva ampulli sulatettiin, laimennettiin Muellerin-Hintonin liemellä ja vedettiin viivoiksi 40:lie Muellerin-Hintonin agarmaljalle. 35 Maljoja inkuboitiin 37 °C:ssa, 6 % C02, 18 tuntia, jonka 46 107370 jälkeen kasvu kerättiin 17 ml:aan 10 % "skim milk" -ela-tusainetta, jaettiin 0,3 ml eriksi ja pakastettiin -70 °C:seen. Organismi tunnistettiin positiivisesti Gram-värjäyksellä, agglutinaatiolla spesifisellä antiseerumilla 5 ja oksidaasitestillä.

2. Solutahnan fermentaatio ja kerääminen a. Siirrosteen kehittäminen

Siirroste kasvatettiin yhdestä yllä mainitusta pakastetusta Neisseria meningitidis ryhmä B, B-ll -pullosta 10 (neljäs pasaasi). Kymmenen Muellerin-Hintonin agarvinopin- taviljelmää siirrostettiin ja kuusi kerättiin noin 18 tuntia myöhemmin ja käytettiin siirrosteena kolmelle 250 ml pullolle Gotschlichin hiivadialysaattielatusainetta, pH 6,35. OD660 säädettiin arvoon 0,18, ja inkuboitiin kunnes 15 OD660 °li välillä 1 - 1,8. 1 ml tätä viljelmää käytettiin inokuloimaan kukin viidestä 2 1 erlenmeyer-pullosta (kukin sisälsi 1 litran elatusainetta, katso alla) ja inkuboitiin 37 °C:ssa ravistelijassa 200 rpmrssä. Absorbanssia tarkkailtiin tunnin välein siirrostuksen jälkeen. Tuloksena 20 oli 4 litraa liemiviljelmää, OD660 1,28.

70 litran ymppifermenttori

Noin 4 litraa ymppiviljelmää käytettiin inokuloimaan steriili 70 litran fermenttori, joka sisälsi noin 40 litraa täydellistä tuotantoelatusainetta (katso alla). 25 70 litran fermentoinnin olosuhteisiin kuuluivat 37 °C, > · · 185 rpm, ilmastus 10 litraa/minuutti ja jatkuva pH:n pitäminen noin pH:ssa 7,0 noin kahden tunnin ajan. Tälle erälle lopullinen OD660 oli 0,732 kahden tunnin kuluttua. 800 litran tuotantofermenttori 30 Noin 40 litraa ymppiviljelmää käytettiin inokuloi- *· maan steriili 800 litran fermenttori, joka sisälsi 568,2 • · litraa täydellistä tuotantoelatusainetta (katso alla). Erää inkuboitiin 37 °C:ssa, 100 rpm, ilmastuksella 60 litraa/minuutti ja pH pidettiin jatkuvasti arvossa 7,0. Tälle 47 1 0 7 3 7 0 erälle lopullinen absorbanssi oli 5,58 kolmetoista tuntia siirrostuksen jälkeen.

3. Täydellinen elatusaine erlenmeyer-pulloille ja 70 ja 800 litran fermenttoreille 5 Fraktio A

L-glutamiinihappo 1,5 g/litra

NaCl 6,0 g/litra

Na2HP04, vedetön 2,5 g/litra NH4C1 1,25 g/litra 10 KC1 0,09 g/litra L-kysteiini-HCl 0,02 g/litra

Fraktio B (Gotschlichin hiivadialysaatti) 1280 g Difcon hiivauutetta liuotettiin 6,4 litraan tislattua vettä. Liuos dialysoitiin kahdessa Amicon DC-30 15 onttokuitudialyysiyksikössä kolmen HIOSM-patruunan kanssa.

384 g MgS04 H20 ja 3200 g dekstroosia liuotettiin dialy-saattiin ja kokonaistilavuus täytettiin 15 litraksi tislatulla vedellä. pH säädettiin arvoon 7,4 NaOHtlla, steriloitiin laskemalla 0,22 μ suodattimen läpi, ja siirrettiin 20 fermenttoriin joka sisälsi fraktion A.

Erlenmeyer-pulloille: 1 litra fraktiota A ja 25 ml fraktiota B yhdistettiin, ja pH säädettiin arvoon 7,0 - 7,2 NaOH:lla.

70 litran fermenttorille: 41,8 litraa fraktiota A • 25 ja 900 ml fraktiota B yhdistettiin, ja pH säädettiin ar voon 7,0 - 7,2 NaOHtlla.

800 litran fermenttorille: 553 litraa fraktiota A ja 15 litraa fraktiota B yhdistettiin, ja pH säädettiin arvoon 7,1 - 7,2 NaOHtlla.

30 b. Keruu ja inaktivointi

Fermentoinnin loputtua fenolia lisättiin eri asti- • · aan, johon soluliemi sitten siirrettiin, minkä tuloksena fenolin loppukonsentraatio oli noin 0,5 %. Materiaalia pidettiin huoneenlämmössä varovasti sekoittaen kunnes vil-35 jelmä ei ollut enää elinkelpoinen (noin 24 tuntia).

48 107370 e. Sentrifugointi

Noin 24 tunnin kuluttua 4 °C:ssa, 614,4 litraa in-aktivoitua viljelmänestettä sentrifugoitiin Sharpies-jat-kuvavirtaussentrifuugien läpi. Solutahnan paino fenolikä-5 sittelyn jälkeen oli 3,875 kg. Vaihtoehtoisesti fenolilla tapettu fermentaatioliemi kerättiin diafiltraatiolla kuten edempänä kuvataan.

B. OMPC:n eristys

Vaihe 1. Konsentrointi ja diafiltraatio 10 Fenolilla inaktivoitu viljelmä konsentroitiin noin 30 litraksi ja diafiltroitiin steriilissä tislatussa vedessä käyttäen 0,2 pm onttokuitusuodattimia (ENKÄ).

Vaihe 2. Uutto

Yhtä suuri tilavuus 2X TED-puskuria [0,1 M Tris-15 0,01 M EDTA -puskuri, pH 8,5, jossa 0,5 % natriumdeoksi- kolaatti] lisättiin konsentroituihin diafiltroituihin soluihin. Suspensio siirrettiin OMPC:n eristystä varten läm-pösäädeltyyn tankkiin 56 °C:seen ja ravisteltiin 30 minuuttia.

20 Uutos sentrifugoitiin noin 18 000 rpm:ssä Sharples- jatkuvavirtaussentrifuugissa virtausnopeudella noin 80 ml/minuutti, noin 4 °C:ssa. Sitten viskoosi superna-tanttineste kerättiin ja varastoitiin 4 °C:seen. Uutetut solusakat uutettiin uudelleen TED-puskurilla kuten yllä on · 25 kuvattu. Supernatanttinesteet yhdistettiin ja varastoitiin 4 ° C: seen.

Vaihe 3. Konsentrointi ultrasuodatuksella

Yhdistettu uutos siirrettiin lämpötilasäädeltyyn tankkiin, joka oli kiinnitetty AG-Tech 0,1 pm polysulfoni-30 suodattimiin. Uutoksen lämpötila pidettiin 25 °C:ssa astiassa koko konsentrointiprosessin ajan. Näyte konsentroitiin kymmenkertaisesti keskimääräisen transmembraanipai-neen ollessa välillä 76 - 166 kPa.

49 107370

Vaihe 4. OMPC:n keruu ja pesu

Vaiheesta 3 peräisin oleva jäljelle jäänyt aines sentrifugoitiin noin 160 000 x g:ssä (35 000 rpm) noin 70 eC:ssa jatkuvavirtaussentrifuugissa virtausnopeudella 5 noin 300 - 500 ml/minuutti, ja supernatanttineste heitettiin pois.

OMPC-sakka suspendoitiin TED-puskuriin (190 ml puskuria, 20 ml/g sakkaa). Vaihe 2 ja vaihe 4 toistettiin kahdesti (vaihe 3 jätettiin tällöin väliin).

10 Vaihe 5. OMPC-tuotteen keräys

Vaiheesta 4 peräisin olevat pestyt sakat suspendoitiin 100 ml:aan tislattua vettä lasisauvalla ja Dounce-homogenisoijalla täydellisen suspensoitumisen varmistamiseksi. OMPC:n vesisuspensio steriloitiin sitten suodatta-15 maila 0,22 pm suodattimen läpi laskemalla, ja TED-puskuri vaihdettiin vedeksi dialysoimalla steriiliä tislattua vettä vastaan 0,1 pm onttokuitusuodatinta käyttäen.

Esimerkki 2 OMPC:n alayksikön puhdistus: 20 Puhdistetun MIEP:n valmistus 0MPC:sta tai rekombi- nanttisoluista polyakryyliamidigeelielektroforee- silla Käytettiin akryyliamidi/BIS-geelejä (37.5:1), 18 x 14 cm, paksuus 3 mm. Konsentrointigeeli oli 4 % polyak-• 25 ryyliamidi ja erotusgeeli oli 12 % polyakryyliamidi. Gee liä kohti käytettiin noin 5 pg OMPC-proteiinia tai rekom-binantti-isäntäsolun proteiinia. 1 ml:aan 0MPC:tä lisättiin 0,5 ml näytepuskuria (4 % glyseroli, 300 mM DTT, 100 mM Tris, 0,001 % Bromophenol blue, pH 7,0). Seos kuu-30 mennettiin 105 °C:seen 20 minuutiksi ja annettiin jäähtyä '* huoneenlämpötilaan ennen lataamista geelille. Geeliä ajet- • · tiin 200 - 400 milliampeerilla, jäähdyttäen, kunnes Bromophenol blue saavutti geelin pohjan. Geelistä leikattiin irti pystysuora kaistale (noin 1 - 2 cm leveä), j oka vär-35 jättiin Coomassie/kupari(Il)asetaatilla (0,1 %). Kaista- so 107370 leesta poistettiin väriä kunnes MIEP-vyöhyke (noin 38 kDa) tuli näkyviin. Sitten kaistale sijoitettiin alkuperäiseen paikkaansa geelissä ja MIEP-alue leikattiin irti lopusta geelistä kirurginveistä käyttäen.

5 Irtileikattu alue leikattiin kuutioiksi (noin 5 mm) ja elutoitiin 0,01 M Tris-puskurilla, pH 8,1. Kahden eluu-tiokierroksen jälkeen eluaatin puhtaus arvioitiin SDS-PAGErssa. Eluaatti yhdistettiin eluaattien yhteisen poolin kanssa ja dialysoitiin 48 tuntia 60 mM ammoniakki-muura-10 haishappopuskuria, pH 10, vastaan. Vaihtoehtoisesti eluoi-tu proteiini voidaan dialysoida etikkahapon 50 % vesiliuosta vastaan. Dialyysin jälkeen eluoitu proteiini haihdutettiin kuivaksi. Materiaali puhdistettiin edelleen viemällä se PD10 koonmäärityspylvään läpi (Pharmacia, Pisca-15 taway, NJ) ja varastoitiin huoneenlämpötilaan.

Esimerkki 3

Streptococcus pneumoniae -alatyyppien viljely ja epäpuhtaan Pn-Ps:n eristys: I. Pneumokokkien viljely: 20 Pneumokokkien viljelymenetelmät tunnetaan alalla hyvin [Chase, M.W., Methods of Immunology and Immunoche-mistry 1^, 52 (1967)]. Pneumokokkialatyyppi-isolaatit ovat saatavilla ATCC:ltä. Bakteerit tunnistetaan kapselillisik-si, ei-liikkuviksi, Gram-positiivisiksi, suikulan muotoi-25 siksi diplokokeiksi, jotka ovat alfa-hemolyyttisiä veri-agarilla. Alatyypit erotetaan Quellingin reaktion perusteella spesifisiä antiseerumeita käyttäen. Alkuperäisiä ja varastoymppiviljelmiä pidetään edullisesti yllä lyofili-soituina tai alle 8 °C:ssa. Edullisissa viljelymenetel-30 missä kantaviljelmät herätetään Heart Infusion Broth -ela- ’* tusaineella, maljataan Heart-Infusion -agarille, joka si- • · sältää 10 % fibriinittömäksi tehtyä kanin verta ja inku-boidaan 37 °C ± 2 °C lämpötilassa noin 18 tuntia.

Maljan kasvu resuspendoidaan Heart Infusion Broth 35 -elatusaineeseen ja erää resuspendoidusta kasvusta käyte- 51 107370 tään inokuloimaan 100 ml Heart Infusion Broth -elatusai-netta, joka sisältää 10 % fibriinittömäksi tehtyä kanin verta, jota inkuboidaan seisovana viljelmänä noin 18 tuntia 37 °C ± 2 °C lämpötilassa. 100 ml:sta nestemäiseksi 5 tehtyä viljelmää (käyttöymppi) tarkastetaan puhtaus tutkimalla mikroskoopilla Gram-värjätty sivelyvalmiste ja kasvusto Heart Infusion Blood -agarmaljoilla. Käyttöymppi voidaan varastoida 2-8 °C:een lämpötilaan jopa 14 päiväksi tai käyttää heti. Kahden litran Erlenmeyer-pulloihin 10 tai muihin sopiviin astioihin, jotka sisältävät pneumokok-kisiirrostuselatusainetta (YUF), joka sisältää dekstroosia (25 g/1), siirrostetaan käyttöymppiä ja inkuboidaan seisovina noin 8-24 tuntia 37 °C ± 2 °C:een lämpötilassa. Inku-bointiaika vaihtelee kuten erityisesti mainitaan, riippuen 15 kasvatettavan Streptococcus pneumoniaen tyypistä. Fermen- toinnin pH säädetään niin, että se pysyy tavoite-pH-alu-eella 6,0 - 7,2 lisäämällä ajoittain 12 % natriumbikarbo-naattiliuosta, kunnes saavutetaan absorbanssi 1,5 - 4,0. Absorbanssia tarkkaillaan 660 nanometrin aallonpituudella. 20 Kasvustonäytettä tutkitaan mikroskooppisesti ja suorite taan serologinen agglutinaatioreaktio puhtauden tarkistamiseksi. Kasvusto tästä vaiheesta siirretään ymppiferment-toriin, joka sisältää 40 litraa pneumokokkifermenttoriela-tusainetta, joka koostuu tislatusta vedestä, kuiva-annok-25 sesta pneumokokkiymppielatusaineen (YUF) komponentteja, hiivauuteultrafiltraatista, UC0N:stä ja dekstroosista (noin 25 g/litra). Viljelmää inkuboidaan 37 °C ± 2 eC:een lämpötilassa kevyesti sekoittaen noin 2-12 tuntia. pH pidetään välillä 6,0 - 7,2 lisäämällä ajoittain natrium-30 hydroksidiliuosta. Fermenttoriin, joka sisältää 525 litraa pneumokokkifermenttorielatusainetta, joka koostuu tisla- • · tusta vedestä, kuiva-annoksesta pneumokokkiymppielatusaineen (YUF) komponenteja, hiivauuteultrafiltraatista, UC0N:stä ja dekstroosista (noin 25 g/litra), siirrostetaan 35 noin 50 litraa yhtä 2-12 tunnin ymppiviljelmää. Viljel- 52 1 0 7 3 7 0 mää inkuboidaan 37 °C ± 2 °C:een lämpötilassa kevyesti sekoittaen 6-30 tuntia riippuen siitä, mitä tyyppiä kasvatetaan. pH pidetään välillä 6,0 - 7,2 lisäämällä ajoittain natriumhydroksidiliuosta. Fermentaation jälkeen seu-5 raa absorbanssin määritys, ja fermentaatio lopetetaan kun dekstroosi on täysin hyödynnetty, minkä osoittaa se, ettei pH enää muutu.

Patogeeniset organismit tapetaan välittömästi sen jälkeen kun fermentaatio on lopetettu. Tämä saadaan aikaan 10 lisäämällä fenolia noin 1 % konsentraatioksi, ja tappamisen annetaan jatkua 2-12 tuntia huoneenlämpötilassa.

II) Epäpuhtaan Pn-Ps:n eristys:

Tapettuun viljelmään lisätään denaturoitua alkoholia riittävä määrä saostamaan soluroskat ja nukleiiniha-15 pot, jotka poistetaan sentrifugoinnilla. Epäpuhdas polysakkaridi saostetaan sitten supernatanttiliuoksesta lisäämällä lisää denaturoitua alkoholia. Kiinteät aineet kerätään sentrifugoimalla ja supernatanttiliuos heitetään pois.

20 Nukleiinihappokontaminaatiota vähennetään liuotta malla polysakkaridi neutraaliin vesiliuokseen, kuten 1 -5 % natriumasetaattiin tai 0,05 M fosfaattipuskuriin, johon lisätään nukleaasia ja noin 0,01 M magnesiumkloridia. Noin 60 - 120 minuutin kuluttua noin 36 °C:ssa pH sääde-25 tään noin arvoon 8,0 ja lisätään proteaasia, kuten tryp-siiniä, pilkkomaan proteiinia sisältävät kontaminantit.

Lisää epäpuhtauksia voidaan eliminoida seostamalla polysakkaridi uudestaan natriumasetaatissa denaturoidulla alkoholilla tai isopropanolilla, jota seuraa uudelleen- 30 liuottaminen tislattuun veteen. Setrimoniumbromidin li- “ sääminen noin 8 °C:ssa saostaa epäpuhtauksia, jotka pois- • · tetaan sentrifugoinnilla. Natriumasetaatin ja pienen määrän denaturoitua alkoholia tai isopropanolia lisäys mahdollistaa epäpuhtauksien poistamisen edelleen. Polysakka-35 ridi kerätään talteen lisäämällä vielä alkoholia ja sent- 53 1 0 7 3 7 0 rifugoimalla. Sakkaa pestään absoluuttisella etanolilla kunnes saadaan valkoinen jauhe. Polysakkaridi kerätään suodattamalla, pestään absoluuttisella etanolilla ja asetonilla ja kuivataan vakuumissa, tuloksena epäpuhdas Pn-Ps 5 j auheena.

Esimerkki 4

Osittain hydrolysoidun, puhdistetun Pn6B-Ps:n valmistus : (1) Lämpöhydrolyysi: 3,0 g erä epäpuhdasta Pn6N- 10 Ps-jauhetta liuotettiin 1200 ml:aan suolaliuosta (0,9 %

NaCl) sekoittaen huoneenlämpötilassa noin 4 tunnin ajan ja pidettiin 4 °C:ssa yli yön. Sitten liuosta hydrolysoitiin kylmäsormella varustetussa palautusjäähdytyslaitteistossa 100 °C:ssa 24 tunnin ajan ja jäähdytettiin huoneenlämpö-15 tilaan. Natriumasetaattireagenssi (59,7 g) lisättiin 3 %:n (w/v) loppukonsentraatioon asti.

(2) Serologinen testaus: Fraktiointipilottikoe iso-propanolilla (IPA) ja vasta-aineohjattu päätepisteen Nephelose-määritys, joka suoritettiin 10 ml erälle näytet- 20 tä, osoittivat, että Pn6B-Ps saostuisi 40 - 50 %:ssa IPA:a.

(3) Ensimmäinen IPA:n lisäys: Hydrolysoitu näyte (tilavuus 1210 ml, vaiheesta 1 yllä) saatettiin 43,5 % IPA-pitoisuuteen lisäämällä 932 ml IPA:aa (lisättiin ti- 25 poittain sekoittaen huoneenlämmössä). Näytteen annettiin sekoittua 15-30 minuuttia, ja sitten sitä sentrifugoi- tiin 11 000 x g:ssä 30 minuuttia (Beckman JA-10-roottori, 8 000 rpm, 20 °C). Jätesakkaa trituroitiin absoluuttisessa

Et0H:ssa 250 ml:n Omnimix-astiassa, sitten se kerättiin 30 60 ml:n lasisintterisuppiloon. Sakka pestiin suoraan sup- *’ pilossa absoluuttisella EtOH:lla, sitten asetonilla, ja • · kuivattiin in vacuo CaCl2:n yläpuolella huoneenlämpötilassa valmisteluna analyysiin.

(4) Toinen IPA:n lisäys ja tuotteen keräys: 43,5 % 35 IPA-supernatanttineste [tilavuus = 2020 ml, vaiheesta 3 107370 54 t yllä] saatettiin 46,0 % IPA-pitoisuuteen lisäämällä 93,5 ml lPA:aa tipoittain huoneenlämpötilassa sekoittaen. Näytteen annettiin seistä ja sentrifugoitiin kuten vaiheessa 3 yllä. Pohjasakka trituroitiin, kerättiin talteen, 5 pestiin ja kuivattiin kuten vaiheessa 3 yllä. Pn6B-Ps-tuo-te painoi 1 650 mg, ja sen Kd oli 0,62 ja fosforipitoisuus 3,3 %.

Esimerkki 5 S. pneumoniae 6B-OMPC -konjugaatti, Pn6B-Ps-0MPC: 10 A. Dowex 50x2 -tetrabutyyliammoniumhartsin valmis tus [Douex 50 (Bu4N+) 1:

Dowex 50x2 (200 - 400 mesh) H+-muoto (72 g) lietet-tiin veteen, ladattiin pylvääseen ja pestiin perätysten vedellä, 6 N HClrlla ja sitten vedellä kunnes effluentti 15 antoi neutraalin testituloksen pH-paperilla. Sitten pylvään läpi ajettiin 10 % tetrabutyyliammoniumhydroksidin vesiliuosta kunnes effluentti antoi vahvasti emäksisen tuloksen. Lopulta vettä ajettiin pylvään läpi kunnes effluentti antoi taas neutraalin testituloksen.

20 B. Pn6B(Bu4N*):

Pn6B-Ps (600 mg), joka oli kooltaan pienennetty ja fraktioitu (katso fysikaaliset ominaisuudet taulukosta I, Pn6B-Ps:n erä 1) liuotettiin steriiliin tislattuun veteen (60 ml) ja liuosta sekoitettiin magneettisekoittajalla • - · 25 kunnes kaikki kiinteät aineet liukenivat (1,5 tuntia).

Polysakkaridiliuos lisättiin huuhdeltuun hartsiin ja annettiin siivilöityä kerroksen läpi painovoimalla (4,5 tuntia). Pylväs pestiin vedellä (10 - 12 ml) ja yhdistetyt effluentit lyofilisoitiin, mikä tuotti 640 mg kuivaa 30 Pn6B-Ps:n tetra-n-butyyliammoniumsuolaa, Pn6B(n-Bu4N+).

C. Pn6B-BuA2:

Pn6B(n-Bu4N+) (640 mg) liuotettiin dimetyylisulfok-sidiin (DMSO) (24 ml) ja sekoitettiin magneettisekoittajalla 30 minuuttia, jossa vaiheessa kaikki kiinteät aineet 35 näyttivät liuenneen. Tähän seokseen lisättiin l,l'-karbo- » 107370 55 nyylidi-imidatsolia (44,2 mg) ja reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa (60 minuuttia). Erillisessä pullossa tehtiin emäksiseksi (pH 10,2) butaanidiamiinidihyd-rokloridin (BuA2 2HC1, 1,022 g) vesiliuos (16 ml) lisäämäl-5 lä 10 N NaOHria. Liuos suodatettiin 0,2 pm steriilisuodat-timen läpi ja jäähdytettiin jäähauteessa. Seisotettu DMSO-liuos, joka sisälsi aktivoidun polysakkaridin, lisättiin kylmään BuA2 2HCl-liuokseen hitaana tasaisena valutuksena, ja saatua liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa (15 minuuttia). 10 Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan, ja sitä sekoitettiin vielä tunnin ajan, jonka jälkeen se siirrettiin diälyysiletkuun ja dialysoitiin (4 °C) seuraa-via vastaan: 1) 15 1 0,1 M pH 7,0 natriumfosfaattipuskuria, 6 tuntia; 15 2) 15 1 0,01 M pH 7.0 natriumfosfaattipuskuria, 12 tuntia; 3) 15 1 0,01 M pH 7,0 natriumfosfaattipuskuria, 9 tuntia; 4) 15 1 tislattua H20:ta, 17,5 tuntia. Dialyysiletkun sisältö lyofilisoitiin, mikä tuotti 222 mg Pn6B-l,4-butaani-diamiinia (Pn6B-BuA2). NMR:ssä (300 MHz, D20) noin 5 mg:sta 20 tätä materiaalia paljastui 22 diamiinitähteen tulleen mukaan sataa Pn6B-Ps:n toistuvaa monomeeriyksikköä kohden, vertaamalla butaanidiamiinimetyleenien ja Pn6B-Ps:n ram-noosimetyyliprotonien resonanssien integraaleja. Pn6B-BuA2-BrAc: 25 Pn6B-BuA2 (210 mg) liuotettiin 0,1 M Kolthoffin bo- raatti-fosfaattipuskuriin (21 ml), pH 9,04, ja seosta sekoitettiin magneettisekoittajalla 30 minuuttia jotta se liukenisi. Tähän vesipohjaiseen liuokseen lisättiin seos, joka koostui p-nitrofenyylibromiasetaatista (210 mg) ase-30 tonitriilissä (2,6 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin yli yön (20 tuntia, 4 °C). Liuos siirrettiin dialyysiletkuun ja dialysoitiin (4 °C) seuraavia vastaan: 1) 15 1 steriiliä tislattua H20:ta, 12,3 tuntia; 2) 15 1 steriiliä tislattua H20:ta, 8,25 tuntia; 56 1 0 7 3 7 0 3) 15 1 steriiliä tislattua vettä, 5,5 tuntia. Pussin sisällöstä poistettiin 1,7 ml määrityksiä varten (NMR sekä HPSEC yleispätevällä kalibraatiolla eli molekyylikoon analysointi) ja sitten lisättiin 0,449 g kuivattua pH 8 fos-5 faattipuskurisuolaa (valmistettu lyofilisoimalla 0,1 M, pH 8 natriumfosfaattiliuos). Kun liukeneminen oli täydellistä (30 minuuttia), liuos suodatettiin 0,2 pm steriilisuodat-timen läpi, mikä tuotti Pn6B-BuA2-BrAc-liuoksen, pH 8.

Pn6B-0MPC

10 Steriili OMPC (40 ml, 4,5 mg/ml) ajettiin sakaksi ultrasentrifugoinnilla (4 °C, 43 000 rpm, 2 tuntia) neljässä 10 ml sentrifuugiputkessa. Kukin pelletti resuspen-doitiin 3 ml:aan steriilisuodatettua (0,22 pm) tiolointi-seosta, joka koostui seuraavista: N-asetyylihomokysteiini-15 tiolaktonihydrokloridi (164 mg), etyleenidiamiinitetra-etikkahapon dinatriumsuola (255 mg) ja ditiotreitoli (53 mg) pH:ssa 11,09, Na2B407-puskuri (30 ml). Resuspen-doidut sakat homogenisoitiin (Dounce), yhdistettiin, kaasu poistettiin astiasta, peitettiin typellä ja seisotettiin 20 yli yön (19 tuntia) huoneenlämpötilassa. Liuos jaettiin kolmeen ultrasentrifuugiputkeen, päälle pantiin 1 M KH2P04 ja proteiini ajettiin sakaksi (4 °C, 43 000 rpm, 2 tuntia). Sakat resuspendoitiin 0,1 M natriumfosfaattipus-kuriin, pH 8, (30 ml), homogenisoitiin (Dounce) ja ajet- - 25 tiin uudestaan sakaksi (4 °C, 43 000 rpm, 2 tuntia). Ste riiliä proteiinisakkaa käytettiin suodatettuun Pn6B-BuA2-BrAc-liuokseen resuspendoituna. Ellmanin koe tehtiin välittömästi, ja se osoitti SH-tiitteriksi 34 pmol. Reak-tioseoksesta poistettiin kaasut, se peitettiin typellä ja 30 seisotettiin 91 tunnin ajan huoneenlämpötilassa.

Proteiiniin liitettiin "cap"-rakenne lisäämällä 1 ml (0,22 pm steriilisuodatettua) liuosta, joka sisälsi seuraavat: N-etyylimaleimidi (75 mg) 5 ml:ssa 0,1 M natri-umfosfaattipuskuria, pH 8,0. Tätä seosta seisotettiin 4 35 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen lisättiin 57 1 0 7 3 7 0 300 μΐ N-asetyylikysteamiinia (0,22 pm steriilisuodatettu) ja liuosta seisotettiin vielä 19,5 tuntia.

Steriili konjugaatti, johon oli liitetty "cap"-rakenne, jaettiin neljään sentrifuugiputkeen, päälle lisät-5 tiin 0,1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 7, ja se ajettiin sakaksi ultrasentrifugoinnilla (4 °C, 43 000 rpm, 2 tuntia), sitten resuspendoitiin ja homogenisoitiin (Dounce) steriilissä 0,1 M NaP04-puskurissa (42 ml). Sen jälkeen kun oli sentrifugoitu uudestaan kuten aikaisemmin, sakat re-10 suspendoitiin Dounce-homogenisoijassa kaiken kaikkiaan 50 ml:aan steriiliä tislattua vettä. Sen jälkeen kun oli seisotettu 17 tuntia 4 °C:ssa, konjugaattivalmiste sentri-fugoitiin 1000 rpm:ssa 3,5 minuuttia TH 4 -roottorissa TJ-6 -sentrifuugissa, ja pieni määrä sedimentoitunutta 15 ainesta poistettiin. Lopulliselle tuotekonjugaattisuspen- siolle tehtiin proteiini- (Lowry), Pn6B-polysakkaridi-( fenoli/rikkihappo), konjugoi tuma ton polysakkaridi- (koko-ekskluusiokromatografia - nopeusnefelometria) ja aminohap-pomääritys (aminohappoanalyysi). Tulokset olivat seuraa-20 vat:

Pn6B-polysakkaridi 0,33 mg/ml

Proteiini 2,2 mg/ml

Pn6B-Ps/0MPC 0,15

Vapaa Pn6B-Ps < 5 pinta-ala-% • : 25 S-karboksimetyylihomokysteiini/lysiini 1,7 % S-karboksimetyylikysteamiini/lysiini 1,6 %

Esimerkki 6

Osittain hydrolysoidun, puhdistetun Pnl4-Ps:n valmistus: 30 (1) Käsittely anioninvaihtohartsilla: 2,81 gramman erä Pnl4-Ps-jauhetta liuotettiin 1124 ml:aan tislattua H20:ta sekoittaen huoneenlämpötilassa noin 4 tunnin ajan ja sitten varastoitiin 4 eC:seen yli yön. Liuos lisättiin 60 grammaan DE52:ta (Whatman, dietyyliaminoetyyliselluloosa), 35 jota oli esiturvotettu n. 15 tunnin ajan tislatussa vedes- „ 107370 58 sä pH:ssa n. 5 - 6. Lietettä ravisteltiin hellävaraisesti tasoravistelijassa huoneenlämpötilassa noin 15 tuntia, jonka jälkeen se sentrifugoitiin Beckman JA-10 -roottorissa 5 000 rpm:ssa, 15 minuutin ajan 20 °C:ssa. Supernatant-5 tiliuos selkeytettiin edelleen lasisintterisuppilon läpi (150 ml, keskitason huokoisuus) ja kerättiin 2 1 sivuput-kipulloon.

(2) Ultraäänihydrolyysi: DE52-käsitelty Pnl4-Ps (tilavuus 1100 ml, vaiheesta 1 yllä) sonikoitiin muovises- 10 sa dekantterilasissa jäähauteessa Branson Sonifier -laitteella (1,25 cm koetin, asetus 8) 2 minuutin ajan. Näytteen annettiin jäähtyä n. 15 minuuttia, sillä välin kun viskositeetti määritettiin, ja sitten sitä sonikoitiin vielä 1 minuutin jaksoja. Viimeisen ultraäänikäsittelyn 15 jälkeen saavutettiin viskositeettiloppupiste 1,096 sent-tistokea. Hydrolysoitu näyte tuotiin huoneenlämpötilaan, ja natriumasetaattireagenssia (18,0 g) lisättiin niin, että loppukonsentraatio oli 1 % (w/v).

(3) Serologinen testaus: Isopropanoli (IPA) frak-20 tiointipilottikoe ja vasta-aineohjattu päätepisteen Nephe- lose-määritys, joka suoritettiin 10 ml erälle näytettä, osoitti että Pnl4-Ps saostuisi 35 - 45 %:ssa IPA:aa.

(4) Ensimmäinen IPA:n lisäys: Hydrolysoitu näyte (tilavuus 1090 ml, vaiheesta 2 yllä) saatettiin 39,3 % 25 IPA-pitoisuuteen lisäämällä 706 ml IPA:aa (lisättiin tipoittain sekoittaen huoneenlämmössä). Näytteen annettiin sekoittua 15 - 30 minuuttia, ja sitten sitä sentrifugoitiin 11 000 x g:ssä 30 minuuttia (Beckman JA-10-roottori, 8 000 rpm, 20 °C). Jätesakkaa trituroitiin absoluuttisessa 30 Et0H:ssa 250 ml:n Omnimix-astiassa, sitten se kerättiin .. 60 ml:n lasisintterisuppiloon. Sakka pestiin suoraan sup pilossa absoluuttisella EtOH:lla, sitten asetonilla ja kuivattiin in vacuo CaCl2:n yläpuolella huoneenlämpötilassa valmisteluna analyysiin.

107370 59 (5) Toinen IPA:n lisäys ja tuotteen keräys: 39,3 % IPA-supernatanttineste [tilavuus 1712 ml, vaiheesta 4 yllä] saatettiin 41,8 % IPA-pitoisuuteen lisäämällä 73,5 ml IPA:a tipoittain samalla sekoittaen huo-5 neenlämpötilassa. Näytettä seisotettiin ja sentrifugoitiin kuten vaiheessa 4 yllä. Sakka trituroitiin, kerättiin talteen, pestiin ja kuivattiin kuten vaiheessa 4 yllä. Pnl4-Ps-tuote painoi 1 399 mg.

(6) Dialysointi ja lyofilisointi: Osa (1 385,6 mg) 10 näytettä vaiheesta 5 yllä liuotettiin 554 ml:aan tislattua H20:ta huoneenlämpötilassa 2-3 tunnin ajan. Liuos (2,5 mg/ml) siirrettiin dialyysiletkuun (12 000 MW alaraja; 45 mm) ja dialysoitiin tislattua H20:ta vastaan 27 tuntia vaihtaen tislattu H20 vielä kahdesti. Sitten dialy-15 soitu näyte siirrettiin lyofilisointipulloihin, jäädytet tiin pullon sisäpintaan kuivajää-metanolihauteessa ja lyo-filisoitiin Virtis (Freezemobile) -lyofilisoijassa 2-1/2 päivän ajan kunnes se oli kuiva. Lopullisen Pnl4-Ps-tuot-teen saalis oli 1326,8 mg, jolla Kd oli 0,56.

20 Tämän paljastuksen perusteella pitäisi olla ilmeistä ammattimiehille, että muita neutraaleja Pn-Ps-ala- tyyppejä, kuten Pn7F-Ps, voitaisiin valmistaa tässä paljastetun menetelmän mukaisesti, ja konjugoida kuten Pnl4-Ps:n tapauksessa, joka on myös neutraali polysakka-25 ridi.

Esimerkki 7

Ulkomembraaniproteiinikompleksin konjugaatio pneumokokki 14 -polysakkaridiin, Pnl4-Ps-0MPC: a. Pnl4-Ps:n 1,4-butaanidiamiinijohdannaisen (14-30 BuA2) valmistus: 410 mg osa Pnl4-Ps:ia, sen jälkeen kun sitä oli varastoitu in vacuo P205:n yläpuolella 3 tuntia, peitettiin 26 ml:11a dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja sekoitettiin 0,75 tuntia jotta se saataisiin liukenemaan. Tähän lisättiin 107370 60 62 mg karbonyylidi-imidatsolia ja tuloksena olevaa liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 80 minuutin ajan.

Valmistettiin liuos, joka sisälsi 1,067 g 1,4-bu-taanidiamiinidihydrokloridia (BuA2 2HC1) 38,5 ml:ssa H20:ta 5 ja sen pH säädettiin arvoon 10,20 2,5 N NaOHrlla. Tämä liuos suodatettiin Millex 0,2 μπι GV-suodattimen läpi ja jäähdytettiin jäähauteella.

Seisotettu DMSO-liuos lisättiin kylmään BuA2-liuok-seen ja sekoitettiin vielä 10 minuuttia jäähauteella. Sitä 10 seisotettiin sitten huoneenlämpötilassa 50 minuuttia, jonka jälkeen liuos ladattiin kahteen 30 cm pitkään Spectra-por 2 -dialyysiletkuun, jotka katkaistiin nesteen yläpinnasta laskien 1 cm päästä, ja dialysoitiin seuraavia vastaan: 15 1) 15 1 0,1 M pH 7,0 natriumfosfaattipuskuria, 16,5 tun tia; 2) 15 1 0,1 M pH 7.0 natriumfosfaattipuskuria, 8 tuntia; 3) 15 1 0,1 M pH 7,0 natriumfosfaattipuskuria, 8 tuntia; 4) 15 1 H20:ta, 17,5 tuntia. Sitten se lyofilisoitiin, tu-20 loksena 210 mg Pnl4-Ps:n 1,4-butaanidiamiinijohdannaista (Pnl4-BuA2). NMR-spektri noin 5 mgrsta tätä materiaalia paljasti 31 diamiinitähteen tulleen mukaan sataa toistuvaa polysakkaridiyksikköä kohden, mikä määriteltiin vertaamalla butaanidiamiinimetyleenien ja (Pnl4-Ps:n) N-ase-; 25 tyylimetyylin resonanssien integraaleja.

b. Pnl4-Ps:n bromiasetyloidun butaanidiamiinijohdannaisen (Pnl4-BuA2-BrAc) valmistus:

Pnl4-BuA2 (210 mg) peitettiin 36 ml:11a 0,1 M bo-raatti-fosfaattipuskuria, pH 9,0, ja sekoitettiin 2,5 tun-30 nin ajan jotta se saataisiin liukenemaan. Sitten lisättiin .. 195 mg p-nitrofenyylibromiasetaattia 4 ml:ssa asetonitrii- liä. Tuloksena olevaa seosta sekoitettiin 21 tuntia 4 °C:ssa. Sitä dialysoitiin sitten Spectrapor 2 -letkussa seuraavia vastaan: 61 107370 1) 15 1 tislattua H20:ta, 6 tuntia; 2) 15 1 tislattua H20:ta, 14,5 tuntia ja 3) 15 1 H20, 6 tuntia. Letkun dialysoidusta sisällöstä poistettiin 2,0 ml määrityksiä varten, ja sitten lisättiin 492 mg kui- 5 vattua fosfaattipuskurisuolaa, pH 8,0 (valmistettu lyofi-lisoimalla 0,1 M natriumfosfaattiliuos, pH 8,0). Liuos suodatettiin kahden 0,2 pm Corning-suodattimen läpi, tuloksena Pnl4-BuA2-BrAc-vesiliuos, pH 8,0 (43 ml).

c. 0MPC:n konjugointi Pnl4-BuA2-BrAc-Ps:iin: 10 Viisikymmentä ml OMPCria (konsentraatio 3,2 mg/ml) ladattiin viiteen 10 ml:n sentrifuugiputkeen ja sentrifu-goitiin Beckman 80 Ti -roottorissa 43 000 rpm:ssa 4 °C:ssa 2 tuntia. Tiolointiseos valmistettiin liuottamalla 350 mg EDTA:ta (etyleenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuola) 15 ja 64 mg ditiotreitolia (DTT) 30 ml:aan Na2B407-puskuria, pH 11,0. Lisättiin 346 mg N-asetyylihomokysteiinitiolakto-nia, ja liuos suodatettiin 0,2 pm Corning-suodattimen läpi (kuppityyppi).

Yllä olevasta sentrifugaatiosta saadut sakat ir-20 rotettiin kukin 3 ml:aan suodatettua tiolointiseosta (15 ml yhteensä), siirrettiin Dounce-homogenisoijaan ja resuspendoitiin. Putket huuhdeltiin siirtämällä kaikkien läpi vielä 5 ml tiolointiliuosta. Huuhtelumenetelmä toistettiin vielä 5 ml:11a tiolointiliuosta. Yhdistetyt huuh-25 teluliuokset homogenisoitiin Douncessa ja kaikki resuspen-doitu materiaali (25 ml) siirrettiin 100 ml:n pyöreäpoh-jaiseen pulloon.

Sen jälkeen kun se oli suljettu septumilla, ja ilma oli korvattu N2:lla Firestone-venttiiliä käyttäen, reak-30 tioseosta seisotettiin 21 tuntia. Sitten 25 ml reaktioseos jaettiin kolmeen sentrifuugiputkeen, joiden kunkin pinnalle pantiin 1 M KH2P04 (vesiliuos) ja sitten sentrifugoi-tiin 2 tunnin ajan 43 000 rpm:ssa ja 4 °C:ssa. Super-natanttiliuokset poistettiin ja sakat resuspendoitiin „ 107370 62 0,1 M natriumfosfaattipuskuriin, pH 8,0 (lopullinen resus-pensiotilavuus oli yhteensä 30 ml).

Sitten suoritettiin toinen ultrasentrifugointi (2 tuntia, 4 °C, 43 000 rpm). Sen jälkeen kun supernatant-5 tineste oli poistettu, pohjasakat resuspendoitiin Dounce-menetelmällä yllä valmistetussa suodatetussa Pnl4-BuA2-BrAc-liuoksessa. Tässä vaiheessa suoritettu Ellmanin määritys osoitti, että tiolia oli yhteensä noin 23 pmoolia.

Pitäisi panna merkille, että Pnl4-BuA2-BrAc-liuoksen 10 suodatus tapahtuu j uuri ennen kuin tioloitu proteiini re-suspendoidaan. Tuloksena olevaa reaktiota (ts. Pnl4-BuA2-BrAc tioloidun OMPCrn kanssa) seisotettiin N2:n alla (kaa-sunpoistolla) N2-laatikossa huoneenlämpötilassa 114 tunnin ajan.

15 Reaktioon lisättiin sitten "cap"-ryhmät (ts. Pnl4-

Ps:n ja OMPC:n reaktiiviset ryhmät deaktivoidaan) seuraavasti: Lisättiin liuos, joka sisälsi 75 mg N-etyylimale-imidia (NEM) 5 ml:ssa 0,1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 8,0, ja seosta seisotettiin vielä 22,5 tuntia. Reaktio-20 seos, johon oli lisätty "cap"-ryhmät, (35 ml) jaettiin neljään sentrifuugiputkeen ja sentrifugoitiin (43 000 rpm, 2 tuntia, 4 °C). Sakat resuspendoitiin 40 ml:aan TED-pus-kuria (0,1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,5 % DOC, pH 8,5) ja seisotettiin huoneenlämpötilassa 19 tunnin ajan. Sitten liuos 25 sentrifugoitiin (43 000 rpm, 2 tuntia, 4 °C). Sakat resus- > · · pendoitiin 40 ml:aan 0,1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 8, ja sitten sentrifugoitiin uudestaan (43 000 rpm, 2 tuntia, 4 °C). Nämä sakat resuspendoitiin 44 ml:aan H20:ta ja seisotettiin 4 °C:ssa 17 tunnin ajan. Pienellä nopeudella 30 suoritettu sentrifugointi (1 000 rpm, 3,5 minuuttia) tuot-;· ti pienen sakan, joka heitettiin pois. Supernatanttineste poistettiin, mistä oli tuloksena 43 ml konjugaattia suuressa erässä, jolla oli seuraavat ominaisuudet analyyseissä: 107370 63

Testi Tulokset a. Ps-pitoisuus 3,87 mg/ml b. Proteiinia 13 mg/ml

Ps/proteiini -suhde (laskettu) 0,30 5 c. Vapaa Ps <5 pinta-ala-% d. Aminohappoanalyysi SCMHC/lysiini 9,8 % SCMC/lysiini 3,5 %

Esimerkki 8 10 Pn23F-Ps -välituotteen valmistus: (1) Ultraäänihydrolyysi: 3,0 g erä Pn23F-Ps-jauhetta liuotettiin 1200 ml:aan suolaliuosta (0,9 % NaCl) sekoittaen huoneenlämpötilassa noin 4 tunnin ajan. Sitten liuosta sonikoitiin muovisessa dekantterilasissa jäähau- 15 teessä Branson Sonifier -laitteella (1,25 cm koetin, asetus 8) 3 minuutin jaksoina yhteensä 15 minuuttia. Viskositeetti tarkastettiin kunkin jakson jälkeen. 15 minuutin kuluttua suoritettiin vielä 5 minuutin sonikointi, jolloin saavutettiin viskositeettiloppupiste 1,206 sent- 20 tistokea. Hydrolysoitu näyte tuotiin huoneenlämpötilaan, ja natriumasetaattireagenssia (58,4 g) lisättiin niin, että loppukonsentraatio oli 3 % (w/v).

(2) Serologinen testaus: Isopropanoli (IPA) frak-tiointipilottikoe ja vasta-aineohjattu päätepisteen Nephe- 25 lose-määritys, joka suoritettiin 10 ml erälle näytettä, osoitti että Pn23F-Ps saostuisi 35 - 45 %:ssa IPA:a.

(3) Ensimmäinen IPA:n lisäys: Hydrolysoitu näyte (tilavuus = 1165 ml, vaiheesta 1 yllä) saatettiin 41,0 % IPA-pitoisuuteen lisäämällä 810 ml IPA:aa (lisättiin 30 tipoittain sekoittaen huoneenlämmössä). Näytteen annettiin sekoittua 15 - 30 minuuttia ja sitä sentrifugoitiin sitten 11 000 x g:ssä 30 minuuttia (Beckman JA-10-roottori, 8 000 rpm, 20 °C). Jätesakkaa trituroitiin absoluuttisessa EtOH:ssa 250 ml:n Omnimix-astiässä, sitten se kerättiin 35 60 ml:n lasisintterisuppiloon. Sakka pestiin suoraan sup- 107370 64 pilossa absoluuttisella EtOHrlla, sitten asetonilla ja kuivattiin in vacuo CaCl2:n yläpuolella huoneenlämpötilassa valmisteluna analyysiin.

(4) Toinen IPA:n lisäys ja tuotteen keräys: 5 41,0 % IPA-supernatanttineste [tilavuus = 1925 ml, vaiheesta 3 yllä] saatettiin 43,5 % IPA-pitoisuuteen lisäämällä 85,0 ml IPA:a tipoittain samalla sekoittaen huoneenlämpötilassa. Näytettä seisotettiin ja sentrifugoitiin kuten vaiheessa 3 yllä. Sakka trituroitiin, kerättiin tal-10 teen, pestiin ja kuivattiin kuten vaiheessa 3 yllä. Pn23F-Ps-tuote painoi 1 795 mg.

(5) Dialysointi ja lyofilisointi: Osa (1 779 mg) Pn-Ps-näytettä vaiheesta 4 yllä liuotettiin 712 ml:aan tislattua H20:ta huoneenlämpötilassa 3-4 tunnin ajan.

15 Liuos (2,5 mg/ml) siirrettiin dialyysiletkuun (12 000 MW alaraja; 45 mm) ja dialysoitiin tislattua HzO:ta vastaan 27 tuntia vaihtaen tislattu H20 vielä kahdesti. Sitten näyte siirrettiin lyofilisointipulloihin, jäädytettiin pullon sisäpintaan kuivajää-metanolihauteessa ja lyofilisoitiin 20 Virtis (Freezemobile) lyofilisoijassa 2-3 päivän ajan. Lopullisen Ps-tuotteen saalis oli 1 703 mg. Lopullisella tuotteella oli Kd = 0,60.

Esimerkki 9

Ulkomembraaniproteiinikompleksin konjugointi Pn23F-25 Ps-välituotteen kanssa: a. Dowex 50X2-tetrabutyyliammoniumhartsin valmistus [Dowex 50 (Bu4N+)]:

Dowex 50X2 (200 - 400 mesh) H+-muoto (72 g) lietet-tiin H20:hon (kaikissa näissä menetelmissä käytetty vesi 30 oli pyrogeenivapaata, steriiliä, tislattua vettä), ladattiin pylvääseen ja pestiin perätysten 1) 800 ml :11a H20:ta; 2) 400 ml :11a 6 N HCl:ia; 3) 300 ml:11a H20:ta kunnes effluentti antaa neutraalin testituloksen pH-paperilla; M 107370 bo 4) 250 g:lla 10 % tetrabutyyliammoniumhydroksidin vesiliuosta, kunnes effluentti on vahvasti emäksinen pH-paperin mukaan; 5) 750 ml:lla H20:ta.

5 b. Pn23F-Ps:n tetrabutyyliammoniummuodon [Pn23F- ( Bu4N+ ) ] valmistus; 34 ml pylväs Dowex 50X2:ta (Bu4N+) pestiin 70 ml:11a HzO:ta. 450 mg erä kokoeroteltua Pn23F-Ps:ia peitettiin 50 ml:11a H20:ta ja sekoitettiin (0,5 tuntia). Tämä liuos 10 pantiin pylvääseen ja annettiin painua kerroksen läpi painovoimalla (n. 2 tuntia). Tässä vaiheessa alipaine kytkettiin pylvään pohjaan, ja eluutiota (alipaineessa) jatkettiin vielä tunti. Pylväs pestiin 25 ml:11a vettä ja yhdistetyt effluentit lyofilisoitiin, mikä tuotti 0,5 g Pn23F:n 15 (Bu4N+)-suolaa. Tämä varastoitiin vakuumieksikaattoriin P205:n päälle n. 17 tunniksi.

c. Pn23F-Ps:n 1,4-butaanidiamiinijohdannaisen (Pn23F-BuA2) valmistus: 0,5 g Pn23F-(Bu4N*):a vaiheesta b yllä peitettiin 20 25 ml:11a dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja sekoitettiin 15 minuuttia jotta se saataisiin liukenemaan. Tähän lisättiin 22 mg karbonyylidi-imidatsolia (CDI) ja tuloksena olevaa liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 0,5 tuntia.

Valmistettiin liuos, joka sisälsi 507 mg 1,4-butaa-25 nidiamiinidihydrokloridia (BuA2 2HC1) 32 ml:ssa H20:ta ja sen pH säädettiin arvoon 10,23 2,5 N NaOH:lla. Tämä liuos suodatettiin Millex 0,2 pm GV-suodattimen läpi ja jäähdytettiin jäähauteella.

Seisotettu DMSO-liuos lisättiin kylmään BuA2-liu-30 okseen ja sekoitettiin jäähauteella 1 tunnin ajan. Sitten ·· sitä seisotettiin huoneenlämpötilassa 1 tunti, jonka jäl keen liuos ladattiin 5 x 30 cm Spectrapor-dialyysiletkuun, jotka katkaistiin nesteen yläpinnasta laskien 1 cm päästä, ja dialysoitiin seuraavia vastaan: 66 1 0 7 3 7 0 1) 15 1 0,1 M pH 7,0 natriumfosfaattipuskuria, 16 tuntia; 2) 15 1 0,01 M pH 7.0 natriumfosfaattipuskuria, 10,5 tuntia; 3) 15 1 0,01 M pH 7,0 natriumfosfaattipuskuria, 12,5 tun- 5 tia; 4) 15 1 H20:ta, 10,5 tuntia. Sitten se lyofilisoitiin, mikä tuotti 220 mg Pn23F Pstn 1,4-butaanidiamiinijohdannaista (Pn23F-BuA2).

NMR-spektri noin 6,9 mg:sta tätä materiaalia pallo jasti 23,56 butaanidiamiinitähteen tulleen mukaan sataa toistuvaa polysakkaridiyksikköä kohden, mikä määritettiin vertaamalla butaanidiamiinimetyleenien ja (Pn23F:n) ram-noosimetyylin resonanssien integraaleja.

d. Pn23F-Ps:n bromiasetyloidun butaanidiamiinijoh- 15 dannaisen (Pn23F-BuA2-BrAc) valmistus:

Pn23F-BuA2 (214 mg) peitettiin 23 mlilla 0,1 M bo-raatti-fosfaattipuskuria, pH 9,0, ja sekoitettiin 30 minuutin ajan jotta se saataisiin liukenemaan. Sitten lisättiin 230 mg p-nitrofenyylibromiasetaattia 6 mlrssa aseto-20 nitriiliä. Tuloksena olevaa seosta sekoitettiin 23 tuntia 4 °C:ssa. Sitä dialysoitiin sitten Spectrapor 2 -letkussa seuraavia vastaan: 1) 15 1 H20:ta, 8 tuntia; 2) 15 1 H20:ta, 12 tuntia ja 3) 15 1 H20:ta, 6 tuntia. Pussin dia-lysoidusta sisällöstä poistettiin 1,5 ml määrityksiä var-25 ten, ja sitten lisättiin 490 mg kuivattua fosfaattipus- • · kurisuolaa, pH 8,0 (valmistettu lyofilisoimalla 0,1 M nat-riumfosfaattiliuos, pH 8,0). Liukeneminen vaatii noin 15 minuuttia, jonka jälkeen se suodatetaan 0,2 pm Corning-suodattimen läpi, mikä tuottaa Pn23F-BuA2-BrAc-vesiliuok-30 sen, pH 8,0.

e. 0MPC:n konjugointi Pn23F-BuA2-BrAc-Ps: iin: ’ 60 ml 0MPC:ia (3,1 mg/ml) ladattiin kuuteen 10 ml:n sentrifuugiputkeen ja sentrifugoitiin Beckman 80 Ti-root-torissa 43 000 rpm:ssa 4 °C:ssa 2 tuntia. Tiolointiseos 35 valmistettiin liuottamalla 260 mg EDTA:aa (etyleenidi- 67 1 0 7 3 7 0 amiinitetraetikkahapon dinatriumsuola) ja 52 mg ditiotrei-tolia (DTT) 30 ml:aan Na2B407:ia tiolaktoni lisättiin ja liuos suodatettiin 0,2 ym Corning-suodattimen läpi (kuppi-tyyppi ).

5 Yllä olevasta sentrifugaatiosta saadut sakat ir rotettiin kukin 3 ml:aan suodatettua tiolointiseosta (20 ml yhteensä), siirrettiin Dounce-homogenisoijaan ja resuspendoitiin. Putket huuhdeltiin siirtämällä kaikkien läpi vielä 6 ml tiolointiliuosta. Huuhtelumenetelmä tois-10 tettiin vielä 4 ml:11a tiolointiliuosta. Yhdistetyt huuh-teluliuokset homogenisoitiin Douncessa ja kaikki resuspen-doitu materiaali (28 ml) siirrettiin 100 ml:n pyöreäpoh-jaiseen pulloon.

Sen jälkeen kun se oli suljettu septumilla, ja ilma 15 oli korvattu N2:lla Firestone-venttiiliä käyttäen, reaktio-seosta seisotettiin 19 tuntia. 28 ml reaktioseos jaettiin sitten kolmeen sentrifuugiputkeen, joiden kunkin pintaan pantiin 1 M KH2P04 (vesiliuos) ja sitten sentrifugoitiin 2 tunnin ajan 43 000 rpm:ssa ja 4 °C:ssa Beckman 80 Ti-20 roottorissa. Supernatanttiliuokset poistettiin ja sakat resuspendoitiin 0,1 M natriumfosfaattipuskuriin, pH 8,0 (lopullinen resuspensiotilavuus oli yhteensä 30 ml).

Sitten suoritettiin toinen ultrasentrifugointi (2 tuntia, 4 °C, 43 000 rpm). Sen jälkeen kun super- 25 natanttineste oli poistettu, sakat resuspendoitiin Douncen menetelmällä osassa 7.I.C.3d valmistetussa suodatetussa Pn23F-BuA2-Br Ac-liuoksessa. Tässä vaiheessa suoritettu Ellmanin määritys osoitti, että tiolia oli yhteensä noin 28 ymoolia tuloksena olevassa liuoksessa.

30 Pitäisi panna merkille, että Pn23F-BuA2-BrAc-liuok- • ·· sen suodatus tapahtuu juuri ennen kuin tioloitu proteiini « resuspendoidaan. Tuloksena olevaa reaktiota (ts. Pn23F-BuA2-BrAc tioloidun OMPC:n kanssa) seisotettiin N2:n alla (kaasunpoistolla) N2-laatikossa huoneenlämpötilassa 117 35 tunnin ajan.

68 1 0 7 3 7 0

Reaktioon lisättiin sitten "cap”-ryhmät (ts. Pn23F--Ps:n ja OMPCrn reaktiiviset ryhmät deaktivoidaan) seuraavasti: Liuos, joka sisälsi 75 mg N-etyylimaleimidia (NEM) 5 ml:ssa 0,1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 8,0, 5 suodatettiin 0,22 pm:n suodattimen läpi, ja seosta seisotettiin 18 tuntia.

Reaktioseoksen, johon oli lisätty "cap"-ryhmät, kokonaistilavuus oli 38,5 ml ja 1,5 ml 0,1 M natriumfos-faattipuskuria, pH 8,0, lisättiin jotta totaalitilavuus 10 saataisiin 40 ml:ksi. 35 ml tätä liuosta jaettiin tasan neljään 10 ml:n sentrifuugiputkeen, joiden kunkin päälle lisättiin 0,1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 8,0. Nämä sentrifugoitiin 43 000 rpm:ssa, 2 tuntia, 4 °C:ssa. Super-natanttinesteet poistettiin ja kukin sakka irrotettiin 15 8 ml:aan TED-puskuria (1 M Tris, pH 8,5, 0,01 M EDTA, 0,5 % Na-deoksikolaatti) ja siirrettiin Dounce-homogenisoi jaan. Sentrifuugiputket huuhdeltiin perättäin vielä 8 ml:11a TED-puskuria ja sakat resuspendoitiin (yhteensä 40 ml) ja seisotettiin huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan. 20 Seisotettu materiaali sentrifugoitiin (kuten yllä on kuvattu) neljässä 10 ml putkessa 43 000 rpm:ssa, 2 tuntia, 4 °C:ssa. Kukin sakka irrotettiin 8 ml:11a TED-puskuria, putket huuhdeltiin perättäin 8 ml:11a TED-puskuria, resuspendoitiin ja sentrifugoitiin kuten yllä on kuvattu. Nämä 25 sakat resuspendoitiin sitten yhteensä 40 ml:aan 0,1 M natriumfosf aattipuskuria, pH 7, ja sentrifugoitiin uudelleen kuten yllä on kuvattu. Sakat resuspendoitiin kaikkiaan 44 ml:aan vettä ja seisotettiin 4 °C:ssa 17 tunnin ajan. Pieni määrä liukenemattomia aineita poistettiin sentrifu-30 goimalla pienellä nopeudella (1000 rpm, 3,5 minuuttia), ·· jonka tuloksena oli tuote supernatanttinesteessä.

Tuloksena oleva supernatanttineste on lääkeaine, konjugaattirokotteen suuri erä. Konjugaatilla oli seuraa-vat analyyttiset ominaisuudet analyyseissä: 107370 69

Testi Tulokset a. Ps-pitoisuus 2,84 mg/ml b. Proteiinia 20,25 mg/ml

Ps/proteiini -suhde (laskettu) 0,14 5 c. Vapaa Ps <5 pinta-ala- % d. Aminohappoanalyysi SCMHC/lysiini 6,7 % SCMC/lysiini 1,6 % 10 Esimerkki 10

Pn-Ps:n valmistus Gaulinin homogenisaatiolla: Epäpuhdas pneumokokkijauhe liuotettiin veteen kon-sentraatioksi 1,5 mg/ml sekoittamalla yli yön 4 eC:ssa. Valmistettiin myös konsentroidumpi Pn-Ps-liuos (10 mg/ml). 15 50 mM CaCl2:n lisäys onnistui vähentämään 10 mg/ml liuoksen viskositeettia 1,5 mg/ml liuoksen viskositeettiin. Liuotettu Pn-Ps vietiin sitten Gaulinin homogenisaattorin läpi yhdellä neljästä paineasetuksesta: 13 800, 34 500, 69 000 tai 103 500 kPa. Rikottu Pn-Ps kerättiin sitten lisäämällä 20 60 % isopropanolia, joka oli tehty 50 mM CaCl2:n suhteen 2 M kantaliuoksesta. Sakka pestiin 100 % etanolissa omni-sekoittajassa ja suodatettiin, jotta saataisiin talteen saostunut Pn-Ps. Pn-Ps pestään suodattimena asetonilla ja sitten kuivataan CaS04:n yläpuolella (drieriitti) ja varas-25 toidaan -70 °C:seen kunnes se analysoidaan. Eriä rikotusta • · ·

Pn-Ps:sta resuspendoidaan noin 1 mg/ml pitoisuuteen ja niiden molekyylikoko ja polydispergoitumisaste analysoidaan HPSEC universaalilla kalibraatiolla ja antigeenisuus-indeksi analysoidaan nopeusnefelometrialla: 30

Pn-Ps-alatyyppi MW, jossa antigeeni- Polydisper- * ' suus alkaa laskea goitumisaste 6 B 500 000 1,19 14 300 000 1,15 35 19F 250 000 1,09 23F 250 000 1,15 70 10737Γ

Esimerkki 11

Hiiren T-solujen stimulaatio: Tämä testi suoritettiin, jotta saataisiin osoitettua Pn-Ps-konjugaattirokotteiden T-soluriippuvuus/immuno-5 geenisuus hiirissä. Tämä malli otettiin käyttöön, koska alle kaksi vuotta vanhat lapset respondoivat normaalisti hyvin T-riippuvaisille antigeeneille. Kateenkorvattomilla hiirillä on epänormaali kateenkorvan epiteeli ja näin ollen niiden responssi T-riippuvaisille antigeeneille on 10 merkittävästi vähäisempi kuin niiden normaalien samaan sukuun kuuluvien poikuekumppanien.

Yksittäinen rokotelaimennos, jolloin annettiin 0,5 pg:n polysakkaridiannos, injektoitiin vatsakalvon sisäisesti aikuisiin kateenkorvattomiin hiiriin (nu/nu) ja 15 niiden samaan sukuun kuuluvien kontrollipoikuekumppaneihin (nu/+) päivinä 0, 7 ja 28. Hiiristä otettiin verta viikkoa myöhemmin ja niiden yksilöllisistä seerumeista testattiin vasta-aineresponssi radioimmunomäärityksellä (RIA).

RIArssa kukin hiiren seerumi yhdistettiin C14-leima-20 tun Pn-Ps:n kanssa. Mikä tahansa antigeeni-vasta-aine -kompleksi, joka muodostui, seostettiin sitten lisäämällä kyllästettyä ammoniumsulfaattia. Kukin käsitelty näyte laskettiin betalaskurissa yhden minuutin ajan. Tämän keksinnön Pn6B-Ps-0MPC, Pnl4-Ps-0MPC, Pnl9F-Ps-0MPC, Pn23F-25 Ps-OMPC, Pnl8C-Ps- ja Pn4-Ps-konjugaatit testattiin tällä • · tavalla ja niiden havaittiin saavan aikaan hyvän T-solu-stimulaation Nu/+ -hiirissä.

Esimerkki 12

Pn-Ps-konjugaattien immunogeenisuus imeväisikäi-30 sillä resusapinoilla: ·;· Tämä testi suoritetaan joko suuresta erästä otetun konjugaatin tai Pn-Ps-OMPCtn tai Pn-Ps-MIEP-konjugaatti-rokotteen täytettyjen astioiden immunogeenisuuden selvittämiseksi imeväisikäisillä apinoilla. Imeväisikäisiä 35 apinoita käyttävän mallin on osoitettu olevan erinomainen 7i 107370 kliininen ennustemalli PedvaxHIB™ -konjugaattirokotteelle [Vella ym., Pediatrics, 5. huhtikuuta Suppl., s. 668-675 (1990)] ja se valittiin näin ollen malliksi Pn-Ps-konju-gaattirokotteen tarkkailuun.

5 Annos rokotetta injektoidaan lihaksensisäisesti (0,25 ml molempiin kohtiin) 2-3 kuukautta vanhoihin imeväisikäisiin apinoihin päivänä 0 ja 28. Apinoista otetaan verta päivänä 0, 28 ja päivänä 42 ja yksilöiden seerumeista testataan vasta-aine-responssi radioimmunomäärityksellä 10 (RIA).

RIArssa kukin apinan seerumi yhdistetään (^-leimattuun Pn-Ps:iin. Kukin muodostunut antigeeni-vasta-aine -kompleksi seostetaan sitten lisäämällä kyllästettyä am-moniumsulfaattia. Kukin käsitelty näyte lasketaan beta-15 laskurissa yhden minuutin ajan. Immunogeeninen responssi rokotteelle on tyydyttävä, jos ainakin 50 %:lla koe-eläi-mistä on ainakin 1 pg:n vasta-aineresponssi sen jälkeen kun ne ovat saaneet kaksi annosta rokotetta.

Pn6B-Ps-0MPC:n, Pn23F-Ps-OMPC:n, Pnl9F-Ps-0MPC:n, 20 Pnl8C-Ps-0MPC:n, Pn4-Ps-0MPC:n ja Pnl4-Ps-0MPC:n on osoi tettu saavan aikaan vahvoja tyyppispesifisiä vasta-aine-responsseja. Lisäksi tetravalentti koostumus, joka koostui Pn6B-Ps-0MPC:sta, Pn23F-Ps-0MPC:sta, Pnl9F-Ps-0MPC:sta ja Pnl4-Ps-0MPC: sta osoitti hyviä Pn-Ps-vasta-aineresponsseja 25 kaikille neljälle serotyypille.

• · ·

Esimerkki 13

Pneumokokkikonjugaattien suojausteho chinchillois- sa:

Kuhunkin chinchillaan injektoitiin ihonalaisesti 30 tai lihaksensisäisesti 0, 0,25, 1,0 tai 4,0 pg: Pn6B-Ps-OMPCrta joka oli adsorboitu Al(0H)3:iin. Chinchilloista otettiin verinäytteet 0, 2, 4, 6 ja 8 viikon kuluttua.

Eläimet altistettiin Streptococcus pneumoniae 6B:lla kahdeksan viikkoa injektion jälkeen ja tarkkailtiin joka 1-3 35 päivä otoskopialla ja tärykalvonmittauksella. Välikorvan 72 107370 nestepurkaumaa imettiin viljeltäväksi ja eläimet uhrattiin kaksi viikkoa altistuksen jälkeen. Uhratuista eläimistä analysoitiin keskikorvan histopatologia. Eläimillä, jotka eivät olleet saaneet konjugaattia, kuolleisuus oli 5 60 %, samalla kun pieninkin annos johti 0 % kuolleisuu teen. Niillä eläimillä, jotka eivät saaneet konjugaattia, ei ollut suojaa märkivää välikorvantulehdusta vastaan, kun taas ne jotka saivat konjugaattia, oli suojattu tasoilla 60 - 100 % kaikilla annostuksilla.

10 Esimerkki 14

Immuunivasteet pneumokokkeja vastaan 2-5 vuotta vanhoilla lapsilla: 2-5 vuotta vanhat lapset, jotka olivat kukin saaneet kaksi annosta (0,5 tai 5 pg) Pn6B-Ps:ia, testattiin 15 RIAtlla ja ELISA:11a Pn6B-Ps vasta-aineita silmälläpitäen. Havaittiin merkittävät nousut Pn6B-Ps-vasta-aineissa.

Esimerkki 15

Pneumokokkipolysakkaridien nopeusnefelometria: Tämän määrityksen tarkoitus on määrittää vapaan 20 Pn-Ps:n ja konjugaattivalmisteiden polysakkaridipatoisuus ja antigeenisuusindeksi nopeusnefelometriaa käyttäen.

Standardikäyrän alue nopeusnefelometrialle eroaa eri Pn-Ps:ille responssina Pn-Ps-massayksikköä kohden, ja responssin lineaarinen osa versus Pn-Ps-antigeenikonsen-25 traatioprofiili eroaa kunkin PnPs:n suhteen. Tässä annettu menettelytapaesimerkki on spesifinen Pn6B-konjugaatille eikä se sovellu välttämättä muiden Pn-Ps-tyyppien konju-gaateille. Lisäksi alunaan adsorboidut näytteet ja niiden vastaavat standardit laimennetaan 3 % natriumsitraattiin 30 pikemminkin kuin 0,9 % NaClriin kuten alla on kuvattu.

.. Vesiliukoiset konjugaattinäytteet ja standardit (se on: ne jotka eivät ole alunassa) laimennetaan 0,9 % NaCl:ssa, ja taas laimennetaan nimellisiin konsentraatioihin, joiden odotetaan olevan standardikäyrän rajoissa.

73 107370 A) Reagenssit

Suolaliuos: 0,9 % NaClin vesiliuos Pn-Ps-antiseerumit: antiseerumit (Health Research Inc. Albany, NY) laimennetaan 30-kertaisesti suolaliuok-5 sella.

Standardit: valmista 10, 15, 20, 25, 30 ja 40 pg/ml Pn-Ps-konjugaattistandardit 387 pg/ml kantaliuoksesta, jonka konsentraatio määritetään polysakkaridin fenoli-rik-kihappomäärityksellä.

10 Testinäytteet: valmista natriumsitraattikantaliuos, jonka lopullinen konsentraatio on 3 % natriumsitraatin suhteen ja testinäytteiden laimennossarja teoreettisiksi konsentraatioiksi 10, 20 ja 30 pg Pn-Ps/ml. b) Menetelmä 15 Määritä kaikki näytteet ja standardit käyttäen

Beckman ICS-nopeusnefelometriaa käyttäen kahta rinnakkais-näytettä. Määritä näytteiden konsentraatio standardikäy-rästä. Kerro näytteen konsentraatio laimennoskertoimella ja laske arvojen keskiarvot kullekin koenäytteelle.

20 Kuten aikaisemmin on huomautettu, tällä menetel mällä havaitut näytteet, joilla on alle 70 % antigeeni-suusindeksit, hylätään konjugaatiosta, jotta saadaan varmistettua että käytettävällä Pn-Ps:lla on halutut immunologiset ominaisuudet.

25 Esimerkki 16 MIEP:ia koodittavan genomisen DNA:n kloonaus:

Noin 0,1 g :11a fenolia inaktivoitu ja N_;_ meningitidis -soluja (katso esimerkki 1) pantiin uuteen putkeen. Fenolilla inaktivoidut solut resuspendoitiin 567 pl:aan 30 TE-puskuria [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0]. Resuspen-doiduille soluille lisättiin 30 μΐ 10 % SDS:ia ja 3 μΐ 20 « mg/ml proteinaasi K:ta (Sigma). Solut sekoitettiin ja niitä inkuboitiin 37 °C:een lämpötilassa noin 1 tunnin ajan, jonka jälkeen lisättiin 100 μΐ 5 M NaCl:ia ja sekoitettiin 35 läpikotaisin. Sitten lisättiin 80 μΐ 1 % setyylitrimetyy- 74 107370 liammoniumbromidia (CTAB) 0,7 M NaCl:ssa, sekoitettiin läpikotaisin ja inkuboitiin 65 °C:een lämpötilassa 10 minuuttia. Lisättiin yhtä suuri tilavuus (noin 0,7 - 0,8 ml) kloroformi/isoamyylialkoholia (vastaavasti suhteessa 5 24:1), sekoitettiin läpikotaisin ja sentrifugoitiin noin 10 000 g:ssä noin 5 minuuttia. Vesifaasi (ylempi) siirrettiin uuteen putkeen ja orgaaninen faasi heitettiin pois. Yhtä suuri tilavuus fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia (vastaavasti suhteessa 25:24:1) lisättiin vesifaasiin, 10 sekoitettiin läpikotaisin ja sentrifugoitiin 10 000 g:ssä noin 5 minuuttia. Vesifaasi (ylempi) siirrettiin uuteen putkeen ja lisättiin 0,6 tilavuutta (noin 420 μΐ) isopro-pyylialkoholia, sekoitettiin läpikotaisin ja saostunutta DNA:ta sentrifugoitiin 10 000 g:ssä 10 minuuttia. Super-15 natanttineste heitettiin pois ja sakka pestiin 70 % etanolilla. DNA-sakka kuivattiin ja resuspendoitiin 100 plraan TE-puskuria, ja se edustaa meningitidisin genomin DNA:ta.

Syntetisoitiin kaksi DNA-oligonukleotidia, jotka 20 vastaavat MIEP-geenin 5'-päätä ja MIEP-geenin 3’-päätä [Murakami, E. C. ym., (1989) Infection and Immunity, 57, s. 2318-23]. DNA-oligonukleotidin, joka oli spesifinen MIEP-geenin 5'-päälle, sekvenssi oli: 5'-ACTAGTTGCAAT- GAAAAAATCCCTG-3' JA MIEP-geenin 3'-päälle sekvenssi oli: 25 5'-GAATTCAGATTAGGAATTTGTT-3’. Näitä DNA-oligonukleotideja käytettiin alukkeina MIEP-geenin polymeraasiketjureaktio-monistuksessa (PCR) niin, että käytettiin 10 nanogrammaa N. meningitidisin genomista DNA:ta. PCR-monistusvaihe suoritettiin valmistajan (Perkin Elmer) antamien menetelmien 30 mukaisesti.

.. Monistettu MIEP-DNA digestoitiin sitten restriktio- endonukleaaseilla Spel ja EcoRI. 1,3 kiloemäksen (kb) DNA-fragmentti, joka sisälsi koko MIEP:n koodittavan alueen, eristettiin elektroforeesilla 1,5 % agaroosigeelissä, ja 35 kerättiin geelistä elektroeluutiolla [Current Protocols in 75 107370

Molecular Biology, (1987), Ausubel, R.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Smith, J.A., Seidman, J.G. ja Struhl, K. toim., Greene Publishing Assoc.].

Plasmidivektori pUC-19 digestoitiin Spel- ja EcoRI-5 entsyymeillä. Geelipuhdistettu Spel-EcoRI-MIEP-DNA ligoi-tiin Spel-EcoRI -pUC 19 -vektoriin ja sitä käytettiin transformoimaan E. coli -kanta DH5. Transformantit, jotka sisälsivät pUC-19 vektorin 1,3 kbp MIEP-DNA:n kanssa, tunnistettiin restriktioendonukleaasikartoituksella ja MIEP-10 DNA sekvensoitiin, jotta sen identiteetti saatiin varmistettua .

Esimerkki 17 pCl/l.GallOp(B)ADHlt -vektorin muodostaminen:

Gal 10 -promoottori eristettiin plasmidista YEp52 15 (Broach ym. (1983) teoksessa Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M. (toim.) Academic Press s. 83-117] puhdistamalla geelissä 0,5 kiloemäsparin (kbp) fragmentti, joka oli saatu katkaisemalla Sau 3A- ja Hind III -entsyymeillä. ADHl-terminaattori eristettiin vektorista 20 pGAP.tADH2 [Kniskern, ym. (1986) Gene, 46, s. 135-141] puhdistamalla geelissä 0,35 kbp fragmentti, joka oli saatu katkaisemalla Hind III- ja Spel-entsyymeillä. Nämä kaksi fragmenttia ligoitiin T4-DNA-ligaasilla geelipuhdistettuun pucl8 Hind III -vektoriin (Hind III -kohta poistettiin 25 digestoimalla pUC18 Hind_III-entsyymillä, tasoittamalla päät E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla ja ligoimalla T4-DNA-ligaasilla), joka oli digestoitu BamHI-ja Sphl-entsyymillä, jolloin saatiin aikaan kantavektori pGallO-tADHl. Tällä on ainutkertainen Hind III -kloonaus- 30 kohta GallOp.ADHlt-liitoskohdassa.

pGallO.tADHl:n ainutkertainen Hind III -kloonaus-• ' kohta muutettiin ainutkertaiseksi BamHI-kloonauskohdaksi digestoimalla pGallO.tADHl Hind 111:11a, puhdistamalla katkaistu DNA geelissä ja ligoimalla T4-ligaasia käyttäen 35 siihen seuraava Hindlll-BamHI-linkkeri: ™ 107370 5'-AGCTCGGATCCG-3' 3'-GCCTAGGCTCGA-5'.

Tuloksena syntyvässä plasmidissa, pGAUO(B)-tADHltssa, HindiII-kohta on deletoitunut, ja on syntynyt 5 ainutkertainen BamHI-kloonauskohta.

GallOp.tADHl-fragmentti eristettiin pGallO(B)-tADHl:sta digestoimalla Smal- ja SphI-entsyymeillä, sen päät tasattiin T4-DNA-polymeraasilla ja se puhdistettiin geelissä. Hiivan sukkulavektori pCl/1 [Brake ym. (1984), 10 Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 81, s. 4642-4646] digestoitiin

Sphil-entsyymillä, sen päät tasattiin T4-DNA-polymeraasil-la ja se puhdistettiin geelissä. Tämä fragmentti ligoitiin vektoriin T4-DNA-ligaasilla. Ligaatioreaktioseosta käytettiin sitten transformoimaan E. coli HB101 -solut ampisil-15 liiniresistenteiksi, ja transformantit seulottiin suorit tamalla hybridisaatio 32P-leimatun Hindlll-BamHI-linkkerin yhteen juosteeseen. Uusi vektorikonstruktio, pCl/1.GallOp-(B)ADHlt vahvistettiin digestoimalla Hindi!I- ja BamHI-ent-syymeillä.

20 Esimerkki 18

Uuden hiivan MIEP-ekspressiovektorin muodostaminen, jossa on M1EP + leader-DNA-sekvenssejä

Muodostettiin DNA-fragmentti, joka sisältää MIEP:n täydellisen koodittavan jakson, digestoimalla pUC19.MIEP ^ 25 #7 Spel- ja EcoRI-entsyymeillä, puhdistamalla MIEP-DNA

geelissä ja tasoittamalla päät T4-DNA-polymeraasilla.

Hiivan sisäinen ekspressiovektori pCl/l.GallOp(B)A-DHlt digestoitiin BamHI-entsyymillä, defosforyloitiin vasikan suolen emäksisellä fosfataasilla ja päät tasoitet-30 tiin T4-DNA-polymeraasilla. DNA puhdistettiin geelissä “ katkeamattoman vektorin puhdistamiseksi.

1,1 kbp tasapäinen MIEP-fragmentti ligoitiin tasa-päiseen pCl/l.GallOp(B)ADHlt-vektoriin ja ligaatioreaktioseosta käytettiin transformoimaan kompetentit E. coli 35 DH5-solut ampisilliiniresistenteiksi. Transformantit seu- 77 107370 lottiin hybridisoimalla 32P-leimatun DNA-oligonukleotidin kanssa: 5' AAGCTCGGATCCTAGTTGCAATG...3', joka suunniteltiin niin, että se on homologinen niiden sekvenssien kanssa, jotka ovat yhteisiä MIEP-vektoriliitoksen kanssa. DNA-5 preparaatteja tehtiin hybridisaatiopositiivisista trans- formanteista ja digestoitiin Kpnl- ja Sali-entsyymeillä, jotta saatiin varmistettua että MIEP-fragmentti oli oikeassa orientaatiossa GallO-promoottorista käsin tapahtuvaa ekspressiota varten. DNA-konstruktion lisävahvistus saa-10 tiin sekvensoimalla dideoksimenetelmällä GallO-promootto rista käsin MIEP:n koodittamalle alueelle.

Transformanttien ekspressoima MIEP havaittiin Wes-tern-blottaus -analyysilla. Transformanttien tuottama rek-ombinantti-MIEP liikkui samassa kohdassa polyakryyliamidi-15 geelissä OMPC-vehikkeleistä puhdistetun MIEP:n kanssa, ja se oli immunologisesti reaktiivinen MIEP-spesifisten vasta-aineiden kanssa.

Esimerkki 19

Hiivan MIEP-ekspressiovektorin muodostaminen, jolla 20 on 5’-päästä muokattu MIEP-DNA-sekvenssi

Tehtiin polymeraasiketjureaktiotekniikkaa (PCR) käyttäen DNA-oligonukleotidi, joka sisältää Hindlljt-kohdan, hiivan konservoitaneen 5'-pään ei-transloituvan leader- jakson (NTL), metroniini-aloituskodonin (ATG), kypsän 25 MIEP:n ensimmäiset 89 kodonia (alkaen Asp:11a kohdassa +20) ja Kpnl-kohdan (kohdassa +89). PCR suoritettiin valmistajan (Perkin Elmer Cetus) ohjeiden mukaisesti käyttäen templaattina pUC19MIEP42#7-plasmidia ja alukkeina seuraa-via DNA-oligomeereja: 30 • · 5'CTAAGCTTAACAAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT3\ J a 5'ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG3’.

i 107370 78

Jotta saataisiin poistettua MIEP-kloonin 5'-pään alue, plasmidi pUC19MIEP42#7 digestoitiin Kpnl;11a ja Hindin:11a ja 3,4 kbp vektorifragmentti puhdistettiin agaroosigeelissä. 280 pb PCR-fragmentti digestoitiin 5 Kpnl;11a ja Hindin:11a, puhdistettiin agaroosigeelissä ja ligoitiin 3,4 kbp vektorifragmentilla. E. coli HB101 (BRL) -transformantit seulottiin hybridisoimalla DNA-oligonuk-leotidilla ja positiivisista transformanteista peräisin oleva DNA analysoitiin restriktioentsyymidigestiolla. Sen 10 varmistamiseksi, ettei PCR-vaiheessa tullut mutaatioita, positiivisten transformanttien PCR:llä tehty 280 bp:n DNA sekvensoitiin. Tuloksena oleva plasmidi sisältää HindiII -EcoRI -insertin, joka sisältää hiivan NTL:n, ATG-kodonin ja MIEPtn koko avoimen lukuraamin (ORF), joka alkaa Asp-15 kodonista (aminohappo +20).

Hiivan MIEP-ekspressiovektorit muodostettiin seuraavasti. pGAL10/pCl/l- ja pGAP/pCl/1 -vektorit [Vlasuk, G.P. ym. (1989), J.B.C., 264, s. 12 106 - 12 112] digestoitiin BamHI:11a, päät tasattiin DNA-polymeraasi I:n Kle-20 now-fragment!11a ja defosforyloitiin vasikan suolen emäk sisellä fosfataasilla. Nämä lineaariset vektorit ligoitiin yllä kuvatun, Klenow-käsitellyn ja geelissä puhdistetun HindiII-EcoRI-fragmentin kanssa, joka sisältää hiivan NTL:n, ATG:n ja MIEP:n ORF:n, muodostavat pGallO/pCl/1-25 MIEP:n ja pGAP/pCl/l-MIEP:n.

Saccharomyces cerevisiae kanta U9 (gall0pgall4-) transformoitiin plasmidilla pGallO/pCl/l-MIEP. Rekombi-nanttikloonit eristettiin ja tutkittiin ekspressoivatko ne MIEP:ia. Klooneja kasvatettiin 37 °C:een lämpötilassa ra-30 vistellen synteettisessä elatusaineessa (leu-), joka sisältää 2 % glukoosia (w/v) OD660-arvoon noin 6,0. Sitten lisättiin galaktoosia pitoisuudeksi 2 % (w/v), jotta saataisiin indusoitua MIEP:n ekspressio GallO-promoottorista. Soluja kasvatettiin vielä 45 tuntia galaktoosi-induktion 35 jälkeen OD660-arvoon noin 9,0. Solut kerättiin sitten sent- 79 1 0 7 3 7 0 rifugoimalla. Solusakka pestiin tislatulla vedellä ja pakastettiin.

Western-blottaus rekombinantti-MIEP:lle:

Jotta saataisiin määritettyä, ekspressoiko hiiva 5 MIEP:ia, tehtiin Western blot -analyysi. Käytetään kak-sitoistaprosenttisia, 1 mm, 10-15 -kaivoisia Novex Laem-mli-geelejä. Hiivasolut rikottiin H20:ssa lasihelmiä käyttäen (natriumdodekyylisulfaattia (SDS) voidaan käyttää 2 % pitoisuutena rikkomismenetelmän aikana). Soluroskat pois-10 tettiin sentrifugoimalla 1 minuutin ajan 10 000 g:ssä.

Supernatantti sekoitettiin näyteajopuskurin kanssa, kuten on kuvattu MIEP:n polyakryyliamidigeelipuhdistuksen kohdalla. Näytteitä ajettiin 35 mA:lla käyttäen OMPC:ia referenssikontrollina, kunnes merkkiväriaine bromifenoli-15 sininen ajautuu ulos geelistä.

Proteiinit siirrettiin huokoskooltaan 0,45 μ nitro-selluloosapaperille käyttäen NOVEX-siirtolaitetta. Siirron jälkeen nitroselluloosapaperi tukittiin 5 % naudan seerumialbumiinilla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa 20 1 tunnin ajan, jonka jälkeen lisättiin 15 ml 1:1000 lai mennosta kanin MIEP-antiseerumia (joka on saatu aikaan immunisoimalla geelipuhdistetulla MIEPtlla standardi-menetelmiä käyttäen). Sen jälkeen kun oli inkuboitu yli yön huoneenlämmössä, lisättiin 15 ml 1:1000 emäksiseen .. 25 fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-kani-IgG:tä. 2 tunnin inkubaation jälkeen blotti kehitettiin käyttäen FAST RED TR SALT:ia (Sigma) ja Naphthol-AS-MX-fosfaattia (Sigma).

Esimerkki 20

Rekombinantti-MIEP:n ekspressio bakteerissa 30 Plasmidi pUCl9-MIEP, joka sisältää 1,3 kiloemäs- parin MIEP-geeni-insertin, digestoitiin restriktioendonuk- • · leaaseilla Spel ja EcoRI♦ 1,1 kbp fragmentti eristettiin ja puhdistettiin agaroosigeelissä sinänsä tunnetulla tavalla. Plasmidi pTACSD, joka sisältää kaksikistronisen 35 TAC-promoottorin ja ainutkertaisen EcoRI -kohdan, digestoi- so 107370 tiin EcoRI:11a. Muodostettiin tasapäät sekä 1,3 kbp MIEP-DNArhan ja pTACSD-vektoriin käyttäen T4-DNA-polymeraasia (Boehringer Mannheim) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tasapäiseksi tehty 1,3 kbp MIEP-DNA ligoitiin tasapäiseksi 5 tehtyyn vektoriin käyttämällä T4-DNA-ligaasia (Boehringer Mannheim) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ligoitua DNA:ta käytettiin transformoimaan E. coli -kanta DH5aIQMAX (BRL) valmistajan ohjeiden mukaan. Transformoidut solut maljättiin agarmaljoille, jotka sisälsivät 25 pg kanamysiiniä/ml 10 ja 50 pg penisilliiniä/ml ja inkuboitiin noin 15 tuntia 37 °C:een lämpötilassa. DNA-oligonukleotidi, jolla on sekvenssi joka on homologinen MIEPrn kanssa, leimattiin 32P:lla ja sitä käytettiin standardinomaisia DNA-hybridi-saatiotekniikoita käyttäen seulottaessa nitroselluloosa-15 filttereitä, jotka sisältävät transformanttimaljoilta pe räisin olevia hajotettuja denaturoituja pesäkkeitä. Pesäkkeet, jotka olivat positiivisia hybridisaatiossa, kartoitettiin restriktioendonukleaaseja käyttäen MIEP-geenin orientaation määrittämiseksi.

20 Transformanttien ekspressoima MIEP havaittiin Wes tern blottaus -analyysillä. Transformanttien tuottama re-kombinantti-MIEP liikkui samassa kohdassa polyakryyliami-digeelissä OMPC-vehikkeleistä puhdistetun MIEP:n kanssa, ja se oli immunologisesti reaktiivinen MIEP-spesifisten 25 vasta-aineiden kanssa.

Esimerkki 21

Pn-Ps:n konjugaatio N. meningitidisin MIEP:n kanssa:

Suoritetaan kemiallisia konjugaatioita sen menetel-30 män mukaisesti, joka on paljastettu US-patentissa numero 4 882 317.

« · 10 mg MIEP:ia 3 ml:ssa 0,1 M boraattipuskuria, pH 11,5, sekoitetaan 10 mg:aan etyleenidiamiinitetraetik-kahapon dinatriumsuolaa (EDTA, Sigma Chemicals) ja 35 4 mg:aan ditiotreitolia (Sigma Chemicals). Proteiiniliuos ei 107370 huuhdellaan perusteellisesti N2:llai 125 mg N-asetyylihomo-kysteiinitiolaktonia (Aldrich Chemicals) lisätään MIEF-liuokseen ja seosta inkuboidaan huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Sitten se dialysoidaan kahdesti N2:n alla kahta 5 litraa 0,1 M boraattipuskuria (ph 9,5) vastaan, joka on 4 mM EDTA:n suhteen, 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Tio-loidun proteiinin tiolipitoisuus määritettiin sitten Ellmanin reagenssilla (Sigma Chemicals) ja proteiinikon-sentraatio määritetään Bradfordin reagenssilla (Pierce 10 Chemicals). MIEP:n konjugoimiseksi Pn-Ps:iin 1,5-kertainen ylimäärä (w/w) bromiasetyloitua Pn-Ps:ia lisätään MIEP-liuokseen ja pH säädetään arvoon 9-9,5 1 N NaOH:lla. Seoksen annetaan inkuboitua N2:n alla 6-8 tuntia huoneenlämmössä. Reaktioajan lopussa seokseen lisätään 25 μΐ N-asetyy-15 likysteamiinia (Chemical Dynamics) ja sen annetaan seistä 18 tuntia N2:n alla huoneenlämmössä. Konjugaattiliuos hapo-tetaan pH-arvoon 3-4 1 N HClzlla ja suoritetaan sentrifu-gaatio 10 000 g:11a 10 minuutin ajan. 1 ml supernatantti-nestettä pannaan suoraan Superose 6B FPLC-pylvääseen 20 (1,6x50 cm, Pharmacia) ja konjugaatti eluoidaan PBSrlla.

Huokostilavuuden piikki, joka sisältää polysakkaridi-proteiini-kon jugaatin (Pn-Ps-MIEP) kerätään yhteen. Konju-gaattiliuos steriloidaan sitten suodattamalla 0,22 pm suodattimen läpi.

25 Esimerkki 22

Pn-Ps-MIEP-konjugaattien immunogeenisuuden osoittaminen:

Immunisaatiot: Koiraspuoliset Balb/c -hiiret (Charles River, Wilmington, MA) immunisoidaan vatsaontelon si-30 säisesti Pn-Ps:lla, joka on konjugoitu kovalenttisesti MIEP:iin, käyttäen 2,5 pg Pn-Ps 0,5 ml:ssa ennalta muodos-tettua alunaa. Kontrollihiiret immunisoidaan yhtä suurilla määrillä Pn-Ps:ia, joka annettiin Pn-Ps-CRM:ina [Anderson, M.E. ym. (1985), J. Pediatrics, 107, s. 346-351] (2,5 pg 35 Pn-Ps/6,25 pg CRM; 1/4 ihmisen annoksesta), Pn-Ps-DT:na 107370 82 (2,5 pg Pn-Ps/1,8 pg DT; 1/10 ihmisen annoksesta niin, että käytetään vakiomääriä Pn-Ps:ia) ja Pn-Ps-OMPC:na (2,5 pg Pn-Ps/35 pg OMPC; 1/4 ihmisen annoksesta).

Imeväisikäisiä resusapinoita, ikä 6-13,5 viikkoa, 5 immunisoidaan alunaan adsorboiduilla Pn-Ps-MIEP-konjugaa-teilla. Kukin apina saa 0,25 ml konjugaattia kahteen eri injektiokohtaan, kokonaisannoksen ollessa 0,5 ml. Apinat immunisoidaan päivänä 0, 28 ja 56, ja verinäytteet otetaan joka toinen - joka neljäs viikko.

10 Vasta-aineresponssit mitataan ELISA:11a, joka erot taa immunoglobuliiniresponssin luokan ja alaluokan. Apinan responssin arvioinnissa käytetään myös RlA:aa, joka kvan-titoi Pn-Ps-vasta-aineen kokonaismäärän.

Pn-Ps-MIEP-konjugaatit pystyvät saamaan hiirissä 15 aikaan immuunivasteen, joka koostuu IgG-luokan Pn-Ps-vas-ta-aineesta ja muistiresponssista. Asia on päinvastoin Pn-Ps-CRM:n ja Pn-Ps-DT:n tapauksessa, jotka eivät saa aikaan mitattavissa olevaa Pn-Ps-vasta-ainetta. Täten MIEP toimii immunologisena kantajaproteiinina Pn-Ps:lie ja se 20 kykenee aiheuttamaan Pn-Ps-vasta-aine -responssin silloin kun se on konjugoitu kovalenttisesti Pn-Ps-antigeeniin. Puhdistettu MIEP on täten tehokas immunologinen kantajaproteiini, joka korvaa heterogeenisen OMPC:n, kun muodostetaan bakteeriperäisiä polysakkaridikonjugaattirokottei-.. 25 ta.

Esimerkki 23 C-polysakkaridipitoisuuden kvantitatiivinen määritys Pn-Ps-valmisteissa: C-polysakkaridin kvantitoimiseksi on kehitetty jär-30 jestelmiä, jotka perustuvat NMR-, entsymaattisiin tai kro-matografisiin menetelmiin. Tässä tapauksessa käytettiin koliinin (C-Ps:n komponentti) kromatografista erottelua hydrolysoiduista Pn-Ps-näytteistä ja sitä verrattiin näihin muihin menetelmiin. Koliini erotettiin kationinvaih- 107370 83 topylväässä, joka oli kytketty vaimennettuun konduktivi-teetin detektioon.

Pn-Ps-näytteet hydrolysoitiin täysin käsittelemällä 36 % fluorivetyhapolla 2 tuntia 45 - 65 °C:een lämpöti-5 lassa, jota seurasi 2 M trifluorietikkahappo 16 tuntia 100 °C:een lämpötilassa. Hydrolyysin jälkeen 200 - 300 yg näytteestä injektoitiin Dionex BioLC -kromatografiajärjestelmään, jossa oli Omnipac PCX-500 -analyyttinen ja suoja-pylväs, Ion Pac CTC-1 kationiloukkupylväs, CMMS-2 Micro-10 membrane Suppressor, joka regeneroitiin 50 mM tetrabutyy-liammoniumhydroksidilla (10 ml/min) ja konduktiviteetti-detektori, joka oli asetettu 1 pSiemensin herkkyydelle. Näyte eluoitiin isokraattisesti käyttäen seosta, jossa oli 5 % 200 mM HClria, 5 % 20% asetonitriiliä, 85 % Milli-Q 15 -vettä, 5 % 20 mM diamiinipropionihappoa. Koliini eluoi-tui terävänä piikkinä noin 10 minuutin kuluttua.

Puhdistetusta C-Ps:ta (joka oli saatu Statens Serum Institutelta) analysoitiin koliinipitoisuus tätä menetelmää käyttäen ja saatiin arvo 5,4 painoprosenttia koliinia. 20 Tämä arvo on yhtäpitävä C-Ps:n koliinipitoisuudesta julkaistujen raporttien kanssa.

Tätä tekijää käytettiin laskettaessa eri Pn-Ps-val-misteiden C-Ps-konsentraatio, niin että muutettiin HPCL:lla saadut koliinin nanomoolimäärät massa-arvoiksi.

... 25 C-Ps:n painomassa laskettiin käyttäen 5,4 painoprosenttia koliinia konversiossa. Näytteet, joissa oli yli 3 %:n C-Ps-konsentraatiot, hylättiin konjugaatioon sopimattomina. Alla oleva taulukko osoittaa tämän menetelmän vastaavuussuhteen NMR- ja entsymaattisten menetelmien kanssa, 30 ja esittää tyypilliset C-Ps-kontaminaatiotasot Pn-Ps-val-misteissa, joiden puhtaus vaihtelee: 107370 84

Näyte NMR Entsymaattinen HPLC

Pn6B-Ps 20 % Ei havaittu 18,4 %

Pn6B-Ps 1,6 % 0,3-1,0 % 1,2 %

Pn23F-Ps Ei hav. 2,8 % 3,7 % 5 Pnl4-Ps 2,9 % 2,4 % 3,2 %

Pnl9F-Ps 2,7 % 2,6 % 2,6 %

Esimerkki 24

Osittain hydrolysoidun, puhdistetun Pnl8C-Ps:n valmistus: 10 (1) Ultraäänihydrolyysi: 3,0 g erä Pnl8C Ps -jau hetta liuotettiin 1200 ml:aan suolaliuosta (0,9 % NaCl) sekoittaen huoneenlämpötilassa noin 3-4 tunnin ajan. Sitten liuos sonikoitiin muovisessa dekantterilasissa jäähau-teessa Branson Sonifier -laitteella (1,25 cm koetin, ase-15 tus 8) 20 minuutin jaksoin (5 minuutin osajaksot) aina 40 minuutin kokonaisaikaan asti. Viskositeetti tarkastettiin kunkin väliajan kuluttua. 40 minuutin kuluttua suoritettiin vielä 10 minuutin sonikointi, jolloin saavutettiin viskositeettiloppupiste 1,218 senttistokea. Hydrolysoitu 20 näyte (tilavuus 1188 ml) tuotiin huoneenlämpötilaan ja natriumasetaattireagenssia (59,2 g) lisättiin niin, että loppukonsentraatio oli 3 % (w/v).

(2) Serologinen testaus: Isopropanoli (IPA) frak-tiointipilottikoe ja vasta-aineella ohjattu päätepisteen 25 Nephelose-määritys, joka suoritettiin 10 ml erälle näytettä, osoitti että Pnl8C Ps saostuisi 40-50 %:ssa IPA:aa.

(3) Ensimmäinen IPA:n lisäys: Hydrolysoitu näyte [tilavuus = 1200 ml, vaiheesta 1 yllä] tehtiin 42,7 %:seksi IPA:n suhteen lisäämällä 894 ml IPA:aa (li- 30 sättiin tipoittain sekoittaen huoneenlämmössä). Näytteen annettiin sekoittua 15-30 minuuttia ja sitä sentrifugoi- > ·« tiin sitten 11 000 g:ssä 30 minuuttia (Beckman JA-10-root-tori, 8 000 rpm, 20 °C). Jätesakka trituroitiin absoluuttisessa EtOH:ssa 250 ml:n Omnimix-astiassa, sitten se ke-35 rättiin 60 ml:n lasisintterisuppiloon. Sakka pestiin suo- 107370 85 raan suppilossa absoluuttisessa EtOH:ssa, sitten asetonissa ja kuivattiin iri vacuo CaCl2:n yläpuolella (Drierite) huoneenlämpötilassa analyysiin valmistettaessa.

(4) Toinen IPA:n lisäys ja välituotteen keräys: 5 42,7 % IPA-supernatanttineste [tilavuus 2016 ml, vaiheesta 3 yllä] tehtiin 45,2 %:seksi IPA:n suhteen lisäämällä 92,0 ml IPA:ia tipoittain samalla sekoittaen huoneenlämpötilassa. Näytettä seisotettiin ja sentrifugoitiin kuten vaiheessa 3 yllä. Sakka trituroitiin, kerättiin, pestiin 10 ja kuivattiin kuten vaiheessa 3 yllä. Pnl8C Ps -välituote painoi 1 609 mg.

(5) Dialysointi ja lyofilisointi: Osa (1 612,5 mg) näytettä vaiheesta 4 yllä liuotettiin 645 ml:aan tislattua H20:ta huoneenlämpötilassa noin 2 tunnin ajan. Liuos 15 (2,5 mg/ml) siirrettiin diälyysiletkuun (12 000 MW alara ja; 45 mm) ja dialysoitiin tislattua H20:ta vastaan 30 tuntia niin, että vaihdettiin tislattu H20 vielä 2 kertaa. Sitten näyte siirrettiin lyofilisointipulloihin, jäädytettiin pullon sisäpintaan kuivajää-metanolihauteessa ja lyo-20 filisoitiin Virtis (Freezemobile) lyofilisoijassa 2-3 päivän ajan. Lopullisen Ps-tuotteen saalis oli 1487 mg. Esimerkki 25 S. pneumoniae 18C-0MPC-konjugaatin, Pnl8C-Ps-0MPC:n valmistus: 25 A. Dowex 50x2 tetrabutyyliammoniummuodossa olevan hartsin (200-400 mesh) valmistus [Dowex 50 (Bu4N*)]:

Dowex 50x2 (200-400 mesh) H*-muoto (500 g) luetettiin H20:ssa, ladattiin pylvääseen ja pestiin perätysten: 1) 600 ml :11a H20:ta; 30 2) 1000 ml:11a 6 N HCl:ia; • **; 3) 400 ml:11a H20:ta kunnes effluentti antaa neutraalin « 4 testituloksen pH-paperilla; 4) 72 g tetrabutyyliammoniumhydroksidin 10 % vesiliuosta kunnes effluentti on vahvasti emäksinen pH-paperin mukaan; 35 5) 1000 ml H20:ta neutraalisuuteen asti.

86 107370 B. S. pneumoniae tyyppi 18C-polysakkaridin tetrabu-tyyliammoniummuodon [Pnl8C (Bu4N+) ] valmistus: 60 ml pylväs Dowex 50X2:ta (Bu4N+) pestiin 250 ml: 11a H20: ta. Pnl8C-polysakkaridi (molekyylipainoltaan 5 pienennetty (650 mg)) peitettiin 65 ml:11a H20:ta ja sekoitettiin 1 tunnin ajan, jossa vaiheessa kaikki näytti liuenneen. Tämä liuos pantiin pylvääseen ja annettiin siivilöityä läpi painovoimalla (n. 2 h, sitten alipaineella 1 h). Pylväs pestiin 150 ml:lla H20:ta ja yhdistetyt eff-10 luentit lyofilisoitiin, mikä tuotti 655 mg 18C (Bu4N+) -suolaa. 25 mg otettiin sivuun NMR-analyysia varten ja säästettäväksi.

C. 18C:n 1,4-butaanidiamiinijohdannaisen (18C-BuA2) valmistus: 15 18C (Bu4N+) (630 mg) peitettiin 143 ml:11a DMS0:ta (dimetyylisulfoksidi) ja sekoitettiin 3,25 tuntia. Tässä vaiheessa kaikki kiinteä aine oli liuennut ja 1 ml otettiin sivuun vesipitoisuuden Karl Fischer -titrausta varten. Havaittiin arvo 28,2 mikromoolia H20:ta/ml (4 mmoolia 20 kaikkiaan). Tähän liuokseen lisättiin 165,1 mg karbonyyli-di-imidatsolia (CDI) ja tuloksena olevaa liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2,0 tuntia. Valmistettiin liuos, joka sisälsi 1,260 g 1,4-butaanidiamiinidihydrokloridia (BuA2 2HC1) 40 ml:ssa H20:ta ja sen pH säädettiin arvoon 25 10,20 2,5 N NaOH:lla. Tämä liuos jäähdytettiin jäähauteel- la. Seisotettu DMSO-liuos lisättiin hitaasti kylmään BuA2-liuokseen ja sekoitettiin vielä jäähauteella 10 minuutin ajan. Sitten sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa 50 minuutin ajan, jonka jälkeen liuos ladattiin Spectrapor 2 30 -dialyysiletkuun, joka katkaistiin nesteen yläpinnasta laskien 1,25 cm päästä, ja dialysoitiin seuraavia vastaan: »·«.

1) 15 1 0,1 M pH 7,0 NaP04-puskuri, 13 h; 2) 15 1 0,01 M pH 7.0 NaP04-puskuri, 11 h; 3) 15 1 0,01 M pH 7,0 NaP04-puskuri, 10,8 h; 35 4) 15 1 H20:ta, 9,5 tuntia.

87 107370

Tilavuus oli tässä vaiheessa 190 ml. 7,5 ml erä otettiin sivuun ja lyofilisoitiin erikseen NMR-määritystä varten. Jäljellejäänyt 182,5 ml lyofilisoitiin 416 mgrksi 18C:n 1,4-butaanidiamiinijohdannaista (Pnl8C-BuA2). NMR-spektri 5 noin 5 mg:sta tätä materiaalia paljasti 10 butaanidiamii-nitähteen tulleen mukaan 100 toistuvaa polysakkaridin mo-nomeeriyksikköä kohden, joka määriteltiin vertaamalla bu-taanidiamiinin sisäisten metyleenien ja (18C:n) ram-noosimetyylien resonanssien integraaleja.

10 D. 18C:n bromiasetyloidun butaanidiamiinijohdan naisen (Pnl8C-BuA2-BrAc) valmistus: 18C-BuA2 (416 mg) peitettiin 36 ml:11a 0,1 M boraat-ti-fosfaattipuskuria (pH 9,04) (Kolthoffin boraatti-fos-faatti) ja sekoitettiin jotta se saataisiin liukenemaan. 15 Sitten lisättiin 256 mg p-nitrofenyylibromiasetaattia, joka oli liuotettu 4,48 ml:aan asetonitriiliä. Tuloksena olevaa seosta sekoitettiin 20 tuntia 4 °C:een lämpötilassa. Sitä dialysoitiin sitten Spectrapor 2 -letkussa seu-raavia vastaan: 20 1) 15 1 H20:ta, 6 h; 2) 15 1 H20:ta, 6 tuntia ja 3) 15 1 H20:ta, 6 tuntia. Tässä vaiheessa tilavuus oli 60 ml, josta otettiin sivuun 1,7 ml määrityksiä varten (NMR, Ouchterlony ja Viscotek) ja sitten lisättiin 2,42 mg kuivattua fosfaattipuskurisuolaa, 25 pH 8 (valmistettu lyofilisoimalla 0,1 M NaP04-liuos, pH 8). Liukenemisen jälkeen se suodatetaan 0,2 pm Corning-suodat-timen läpi, mikä tuottaa 18C-BuA2-BrAc-vesiliuoksen, pH 8. Suodatus oli hidasta ja vaati 4 kuppisuodatinta.

E. 0MPC:n (N. meningitidis) konjugointi Pnl8C-BuA2-30 BrAc:iin: *’; Ulkomembraaniproteiinikompleksi (N. meningitidis, » « OMPC 3,2 mg/ml, 80 ml) ladattiin neljään 25 ml:n sentri-fuugiputkeen ja sentrifugoitiin 60 Ti-roottorissa 43 000 rpm (43 K) 4 °C:een lämpötilassa 2 tuntia. Tiolointiseos 35 valmistettiin liuottamalla 680 mg EDTA:aa (etyleenidi- ββ 107370 amiinitetraetikkahapon dinatriumsuola) ja 120 mg ditio-treitolia (DTT) 40 ml:aan Na2B407-puskuria, pH 11,09. 320 mg N-asetyylihomokysteiinitiolaktonia lisättiin ja sitten liuos suodatettiin 0,2 μ Corning-suodattimen läpi (kuppi-5 tyyppi). Yllä olevasta sentrifugaatiosta saadut sakat irrotettiin 5 ml:aan suodatettua tiolointiseosta (20 ml yhteensä), siirrettiin Dounce-homogenisoijaan ja resuspen-doitiin. Putket huuhdeltiin siirtämällä kaikkien läpi vielä 2/10 ml tiolointiliuosta. Yhdistetyt liuokset homogeni-10 soitiin Douncessa ja resuspendoitu totaalimateriaali (40 ml) siirrettiin 100 ml:n pyöreäpohjäiseen pulloon. Lasitavara huuhdeltiin vielä 20 ml:11a tiolointiliuosta ja lisättiin reaktiopulloon. Sen jälkeen kun pullo oli suljettu tiiviisti tiivisteellä ja ilma oli korvattu N2:lla 15 Firestone-venttiiliä käyttäen, reaktioseosta seisotettiin 18,5 tuntia. 60 ml jaettiin sitten neljään sentrifuugiput-keen, jotka kukin täytettiin 1 M KH2P04:lla (vesiliuos) ja sitten sentrifugoitiin 2 tunnin ajan 43 000 rpm ja 4 °C. Supernatantit poistettiin ja sakat resuspendoitiin 0,1 M 20 NaP04-puskuriin, pH 8,0 (lopullinen resuspensiotilavuus oli yhteensä 40 ml). Tämä liuos jaettiin tasan kahteen 25 ml:n sentrifuugiputkeen (polykarbonaatti) ja lasitavara (DOUNCE jne.) huuhdeltiin noin 10 ml:lla fosfaattipuskurilla, pH 8, jota käytettiin sentrifuugiputkien täyttämiseen. Sitten . 25 suoritettiin toinen ultrasentrifugointi (2 h, 4 °C, 43 000 rpm). Sakat resuspendoitiin 30 ml:aan 0,1 M P04-puskuria, pH 8. Ellmanin määritys osoitti, että SH:ia oli yhteensä 24 mikromoolia tai noin 100 nanomoolia/mg 0MPC:ia. Tioloi-tu proteiini siirrettiin 100 ml pyöreäpohjäiseen pulloon 30 ja suodatettu 18C-BuA2-BrAc-liuos lisättiin siihen. Tulok-·· sena olevaa reaktiota (se on: 18C-BuA2-BrAc tioloidun 0MPC:n kanssa) seisotettiin N2:n alla (kaasunpoistolla) N2-laatikossa huoneenlämpötilassa 89 tuntia.

Reaktioon lisättiin sitten "cap"-ryhmät seuraavas-35 ti: Liuos, joka sisälsi 75 mg N-etyylimaleimidia (NEM) 107370 89 5 ml:ssa 0,1 M NaP04-puskuria, pH 8> suodatettiin 0,22 mikronin suodattimen läpi ja ylläolevaan reaktioseokseen lisättiin 2 ml ja seisotettiin 4 tuntia.

Sitten 0,5 ml N-asetyylikysteamiinia 2,5 ml:ssa 5 0,1 M P04-puskuria, pH 8, suodatettiin 0,22 mikronin suo dattimen läpi ja 1,0 ml tätä liuosta lisättiin reaktioon ja seisotettiin 22,5 tuntia.

Tuote, johon oli liitetty "cap"-ryhmät, jaettiin sitten tasan neljään 25 ml:n sentrifuugiputkeen, joiden 10 kunkin päälle lisättiin 8 ml 0,1 M P04-puskuria, pH 8,0, ja sentrifugoitiin (43 000, 2 h, 4 °C). Supernatanttines-teet poistettiin ja sakat resuspendoitiin kaikkiaan 40 ml:aan TED-puskuria Dounce-homogenisoijassa, lasitavara huuhdeltiin vielä 10 ml:11a TED-puskuria ja liuos siirret-15 tiin kahteen 25 ml putkeen. Nämä putket varastoitiin huoneenlämpötilaan 15,25 tunnin ajan ja sitten sentrifugoitiin 2 tunnin ajan 43 000 rpm, 24 eC:een lämpötilassa. Tuloksena olevat sakat resuspendoitiin Dounce-homogenisoijassa kaikkiaan 30 ml:aan TED-puskuria, siirrettiin kah-20 teen 25 ml:n sentrifuugiputkeen, lasitavara huuhdeltiin vielä 20 ml:11a TED-puskuria ja sentrifugoitiin uudestaan 43 000 rpm, 4 °C:een lämpötilassa 2 tunnin ajan. Sakat resuspendoitiin 50 ml:aan fosfaattipuskuria, pH 7, ja alistettiin kolmanteen sentrifugaatioon, 43 000 rpm, 2 h, • 25 4 °C. Sakat resuspendoitiin 82 ml:aan vettä ja siirrettiin « · 20,5 ml erinä kahteen 50 ml:n muovisiin, steriileihin sentrifuugiputkiin (FALCON). Sen jälkeen kun oli seisotettu 4 °C:een lämpötilassa 18 tuntia, konjugaattivalmiste sentrifugoitiin 1000 rpm 3,5 minuuttia TH-roottorissa 30 TJ-6-sentrifuugissa. Lopulliselle tuotekonjugaattisuspen- siolle tehtiin proteiini- (Lowry), 18C-polysakkaridi- (fenoli /rikkihappo ) , konjugoitumaton polysakkaridi- (kokoeks-kluusiokromatografia - nopeusnefelometria) ja aminohappo-määritys (SPINCO): 35 Polysakkaridi=339 mikrogrammaa/ml; 107370 90

Proteiini=2,57 mg/ml;

Vapaa polysakkaridi: < 5 % (koevirheen raja) S-karboksimetyylihomokysteiini/lysiini * 0,025; S-karboksimetyylikysteamiini/lysiini = 0,005.

5

Esimerkki 26

Pn4-Ps-välituotteen valmistus: (1) Ultraäänihydrolyysi: 1,0 g erä Pn4-Ps-jauhetta liuotettiin 400 ml:aan suolaliuosta (0,9 % NaCl) sekoit- 10 taen huoneenlämpötilassa noin 4 tunnin ajan. Sitten liuos sonikoitiin muovisessa dekantterilasissa jäähauteessa Branson Sonifier -laitteella (1,25 cm koetin, asetus 8) 10 minuutin jaksoina aina 20 minuutin kokonaisaikaan asti. Viskositeetti tarkastettiin kunkin väliajan kuluttua. 15 20 minuutin kuluttua saavutettiin viskositeettiloppupiste 1,267 senttistokea. Hydrolysoitu näyte tuotiin huoneenlämpötilaan, ja natriumasetaattireagenssia (18,7 g) lisättiin niin, että loppukonsentraatio oli 3 % (w/v).

(2) Serologinen testaus: Isopropanoli (IPA) frak-20 tiointipilottikoe ja vasta-aineella ohjattu päätepisteen

Nephelose-määritys, joka suoritettiin 10 ml erälle näytettä, osoitti että Pn4-Ps saostuisi 45 - 55 %:ssa IPA:aa.

(3) Ensimmäinen IPA:n lisäys: Hydrolysoitu näyte [tilavuus = 385 ml, vaiheesta 1 yllä] tehtiin 49,7 %:seksi • 25 IPA:n suhteen lisäämällä 379 ml IPA:ia (lisättiin tipoit- « · tain sekoittaen huoneenlämmössä). Näytteen annettiin sekoittua 15 - 30 minuuttia ja sitä sentrifugoitiin sitten 11 000 g:ssä 30 minuuttia (Beckman JA-10-roottori, 8 000 rpm, 20 °C). Jätesakka trituroitiin absoluuttisessa 30 EtOH:ssa 250 ml:n Omnimix-astiassa, sitten se kerättiin ·· 60 ml:n lasisintterisuppiloon. Sakka pestiin suoraan sup pilossa absoluuttisella EtOH:lla, sitten asetonilla ja kuivattiin in vacuo CaCl2:n yläpuolella huoneenlämpötilassa valmisteluna analyysiin.

35 (4) Toinen IPA:n lisäys ja välituotteen keräys: 91 107370 49,7 % IPA-supernatanttineste [tilavuus 727 ml, vaiheesta 3 yllä] tehtiin 52,2 % IPA:n suhteen lisäämällä 38 ml IPA:a tipoittain samalla sekoittaen huoneenlämpötilassa. Näytettä seisotettiin ja sentrifugoitiin kuten vaiheessa 3 5 yllä. Sakka trituroitiin, kerättiin, pestiin ja kuivattiin kuten vaiheessa 3 yllä. Pn4-Ps-tuote painoi 516 mg.

(5) Dialysointi ja lyofilisointi: Osa (500 mg)

Pn-Ps-näytettä vaiheesta 4 yllä liuotettiin 200 ml:aan tislattua H20:ta huoneenlämpötilassa 2-3 tunnin ajan. Liuos 10 (2,5 mg/ml) siirrettiin dialyysiletkuun (12 000 MW alara ja; 45 mm) ja dialysoitiin tislattua H20:ta vastaan 4 °C:een lämpötilassa 27 tuntia niin, että tislattu H20 vaihdettiin vielä 2 kertaa. Sitten näyte siirrettiin lyo-filisointipulloihin, jäädytettiin pullon sisäpintaan kui- 15 vajää-metanolihauteessa ja lyofilisoitiin Virtis (Free-zemobile) lyofilisoijassa 2-3 päivän ajan. Lopullisen Ps-tuotteen saalis oli 491 mg. Lopullisen tuotteen Kd oli 0,69.

Tämän paljastuksen perusteella pitäisi olla ilmeis- 20 tä ammattimiehille, että muita karboksyylejä sisältäviä

Pn-Ps-alatyyppejä, kuten Pnl-Ps tai Pn5-Ps, voitaisiin valmistaa tässä paljastetun menetelmän mukaisesti ja kon- jugoida kuten Pn4-Ps tai Pn9V-Ps, jotka ovat myös happamia polysakkaridej a.

. 25 Esimerkki 27 • · * S. pneumoniae tyyppi 4 -OMPC-konjugaatti, Pn4-Ps-OMPC: A. Dowex 50x2 tetrabutyyliammoniummuodossa olevan hartsin (200-400 mesh) valmistus [Dowex 50 (Bu4N*)]: 30 Dowex 50x2 (200-400 mesh) H+-muoto (500 g) lietet- tiin H20:ssa (CM-66), ladattiin pylvääseen ja pestiin perätysten 1) 600 ml:11a H20:ta; 2) 1000 ml:11a 6 N HCl:ia; 3) 400 ml:11a H20:ta kunnes effluentti antoi neutraalin 35 testituloksen pH-paperilla; 92 107370 4) 72 g 10 % tetrabutyyliammoniumhydroksidin vesiliuosta kunnes effluentti oli vahvasti emäksinen pH-paperin mukaan; 5) 1000 ml H20:ta neutraaliisuuteen asti.

5 B. S. pneumoniae tyyppi 4 -polysakkaridin tetrabu- tyyliammoniummuodon [Pn4(Bu4N+) ] valmistus: 65 ml pylväs Dowex 50X2:ta (Bu4N+) pestiin 520 ml:11a H20:ta. Pn4-polysakkaridi (molekyylipainoltaan pienennetty (400 mg)) peitettiin 35 ml:lla H20:ta ja sek-10 oitettiin 20 minuutin ajan, jossa vaiheessa kaikki näytti liuenneen (sekoitusta jatkettiin yli yön). Tämä liuos pantiin pylvääseen ja annettiin painua läpi painovoimalla ja pylväs pestiin 150 ml:lla H20:ta ja yhdistetyt effluentit lyofilisoitiin, mikä tuotti 504 mg Pn4 (Bu4N+) -suolaa.

15 C. Pn 4:n 1,4-butaanidiamiini johdannaisen (Pn4-

Buä2) valmistus:

Pn4 (Bu4N+) (97 mg) peitettiin 16 ml:11a DMS0:ia (dimetyylisulfoksidi) ja liuotettiin sekoittamalla 52 °C:een lämpötilassa 15 minuutin ajan. Tässä vaiheessa 20 kaikki kiinteä aine oli liuennut ja liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan.

Tähän liuokseen lisättiin 2 mg karbonyylidi-imidat-solia (CDI), joka oli liuotettu 160 mikrolitraan DMS0:ia, ja tuloksena olevaa liuosta sekoitettiin huoneenlämpöti-- · 25 lassa 1,0 tuntia. Valmistettiin liuos, joka sisälsi 0,500 g 1,4-butaanidiamiinidihydrokloridia (BuA2 2HC1) 5 ml:ssa H20:ta ja sen pH säädettiin arvoon 10,20 5,0 N NaOH:lla. Tämä liuos jäähdytettiin jäähauteella. Seisotettu DMSO-liuos lisättiin hitaasti kylmään BuA2-liuokseen ja 30 sekoitettiin vielä jäähauteella 5 minuutin ajan. Sitten ** sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, jonka jälkeen liuos ladattiin Spectrapor 2 -dialyysiletkuun, joka katkaistiin nesteen yläpinnasta laskien 1,25 cm päästä, ja dialysoitiin seuraavia vastaan: 35 1) 4 1 0,1 M pH 7,0 NaP04-puskuri, 15,0 tuntia; 93 107370 2) 4 1 0,01 M pH 7.0 NaP04-puskuri, 9 tuntia; 3) 15 1 0,01 M pH 7,0 NaP04-puskuri, 21 tuntia; 4) 4 1 H20:ta, 20 tuntia.

Tämä liuos lyofilisoitiin 70 mgrksi Pn 4:n 1,4-butaanidi-5 amiinijohdannaista (Pn 4-BuA2). NMR-spektri noin 5 mg:sta tätä materiaalia paljasti 22 butaanidiamiinitähteen tulleen mukaan 100 toistuvaa monomeerista polysakkaridiyk-sikköä kohden, joka määriteltiin vertaamalla butaanidi-amiinin sisäisten metyleenien ja (Pn 4:n) N-asetyylime-10 tyylien resonanssien integraaleja.

D. Pn 4:n bromiasetyloidun butaanidiamiinijohdannaisen (Pn4-BuA2-BrAc) valmistus:

Pn 4-BuA2 (54 mg) peitettiin 5,5 ml:11a 0,1 M puskuria (pH 9,04) (Kolthoffin boraatti-fosfaatti) ja sekoi-15 tettiin jotta se saataisiin liukenemaan. Sitten lisättiin 55 mg p-nitrofenyylibromiasetaattia, joka oli liuotettu 1,0 ml:aan asetonitriiliä. Tuloksena olevaa seosta sekoitettiin 17 tuntia 4 °C:een lämpötilassa. Sitä dialysoitiin sitten Spectrapor 2 -letkussa seuraavia vastaan: 1) 16 1 20 H20:ta, 24 tuntia; 2) 16 1 H20:ta, 8 tuntia; 3) 16 1 H20:ta, 23 tuntia. Tässä vaiheessa tilavuus oli 12,5 ml, josta otettiin sivuun 1,0 ml määrityksiä varten (NMR, Ouchterlo-ny ja Viscotek) ja sitten lisättiin 275 mg kuivattua fos-faattipuskurisuolaa, pH 8 (valmistettu lyofilisoimalla ; 25 0,1 M NaP04-liuos, pH 8). Liukenemisen jälkeen se suodatet tiin 0,2 mikronin Corning-suodattimen läpi, mikä tuotti Pn 4 -BuA2-BrAc-vesiliuoksen, pH 8.

E. OMPCrn (N. meningitidis) konjugointi Pn 4-BuA2-BrAcriin: 30 Ulkomembraaniproteiinikompleksi (N. meningitidis, OMPC 4,34 mg/ml) (5 ml) sentrifugoitiin 80 Ti-roottorissa 43 000 rpm (43 K) 4 °C:een lämpötilassa 2 tuntia. Tioloin-tiseos valmistettiin liuottamalla 85 mg EDTA:aa (etyleeni-diamiinitetraetikkahapon dinatriumsuola) ja 15 mg ditio-35 treitolia (DTT) 10 ml:aan Na2B407-puskuria, pH 11,09. 50 mg 107370 94 N-asetyylihomokysteiini-tiolaktonia lisättiin ja sitten liuos suodatettiin 0,2 mikronin suodattimen läpi. Yllä olevasta sentrifugaatiosta saadut sakat irrotettiin 5 ml:aan suodatettua tiolointiseosta, siirrettiin Dounce-5 homogenisoijaan ja resuspendoitiin. Resuspendoitu liuos siirrettiin sentrifuugiputkeen, suljettiin tiiviiisti tiivisteellä ja ilma korvattiin N2:lla Firestone-venttiiliä käyttäen. Reaktioseosta seisotettiin 19 tuntia ja sitten se siirrettiin sentrifuugiputkeen, joka täytettiin 1 M 10 KH2P04:lla (vesiliuos) ja sitten sentrifugoitiin 2 tunnin ajan 43 000 rpm, 4 °C. Supernatantit poistettiin ja sakat resuspendoitiin 10 ml:aan 0,1 M NaP04-puskuria, pH 8,0. Tämä liuos siirrettiin sentrifuugiputkeen ja suoritettiin toinen ultrasentrifugointi (2 h, 4 “C, 43 000 rpm). Sakat 15 resuspendoitiin 11,5 ml:aan Pn 4-BuA2-BrAc-liuosta, joka valmistettiin osassa D. Ellmanin määritys osoitti, että SH:ia oli yhteensä 3,44 mikromoolia tai noin 158 nanomoo-lia SH/mg OMPC:ia. Tuloksena olevaa reaktiota (ts. Pn 4-BuA2-BrAc tioloidun 0MPC:n kanssa) seisotettiin N2:n alla 20 (kaasunpoistolla) N2-laatikossa huoneenlämpötilassa 66 tuntia.

Reaktioon lisättiin sitten "cap"-ryhmät seuraavasti: Liuos, joka sisälsi 5 mg N-etyylimaleimidia (NEM) 1 ml:ssa 0,1 M NaP04-puskuria, pH 8, suodatettiin 0,22 mik-• 25 ronin suodattimen läpi ja lisättiin ylläolevaan reaktio- j · * seokseen ja vanhennettiin 5 tuntia. Sitten 0,1 ml N-ase-tyylikysteamiinia 0,4 ml:ssa 0,1 M P04-puskuria, pH 8, suodatettiin 0,22 mikronin suodattimen läpi ja tämä liuos lisättiin reaktioon ja vanhennettiin 14,5 tuntia.

30 Reaktioseosta sentrifugoitiin sitten 43 000 rpm, 4 °C, 2 tunnin ajan ja sakka resuspendoitiin 8 ml:aan 1 x TED-puskuria. Tätä liuosta vanhennettiin huoneenlämmössä yli yön ja sitten sentrifugoitiin 43 000 rpm, 4 °C, 2 tuntia. Sakka resuspendoitiin 8 ml:aan TED-puskuria ja 35 sentrifugoitiin välittömästi uudelleen 2 tuntia 43 000 rpm 107370 95 ja 4 °C. Pelletti resuspendoitiin sitten 10 ml:aan 0,1 M P04-puskuria, pH 7,0, ja sentrifugoitiin uudelleen 43 000 rpm, 4 °C, 2 tunnin ajan. Tämä lopullinen sakka resuspendoitiin 7,5 ml:aan H20:ta. Sen jälkeen kun suspensiota oli 5 seisotettu yli yön 4 °C:een lämpötilassa, se sentrifugoitiin 1000 rpm 3 minuutin ajan ja supernatantti poistettiin lopullisena konjugaattina.

Määritykset: Lowryn proteiinimääritys: 0,920 mg/ml;

Fenoli-rikkihappomääritys: 0,212 mg/ml; 10 Ps/Pro=0,23; SCMHC/lys=0,031; SCMC/lys=0,022.

Kun tätä konjugaattia annettiin hiirille tai afrikkalaisille viherapinoille, korkeita Pn4-Ps-vasta-ainetiitterei-15 tä kohosi Pn4-Ps-spesifisellä ELISA-määrityksellä mitattaessa.

Esimerkki 28

Pn9V-Ps-välituotteen valmistus: (1) Ultraäänihydrolyysi: 20 1,0 g erä Pn9V-Ps-jauhetta liuotettiin 400 ml:aan suolaliuosta (0,9 % NaCl) sekoittaen huoneenlämpötilassa noin 4 tunnin ajan. Sitten liuos sonikoitiin muovisessa dekantterilasissa jäähauteessa Branson Sonifier -laitteella (1,25 cm koetin, asetus 8) 3 minuutin ajan. Viskosi-25 teetti tarkastettiin tämän ajan kuluttua. 13 minuutin ku- • · luttua suoritettiin toinen 1 minuutin sonikointi, jolloin saavutettiin viskositeettiloppupiste 1,117 senttistokea. Hydrolysoitu näyte tuotiin huoneenlämpötilaan ja natrium-asetaattireagenssia (19,5 g) lisättiin niin, että loppu-30 konsentraatio oli 3 % (w/v).

*· (2) Serologinen testaus:

Isopropanoli (IPA) -fraktiointipilottikoe ja vasta-aineella ohjattu päätepisteen Nephelose-määritys, joka suoritettiin 10 ml erälle näytettä, osoitti että Pn 9V Ps 35 saostuisi 40-45 %:ssa IPA:ia.

96 1 0 7 3 7 0 (3) Ensimmäinen lPA:n lisäys:

Hydrolysoitu näyte (tilavuus = 391 ml, vaiheesta 1 yllä) tehtiin 41,8 %:seksi IPA:n suhteen lisäämällä 281 ml IPA:aa (lisättiin tipoittain sekoittaen huoneenlämmössä).

5 Näytteen annettiin sekoittua 15-30 minuuttia ja sitä sent-rifugoitiin sitten 11 000 g:ssä 30 minuutin ajan (Beckman JA-10-roottori, 8 000 rpm, 20 eC). Jätesakka trituroitiin absoluuttisessa EtOH:ssa 250 ml:n Omnimix-astiässä, sitten se kerättiin 60 ml:n lasisintterisuppiloon. Sakka pestiin 10 suoraan suppilossa absoluuttisella EtOH:lla, sitten ase tonilla ja kuivattiin in vacuo CaCl2:n yläpuolella huoneenlämpötilassa analyysiin valmistettaessa.

(4) Toinen IPA:n lisäys ja välituotteen keräys: 41,8 % IPA-supernatanttineste [tilavuus 637 ml, 15 vaiheesta 3 yllä] tehtiin 44,3 % IPA:n suhteen lisäämällä 28,6 ml iPAtia tipoittain samalla sekoittaen huoneenlämpötilassa. Näytettä seisotettiin ja sentrifugoitiin kuten vaiheessa 3 yllä. Sakka trituroitiin, kerättiin, pestiin ja kuivattiin kuten vaiheessa 3 yllä. Pn9V-Ps-välituote 20 painoi 342,2 mg.

(5) Dialysointi ja lyofilisointi:

Osa (347 mg) Pn-Ps-näytettä vaiheesta 4 yllä liuotettiin 139 ml:aan tislattua H20:ta huoneenlämpötilassa 4-5 tunnin ajan. Liuos (2,5 mg/ml) siirrettiin dialyysi-; 25 letkuun (12 000 MW alaraja; 45 mm) ja dialysoitiin tislat tua H20:ta vastaan 4 °C:een lämpötilassa 25 tuntia niin, että tislattu H20 vaihdettiin vielä 2 kertaa. Sitten näyte siirrettiin lyofilisointipulloihin, jäädytettiin pullon sisäpintaan kuivajää-metanolihauteessa ja lyofilisoitiin 30 Virtis (Freezemobile) -lyofilisoijassa 2-3 päivän ajan.

** Lopullisen Ps-tuotteen saalis oli 303,5 mg. Lopullisen tuotteen kd oli 0,60.

(6) Kolmas IPA:n lisäys ja tuotteen keräys: 44,3 % IPA-supernatanttineste [tilavuus 655 ml, 35 vaiheesta 4 yllä] tehtiin 46,8 %:seksi IPA:n suhteen li- 97 107370 säämällä 30,8 ml IPA:ia tipoittain samalla sekoittaen huoneenlämpötilassa. Näytettä seisotettiin ja sentrifugoitiin kuten vaiheessa 3 yllä. Sakka trituroitiin, kerättiin, pestiin ja kuivattiin kuten vaiheessa 3 yllä. Pn9V-Ps-tuo-5 te painoi 410,8 mg.

(7) Dialysointi ja lyofilisointi:

Osa (420,4 mg) Pn-Ps-näytettä vaiheesta 6 yllä liuotettiin 168 ml:aan tislattua H20:ta huoneenlämpötilassa 4-5 tunnin ajan. Liuos (2,5 mg/ml) siirrettiin dialyysi-10 letkuun (12 000 MW alaraja; 45 mm) ja dialysoitiin tislattua H20:ta vastaan 4 eC:een lämpötilassa 25 tuntia niin, että tislattu H20 vaihdettiin vielä 2 kertaa. Sitten näyte siirrettiin lyofilisointipulloihin, jäädytettiin pullon sisäpintaan kuivajää-metanolihauteessa ja lyofilisoitiin 15 Virtis (Freezemobile) lyofilisoijassa 2-3 päivän ajan. Lopullisen Ps-tuotteen saalis oli 342,5 mg. Lopullisen tuotteen kd oli 0,60.

(8) Ammattimiehille on ilmeistä, että tuotteet vaiheissa 4 ja 6 olisi voitu kerätä yhteen lisäämällä enemmän 20 IPA:a, sitten dialysoida ja lyofilisoida yhtenä tuotteena, jonka analyyttiset ominaisuudet olisivat yksilöllisten alafraktioiden ominaisuuksien painotettu keskiarvo. Ammattimiehille pitäisi myös olla ilmeistä, että Pnl-Ps tai Pn5-Ps voitaisiin käsitellä samalla tavoin kuin Pn9V-Ps • 25 tai Pn4-Ps, kuten tässä on paljastettu.

Esimerkki 29

Pn9V:n konjugointi 0MPC:n kanssa:

Pn9V-Ps, joka on valmistettu esimerkin 28 mukaisesti, konjugoidaan samalla tavalla kuin Pn4-Ps, kuten esite-30 tään esimerkissä 27.

Esimerkki 30

Asetaatin kvantitatiivinen määritys Pn9V/18C-Ps: ssa ja pyruvaatin kvantitatiivinen määritys Pn4-Ps:ssa:

Kehitettiin menetelmä, jolla voitiin kvantitoida 35 0-pyruvaatin säilyminen Pn4-Ps:ssa ja O-asetaattiryhmien QO 1 0 7 3 7 0 98 säilyminen Pn9V-Ps:ssa ja Pnl8C-Ps:ssa sinä aikana kun käsitellään pneumokokki(Pn)-kapselipolysakkarideja (Ps). O-asetyyli- tai O-pyruvaattiryhmät vapautetaan ensin hydrolysoimalla, sitten asetaatti ja pyruvaatti PnPs-hydroly-5 saatissa tunnistetaan ja kvantitoidaan käyttäen korkean suorituskyvyn anioninvaihtokromatografiaa, joka on kytketty suppressoituun konduktiviteetin detektioon.

Tällä menetelmällä analysoitiin käsittelemättömät ja käsitellyt Pn4-, Pn9V- ja Pnl8C-näytteet. Alustavat 10 tulokset osoittivat pyruvaatille likimääräisen 1:1 ja 0,8:1 -molaarisen suhteen suhteessa kuhunkin toistuvaan Ps-yksikköön käsittelemättömälle ja vastaavasti koon mukaan valikoidulle Pn4:lle. Asetaatin molaaristen suhteiden kullekin toistuvalle Ps-yksikölle Pnl8C-Ps:ssa havaittiin 15 olevan 1:1 ja 0,8:1 käsittelemättömille ja vastaavasti koon mukaan valikoiduille näytteille; ja 1,7:1 ja 1,5:1 käsittelemättömälle ja vastaavasti koon mukaan valikoidulle Pn9V:lle. Pnl8C-Ps-0MPC-konjugaatin veteen liuotetusta erästä analysoitiin myös näyte silmälläpitäen O-asetaatin 20 molaarista suhdetta kutakin toistuvaa Ps-yksikköä kohden ja sen havaittiin olevan noin 0,5:1.

Kirjallisuudessa on raportoitu, että pyruvaatti-ryhmä on voimakas immunodeterminantti tyypin 4 kapseli-polysakkarideissa, ja sen poistaminen johtaa merkittäviin • 25 muutoksiin immunologisessa spesifiteetissä [Heidelberger, • · M., Dudman, W.F. ja Nimmich, W., ’Immunochemical relationships of certain capsular polysaccharides of Klebsiella, pneumococci and Rhizobia. ' J. Immunol., 104, 1321-1328, (1970); Higginbotham, J.D., Heidelberger, M., ja Got-30 schlich, E., 'Degradation of a pneumococcal type-specific ·· polysaccharide with exposure of group-specificity.' Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 67, 138-142 (1970)]. Vastaavasti O-asetaattiryhmän poisto tyypin Pnl8C-Ps polysakkaridissa poisti sen immunologisen spesifiteetin [Estrada-Parra, 35 S. ja Heidelberger, M., 'The specific polysaccharide of 107370 99 type XVIII pneumococcus.' Biochemistry,. 2, 1288-1294 (1963)]. Oli näin ollen välttämätöntä kehittää kvantitatiivinen menetelmä asetaatin ja pyruvaatin määrittämiseksi Pnl8C-Ps:ssa ja Pn4:ssa. O-asetyyliryhmät Pn9V:ssa saat-5 tavat myös esittää merkittävää osaa Pn9V:n immunologisessa rakenteessa, koska de-O-asetyloidulla Pn9V:lla ei ole antigeenistä reaktiivisuutta nopeusnefelometrisella mittauksella määritettäessä.

Havaitsimme, että O-asetaatti vapautuu helposti 10 Pn9V:sta ja Pnl8C-Ps:sta emäksisissä oloissa (pH 11) 4 °C:een lämpötilassa ja O-pyruvaatti vapautuu helposti Pn4:sta kuumennettaessa 65 °C:een lämpötilaan. Havaitsimme, että asetaatti ja pyruvaatti voidaan erottaa hydrolysoidusta PnPs-näytteestä käyttäen OmniPac PAX500-pylväs-15 tä virtausnopeudella 1 ml/min liikkuvan faasin ollessa 0,98 mM NaOH ja 2 % MeOH. Detektio saatiin aikaan vaimennetulla konduktiviteettidetektiolla käyttäen 25 mM H2S04:oa regeneranttina virtausnopeudella 10 ml/min. Tässä esimerkissä paljastetaan optimaaliset hydrolyysiolosuhteet kvan-20 titatiivista HPLC-analyysiä varten O-asetaatille ja O-py-ruvaatille Pnl8C-Ps:sta, 9V:sta ja vastaavasti Pn4:sta.

Laitteisto

Dionex BioLC varustettiin OmniPac PAX-500 suojapyl-väällä ja analyyttisellä pylväällä (4,6 x 250 mm). Sup-25 pressoitu konduktiviteetin detektio saatiin aikaan 25 mN

• · rikkihapon ollessa regenerantti. Virtausnopeus asetettiin 10 ml:ksi/min Dionex-autoregenerointiyksiköllä. Liikkuva faasi ja gradienttiohjelma, jolla erotetaan asetaatti ja pyruvaatti hydrolysoidusta PnPs-näytteestä, luetellaan 30 seuraavassa taulukossa: 100 107370

Puskuri 1 - 1 mM natriumhydroksidi Puskuri 2 - 100 % metanaali Puskuri 3 - 200 mM natriumhydroksidi Puskuri 4 - vesi 5 Aika %Puskuri 1 %Puskuri 2 %Puskuri3 %Puskuri 4 Virtaus (ml/min) 0 98 2 0 0 1 12.5 98 2 0 0 1 12.6 58 2 0 40 1,5 10 20,0 58 2 0 40 1,5 20,1 98 2 0 0 1,5 30.0 98 2 0 0 1,5 30.1 98 2 0 01 50,0 98 2 0 0 1 15 Käyttämällä näitä menetelmiä ja detektorin herkkyyttä 3 μSiemensiä, voidaan havaita helposti 4 nanomoolia asetaattia ja pyruvaattia, jotka eluoituvat retentioajoilla noin 5,2 ja vastaavasti 9,5 minuuttia.

20 Näytteen valmistus

Puhdistetut PnPs-näytteet Merckin Manufacturing Division -osastolta alistettiin Karl Fischer -titraukseen käyttäen Aquastar V3000-volymetristä kosteustitrauslaitet-ta, jotta saataisiin määritettyä tähteeksi jääneen H20:n . 25 määrä, ja sitten ne liuotettiin Milli-Q-veteen konsentraa- tiona 1,0 mg kuivapainoa per ml. Näytteitä (100 pg/ml) käsiteltiin 2 mM NaOH:ssa 16 tuntia huoneenlämpötilassa O-asetaatin poistamiseksi Pn9V-Ps- ja Pnl8C-Ps-näytteis-tä. Pn4-Ps-näytteet hydrolysoitiin 1 mM HClrssa 65 °C:een 30 lämpötilassa 16 tuntia O-pyruvaatin poistamiseksi Pn4:sta. ·· Koon mukaan valikoidut Pn9V-näytteet ja Pnl8C-Ps ja Pnl8C-

Ps-OMPC -konjugaatin veteen liuotettu erä alistettiin myös monosakkaridikoostumusanalyysiin korkean pH:n anioninvaih-tokromatografiällä ja pulssiamperometrisella detektiolla. 35 Monosakkaridikoostumusanalyysi suoritettiin, jotta saatai- ιοί 107370 siin PnPs:n oikea konsentraatio koon mukaan valikoiduissa ja veteen liuotetuissa suurissa määrissä konjugaattinäyt-teitä.

Asetaatti-, pyruvaatti- ja N-asetyylimannosamiini-5 standardit liuotettiin Milli-Q-veteen konsentraatioksi 200 nanomoolia/ml.

Näytteiden ja standardien hydrolyysi

Pnl8C-Ps:n de-O-asetylaatiota tutkittiin käsittelemällä Pnl8C-Ps neljällä NaOH-konsentraatiolla (1,2,4 ja 10 50 mM) eri lämpötiloissa (4, 25, 45 ja 65 °C) ja eri aika pisteissä (3, 5 ja 16 tuntia). Tutkimukseen otettiin mukaan myös asetaatin, pyruvaatin ja N-asetyylimannosamiinin standardiliuokset sen määrittämiseksi, johtaisivatko ne konsentraatiot, jotka ovat välttämättömiä de-O-asetylaa-15 tiolle, myös asetaatin/pyruvaatin hajoamiseen tai N-ase-tyyliryhmien katoamiseen.

Pyruvaatin poistumista Pn4:sta tutkittiin sen jälkeen kun oli käsitelty joko natriumhydroksidilla (50 mM/100 °C/16 h) tai suolahapolla eri konsentraatiossa (1, 20 10, 100 mM), ajoilla (3, 5 ja 16 tuntia) ja lämpötiloissa (65, 85 ja 100 °C).

Nopeusnefelometria

Mitattiin Pn9V-Ps:n, Pnl8C-Ps:n ja Pn4-Ps:n nopeus-nefelometrinen aktiivisuus ennen de-O-asetylaatiota tai 25 de-O-pyruvylaatiota ja niiden jälkeen. Näytteet laimen- • · i nettiin pitoisuuksiksi 1, 1,5, 2 ja 2,5 pg/ml.

Korkean suorituskyvyn kokoekskluusiokromatografia (HPSEC)

Mitattiin Pn9V-Ps:n, Pnl8C-Ps:n ja Pn4:n HPSEC en-30 nen de-O-asetylaatiota tai de-O-pyruvylaatiota ja niiden jälkeen. 7,5 x 600 mm TSK G6000PW-pylväs, joka oli varustettu virtausrajoittimella, kuumennettiin 50 °C:een lämpötilaan 5520-6900 kPa:ssa ja tasapainotettiin 0,2 M nat-riumasetaatilla nopeudella 0,3 ml/min. 60 pg näyte 35 (1 mg/ml) injektoitiin pylvääseen ja eluoitiin liikkuvan 102 1 0 7 3 7 0 faasin mukana nopeudella 0,3 ml/min. Pylvään eluantti sekoitettiin pylvääseen sen jälkeen pannun lisäyksen kanssa (0,5 M NaOH virtausnopeudella 0,5 ml/min), monitoroitiin pulssiamperometrisella Dionex-detektorilla ja kd mitattiin. 5 Määrityksen herkkyys ja lineaarisuus

Detektorin lineaarisuus ja herkkyys määritettiin 3 pSiemensillä sekä pyruvaatille että asetaatille. Pyru-vaatti ja asetaatti voitiin havaita 0,125 nanomoolin alemmalla alarajalla. Detektorin responssi molemmille kompo- 10 nenteille oli lineaarinen 2 nanomooliin saakka korrelaa-tiokertoimilla 0,9999 ja 0,9992 pyruvaatille ja vastaavasti asetaatille.

O-asetaatin Pnl8C-Ps:sta poiston optimointi Alustavat tutkimukset Pnl8C-Ps:n hydrolysoitumi-15 sesta ajan suhteen osoittivat O-asetyyliryhmän labiilisuu-den matalissa lämpötiloissa tapahtuvan emäksisen hydrolyy-sin suhteen. 2 mM natriumhydroksidi riitti täysin de-0-asetyloimaan Pnl8C-Ps:n 4 °C:een lämpötilassa 16 tunnin inkuboinnin jälkeen. Käsittelyjen korkeammissa lämpö-20 tiloissa (>25 °C) havaittiin vapauttavan N-asetaatin N-asetyylimannosamiinista, mikä häiritsisi Pn9V-0-asetaa-tin mittausta. Optimaalisen hydrolyysiolosuhteen 0-asetaa-tin poistamiseksi PnPs:sta havaittiin olevan 16 tuntia 4 °C:een lämpötilassa. Vähemmän kuin 1 % asetaatista ha- * 25 vaittiin poistuvan sellaisesta N-asetyylimannosamiinistan- • « dardista, joka oli käsitelty 2 mM NaOH:11a 16 tuntia huoneenlämpötilassa .

O-pyruvaatin Pn4:sta poiston optimointi Pn4:n hydrolyysitutkimukset suoritettiin alunperin 30 natriumhydroksidihydrolyysiä käyttäen. Havaittiin pian, " että hyvin vähän pyruvaattia saatiin talteen kun käytet tiin natriumhydroksidia. Alussa tehdyt kontrollitutkimuk-set osoittivat, että pyruvaatti lohkeaa irti Pn4:sta H20:ssa 100°C:een lämpötilassa. Tämän tiedon myötä päätet-35 tiin suorittaa O-pyruvaatin vapautumista Pn4:sta koskevat 103 107370 optimointi-tutkimukset käyttämällä HCl-hydrolyysiä korkeissa lämpötiloissa. Korkeammissa lämpötiloissa ilmeni jonkin verran pyruvaatin hajoamista. Tämä voidaan osoittaa pyru-vaattinäytestandardilla, joka on hydrolysoitu samoissa 5 olosuhteissa kuin Pn4. Pyruvaattia saatiin eniten talteen, kun hydrolyysi suoritettiin 1 mM HCl:ssa 16 tunnin ajan 65 °C:een lämpötilassa.

O-asetaatin ja O-pyruvaatin analyysi PnPs-näytteis-sä 10 Eri näytteistä, jotka edustavat lähtö-PnPs:ia, koon mukaan valikoitua PnPs:ia ja yhtä Pnl8C-Ps-0MPC-konjugaat-tia, analysoitiin O-asetaatti/pyruvaatti yllä kuvatulla HPLC-menetelmällä, sen jälkeen kun on hydrolysoitu 2 mM NaOHissa huoneenlämpötilassa, jotta saadaan vapautettua 15 O-asetaatti Pn9V-Ps/18C:sta, tai 1 mM HCl:ssa 65 °C:een lämpötilassa jotta saadaan vapautettua O-pyruvaatti Pn4-Ps:sta. Tämän tutkimuksen tulokset esitetään alla: Näyte Kunkin toistuvan Ps-yk- 20 sikön pyruvaatti/ase- taa11 i-suhde

Pn4, näyte 1 1,0

Pn4, näyte 2 0,8

Pn9V, näyte 1 1,7 25 Pn9V, näyte 2 1,5 > · *

Pnl8C-Ps, näyte 1 1,0

Pnl8C-Ps, näyte 2 0,8

Pnl8C-Ps-0MPC, vesiliukoinen erä 0,5 30 Tulokset osoittavat, että sivuryhmien pysyvyys koon mukaan valikoiduissa PnPs:ssa oli arviolta 90 % Pn9V-Ps:n tapauksessa ja 80 % Pn4:n ja 18C:n tapauksessa. O-asetaatin pysyvyyden Pnl8C-Ps-0MPC-konjugaatin vesiliukoisessa suuressa erässä havaittiin olevan noin 50 %. Teoreettiset 35 arvot Pnl8C-Ps:lle ja Pn4:lle ovat 1 mooli asetaattia tai 104 107370 pyruvaattia per mooli toistuvaa Ps-yksikköä ja Pn9V:lle suhde on 2:1. [Jansson, P-E., Lindberg, B., ja Lindquist, U. ’Structural studies of the capsular polysaccharides from Streptococcus pneumoniae Type 4.' Carbohyd. Res♦, 95, 5 73-80 (1981). Lugrowski, C. ja Jennings, H.J. 'Structural determination of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 18C.' Carbohyd. Res. 131:119-129 (1984). Perry, M.B., Daoust, V., ja Carlos, D.J., 'The specific capsular polysaccharide of Streptococcus pneumo-10 niae Type 9V. ’ Can. J. Biochem. 59: 524-533, (1981)].

O-asetaatin alhaisempi pysyvyys, joka havaitaan Pnl8C-Ps-OMPC-konjugaatissa, on odotettua, mikä johtuu O-asetyyli-ryhmien alttiudesta hydrolysoitua emäksisissä olosuhteissa alhaisissa lämpötiloissa.

15 Mitattiin Pn4-, Pn9V- ja Pnl8C-Ps-näytteiden ja de- O-pyruvyloitujen ja de-O-asetyloitujen näytteiden nopeus-nefelometrinen aktiivisuus. Tulokset osoittavat, että Nephelose-aktiivisuus katosi täysin sen jälkeen kun nämä sivuryhmät oli poistettu, vaikkakin käsittelemättömien 20 näytteiden kd. kd-arvot saatiin yllä kuvatulla HPSEC-mene-telmällä. Kuitenkin miedolla happohydrolyysillä suoritetun de-O-pyruvylaation jälkeen Pn4:n kd lisääntyi 0,60:sta 0,68:aan ja ulkonäkö lähellä suolatilavuutta. Antigeeni-suusaste Pn4:lle ja Pnl8C-Ps:lle tukee muiden tutkijoiden . 25 työtä, kun on kyse näiden sivuryhmien tärkeydestä pneumo kokkien polysakkaridien immunologisesta reaktiivisuudesta. Pn9V:n tulokset viittaavat siihen, että glukuronihapon lisäksi tämän molekyylin O-asetyyliryhmät ovat samoin tärkeitä immunologisia determinantteja.

30 Täten tämän menetelmän mukaisesti on kehitetty no- * pea, herkkä menetelmä O-pyruvyyliketaalin kvantitatiivi sta analysoimista varten Pn4:ssa ja O-asetaatin Pn9V:ssa ja Pnl8C-Ps:ssa. Tämä menetelmä on arvokas määritettäessä oikeaa menetelmää, jolla Pn4, Pn9V ja Pnl8C-Ps voidaan va- 105 107370 likoida koon mukaan ja konjugoida niin, että näiden polysakkaridien antigeeninen rakenne säilyy.

Esimerkki 31

Pn6B-Ps-MlEP-konjugaatin eristys: 5 1. Kaksi konjugaattireaktioseosnäytettä (yksi edus ti toisen H20-dialysoitua näytettä) varastoitiin 3-8 eC:een lämpötilaan käyttöön saakka.

2. 0,2 MOPS-puskuria, pH 7,2, lisättiin näytteisiin niin, että saatiin noin 7 mM lopullinen konsentraatio.

10 Kiinteää GuHClria lisättiin näytteeseen niin, että saatiin aikaan 4,2 M lopullinen konsentraatio (huomautus: Pitäisi lisätä 1,42 g GuHCl/ml näytettä, jotta saadaan kompensoitua tilavuuden kasvu, joka johtuu kiinteän GuHClin lisäyksestä. Samoin puskurin lisäys pitäisi säätää niin, että 15 se vastaa tilavuuden lisäystä, niin että näytteen koostumus on lähempänä pylvään eluentin koostumusta. Vaihtoehtoisesti näyte voitaisiin dialysoida pylvään eluenttia vastaan ennen kromatografiaa).

3. 2,8 ml näytettä (joka sisältää noin 1 mg prote-20 iinia Lowryn proteiinimäärityksen mukaan) injektoitiin 2,6 x 96 cm Sephacryl S-1000 -pylvääseen, joka oli tasapainotettu liuoksella, joka oli 10 mM MOPS: n ja 6 m GuHCl:n suhteen, pH 7,2, virtausnopeudella 0,6 ml/min. Pylväästä ulos virtaavaa nestettä tarkkailtiin jatkuvasti ; 25 280 nm:n aallonpituudella (Perkin Elmer LC 235 diodirivi- detektori) ja kerättiin 3 ml fraktioita.

4. Proteiinijakauma perustui A280:iin (samoin kuin spektreihin) ja Pn6B-Ps-jakauma perustui Pn6B-Ps-spesifi-seen RIA-määritykseen. Niiden kohtien perusteella, joissa 30 Pn6B-Ps-BrAc eluoitui yksinään ja fysikaalisina seoksina inaktivoidun MIEP:n kanssa, tehtiin fraktioiden yhdistel- • · miä, jotka sisälsivät sekä Ps:n että proteiinin, ja ne jotka eluoituivat erillään niistä kohdista, jotka havaittiin Pn6B-Ps-BrAc:n tapauksessa, määritettiin alustavasti 35 Pn6B-Ps-MIEP-konjugaatiksi.

• ·· 106 107370 5. Yhdistelmät konsentroitiin ultrafiltraatiolla käyttäen YM-30-membraania ja diafiltroitiin käyttäen Mil-li-Q-vettä. Proteiini- ja Pn6B-Ps-pitoisuus arvioitiin kvantitatiivisten koostumustutkimusten perusteella.

5 SCMHC:n läsnäolo havaittiin aminohappoanalyysillä.

Esimerkki 32

Pneumokokkipolysakkaridi-Pnl8C-Ps:n suora RXA-mää- ritys Tätä määritystä käytetään kvantitoimaan pneumokokit) kipolysakkaridi tyyppi 18C. Se on monikerroksinen kerros-RIA-määritys. Kanin Pnl8C-Ps-vasta-aineella päällystetään polystyreenipalloja. Palloja inkuboidaan näyteliuoksessa joka sisältää Pnl8C-Ps:n. Inkubaation jälkeen pallot pestään ja inkuboidaan uudestaan toisessa liuoksessa, joka 15 sisältää hiiren vasta-ainetta Pnl8C-OMPC:lie. Tämän inkubaation jälkeen pallot pestään ja inkuboidaan kolmannen kerran liuoksessa joka sisältää vuohen 125I-anti-hiiri-lgG:n. Levyt pestään jälleen, jonka jälkeen pallot siirretään muoviputkiin laskentaa varten. Tuntemattomia Pnl8C-20 Ps-näytteitä verrataan standardisuoraan kvantitaatiota varten.

Varusteet 1. RIA-tarvikesarja: Abbot Labs, Diagnostic Div., Catalog No. 6171-10.

: 25 2. Qwik Wash System, Abbot Labs, Diagnostic Div.

3. Säädettäviä pipettejä ja kertakäyttöisiä pipetin kärkiä (esim. Eppendorf Digital) 4. Gammalaskuri (esim. Abbot Autologic) 5. 62,5 mm polystyreenipalloja, joissa on heijasta- 30 va pintakäsittely: Precision Plastic Ball Co., 3000 N.

Cicero Ave., Chicago, Illinois 60641.

>«

Reagenssit 1. New York State Health Services Pnl8C-Ps-vasta-aine-erä R18-44 tai vastaava.

107 107370 2. Hiiren Pnl8C-Ps OMPC -antiseerumi (pooli 11260-235 tai vastaava) 3. Vuohen anti-hiiri IgG 125I-leimattu antiseerumi: NEX 159, New England Nuclear, 549 Albany Street, Boston, 5 MA 02118.

4. Inkubaatiopuskuri: RCM8 joka sisältää 1,0 % BSA Sigma A2153 0,1 % atsidi Sigma S2002 5. Laimennusaine 10 8 osaa vasikan sikiön seerumia Sigma F3885 1 osan vuohen seerumia Sigma G6767 1 osan kanin seerumia Sigma R4505 0,05 % TWEEN 20:ta Sigma P1379 0,1 % atsidia Sigma S2002 15 3. Lisää 1 Pnl8C-Ps-vasta-aineella päällystetty pallo kuhunkin levyn kuoppaan, joka sisältää näytteen tai standardin, ja heiluta levyä hellävaraisesti sen varmistamiseksi, että kaikki pallot ovat täysin puskurin peittämiä.

20 4. Peitä levy tarrapeitteellä, joka tulee RIA-tar- vikesarjan mukana, ja inkuboi levyä huoneenlämpötilassa 6 tunnin ajan.

5. Pese levy käyttäen Qwik Wash -laitetta ja de-ionisoitua vettä.

; 25 6. Laimenna hiiren 18C-vasta-aine 1:1 000 laimen- nusaineeseen.

7. Lisää 200 μΐ tätä liuosta kuhunkin kuoppaan, joka sisältää pallon.

8. Peitä levy ja inkuboi yli yön huoneenlämpöti- 30 lassa.

9. Pese levy käyttäen Qwik Wash -laitetta ja dei- < · onisoitua vettä.

10. Laimenna 125I-leimattu vuohen anti-hiiri-vasta-aine: 15000 cpm/10 μΐ laimennusaineessa (noin 1:160 lai- 35 mennos).

108 107370 11. Lisää 20 μΐ tätä liuosta kuhunkin kuoppaan, joka sisältää pallon.

12. Peitä levy ja inkuboi 37 °C:een lämpötilassa 2 tuntia.

5 13. Pese levy käyttäen Qwik Wash -laitetta ja de- ionisoitua vettä.

14. Siirrä pallot muoviputkiin, jotka tulevat RIA-tarvikejärjestelmän mukana, ja laske käyttäen sopivaa gam-malaskuria.

10 Laskut 1. Yhdistä kaksi rinnakkaista mittausta, jotta saat kunkin näytteen keskiarvon, standardin ja inkubaatiopusku-rikontrollin. Vähennä inkubaatiopuskurikontrolli kaikista standardeista ja näytteistä.

15 2. Käytä laskinta jossa on tilastolaskutoiminnot, ja syötä standardikäyrän tiedot ja laske korrelaatioker-roin ja suoran kulmakerroin.

3. Käytä sopivaa standardisuoraa (vapaata vapaalle, konjugaattia konjugaatille), laske näytteiden responssi ja 20 korjaa laimennokset.

Yllä kuvattua samaa menetelmää voidaan soveltaa mihin tahansa muuhun Pn-Ps-tyyppiin tuomalla tilalle tyyp-pispesifiset reagenssit.

Claims (9)

107370 Patenttivaatimuk set

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kon-jugaatin valmistamiseksi, joka käsittää immunogeenisen 5 proteiinin ja polysakkaridin, joka on peräisin yhdestä tai useammasta Streptococcus pneumoniaen alatyypistä, ja mainitulla polysakkaridilla on keskimäärin vähemmän kuin noin 1200 toistuvaa yksikköä per molekyyli, molekyylipaino vä- 5 6 Iillä 1 x 10 ja 1 x 10 , polydispergoitumisaste välillä 10 1,0 ja 1,4 ja pneumokokkiryhmäspesifisen C-polysakkaridin kontaminaatiotaso alle 3,0 % tyyppispesifisestä polysakkaridista, tunnettu siitä, että proteiini kytketään kovalenttisesti polysakkaridiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan konjugaatti, jossa mainitulla polysakkaridilla on antigeenisuusindeksi välillä 0,7 ja 1,1 ja rajaviskositeetti välillä 0,6 ja 3,0 dl/g.

3. Streptococcus pneumoniae 19F, jolla mainitulla 16 polysakkaridilla on: a) Mn välillä noin 2 x 105 ja 6 x 10% b) Kd (huippu) noin 0,65 ± 0,05; c) Mw välillä noin 2 x 105 ja 6 x 10% d) rajaviskositeetti 0,1 M natriumfosfaatissa, pH 20 7,2, välillä 1,0 - 2,0; ja e) keskimäärin vähemmän kuin noin 1 000 toistuvaa monomeeriyksikköä per molekyyli;

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että valmistetaan konjugaatti, jossa mainittu polysakkaridi on peräisin mistä tahansa Streptococcus pneumoniaen alatyypeistä, jotka voivat olla 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F ja 33F. ·* 25 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan konjugaatti, jossa mainitulla polysakkaridilla on koon polydispergoitumisaste välillä 1,0 - 1,4, C-polysakkaridin kontaminaatiotaso tyyppispesifiseen polysakkaridiin verrattuna vähemmän kuin 30 3 % ja se on peräisin seuraavista: ·. 1) Streptococcus pneumoniae 6B, jolla mainitulla polysakkaridilla on: a) Mm välillä noin 3 x 105 ja 6 x 105; b) kd (huippu) noin 0,60 ± 0,05; 35 c) Mw välillä noin 3 x 10 ja 7 x 105; no 107370 d) rajaviskositeetti 0,1 M natriumfosfaatissa, pH 7.2, välillä 1,0 - 2,0; ja e) keskimäärin vähemmän kuin noin 1' 000 toistuvaa yksikköä per molekyyli; 5 2) Streptococcus pneumoniae 14, jolla mainitulla polysakkaridilla on: a) Mn välillä noin 3 x 10 ja 8 x 10 ; b) krf (huippu) noin 0,60 ± 0,05; c) M välillä noin 4 x 10 ja 1 x 10 ; 10 d) rajaviskositeetti 0,1 M natriumfosfaatissa, pH 7.2, välillä 0,6 - 1,6; ja e) keskimäärin vähemmän kuin noin 1 200 toistuvaa yksikköä per molekyyli;

4. Streptococcus pneumoniae 23F, jolla mainitulla polysakkaridilla on: : s 5 • 25 a) M„ välillä noin 2 x 10 ja 6 x 10 ; b) Kd (huippu) noin 0,54 ± 0,05; c) Mw välillä noin 4 x 105 ja 8 x 10% d) rajaviskositeetti 0,1 M natriumfosfaatissa, pH 7.2, välillä 1,5 - 3,0; ja . 30 e) keskimäärin vähemmän kuin noin 1 000 toistuvaa *: monomeeriyksikköä per molekyyli;

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että OMPC tai MIEP ja Pn-Ps kytketään kaavan mukaisen väliryhmän välityksellä: 30 ’ . PRO-N-COCHCH2CH2SCH2 (CONH (CH2) 4 NHC-O-PnPs, I I II H NHCOCH3 O 35 kun kytketään polysakkaridihydroksyylien välityksellä, tai 107370 PRO-N-COCHCH2CH2SCH2 (CONH (CH2) 4 NHC-O-PnPs, I I II H NHCOCH3 0 5 siinä tapauksessa, että polysakkarideissa on karboksyyli-happoryhmiä, jossa PRO on OMPC tai MIEP, ja Pn-Ps on pneu-mokokkipolysakkaridi, ja konjugaatilla on Pn-Ps:OMPC- tai Pn-Ps:MIEP-massasuhde noin 0,05:n ja 0,5:n välillä ja hyd-rolyysissä ja aminohappoanalyysissä antaa SCMHC/Lys 10 -suhteen välillä 0,01 ja 0,15.

5. Streptococcus pneumoniae 4, jolla mainitulla polysakkaridilla on: a) Mn välillä noin 2 x 10 ja 4 x 10 ; 35 b) Kd (huippu) noin 0,65 ± 0,05; 5 5 c) välillä noin 2 x 10 ia 5 x 10 ; • - W 107370 d) rajaviskositeetti 0,1 M natriurafosfaatissa, pH 7,2, välillä 1,5 - 3,0; ja e) keskimäärin vähemmän kuin noin 600 toistuvaa monomeeriyksikköä per molekyyli; 5 6) Streptococcus pneumoniae 9V, jolla mainitulla polysakkaridilla on: a) Mn välillä noin 3 x 105 ja 6 x 10% b) Kd (huippu) noin 0,65 ± 0,05; c) Mw välillä noin 3 x 105 ja 7 x 10% 10 d) rajaviskositeetti 0,1 M natriumfosfaatissa, pH 7,2, välillä 1,0 ja 2,0; ja e) keskimäärin vähemmän kuin 800 toistuvaa monomeeriyksikköä per molekyyli;

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) viljellään pneumokokkia ja eristetään epäpuhdas pneumokokkipolysakkaridi tai liuotetaan pneumokokkipo- 15 lysakkaridijauhe; b) puhdistetaan ja osittain hydrolysoidaan vaiheen a) polysakkaridi päätepisteeseen, jonka on ennalta määritelty tuottavan sellaisen polysakkaridin, joka kykenee konjugoitumaan, ja jonka tyyppispesifinen antigeenisuuus 20 ei ole vähentynyt 30 %:ia enempää verrattuna vaiheen a) epäpuhtaaseen polysakkaridiin; ja c) konjugoidaan vaiheen b) tuote immunogeenisen proteiinin kanssa, jossa vaiheessa a) viljelty pneumokokki valitaan yhdestä tai useammasta alatyypistä: 4, 6B, 9V, 25 14, 18C, 19F ja 23F, jossa Pn-Ps säilyttää antigeenisen eheytensä Ouchterlony-kaksoisimmunodiffuusiolla tai nope-usnefelometriamäärityksellä mitaten ja käyttäen Pn-Ps-tyyppispesifistä vasta-ainetta, ja mainittu Pn-Ps rikotaan ennen konjugaatiota fysikaalisesti Gaulin puristuslait-30 teella paineella välillä noin 13 800 ja 103 500 kPa tai hydrolysoidaan kuumentamalla 100 °C:een lämpötilassa 24 tuntia tai sonikoimalla viskositeettiin 1 mg/ml liuosta 0,9 M natriumkloridissa tai (piikki) loppupisteeseen, kuten seuraavassa on lueteltu kullekin luettelossa oleval-35 le Pn-Ps-alatyypille: 113 107370 Pn-Ps alatyyppi Tavoiteloppukohdan Tavoiteloppukohdan viskositetti Kd (piikki) (senttistokea) Pn4-Ps 1,5 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pn6B-Ps 1,3 - 1,00 0,60 ± 0,05 Pn9V-Ps 1,3 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl4-Ps 1,1 - 0,95 0,60 ± 0,05 Pnl8C-Ps 1,5 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl9F-Ps 1,3 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pn23F-Ps 1,5 - 1,00 0,54 ± 0,05 jota valinnaisesti seuraa kromatografinen tai alkoholif-raktiointi, jotta saadaan valikoitua materiaali, jonka po-5 lydispergoitumisaste on alle 1,4.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä Pn-Ps-PRO-konjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että: a) eristetään epäpuhdas pneumokokkipolysakkaridi,

10 Pn-Ps; b) i - valinnaisesti puhdistetaan epäpuhdas Pn-Ps epäpuhtauksien ioninvaihtoadsorptiolla; ii - hydrolysoidaan osittain tai rikotaan mekaanisesti epäpuhdas Pn-Ps; 15 c) valinnaisesti fraktioidaan osittain hydrolysoi tu Pn-Ps koon ja puhtauden mukaan; d) derivatisoidaan fraktioitu Pn-Ps, joka on peräisin yhdestä tai useammasta pneumokokkialatyypistä, vaiheiden a) - c) mukaisesti, niin että niissä on nukleofii- 20 lisiä tai elektrofiilisia osia; e) eristetään Neisseria meningitidis b:n OMPC, tai sen alayksiköitä; f) funktionalisoidaan OMPC tai sen alayksikkö niin, että siinä on reaktiivisia elektrofiilisia tai nu- 25 kleofiilisia osia; 114 107370 g) konjugoidaan vaiheen d) polysakkaridi vaiheen f) proteiinin kanssa; h) lisätään konjugaattiin "cap"-rakenteita jäljelle jääneiden funktionaalisten ryhmien poistamiseksi; 5 i) eristetään konjugaattituote.

7. Streptococcus pneumoniae 18C, jolla mainitulla 15 polysakkaridilla on: 5 5 a) Mn välillä noin 2 x 10 ja 6 x 10 ; b) Kd (huippu) noin 0,65 ± 0,05; c) Mw välillä noin 2 x 10 ja 6 x 10 ; d) rajaviskositeetti 0,1 M natriumfosfaatissa, 20 pH 7,2, välillä 1,5 ja 3,0; ja e) keskimäärin vähemmän kuin 700 toistuvaa monomeeriyksikköä per molekyyli; tai mikä tahansa näiden polysakkaridien seos, jossa mainittu polysakkaridi konjugoidaan Neisseria meningi-* 25 tidis b:n ui komembraani kompleksi in (OMPC) tai sen MIEP- alayksikköön.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa b) 1 - valinnaisesti adsorboidaan Whatman DE52:een anionisia epäpuhtauksia liuoksen pH:n ollessa 10 noin 5; 2. osittain hydrolysoidaan liuoksessa oleva Pn-Ps päätepisteviskositeettiin, jonka on ennalta määritelty vähentävän Pn-Ps:n sitoutumista pneumokokki-tyyppispesifi-seen vasta-aineeseen korkeintaan 30 % verrattuna epä- 15 puhtaaseen Pn-Ps:iin, siten, että: 1. kuumennetaan 50 - 150 °C:een lämpötilaan 1 -48 tunniksi; tai 2. sonikoidaan 5 sekunnin - 5 minuutin pituisia aikoja, riippuen sonikointikärjen tehoasetuksesta, jota 20 seuraa jäähdytyksen ja lisäsonikoinnin jaksot; tai 3. rikotaan Gaulin puristuslaitteella paineilla 13 800 - 103 500 kPa:n välillä; ja vaiheessa c) fraktioidaan hydrolysoitu Pn-Ps ja 5 valitaan fraktio, jolla on molekyylipaino välillä 1x10 ja . 6 25 1x10 siten, että i - differentiaalialkoholiliukoisuudella käyttäen isopropanolia konsentraatioissa, joiden on ennalta määrätty saostavan halutun Pn-Ps:n kokoalueen, tai ii - fraktioimalla kokoekskluusionestekromatogra-30 fiapylväässä, joka kykenee pitämään sisällään ja fraktioi- 4 maan polysakkarideja kokoalueella välillä 5 x 10 ]a 1 x 6 10. ja hydrolyysin tai rikkomisen päätepiste on määritelty 1 mg/ml liuoksen viskometrialla 0,1 M natriumfosfaatis-sa, pH 7,2, tai kromatografiällä kullekin luetellulle po-35 lysakkaridille tämän Pn-Ps-alatyypin päätepisteen mukaisesti: « 115 107370 Pn-Ps alatyyppi Tavoiteloppukohdan Tavoiteloppukohdan viskositetti Kd (piikki) (senttistokea) Pn4-Ps 1,5 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pn6B-Ps 1,3 - 1,00 0,60 ± 0,05 Pn9V-Ps 1,3 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl4-Ps 1,1 - 0,95 0,60 ± 0,05 Pnl8C-Ps 1,5 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pnl9F-Ps 1,3 - 1,00 0,65 ± 0,05 Pn23F-Ps 1,5 - 1,00 0,54 ± 0,05

9. Menetelmä rokotekoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettu konjugaatti sekoitetaan inertin kantajan 5 kanssa, ja mahdollisesti immunologisesti tehokkaiden määrien kanssa adjuvanttia tai immuniteettia moduloivia yhdisteitä tai muita immunogeeneja, jolloin mainittu inertti kantaja on alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti, aluna, ja jolloin mainitut muut immunogeenit valitaan yhdestä tai 10 useammasta rokotteesta hepatiitti B:tä, hepatiitti A:ta, ei-A-ei-B-hepatiittia, AIDS:ia, kurkkumätää-hinkuyskää-jäykkäkouristusta, tuhkarokkoa, sikotautia, vihurirokkoa, vesirokkoa, poliota ja Haemophilus influenzae b:tä vastaan, jolloin konjugaatti sisältää välillä yksi-kaikki ’ 15 seuraavista konjugaateista: Pn4-Ps-OMPC, Pn6B-Ps-OMPC, Pn9V-Ps-OMPC, Pnl4-Ps-OMPC, Pnl8C-Ps-OMPC, Pnl9F-Ps-OMPC, Pn23F-Ps-OMPC, Pnl-Ps-OMPC, Pn5-Ps-OMPC ja Pn7F-Ps-OMPC. m * « 116 107370