KR20230150339A - 활성화 켄칭된 다당류, 및 백신 조성물 중의 다당류의 정량화를 위한 개선된 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비탁법을 사용하여 백신 조성물 중의 다당류 함량을 정량화하기 위한, 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 신규한 기준 표준물을 제공한다. 본 발명은 또한 기준 표준물로 사용하기 위한 활성화 켄칭된 다당류의 제조 방법을 제공한다. 또한, 다가 접합체 백신 중의 다당류를 정량화하기 위한 비탁법 기반 방법도 또한 제공된다. 활성화 켄칭된 다당류로 구성된 본 발명의 기준 표준물은 안정하며, 비탁법을 통한 다당류의 정확한 정량화에 사용될 수 있다.

Description

활성화 켄칭된 다당류, 및 백신 조성물 중의 다당류의 정량화를 위한 개선된 방법
본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물(standard reference), 및 비탁법(nephelometry)을 사용하여 백신 중의 개별 다당류의 정량적 추정을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
비탁법은 용액 내 입자에 의한 광 산란의 원리를 기반으로 분석물을 정량화하는 데 사용되는 기술이다. 작은 입자의 희석 현탁액은 광을 단순히 흡수하는 것이 아니라 이를 통과한 광을 산란시킬것이다. 산란의 양은 광을 각도에서 수집하여 결정된다. 샘플 중의 분석물의 농도는 검출기에 의해 측정된 산란광의 강도에 비례한다.(Whicher et. al., Crit Rev Clin Lab Sci. 1983;18(3):213-60).
비탁법은 혈청, 소변 또는 뇌척수액 내의 다양한 단백질 및 기타 항원 예컨대 리포단백질, 면역글로불린, 보체 인자, 류마티스 인자 및 면역 복합체의 정량적 결정에 적용되어 왔다. 이 기술은 비교적 용이하게 자동화되기 때문에 임상 실험실에서 널리 사용된다.(Whicher et. al., Ann Clin Biochem. 1980 Jul;17(4):170-7.) (Vergani et. al., J Clin Pathol. 1983 Jul; 36(7): 793-797.)
면역비탁법에서, 항체 및 항원은 신속하게 바닥으로 침강되지 않는 작은 응집체만이 형성되도록 하는 농도로 혼합된다. 광 산란의 양을 측정하고 공지된 기준 표준물의 산란 양과 비교한다. 미지의 양은 표준 곡선으로부터 결정된다. 비탁법은 자기 흡수 및 반사가 최소화되는 입자의 희석 현탁액에서 가장 잘 수행된다. 이들 조건하에, 산란 입자의 농도와 산란 광 강도 간의 관계는 매우 넓은 범위에 걸쳐 거의 선형이다.
엔드포인트(또는 고정 시간) 비탁법은 항원-항체 반응이 평형에 도달한 후, 또는 고정 반응 시간 후에 최대 산란광을 측정한다. 미지 샘플 중의 항원 농도는 동일한 조건하에 테스트된 기지 양(known amount)의 항원을 함유하는 기준 표준물을 사용하여 작성된 반응 곡선으로부터 계산된다.
속도 또는 동역학적 비탁법은 면역 복합체 형성의 최고 속도를 측정하는 대안적인 방법이다. 면역 복합체 형성의 최고 속도는 항원 농도에 비례한다.
Lee 등(J Biol Stand. 1983 Jan;11(1):55-64)은 다가 백신 중의 개별 폐렴구균뿐만 아니라 수막구균 다당류를 측정하기 위한 속도 비탁법 기반 방법을 개시하고 있다. 다당류의 수분 보정된 중량을 기준 표준물의 제조에 사용하였다. 정량적 평가를 위한 표준 곡선을 준비할 때, 혈청형 1, 2, 3, 4, 6A, 7F, 8, 9N, 12F, 14, 18C, 19F, 23F 및 25의 폐렴구균 다당류의 최적 농도는 1-5 μg/mL인 것으로 밝혀졌다. 수막구균 다당류, 그룹 A, C, Y 및 W 135의 최적 농도는 1-4 μg/mL인 것으로 밝혀졌다.
Salerno 등(J Biol Stand. 1984 Oct;12(4):447-50)은 23가 폐렴구균 백신(뉴모백스(Pneumovax))의 정량적 분석을 위한 자동화된 속도 비탁 방법을 기술한다. 다가 표준 곡선은 증류수에서 개별 다당류 유형을 수분에 대해 보정된 1 mg/ml 농도로 희석하여 준비하였고; 각각의 다당류 1 ml를 풀링하였으며 베크만(Beckman) ICS 희석제로 희석하여 각각의 다당류의 최종 농도 10 μg/ml를 얻었다.
Lee 등(Biologicals. 2002 Jun; 30(2):97-103)은 표준으로서 인산 알루미늄 보조제가 없는 1가 접합체를 사용하여 다가 폐렴구균 접합체 백신(프리베나(Prevnar)) 중의 개별 다당류를 정량적 분석하는 속도 비탁법 기반의 방법을 개시한다. 접합체 백신 중의 개별 혈청형 다당류 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F의 농도는 제조업체가 표시한 값의 82.3 내지 119%인 것으로 결정되었다. 7가 폐렴구균 접합체 백신을 트립신으로 처리하고, 25℃에서 17 h 동안 유지하여 분해하고 다당류 펩티드 단편을 용액으로 방출시켰다. 후속하여 이를 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 인산알루미늄 보조제를 제거하였다. 샘플 중의 개별 다당류의 농도는 그 후 속도 비탁법으로 결정하였다.
Tabatabaie 등(Iran J Allergy Asthma Immunol. 2008 Jun;7(2): 69-77)은 비접합된 폐렴구균 다가 백신(PNEUMO 23® 아벤티스(Aventis), 프랑스 파스퇴르 소재)을 투여받은 기관지 확장증 환자의 체액성 면역 기능을 조사하는 연구를 개시한다. 환자 40명의 혈액 샘플 중의 면역글로불린 동형 농도를 비탁법으로 측정하였다.
Chen 등(Chinese Journal of Biologicals. 2103 26(8):1170-1174)은 폐렴구균 접합체 백신 중의 다당류를 정량화할 때의 다양한 탈착 처리 효과를 개시한다. 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 포함하는 7가 폐렴구균 접합체 백신을 트립신 또는 수산화나트륨을 사용하여 탈착시키고 그 결과를 비교하였다. 폐렴구균 혈청형 다당류를 사용하여 표준 곡선을 플롯하였다. 결과는 미처리된 샘플의 다당류 함량이 혈청형 14를 제외하고 처리된 샘플보다 낮은 것으로 나타났다. 트립신 처리된 샘플의 다당류 함량은 혈청형 23F를 제외하고 수산화나트륨 처리된 샘플보다 낮았다.
Chen 등(Chinese Journal of Biologicals. 2015 28(7):718-722)은 13가 폐렴구균 접합체 백신 중의 혈청형 다당류 함량을 정량화하기 위한 비탁법 기반 방법을 개시한다. 인산 알루미늄 보조제와 함께 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 포함하는 혈청형 다당류 혼합물을 기준 표준물로 사용하였다. 수산화나트륨 기반 탈착법을 사용하였다. 모든 13가지 혈청형 다당류의 회수율은 70% ~ 130%의 허용 범위 사이인 것으로 밝혀졌다.
Antony 등(Clin Biochem. 2017 Jan;50(1-2):80-83)은 항폐렴구균 협막 다당류 IgG 면역글로불린의 정제 및 특성화를 개시한다. 이는 뉴모백스로 면역된 환자에서 비탁법을 사용하여 항 폐렴구균 항체 면역글로불린 조성을 결정하는 방법을 제공한다.
Fortpied 등(Hum Vaccin Immunother. 2018; 14(5):1243-1250)은 영하의 온도에 노출된 단백질-D-접합 폐렴구균 백신(Synflorix, GSK)의 안정성을 개시한다. 속도 비탁법을 사용하여 영하 온도에 노출된 후 접합체 백신의 항원 농도 및 항원성을 평가하였다. 백신 샘플은 분석을 위해 샘플을 프로테아제(혈청형에 따라 트립신 또는 프로나아제 E)와 함께 인큐베이팅하고 후속하여 이를 원심분리하여 알루미늄 염 입자를 제거하여 제조하였다. 표준 곡선은 기지 농도의 항원이 있는 백신 샘플을 사용하여 생성하였다.
중국 특허 출원 제106018832A호는 다가 폐렴구균 접합체 백신 중의 다양한 유형의 혈청형 다당류의 양을 검출하는 방법을 개시한다. 이 방법은 기준 표준물을 제조하기 위해 다당류-단백질 복합체를 사용한다. 이 방법에서, 기지 농도의 1가 접합체를 갖는 용액이 제조된다. 정량화할 혈청형의 표준 용액의 연속적으로 증가하는 부피를 소정 부피의 접합체 백신에 첨가하여 표준 곡선을 플롯하고 백신 조성물 중의 다당류의 양을 결정한다.
미국 특허 제8,562,999호는 인산 알루미늄 보조제에 흡착된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로 부터의 다당류를 포함하는 13가 폐렴구균 접합체 백신 중의 다당류 접합체의 항원성을 결정하기 위한 속도 비탁법을 개시한다. 속도 비탁법 분석을 위한 샘플을 제조하기 위해, 1M NaOH를 첨가하여 보조제를 가용화시킨 다음 1M 시트르산으로 즉시 중화시킨다.
유럽 특허 제0497525B1호는 폐렴구균 접합체 백신 중의 다당류 함량을 정량화하기 위해 비탁법을 사용한다. 이는 각각의 다당류의 1가 접합체를 표준으로 사용한다. 명반 흡착된 샘플은 비탁법 분석을 위한 샘플을 제조하기 위해 6h 동안 3% 시트르산나트륨에 대해 투석으로 가용화시킨다.
상기 논의된 바와 같이, 비탁법은 백신의 품질 관리 공정에서 다양한 적용에 널리 사용된다. 선행 기술 문헌은 접합체 백신 중의 다당류를 정량화하기 위한 기준 표준물로서 1가 접합체의 사용을 주로 언급한다. 그러나 선행 기술에서 사용된 바와 같은 1가 접합체 기준 표준물 중의 담체 단백질은 시간이 지남에 따라 분해되는 경향이 있다. 이는 접합체 백신 조성물 중의 다당류의 잘못된 추정을 초래하며, 이는 바람직하지 않다. 따라서, 비탁법을 사용하여 백신 조성물 중의 다당류의 정확한 정량화를 위한 안정적으로 유지되는 표준 기준이 필요하다.
본 발명의 목적
본 발명의 주요 목적은 비탁법을 사용하여 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 안정한 기준 표준물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비탁법을 사용하여 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 안정한 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 신규한 기준 표준물을 사용하여 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 비탁법 기반 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는, 비탁법을 사용하여 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 기준 표준물을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 활성화된 다당류를 켄칭제로 켄칭하여 수득된 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 백신 조성물 중의 다당류의 정량화를 위한 기준 표준물을 제공하며, 상기 켄칭제는 아미노산이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 백신 조성물 중의 다당류의 정량화를 위한 기준 표준물을 제공하며, 여기서 활성화 켄칭된 다당류는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:
a) 다당류를 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 켄칭제로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명은 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 다당류를 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 켄칭제로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명은 기준 표준물로서 활성화 켄칭된 다당류를 사용하여 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 비탁법 기반 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서, 활성화제는 시아닐화제, 산화제, 환원제 및 축합시약으로부터 선택된다.
본 발명의 실시양태에서, 시아닐화제는 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP), 시아노겐 브로마이드, N-시아노 트리메틸 암모늄 테트라플루오로보레이트(CTEA) 및 p-니트로 페닐 시아네이트(pNPC)이고, 바람직하게는 CDAP이다.
본 발명의 실시양태에서, 켄칭제는 아미노산이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 백신 조성물 중의 다당류 함량을 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 다당류 특이적 혈청을 다양한 소정 농도의 본 발명의 기준 표준물과 반응시키고, 비탁계에서 광 산란율을 결정하여 표준 곡선을 얻는 단계;
b. 백신 의약품을 다당류 특이적 혈청과 반응시키고 비탁계에서 광 산란율을 결정하는 단계; 및
c. 단계 b.로부터 얻은 광 산란율을 단계 a.로부터 얻은 표준 곡선과 비교하여 접합체 백신 조성물 중의 다당류 함량을 얻는 단계.
도 1은 세 가지 상이한 기준 표준물을 사용하여 접합체 백신 의약품 중의 개별 혈청형 다당류의 정량화에 대한 비교 데이터를 도시한다. 천연 다당류, 접합체 다당류 및 활성화 켄칭된 다당류를 기준 표준물로 사용하였다.
도 2는 0일 및 3개월 령의 표준을 사용하여 접합체 백신 의약품 중의 개별 혈청형 다당류의 정량화에 대한 비교 데이터를 도시한다. 접합체 다당류 및 활성화 켄칭된 다당류를 기준 표준물로 사용하였다.
도 3은 활성화 켄칭된 다당류의 제조 공정을 도시한다.
도 4는 접합 백신 중의 다당류 함량 결정을 위한 도식을 도시한다.
도 5는 활성화 켄칭된 다당류 제조의 개략도를 도시한다.
본 발명은 비탁법을 사용하여 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 안정한 기준 표준물에 관한 것이다.
더 구체적으로, 본 발명은 백신 조성물 중의 다당류의 정량화에 사용되는 안정한 기준 표준물로서의 활성화 켄칭된 다당류에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 기준 표준물로서 활성화 켄칭된 다당류를 사용하여 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 비탁법 기반 방법을 제공한다.
본 발명의 활성화 켄칭된 다당류 기준 표준물은 선행 기술에 개시된 다당류 접합체 기반 기준 표준물에 비해 더 안정적이다. 또한 기준 표준물에서 벌키한 담체 단백질을 글리신과 같은 아미노산으로 대체하면 간섭이 감소하고 다당류 특이적 항체가 에피토프에 더 잘 접근할 수 있게 한다. 이는 접합/비접합 백신 조성물 중의 다당류 함량의 보다 정확한 정량화에 도움이 된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 기준 표준물은 적어도 3개월의 기간 동안 안정하다.
일 실시양태에서, 다당류의 공급원은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), b형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae type b), 및 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 효모, 사상균, 조류 또는 식물 세포로부터 선택된 세균 다당류로부터 유래된다.
또 다른 실시양태에서, 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 39 및 45 등으로부터 선택된 하나 이상의 폐렴구균 혈청형으로부터 유래된 폐렴구균 다당류이다.
또 다른 실시형태에서, 살모넬라로부터 유래된 다당류는 Vi, O2 등으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 네이세리아 메닌기티디스로부터 유래된 다당류는 혈청형 A, C, W, X, Y 등으로부터 선택된다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 폐렴구균 협막 다당류로부터 제조된 비탁법을 위한 활성화 켄칭된 다당류 기준 표준물에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 다당류는 담체 단백질에 접합되어 접합체 백신을 제조한다.
일부 실시양태에서, 담체 단백질은 하나 이상의 하기 담체 단백질, PsaA, CRM197, 불활성화된 세균 독소 예컨대 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드; 콜레라 톡소이드, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A, 세균 외막 단백질 예컨대 외막 복합체 C(OMPC: outer membrane complex C), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴몰리신, PspA, 그룹 A 또는 그룹 B 스트렙토코쿠스로부터의 C5a 펩티다아제, 또는 헤모필루스 인플루엔자 단백질 D, 오발부민, 키홀 림펫 헤모시아닌, (KLH: keyhole limpet hemocyanin), 소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin), 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD: purified protein derivative of tuberculin) 등으로부터 선택된다.
본 발명의 활성화 켄칭된 다당류 기준 표준물은 임의의 상기 다당류를 임의의 상기 담체 단백질과 접합시켜 제조된 접합체 백신 조성물 중의 다당류의 정량화에 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제공한다:
a) 다당류를 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 켄칭제로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제공한다:
a) 다당류를 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 아미노산으로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
본 발명의 실시양태에서, 활성화제는 시아닐화제, 산화제, 환원제 및 축합 시약으로부터 선택된다.
본 발명의 실시양태에서, 시아닐화제는 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP), 시아노겐 브로마이드, N-시아노 트리메틸 암모늄 테트라플루오로보레이트(CTEA) 및 p-니트로 페닐 시아네이트(pNPC)를 포함하는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 CDAP이다.
본 발명의 실시양태에서, 켄칭제는 글리신, 리신, 알라닌 등을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 다당류를 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 아미노산으로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 다당류를 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 글리신, 리신, 알라닌 등을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산으로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 다당류는 "활성화" 단계를 거친다. 용어 "활성화"는 켄칭제와 반응할 수 있는 화학 기를 제공하기 위한 다당류의 화학 처리를 지칭한다. 천연 다당류는 또한 활성화되기 전에 사이징과 같은 제조 공정을 거칠 수도 있다. 활성화 시에 수득되는 다당류는 "활성화된 다당류"로서 지칭된다.
다당류는 다당류-단백질 접합체 백신 조성물의 제조를 위한 성분을 활성화하는 데 일상적으로 사용되는 임의의 반응을 사용하여 활성화될 수 있다.
다당류 단백질 접합체를 제조하기 위해 가장 일반적으로 이용되는 방법은 하기를 포함한다:
1) 환원적 아미노화 화학, 여기서 다당류는 TEMPO 및 과요오드산염(메타과요오드산염, 오르토과요오드산염, 과요오드산 나트륨 또는 과요오드산칼륨 등)과 같은 산화제를 사용하는 히드록시기의 산화로 활성화되어 반응성 알데히드기를 형성하고 활성화된 다당류의 알데히드기는 기타 성분(아미노산 또는 단백질)의 아미노 또는 히드라지드기와 반응하며, 형성된 C=N 이중 결합은 후속하여 시아노보로히드라이드(예컨대 소듐 시아노보로히드라이드) 또는 소듐 보로히드라이드와 같은 환원제에 의해 C-N 단일 결합으로 환원된다;
2) 시아닐화 화학, 여기서 다당류는 시아노겐 브로마이드(CNBr) 또는 1-시아노-4-디메틸암모늄피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화되어 히드록시기에 시아네이트기를 도입하고, 이는 단백질 성분의 첨가 시에 아미노 또는 히드라지드기에 공유 결합을 형성한다; 그리고
3) 카르보디이미드 반응, 여기서 카르보디이미드는 접합 반응의 한 성분에서 카르복시기를 활성화하고, 활성화된 카르보닐기는 기타 성분에서 아미노 또는 히드라지드기와 반응한다. 이들 반응은 또한 접합 반응 전에 접합체의 성분을 활성화하기 위해 자주 이용된다. 간략히 말해, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 디시클로헥실 카르보디이미드(DCC)와 같은 축합 시약은 다당류의 카르복시기를 활성화시키고, 이어서 아미노산 또는 1차 아민을 갖는 단백질로 켄칭시킨다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 다당류를 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 아미노산으로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계;
여기서, 기준 표준물은 비탁법을 사용하여 접합체 백신 제제 중의 다당류를 정량화하는 데 사용된다.
다당류의 활성화는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행된다.
활성화된 다당류는 후속하여 켄칭되어 활성화 켄칭된 다당류를 수득한다. 용어 "켄칭"은 활성화된 다당류 상의 활성화된 기의 불활성화를 지칭한다. 본 발명의 기준 표준물을 제조하기 위해 사용되는 활성화된 다당류는 켄칭제로 켄칭되기 전에 어떠한 담체 단백질과도 반응하지 않는다.
활성화된 다당류는 글리신, 리신, 알라닌 등으로부터 선택된 아미노산일 수 있는 켄칭제를 활성화 반응 혼합물에 첨가함으로써 켄칭된다.
바람직한 실시양태에서, 활성화된 다당류는 활성화된 다당류에 글리신을 첨가함으로써 켄칭된다.
일 실시양태에서, 활성화 반응 혼합물에 첨가되는 글리신 용액의 농도는 2 μM 내지 5.5 μM이다.
일 실시양태에서, 켄칭은 약 8.5 내지 약 9.5 범위의 pH에서 수행된다. pH는 트리에틸아민 또는 빙초산을 사용하여 조정된다.
일 실시양태에서, 글리신에 대한 활성화된 다당류의 비는 0.6 내지 1.5 범위이다.
일 실시양태에서, 켄칭은 2시간 내지 16시간 범위의 기간 동안 수행된다.
활성화된 다당류를 켄칭한 후, 생성된 활성화 켄칭된 다당류는 반응 혼합물로부터 잔류 시약을 제거하기 위한 통상적인 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 이들 기술에는 농축/정용여과(diafiltration), 침전/용출, 컬럼 크로마토그래피, 심층 여과(depth filtration) 등이 포함된다.
일 실시양태에서, 활성화 켄칭된 다당류는 숙시네이트, 포스페이트 등으로부터 선택된 완충액으로 희석된다.
사용되는 완충액의 농도는 5 mM 내지 7 mM 범위일 수 있다. 다당류를 희석하기 위해 사용되는 완충액의 pH는 5.5 내지 6.5 범위이다.
일 실시양태에서, 희석된 활성화 켄칭된 다당류는 후속하여 분획 분자량(MWCO: Molecular Weight Cut-Off) 필터를 사용하여 농축된 다음 완충액을 사용하여 정용여과되어 잔류 시약/화학물질을 제거한다.
실시양태에서, 10KDa 내지 100kDa 범위의 크기를 갖는 MWCO 필터가 사용된다.
정용여과에 적합한 완충액에는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 숙시네이트, Na2CO3, 3-(시클로헥실아미노)-1-프로판설폰산(CAPS), 및 (2-(N-시클로헥실아미노)에탄 설폰산(CHES) 등을 포함한다.
정용여과 후에 수득된 활성화 켄칭된 다당류는 막을 사용하여 더 정제될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 정용여과된 활성화 켄칭된 다당류는 0.2μ 필터를 사용하여 더 정제된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 다당류를 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로부터 선택된 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 글리신으로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 다당류를 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로부터 선택된 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계로서, 여기서 다당류는 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 하나 이상의 혈청형의 폐렴구균 협막 다당류를 포함하는 것인 단계; 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 글리신으로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 다당류를 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 처리하는 단계 및
b) 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 8.5 내지 9.5 범위의 pH 및 22 내지 28℃의 온도 범위에서 2 내지 16시간 범위의 기간 동안 글리신으로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터 선택된 혈청형의 폐렴구균 협막 다당류를 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계, 및
b) 8.5 내지 9.5 범위의 pH 및 22 내지 28℃의 온도 범위에서 2 내지 16시간의 기간 동안 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 글리신으로 켄칭하여, 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
일 실시양태에서, 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 본 발명의 기준 표준물은 적어도 3개월의 기간 동안 안정적으로 유지된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 또한 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물을 사용하여 접합체 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하는 비탁법 기반 방법을 제공한다.
정량화에 사용되는 기준 표준물은 다당류 함량을 정량화 하는 열 중량 분석, 안트론 기반 방법 또는 2-페녹시에탄올(2-PE) 기반 방법으로부터 선택된 방법을 사용하여 단위량(unitage)을 할당하여야 한다.
천연 다당류 기준 표준물은 열 중량 분석 및 안트론 방법에 의해 단위량을 할당하였다. 다당류-단백질 접합체 기준 표준물은 다당류를 정량화하는 안트론 기반 방법을 사용하여 단위량을 할당하였다(Rajendar B et al., Analytical Biochemistry, 2020 Apr; 595).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류 기반 기준 표준물은 다당류 정량화를 위한 2-PE 기반 방법을 사용하여 단위량을 할당하였다.(Burki et al., Analytical Biochemistry. 2020 Apr; 595.)
본 발명의 기준 표준물은 비탁법을 사용하여 접합체 백신 의약품 중의 다당류의 농도를 추정하기 위해 특정 농도 범위에서의 표준 곡선을 개발하는 데 사용된다.
표준 곡선을 준비하기 위해, 활성화 켄칭된 다당류 표준은 각기 14개의 혈청형의 바이알에 언급된 농도로부터 준비되었으며, 여기서 각각의 혈청형에 대한 활성화 켄칭된 다당류 표준의 바이알 농도는 2-PE 방법에 의해 결정된다. 초기에 1 mg/mL의 스톡 기준 표준물은 1X PBS pH 7.2를 사용하여 각각의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F의 벌크를 희석함으로써 제조하였다. 1 mg/mL 스톡 표준은 1X PBS pH 7.2를 사용하여 작업 표준 범위 0, 1, 2, 3.5, 5, 7 및 10 μg/mL로 더 희석하고 표준 곡선은 그 범위에 대하여 준비된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류를 사용하여 의약품 중의 다당류를 정량화하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 백신 의약품 중의 다당류 함량을 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 다당류 특이적 혈청을 다양한 소정 농도의 본 발명의 기준 표준물과 반응시키고, 비탁계에서 광 산란율을 결정하여 표준 곡선을 얻는 단계;
b. 접합체 백신 의약품을 다당류 특이적 혈청과 반응시키고 비탁계에서 광 산란율을 결정하는 단계; 및
c. 단계 b.로부터 얻은 광 산란율을 단계 a.로부터 얻은 표준 곡선과 비교하여 접합체 백신 조성물 중의 다당류 함량을 얻는 단계.
일 실시양태에서, 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류는 상기 언급된 방법에 따라 비접합된 백신 조성물과 마찬가지로 접합체 중의 다당류의 정량화를 위한 기준 표준물로 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 본 발명의 기준 표준물은 접합체 백신 의약품 중의 다당류 함량을 정량화하는 데 사용되며, 여기서 접합체 백신 의약품 중의 다당류는 네이세리아 메닌기티디스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, b형 헤모필루스 인플루엔자, 또는 살모넬라 티피로부터 유래된다.
바람직한 실시양태에서, 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 본 발명의 기준 표준물은 다가 폐렴구균 접합체 백신(PCV) 의약품 중의 개별 혈청형으로부터의 다당류 함량을 결정하기 위해 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 인산알루미늄 상에 흡착된 다가 폐렴구균 접합체 백신은 기준 표준물로서 활성화 켄칭된 다당류를 사용하여 개별 혈청형 당류 함량 분석을 거친다.
일 실시양태에서, 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 본 발명의 기준 표준물은 다가 폐렴구균 접합체 백신(PCV) 의약품 중의 각각의 혈청형의 개별 다당류 함량을 결정하는데 사용되며, 여기서 다가(PCV) 의약품은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 39 및 45 등으로부터의 협막 다당류를 포함하는 10가, 11가, 12가, 13가, 14가, 15가, 20가, 22가, 24가, 25가, 26가, 28가, 30가, 32가 또는 34가 조성물이다.
일 실시양태에서, 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7A, 7B, 7C, 7F, 8, 9A, 9L, 9F, 9N, 9V, 10A, 10B, 10C, 10D, 10F, 11A, 11F, 11B, 11C, 11D, 11E, 12A, 12B, 12F, 13, 14, 15A, 15C, 15B, 15F, 16A, 16F, 17A, 17F, 18C, 18F, 18A, 18B, 19A, 19B, 19C, 19F, 20, 20A, 20B, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24A, 24B, 24F, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32A, 32F, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33B, 34, 45, 38, 35A, 35B, 35C, 35F, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 및 48로부터 선택된 하나 이상의 폐렴구균 혈청형으로부터의 협막 다당류이다.
일 실시양태에서, 다가 PCV 의약품의 다당류는 CRM197, PsaA 또는 PspA로부터 선택된 하나 이상의 담체 단백질에 접합된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류는 폐렴구균 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 협막 다당류를 포함하는 다가 폐렴구균 접합체 백신(PCV) 의약품 중의 개별 다당류 혈청형 함량을 결정하기 위한 기준 표준물로서 사용된다.
예시적인 실시양태에서, 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류는 담체 단백질 CRM197에 개별적으로 접합된 협막 다당류 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 포함하는 다가 폐렴구균 접합체 백신(PCV) 의약품 중의 개별 혈청형 함량을 결정하기 위한 기준 표준물로서 사용된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류는 A, C, W, X, Y 등으로부터의 하나 이상의 혈청형을 포함하는 다가 수막 구균 백신 조성물 중의 개별 다당류 혈청형 함량을 결정하기 위한 기준 표준물로서 사용된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류는 Vi 및/또는 O2로부터 선택된 다당류를 포함하는 1가 또는 2가 백신 조성물 중의 개별 다당류 혈청형 함량을 결정하기 위한 기준 표준물로서 사용된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 의약품 중의 개별 혈청형 다당류 함량의 정량화를 위한 혈청의 제조 방법을 제공한다. 혈청을 1% PEG 및 0.2% Tween-20을 함유하는 10mM PBS를 사용하여 1:5로 희석하고 표적 혈청형 다당류를 제외한 13가 다당류 혼합물 10 μg/mL를 첨가하여 사전 흡착시켰다. 혈청 혼합물을 로커에서 30 min 동안 인큐베이션하고 16000 g에서 30 min 동안 정화시켰다. 정화된 혈청을 분석에 사용하였다.
본 실시양태에서, 접합체 백신 의약품은 의약품 중의 다당류 함량을 정량화하기 전에 트립신 및/또는 알칼리 처리를 거쳤다. 트립신 처리를 위해, 접합체 백신 의약품을 10mM 트리스 완충액 pH 9로 희석한 후 200 rpm/min 하에 37℃에서 밤새 0.1 mg/mL 트립신으로 처리하였다. 처리된 샘플을 16000 g에서 30 min 동안 원심분리하고 정화된 상청액은 평가에 사용하였다. 알칼리 처리에서, 접합체 백신 의약품을 1M NaOH 용액에 첨가하고, 30 sec 동안 인큐베이션한 후 즉시 1M 시트르산으로 중화하였으며 pH는 1M 시트르산을 사용하여 9로 조정하였다. 처리된 샘플은 0 - 10 μg/mL 범위의 다가 표준을 사용하여 평가하였다.
본 실시양태에서, 접합체 백신 중의 개별 혈청형 다당류 함량을 결정하기 위한 비탁법 방법을 개발하였다. 본 발명의 비탁법 기반 방법에서, 접합체 백신 의약품 중의 다당류를 정량화하기 위해 14 μL의 기준 표준물, 샘플 및 대조 물질을 플레이트 레이아웃에 따라 각각의 웰에 첨가한 후 35 μL의 1:5로 희석된 혈청 및 179 μL의 1XPBS pH 7.2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트 진탕기에서 200 rpm으로 30 min 동안 인큐베이션한 후 마이크로플레이트 비탁계에서 판독하여 안정적인 판독값을 얻고 데이터를 편집하였다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며 단지 예시적인 목적일 뿐이고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 생각되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 기준 표준물로서 천연 다당류를 사용하는 비탁법에 의한 의약품 중의 다당류의 정량화
개요서(IP/BP/WHO TRS 977) 요건을 충족하도록 열 중량 분석, 2-PE, 안트론 방법에 의해 할당된 단위량으로 천연 다당류를 표준으로 사용하는 비탁법 검정을 수행하였다. (Rajendar B et al., Analytical Biochemistry, 2020 Apr; 595). CRM197 담체 단백질에 접합된 각각의 혈청형인 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 포함하는 다가 PCV 의약품 중의 개별 혈청형 특이적 당류 함량을 비탁법을 사용하여 결정하였다. 접합된 백신은 혈청형 1, 3, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 사용하여 4.4 μg/mL로 제제화되었으며, 6B의 경우 8.8 μg/mL로 제제화되었다.
각각의 혈청형 다당류 특이적 혈청을 1% PEG 및 0.2% Tween-20을 함유하는 10 mM PBS를 사용하여 1:5로 희석하고 표적 혈청형 다당류를 제외한 13가 다당류 혼합물 10 μg/mL를 첨가하여 사전 흡착시켰다. 혈청 혼합물을 로커에서 30 min 동안 인큐베이션하고, 16000 g에서 30 min 동안 정화시켰다. 정화된 혈청을 비탁 분석에 사용하였다.
표준 곡선은 다당류 농도 0, 1, 2, 3.5, 5, 7 및 10 μg/mL에서 천연 다당류를 기준 표준물로서 사용하여 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F에 대하여 준비하였다. 14 μL의 기준 표준물, 및 대조 물질을 플레이트 레이아웃에 따라 각각의 웰에 첨가한 후 35 μL의 1:5로 희석된 혈청 및 179 μL의 1XPBS pH 7.2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트 진탕기에서 200 rpm으로 30 min 동안 인큐베이션한 후 비탁계에서 광 산란율을 판독하였다.
다가 PCV 의약품은 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 다가 PCV 의약품을 10mM 트리스 완충액 pH 9로 희석한 후 200 rpm/min 하에 37℃에서 밤새 0.1 mg/mL 트립신으로 처리하였다.
14 μL의 탈착된 접합체 백신 의약품 및 대조 물질을 플레이트 레이아웃에 따라 각각의 웰에 첨가한 후 35 μL의 1:5로 희석된 혈청 및 179 μL의 1XPBS pH 7.2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트 진탕기에서 200 rpm으로 30 min 동안 인큐베이션한 후 비탁계에서 광 산란율을 판독하여 다가 PCV 의약품 중의 다당류의 농도를 얻었다. 의약품 중의 개별 혈청형 특이적 당류 함량은 0 - 10 μg/mL 범위의 기준 표준물 곡선에 대하여 결정되었다.
결과:
천연 다당류를 기준 물질로 사용한 의약품 중의 개별 혈청형 당류 함량을 도 1에 예시한다.
혈청형 14, 19F 및 33F의 당류 함량은 라벨 표시 사항의 70-130% 허용 기준을 충족하지 못하였다. 배치 제제화는 접합체 물질(CRM197과의 다당류 접합)을 사용하여 수행되므로 천연 다당류는 비탁법에 의한 표준으로 사용하기에 최선의 선택이 아닐 수 있다.
실시예 2: 기준 표준물로서 다당류-단백질 접합체를 사용하는 비탁법에 의한 의약품 중의 다당류의 정량화
CRM197에 접합된 폐렴구균 혈청형 다당류를 포함하는 다당류-단백질 접합체 기준 표준물은 다당류 정량화를 위한 안트론 기반 방법을 사용하는 할당된 단위량이었다. CRM197 담체 단백질에 접합된 각각의 혈청형인 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 포함하는 다가 PCV 의약품 중의 개별 혈청형 특이적 당류 함량을 비탁법을 사용하여 결정하였다. 접합된 백신은 혈청형 1, 3, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 사용하여 4.4 μg/mL로 제제화되었으며, 6B의 경우 8.8 μg/mL로 제제화되었다.
각각의 혈청형 다당류 특이적 혈청을 1% PEG 및 0.2% Tween-20을 함유하는 10 mM PBS를 사용하여 1:5로 희석하고 표적 혈청형 다당류를 제외한 13가 다당류 혼합물 10 μg/mL를 첨가하여 사전 흡착시켰다. 혈청 혼합물을 로커에서 30 min 동안 인큐베이션하고 16000 g에서 30 min 동안 정화시켰다. 정화된 혈청을 비탁 분석에 사용하였다.
표준 곡선은 농도 0, 1, 2, 3.5, 5, 7 및 10 μg/mL에서 개별 다당류-단백질 당접합체(glycoconjugate)를 기준 표준물로서 사용하여 혈청형 다당류 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F에 대하여 준비하였다. 14 μL의 기준 표준물, 및 대조 물질을 플레이트 레이아웃에 따라 각각의 웰에 첨가한 후 35 μL의 1:5로 희석된 혈청 및 179 μL의 1XPBS pH 7.2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트 진탕기에서 200 rpm으로 30 min 동안 인큐베이션한 후 비탁계에서 광 산란율을 판독하였다.
다가 PCV 의약품은 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 다가 PCV 의약품을 10mM 트리스 완충액 pH 9로 희석한 후 200 rpm/min 하에 37℃에서 밤새 0.1 mg/mL 트립신으로 처리하였다.
14 μL의 탈착된 접합체 백신 의약품 및 대조 물질을 플레이트 레이아웃에 따라 각각의 웰에 첨가한 후 35 μL의 1:5로 희석된 혈청 및 179 μL의 1XPBS pH 7.2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트 진탕기에서 200 rpm으로 30 min 동안 인큐베이션한 후 비탁계에서 광 산란율을 판독하여 다가 PCV 의약품 중의 다당류의 농도를 얻었다. 의약품 중의 개별 혈청형 특이적 당류 함량은 기준 표준물 곡선에 대하여 결정되었다.
결과:
당접합체를 기준 표준물로 사용한 데이터를 도 1에 예시한다. 당접합체를 기준 표준물로 사용한 경우, 의약품 중의 모든 혈청형의 당류 함량은 라벨 표시 사항의 70-130% 허용 기준 내에 있었다.
실시예 3: 기준 표준물로 사용하기 위한 활성화 켄칭된 다당류의 생성.
혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F의 폐렴구균 다당류를 공정에서 언급된 바와 같이 CDAP를 사용하여 활성화시키고 글리신을 첨가하여 켄칭하였다(도 3 참조). 다당류의 활성화는 실행 1, 2 및 3에서와 같이 200 mg 규모로 3회 수행하였다(반응 후, 3회 실행 모두를 풀링하여 정용여과하였다). 다당류 벌크를 RT(22±3℃)에서 해동하고 WFI 및 5M NaCl을 사용하여 각각의 혈청형에 대해 필요한 특정한 활성화 농도로 희석하였다. 활성화는 각각의 혈청형에 대해 특정한 소정 비(1:0.2-1.0)로 CDAP(아세토니트릴 중의 100 mg/mL w/v)를 사용하여 수행하였으며 (각 다당류에 대해 특정한) pH 8.5 내지 9.5는 0.2M 트리에틸아민을 사용하여 조정하였다. 글리신 스톡(10 mg/mL)을 각각의 혈청형에 대하여 필요한 특정 부피로 주사 용수(WFI: Water For Injection) 및 5M NaCl을 사용하여 CRM197 단백질과 등가의 몰 비로 희석하고 반응 혼합물에 첨가하였다(반응에 사용되는 글리신의 양은 각각의 혈청형 접합 반응에서 사용된 단백질의 양과 등가이다). 글리신 농도는 2 - 5.5 μM 범위이다.
(각 혈청형에 대하여 특정한)반응 혼합물의 pH를 0.2M 트리에틸아민/1M 빙초산을 사용하여 8.5 내지 9.5 범위로 조정하고 RT에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 1M 글리신(반응 부피의 1/10에 해당하는 부피)을 첨가하여 반응을 켄칭하였다.
실행 1, 2 및 3을 풀링하고 pH 5.8에서 150 mM NaCl을 함유하는 동일한 부피의 6.5 mM 숙시네이트 완충액으로 희석하였다. 풀링된 활성화 반응 혼합물을 분획 분자량(MWCO) 30kDa 접선 유동 여과(TFF: Tangential Flow Filtration) 카세트를 사용하여 정용여과하고 pH 5.8에서 150 mM NaCl을 함유하는 6.5 mM 숙시네이트 완충액을 사용하여 정용여과하여 잔류 시약/화학물질(TEA, CDAP, ACN 등)을 제거하였다. 그 후, 잔류물을 사전 멸균된 유리병에 수집하였다.
잔류물의 부피는 150 mM NaCl을 함유하는 pH 5.8의 6.5 mM 숙시네이트 완충액으로 대략 270 - 290 mL로 만들고 0.2μ 필터(밀렉스 GP 시린지 필터(Millex GP Syringe Filter)(33mm), MOC: PES 막)을 통해 멸균 PETG 병으로 여과하였다.
도 5는 활성화 켄칭된 다당류 제조의 개략도 및 본 실시예에서 개시된 공정으로부터 수득된 활성화 켄칭된 다당류를 도시한다.
실시예 4: 기준 표준물로서 활성화 켄칭된 다당류를 사용하는 비탁법에 의한 의약품 중의 다당류의 정량화
활성화 켄칭된 다당류 표준 물질의 단위량은 2PE 방법으로 할당되었으며 다가 PCV 의약품 중의 개별 혈청형 당류 함량을 결정하기 위해 사용되었다(Rajendar B et al., Analytical Biochemistry, 2020 Apr; 595). CRM197 담체 단백질에 접합된 각각의 혈청형인 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 포함하는 다가 PCV 의약품 중의 개별 혈청형 특이적 당류 함량을 비탁법을 사용하여 결정하였다. 접합된 백신은 혈청형 1, 3, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 사용하여 4.4 μg/mL로 제제화되었으며, 6B의 경우 8.8 μg/mL로 제제화되었다.
각각의 혈청형 다당류 특이적 혈청을 1% PEG 및 0.2% Tween-20을 함유하는 10 mM PBS를 사용하여 1:5로 희석하고 표적 혈청형 다당류를 제외한 13가 다당류 혼합물 10 μg/mL를 첨가하여 사전 흡착시켰다. 혈청 혼합물을 로커에서 30 min 동안 인큐베이션하고, 16000g에서 30 min 동안 정화시켰다. 정화된 혈청을 비탁 분석에 사용하였다.
표준 곡선은 농도 0, 1, 2, 3.5, 5, 7 및 10 μg/mL에서 개별 활성화 켄칭된 다당류를 기준 표준물로서 사용하여 혈청형 다당류 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F에 대하여 준비하였다. 14 μL의 기준 표준물, 및 대조 물질을 플레이트 레이아웃에 따라 각각의 웰에 첨가한 후 35 μL의 1:5로 희석된 혈청 및 179 μL의 1XPBS pH 7.2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트 진탕기에서 200 rpm으로 30 min 동안 인큐베이션한 후 비탁계에서 광 산란율을 판독하였다.
다가 PCV 의약품은 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 다가 PCV 의약품을 10mM 트리스 완충액 pH 9로 희석한 후 200 rpm/min 하에 37℃에서 밤새 0.1 mg/mL 트립신으로 처리하였다.
14 μL의 탈착된 접합체 백신 의약품 및 대조 물질을 플레이트 레이아웃에 따라 각각의 웰에 첨가한 후 35 μL의 1:5로 희석된 혈청 및 179 μL의 1XPBS pH 7.2를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트 진탕기에서 200 rpm으로 30 min 동안 인큐베이션한 후 비탁계에서 광 산란율을 판독하여 다가 PCV 의약품 중의 다당류의 농도를 얻었다. 의약품 중의 개별 혈청형 특이적 당류 함량은 기준 표준물 곡선에 대하여 결정되었다.
결과:
2-PE 투입과 함께 기준 표준물 물질로서 활성화 켄칭된 다당류를 사용한 의약품 중의 개별 혈청형 당류 함량의 데이터를 도 1에 예시한다.
활성화 켄칭된 다당류를 기준 표준물로 사용한 경우, 의약품 중의 모든 혈청형의 당류 함량은 라벨 표시 사항의 70-130% 허용 기준 내에 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5: 기준 표준물의 안정성(접합체 및 활성화 켄칭된 다당류)
접합체 및 활성화 켄칭된 다당류 기준 표준물의 안정성은 0 및 3개월 시점에서 수행되었으며 의약품 중의 개별 혈청형 당류 함량을 결정하기 위해 사용되었다.
0일 및 3개월 령 접합체 및 활성화 켄칭된 다당류 기준 표준물 물질을 사용한 의약품 중의 개별 혈청형 당류 함량 데이터를 도 2에 예시한다.
혈청형 1, 7F 및 33F의 더 높은 당류 함량은 표준의 응집 또는 분해를 나타내는 3개월 접합체 기준 표준물을 사용하여 관찰된 반면 모든 혈청형의 당류 함량은 3개월까지 표준으로서 활성화 켄칭된 다당류를 사용하는 사양을 충족하였으며 그 결과는 0일 결과와 유사하다.
의약품 분석을 위한 기준 표준물로서 천연 다당류, 접합체 물질 및 활성화 켄칭된 다당류의 평가는 다른 모든 표준과 비교하여 2-PE 방법에 의한 투입으로 활성화 켄칭된 다당류가 라벨 표시 사항의 70-130% 사양을 충족하는 개별 당류 함량을 초래하는 것으로 나타났다. 따라서 활성화 켄칭된 다당류는 의약품의 모든 방출 및 안정성 시점에 대한 정보 수집을 위한 공식 테스트 및 기준 표준물로서 사용될 수 있다.
발명의 이점
본 발명은 안정하고 백신 조성물 중의 다당류의 정확한 정량화에 사용될 수 있는 개선된 활성화 켄칭된 다당류를 제공한다. 본 발명은 또한 활성화 켄칭된 다당류를 제조하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 노동 효율적인 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 비탁법 공정에서 본 발명의 활성화 켄칭된 다당류를 사용하여 접합체 백신 조성물 중의 다당류의 개선된 정량화 방법을 제공한다.

Claims (28)

  1. 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한 기준 표준물(reference standard)로서, 상기 기준 표준물은 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 것인 기준 표준물.
  2. 제1항에 있어서, 활성화된 다당류가 켄칭제를 사용하여 켄칭된 것인 기준 표준물.
  3. 제2항에 있어서, 켄칭제가 글리신, 리신, 알라닌 등을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산인 기준 표준물.
  4. 제3항에 있어서, 아미노산에 대한 활성화된 다당류의 비가 0.6 내지 1.5 범위인 기준 표준물.
  5. 제1항에 있어서, 활성화 켄칭된 다당류의 다당류가 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), b형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae type b) 및 살모넬라 티피(Salmonella typhi)를 포함하는 군으로부터 선택된 세균 공급원으로부터 유래된 것인 기준 표준물.
  6. 제5항에 있어서, 다당류가 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 중 하나 이상의 혈청형으로부터의 협막 다당류이고, 여기서 혈청형은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 39 및 45 등을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 기준 표준물.
  7. 제5항에 있어서, 다당류가 네이세리아 메닌기티디스 중 하나 이상의 혈청형으로부터 유래되고, 여기서 혈청형은 A, C, W, X, Y 등으로부터 선택된 것인 기준 표준물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 표준물이 적어도 3개월의 기간 동안 안정하게 유지되는 것인 기준 표준물.
  9. 백신 조성물 중의 다당류를 정량화하기 위한, 활성화 켄칭된 다당류를 포함하는 기준 표준물의 제조 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 제조 방법:
    a. 다당류를 활성화제로 처리하여 활성화된 다당류를 수득하는 단계; 및
    b. 단계 (a)로부터의 활성화된 다당류를 켄칭제로 켄칭하여 활성화 켄칭된 다당류를 수득하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 활성화제가 시아닐화제, 산화제, 환원제 및 축합 시약으부터 선택되는 것인 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 시아닐화제가 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP), 시아노겐 브로마이드, N-시아노 트리메틸 암모늄 테트라플루오로보레이트(CTEA) 및 p-니트로 페닐 시아네이트(pNPC)를 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 CDAP인 제조 방법.
  12. 제9항에 있어서, 단계 a)에서의 다당류 대 활성화제의 비가 1:0.2-1.0 범위인 제조 방법.
  13. 제9항에 있어서, 켄칭제가 글리신, 리신, 알라닌 등을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산인 제조 방법.
  14. 제9항에 있어서, 아미노산에 대한 활성화된 다당류의 비가 0.6 내지 1.5 범위인 제조 방법.
  15. 제9항에 있어서, 켄칭이 약 8.5 내지 약 9.5 범위의 pH, 22 내지 28℃ 범위의 온도에서 2 내지 16시간 범위의 기간 동안 수행되는 것인 제조 방법.
  16. 제9항에 있어서, 다당류가 네이세리아 메닌기티디스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, b형 헤모필루스 인플루엔자 및 살모넬라 티피를 포함하는 군으로부터 선택된 세균 공급원으로부터 유래된 것인 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 다당류가 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 중 하나 이상의 혈청형으로부터의 협막 다당류이고, 여기서 혈청형은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 39, 45 등을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 제조 방법.
  18. 제16항에 있어서, 다당류가 네이세리아 메닌기티디스 중 하나 이상의 혈청형으로부터 유래되고, 여기서 혈청형은 A, C, W, X, Y 등으로부터 선택된 것인 제조 방법.
  19. 백신 의약품 중의 다당류 함량을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 방법:
    a. 다당류 특이적 혈청을 다양한 소정 농도의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 특정 기준 표준물과 반응시키고, 비탁계에서 광 산란율을 결정하여 표준 곡선을 얻는 단계;
    b. 백신 의약품을 다당류 특이적 혈청과 반응시키고 비탁계에서 광 산란율을 결정하는 단계; 및
    c. 단계 b.로부터 얻은 광 산란율을 단계 a.로부터 얻은 표준 곡선과 비교하여 백신 조성물 중의 다당류 함량을 얻는 단계.
  20. 제19항에 있어서, 백신 의약품이 다당류 특이적 혈청과 반응하기 전에 탈착 처리되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 백신 의약품이 트립신 처리에 의해 탈착되는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 백신 의약품 중의 다당류가 네이세리아 메닌기티디스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, b형 헤모필루스 인플루엔자 또는 살모넬라 티피로부터 유래된 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 백신 의약품이 다가 폐렴구균 접합체 백신 의약품인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 다가(PCV) 의약품이 10가, 11가, 12가, 13가, 14가, 15가, 20가, 22가, 24가, 25가, 26가, 28가, 30가, 32가 또는 34가 조성물인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 다가 폐렴구균 접합체 백신 의약품이 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24B, 24F, 31, 33F, 34, 35B, 35F, 38, 39, 45 등으로부터 선택된 하나 이상의 폐렴구균 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 다가 폐렴구균 접합체 백신 의약품이 폐렴구균 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 협막 다당류를 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 다가 폐렴구균 접합체 백신 의약품의 다당류가 CRM197, PsaA 또는 PspA로부터 선택된 하나 이상의 담체 단백질, 바람직하게는 CRM197에 접합되는 것인 방법.
  28. 제22항에 있어서, 다당류가 네이세리아 메닌기티디스로부터 유래된 것인 방법.
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