BR112017026343A2 - métodos para aperfeiçoar a adsorção de conjugados de proteína-polissacarídeo e formulação de vacina multivalente assim obtida - Google Patents

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Abstract

a presente invenção proporciona métodos para a preparação de formulações de vacina pneumocócica de conjugado proteína-polissacarídeo multivalente estável. as formulações momentâneas instáveis mostram porcentagem ótima de adsorção para cada conjugado em que a agregação pode ser prevenida empregando: i) adsorção individual ou separada para conjugados que de outro modo mostram porcentagem de adsorção inferior por adsorção combinada, ii) sistema tampão de histidina-ácido succínico juntamente com mudança de ph de neutro para ph ácido, iii) uma relação de proteína para polissacarídeo entre 0,5 a cerca de 1,4, iv) um impulsor de turbina de tipo rushton de seis lâminas nos recipientes de formulação.

Description

MÉTODOS PARA APERFEIÇOAR A ADSORÇÃO DE CONJUGADOS DE
PROTEÍNA-POLISSACARÍDEO E FORMULAÇÃO DE VACINA MULTIVALENTE
ASSIM OBTIDA
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0001] Streptococus pneumoniae é uma das principais causas de pneumonia bacteriana, meningite e sepse em crianças. As estimativas recentes de óbitos infantis causados por S. pneumoniae variam de 700 mil a 1 milhão por ano em todo o mundo. Em 2000, estima-se cerca de 14,5 milhões de episódios de doença pneumocócica grave (intervalo de incerteza 11,1-18,0 milhões). A doença pneumocócica causou cerca de 826 mil óbitos (0,58 -0,926 M) em crianças de 1-59 meses, dos quais 91 mil (0,063-0,1 M) foram soroposit ivos e 735 mil (0,51-0,82 M) em crianças HIV-negativas.
[0002] As vacinas de polissacarideos pneumocócicas multivalentes que foram licenciadas por muitos anos se mostraram valiosas na prevenção da doença pneumocócica em adultos, particularmente, idosos e aqueles com alto risco. No entanto, crianças e crianças pequenas respondem mal aos polissacarideos pneumocócitos não conjugados. A vacina pneumocócica conjugada, Prevnar®, contendo os 7 sorotipos mais frequentemente isolados (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) causou doença pneumocócica invasiva em crianças pequenas e bebês na época, sendo licenciada pela primeira vez nos Estados Unidos em fevereiro de 2000.
[0003] Além disso, Prevnar ™ 13 (Wyeth) é uma vacina aprovada que contém conjugados de polissacarideos dos sorotipos 6A, 6B, 19A, 19F, além de 1, 3, 4, 5, 7F, 9V,
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14, 18C e 23F. Synflorix™ (GSK) é outra vacina aprovada que fornece proteção contra 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e
23F, bem como proteção cruzada contra 19A e 6A.
[0004] As formulações de vacina devem, em geral, ser estáveis e ter uma consistência uniforme para acomodar a necessidade de uma longa vida útil e o uso de recipientes de doses múltiplas. As vacinas à base de proteínas, incluindo os conjugados de proteína-polissacarídeo estão sujeitas a agregação e precipitação de proteínas que podem resultar em uma concentração total efetiva inferior da vacina devido à indisponibilidade do produto proteico precipitado. As vacinas conjugadas com polissacarídeoproteína, em particular, parecem ter uma maior tendência de agregação do que a proteína transportadora isoladamente (vide Berti e outros, 2004, Brophys J 86: 3-9) . A escolha da formulação para uma vacina conjugada de proteínapolissacarídeo pode afetar bastante a agregação de proteínas. Vide Ho e outros, 2001, Vacine 19: 716-725.
[0005] Apesar das várias composições de vacinas pneumocócicas de conjugado de proteína-polissacarídeo multivalentes existentes serem desenvolvidas em todo o mundo, existe uma necessidade contínua na técnica para formulações de vacinas que proporcionem alta adsorção de conjugados individuais e isentas de agregação/precipitação de composições imunogênicas com conjugados de proteína polissacarídica.
[0006] Os adjuvantes tradicionalmente utilizados em tais vacinas pneumocócicas multivalentes têm sido sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. Muitos outros adjuvantes experimentais são
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3/35 conhecidos, no entanto a adsorção em sais de alumínio continua a ser a formulação adjuvante de vacina mais comum. Embora o seu uso seja generalizado, os sais de alumínio podem nem sempre ser compatíveis com antígenos particulares, resultando assim em variações significativas em relação à porcentagem de adsorção de conjugado de proteína-polissacarídeo no alumínio ou a antigenicidade.
[0007] As propriedades imunológicas e a estabilidade do candidato de vacina conjugada adsorvido em adjuvantes de alumínio dependem de vários parâmetros, tais como i) antigenicidade de cada antígeno, ii) tipo de proteína transportadora usada para conjugação e iii) o tipo de adjuvante utilizado. Mais importante ainda, a extensão da adsorção do antígeno no adjuvante foi relatada anteriormente como um dos parâmetros fundamentais para demonstrar a consistência lote a lote do processo de formulação e seu possível impacto na eficácia do produto da vacina. Além disso, a adsorção percentual de conjugados de proteína-polissacarídeo pode cair ainda mais no armazenamento da formulação ou nas situações adversas, como excursões de temperatura. Vide 54a reunião do WHO Expert Committee on Biological Standardization, Recommendations for the production & control of Pneumococcal conjugate vaccines, 17-21 November 2003; Carl E. Frasch, Session IV: Conjugate Vaccines; Vaccine Technology II; Portugal. 2008.
[0008] De acordo com as diretrizes da agência de regulamentação europeia (EMEA) para os conjugados de proteína-polissacarídeo pneumococos, a integridade da adsorção (% de conjugado não ligado) deve ser considerada como um parâmetro de controle de qualidade crucial,
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4/35 juntamente com conteúdo de alumínio, esterilidade, identidade e conteúdo de polissacarídeos livre. Vide, Assessment Report for Synflorix 2009, Procedure No. EMEA/H/C/000973. 0 WHO recomenda a maximização da adsorção para antígenos precipitados por alúmen (por exemplo, toxóide de difteria e tétano) em que pelo menos 80% dos antígenos nessas vacinas são adsorvidos.
[0009] Durante a fabricação do conjugado de proteína-polissacarídeo, a formulação pode ser constituída por agregados de tipo polissacarídeo-polissacarídeo, tipo proteína-proteína ou tipo proteína-polissacarídeo. Tais agregações também são observadas no produto acabado levando a rejeição de 4% a 10% de frascos cheios de vacina de conjugado(s) proteína-polissacarídeo afetando assim a estabilidade e eficácia da vacina conjugada.
[0010] Em razão das limitações acima discutidas em relação à agregação e estabilidade do polissacarídeo e seu conjugado, continua a haver uma necessidade distinta de reduzir a agregação e estabilizar o referido polissacarídeo através do processamento a jusante para a fase final da formulação da Fabricação de Vacinas Conjugadas Pneumocócicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] A invenção proporciona melhorias na estabilidade de vacinas que incluem sais de alumínio e, em particular, métodos para minimizar a agregação e melhorias na porcentagem de adsorção de conjugados individuais em vacinas multivalentes de conjugado de polissacarídeo pneumocócico. Os inventores da presente invenção observaram que a adsorção combinada de conjugados de proteína
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5/35 polissacarídeo e o uso de uma proporção de polissacarídeo para proteína maior que 1: 1 resulta em i) porcentagem de adsorção de menos de 55% para conjugados de S. pneumoniae para sorotipos 6A, 9V e 23F e ii) porcentagem de adsorção de cerca de 80% a 90% para os restantes conjugados de sorotipo, deixando assim de obter uma adsorção completa para um conjugado de sorotipo individual para uma determinada formulação conjugada pneumocócica multivalente. Também foi observado que a formulação de vacina preparada usando pH entre 6,8 a 7,0 resultou em uma agregação de cerca de 4 a 10% e menor adsorção.
[0012] A presente invenção refere-se a um método para a preparação de uma formulação de vacina pneumocócica conjugada de proteína-polissacarídeo multivalente, mostrando adsorção ideal entre 75 a 99% para cada conjugado em que, no referido método, a agregação é evitada empregando pelo menos um dentre:
a. adsorção individual ou separada para conjugados que de outro modo mostram adsorção relativa mais baixa por adsorção combinada;
b. sistema tampão de histidina-ácido succínico juntamente com mudança de pH de neutro para pH ácido;
c. uma proporção de polissacarídeo para proteína entre 0,6 a cerca de 1,4; e/ou
d. uso de um impulsor de turbina de tipo Rushton de seis lâminas no recipiente de formulação.
[0013] A presente invenção também descreve um método para preparar conjugados de proteína-polissacarídeo com imunogenicidade melhorada e teor de polissacarídeo menos livre para polissacarídeos de Streptococus pneumoniae
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6/35 contendo ligação fosfodiéster, particularmente 19A, 19F, 6A e 6B. 0 referido processo de conjugação minimiza a degradação mediada por subprodutos do agente de cianilação de polissacarídeos dimensionados e evita a agregação de polissacarídeo-polissacarídeo subsequente, estabilizando assim polissacarídeos lábeis. Uma chave para a agregação reduzida pode ser atribuída ao uso de um polissacarídeo de dimensão no intervalo de 100 a 200 KDa e polissacarídeo em relação à CDAP (agente de cianilação) na faixa de (1): (0,8 - D .
[0014] A composição imunogênica preparada de acordo com a presente invenção proporciona uma agregação reduzida entre Polissacarídeo - Polissacarídeo e conjugado de Polissacarídeo - Proteínas juntamente com estabilidade e imunogenicidade melhoradas.
FIGURAS [0015] A figura 1 ilustra o perfil SEC-HP-RI de PnPs 19A dimensionado (178 KDa) antes do tratamento com DMAP .
[0016] A figura 2 ilustra o perfil SEC-HP-RI de PnPs 19A dimensionado (70 KDa) após 24 h (A) e 14,5 KDa após 72 h e (B) Perfis de degradação e tratamento de DMAP.
[0017] A figura 3 ilustra perfis SEC-HP-RI de PnPs 19A dimensionado (178 KDa; A) e agregação dependente do tempo de polissacarídeos ativados mediados por CDAP (5B, 5C e 5D) , 5E (conjugado sem 10 KDa DF) , 5F (conjugado com 10 KDa DF), 5G-19A dimensionado/5H-19A ativado (proporção de Ps modificado: CDAP 1: 1 para 19A) método de conjugação sem uso de etapa de diafiltração de 10 KDa.
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7/35 [0018] A figura 4 ilustra perfis SEC-HP-RI de
PnPs 19F dimensionado (157 KDa; A) e agregação dependente do tempo de polissacarideos (B) ativados mediados por CDAP,
6C/6D (proporção Ps: CDAP 1: 1 para 19F) método de conjugação sem usar passo de diafiltração de 10 KDa.
[0019] A figura 5 ilustra turbina tipo Rushton de seis lâminas.
[0020] A figura 6 ilustra protocolo de adsorção. DESCRIÇÃO DETALHADA [0021] É um objetivo da invenção proporcionar melhorias na estabilidade de vacinas que incluem sais de aluminio e, em particular, métodos para minimizar a agregação e melhorias na porcentagem de adsorção de conjugados individuais em vacinas pneumocócicas conjugadas de proteina-polissacarideo. Os inventores da presente invenção observaram que a adsorção combinada de conjugados de proteina-polissacarideo e o uso de proporção de polissacarideo para proteina maior do que 1: 1 resulta em
i) porcentagem de adsorção de menos de 55% para conjugados de S. pneumoniae para Sorotipos 6A, 9V e 23F e ii) porcentagem de adsorção de cerca de 80% a 90% para os restantes conjugados de sorotipo, deixando assim de obter a adsorção completa para um conjugado de sorotipo individual para uma determinada formulação conjugada pneumocócica multivalente. Também foi observado que a formulação de vacina preparada usando pH entre 6,8 a 7,0 resultou em uma agregação de cerca de 4 a 10% e menor adsorção.
[0022] O polissacarideo foi cultivado utilizando um método como descrito na Patente WO2013088448A1, em que o referido método compreende (a) provisão de um inócuo de uma
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8/35 cepa de bactéria que expressa o CP; (b) cultivo da cepa por fermentação em pH 7,2, em que a taxa de adição de meio de alimentação é equivalente à taxa de adição da mistura alcalina para manter um pH predefinido; c) fermentação do meio de cultura a 35-38°C sob agitação a 50-150 RPM com uma vazão de ar de 0,l-0,5vvm.
[0023] O polissacarideo foi purificado pelo processo descrito na Patente WO2012127485. O Pn-Ps preparado pelo presente processo mostra recuperação de cerca de 60 a 70%, em que a redução da contaminação do polissacarideo C é de 1 a 5 vezes em comparação com o conteúdo de C-Ps da cromatografia de interação póshidrofóbica (HIC) ou cromatografia de pré-permuta iônica (IEC), contaminação proteica é inferior a 1% e a contaminação por ácido nucleico é inferior a 1%. O referido processo foi realizado em escala de Pesquisa, Piloto e comercial.
[0024] Este processo pode purificar polissacarideos com 80-90% menos consumo de tempo e 90% menos custo quando comparado com CTAB/métodos com base em álcool.
[0025] De acordo com uma forma de realização importante da presente invenção, pode ser obtida uma adsorção percentual melhorada entre 75 a 95% para conjugados de S. pneumoniae por meio de uma relação de polissacarideo para proteina de cerca de 0,8 a 1,4 ii) utilizando adsorção individual ou separada para adsorção fraca de conjugados de S. pneumoniae, iii) mantendo o pH mais baixo durante a formulação.
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9/35 [002 6] De acordo com um aspecto da primeira forma de realização, a proporção de polissacarídeo/proteína
preferida é de 1: 1. aspecto da
[0027] De acordo com um segundo
primeira forma de realização, a referida composição
compreende , pelo menos, 2 conjugados de proteína-
polissacarídeo possuindo polissacarídeo escolhido entre os sorotipos 1, 2, 3,4,5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9F, 9N, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20,22F, 23F, 33F e 45.
[0028] De acordo com um terceiro aspecto da primeira forma de realização, o modo individual de adsorção pode ser utilizado para qualquer sorotipo de S. pneumoniae selecionado a partir de 2, 3, 4, 6A, 8, 9V, 9F, 9N, 12F, 15B, 17F, 18C, 20 , 22F, 23F, 33F e 45, de preferência para sorotipos 6A, 9V e 23F de S. pneumoniae.
[0029] De acordo com um aspecto preferido da primeira forma de realização, a vacina pneumocócica conjugada multivalente é de valência 10, em que os sorotipos 6A, 9V e 23F de S. pneumoniae são adsorvidos individualmente como uma mistura separada e depois adicionados a outra mistura compreendendo uma mistura de sorotipos de S. pneumoniae 1, 5, 6B, 7F, 14, 19A e 19F que foram adsorvidos em modo combinado.
[0030] De acordo com outro aspecto preferido da primeira forma de realização, a vacina pneumocócica conjugada multivalente possui valência de 11, 13, 15, 16 ou mais valente, na qual pelo menos um sorotipo de S. pneumoniae selecionado de um grupo de 2, 3, 4, 6A, 8, 9V, 9F 9N, 12F, 15B, 17F, 18C, 20, 22F, 23F, 33F e 45 é adsorvido individualmente ou adsorvido em um grupo menor
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10/35 como uma mistura separada e depois adicionado a outra mistura compreendendo uma mistura de sorotipos 1 de S.
pneumoniae, 5, 6B, IF, 14, 19A e 19F que foram adsorvidos em um modo combinado.
[0031] De acordo com ainda outro aspecto preferido da primeira forma de realização, a vacina pneumocócica conjugada multivalente é de valência 16, pelo que pelo menos um sorotipo de S. pneumoniae selecionado de um grupo de 2, 3, 4, 6 A, 9V, 12F, 15B, 18C e 23F é adsorvidos individualmente ou em grupos menores como uma mistura separada e depois adicionados a outra mistura compreendendo uma mistura de sorotipos 1, 5, 6B, 7F, 14, 19A e 19F de S. pneumoniae que foram adsorvidos em um modo combinado.
[0032] Uma segunda forma de realização da presente invenção é que a agregação numa formulação pneumocócica de conjugado de polissacarideo/proteina multivalente pode ser completamente prevenida por i) utilização de uma mudança de pH de neutro para pH ácido e ii) utilização de combinação de tampão de histidina-ácido succinico.
[0033] De acordo com um aspecto da segunda forma de realização, o referido deslocamento de pH pode ocorrer de 6, 8 para um pH selecionado dentre, mas não limitado a, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8 e 5,9. Mais preferencialmente de 6,8 a um pH selecionado de 5,4, 5,5, 5,6, 5,7 e 5,8.
[0034] De acordo com outro aspecto da segunda forma de realização, o referido sistema tampão de histidina-ácido succinico pode ter uma concentração entre 1
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11/35 mM e 200 Μ. A concentração é de preferência pelo menos 1 mM (por exemplo, no máximo, 200 mM, 150 mM, 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 20 mM, 10 mM, etc.). Mais preferencialmente, a concentração de tampão de histidina-ácido succínico na composição está entre 10 mM e 40 mM.
[0035] Uma terceira forma de realização da presente invenção é que a formação de flocos ou de agregados em conjugados pneumocócicos em volume pode ser evitada através da utilização de impulsores de lâmina plana da turbina da Rushton em vez de impulsores do tipo radial axial e radial magneticamente agitados nos recipientes de formulação.
[0036] A estabilidade de uma composição imunogênica da invenção é prontamente determinada usando técnicas padrão, que são bem conhecidas e rotineiras para os versados na técnica. Por exemplo, uma composição imunogênica é testada quanto à porcentagem de adsorção de conjugados, estabilidade, agregação, imunogenicidade, formação de partículas, perda de proteína (perda de concentração) e semelhantes, por métodos incluindo, mas não limitados ao ELISA, dispersão de luz, densidade óptica, centrifugação de velocidade de sedimentação, centrifugação de equilíbrio de sedimentação, dicroísmo circular (CD) , ensaio de Lowry, ensaio de ácido bicinconínico (BCA) e semelhantes .
[0037] Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um novo ELISA que pode quantificar diretamente o polissacarídeo conjugado/ligado sem afetar a antigenicidade dos conjugados em vacinas
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12/35 conjugadas pneumocócicas multivalentes. 0 mesmo pode ser utilizado para quantificar o teor de conjugado não adsorvido na matriz de formulação como um parâmetro indicador para porcentagem de adsorção em que os conjugados mostram mais de 70% de adsorção. De preferência, o referido ELISA pode empregar uma etapa de pré-ensaio envolvendo a dessorção do conjugado a partir de adjuvante de alume sem afetar a antigenicidade da proteína transportadora, bem como o polissacarídeo conjugado. Mais especificamente, a dissolução das amostras de conjugado adsorvido de alumínio é obtida utilizando hidróxido de sódio e ácido cítrico.
[0038] A proteína transportadora pode ser selecionada de um grupo, mas não limitada a CRM197, P4, toxóide da difteria, toxóide do tétano, fragmento C do toxóide do tétano, toxóide pertussis, proteína D do H. influenzae, E. coli LT, E. coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, complexo de membrana externa c (OMPC), porinas, proteínas de ligação a transferrina, pneumolisina, proteína de superfície pneumocócica A (PspA), adesina de superfície pneumocócica A (PsaA), PhtD pneumocócico, proteínas de superfície pneumocócicas BVH-3 e BVH -11, antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis e fator de edema desintoxicado (EF) e fator letal (LF) de Bacillus anthracis, ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro humano, albumina de soro bovino (BSA) e proteína purificada derivada da tuberculina (PPD) , particularmente CRM197 ou P4.
[0039] De acordo com uma forma de realização preferida, a referida composição multivalente pode compreende;
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i) pelo menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína transportadora, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo TT como proteína transportadora; ou ii) ao menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína transportadora, pelo menos uma proteína polissacarídica possuindo DT como proteína transportadora; ou iii) ao menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína transportadora, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo a adesina de superfície pneumocócica A (PsaA) como proteína transportadora; ou iv) ao menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína transportadora, pelo menos uma proteína polissacarídica possuindo TT como proteína transportadora, pelo menos uma proteína polissacarídica possuindo DT como proteína transportadora; ou
v) ao menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína transportadora, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo TT como proteína transportadora, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo a adesina de superfície pneumocócica A (PsaA) como proteína transportadora; ou vi) ao menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína transportadora, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo DT como proteína transportadora, pelo menos uma
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14/35 proteína-polissacarídeo possuindo a adesina de superfície pneumocócica A (PsaA) como proteína transportadora.
[0040] Em outra forma de realização, a proteína transportadora preferida conjugada com o Sorotipo 3 é CRM197, o Sorotipo 4 é TT ou DT e o Sorotipo 18C é CRM197.
[0041] Outra forma de realização da presente invenção inclui a utilização de PsaA como uma proteína transportadora na formulação final. O PsaA também pode ser usado na formulação final como um adjuvante.
[0042] Em certas formas de realização, a formulação multivalente da presente invenção pode compreender um agente tensoativo de preferência o polissorbato 20. Em certas formas de realização, a concentração final do polissorbato 20 na formulação é de 0,01% a 10% de polissorbato 20 peso/volume da formulação. Ainda noutras concretizações, a concentração final do polissorbato 20 na formulação é 0,01% de polissorbato 20 peso/volume da formulação. Em outras formas de realização, a concentração final do polissorbato 20 na formulação é 0,05% de polissorbato 20 peso/volume da formulação. Ainda em outras formas de realização, a concentração final do polissorbato 20 na formulação é 0,1% de polissorbato 20 peso/volume da formulação. Noutra forma de realização, a concentração final do polissorbato 20 na formulação é 1,0% de polissorbato 20 peso/volume da formulação. Ainda noutra forma de realização, a concentração final do polissorbato 20 na formulação é 10% de polissorbato de 20%/volume da formulação.
[0043] As presentes formulações de vacina multivalentes podem compreender conservantes selecionados
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15/35 de um grupo de, mas não limitado aos conservantes de mercúrio (por exemplo, timerosal), 2-fenóxi-etanol, metilparabenos, propilparabenos e álcool benzílico (ou suas misturas).
[0044] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a referida formulação de vacina pneumocócica conjugada de proteína-polissacarídeo multivalente, com valência de preferência de 10 ou 16 pode compreender conjugados adsorvidos de fosfato de alumínio, histidina, ácido succínico, cloreto de sódio, polissorbato 20 e tiomersal.
[0045] A composição de vacina da presente invenção pode compreender uma etapa de adição de adjuvante de sal de alumínio em uma quantidade de 20-375 pg, 20-300 pg, 20-200 pg, 25-150 pg de Al +++ por dose de 0,5 mL.
[0046] Tipicamente, as composições imunogênicas são preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas, podendo também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas para efeito adjuvante reforçado. A administração direta das composições será geralmente parentérica (por exemplo, injeção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular ou liberada no espaço intersticial de um tecido). As composições também podem ser administradas em uma lesão. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios e agulhas de aplicações transdérmicas ou transcutâneas, e hiposprays. O tratamento de dosagem pode ser um esquema de dose única ou um esquema
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16/35 de doses múltiplas (por exemplo, incluindo doses de reforço).
[0047] De preferência as vacinas da presente invenção podem ser armazenadas em solução ou liofilizadas, em que a composição de vacina liofilizada da presente invenção pode ser administrada como formulações de 1, 5 ou 10 doses com um gel de fosfato de alumínio contendo diluente e NaCl.
[0048] Outra forma de realização da presente invenção inclui a utilização de impulsores de uma lâmina plana da turbina da Rushton no recipiente de formulação (vide figura 5).
EXEMPLOS
Exemplo 1: Fermentação [0049] O método compreende (a) provisão do inócuo de uma cepa de bactéria que expressa o CP; (b) cultivo da cepa por fermentação a pH 7,2, em que a taxa de adição de meio de alimentação é equivalente à taxa de adição da mistura alcalina para manter um pH predefinido; c) fermentação do meio de cultura a 35-38°C sob agitação a 50-150 RPM com uma vazão de ar de 0-0,5 vvm.
Exemplo 2: Purificação de polissacarídeos capsulares Purificação de Sorotipo 19F de Polissacarídeo de S. Pneumoniae (HIC seguido por IEC) [0050] Cinco caldo clarificado das culturas fermentadoras do sorotipo 19F de S. pneumoniae foram concentrados e diafiltrados para 500 mL usando uma membrana MWCO de 100 KDa. A diafiltração foi realizada utilizando tampão de fosfato de sódio de 25 mM a pH neutro seguido de diafiltração com água para injeção (WFI).
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17/35 [0051] Nuclease foi adicionada à solução de polissacarídeo para se obter uma concentração final de 8
U/mL de solução. O tratamento enzimático foi realizado a
37°C, durante 10 ± 2 horas com agitação.
[0052] Sulfato de amônio foi adicionado à solução de polissacarídeo tratada com nuclease a 50% de saturação e incubando entre 2 e 8 °C durante 12 ± 2 horas (exceto os sorotipos 5 e 4) . A mistura foi submetida a centrifugação. A microesfera (precipitada) foi descartada. A solução (~500 mL) é submetida a uma diafiltração de 100 kD utilizando NaCl seguido por WFI resfriada. Esta solução diafiltrada contendo polissacarídeo com tampão e alta concentração de sal foi carregada na coluna HIC.
[0053] A coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (300 mL) foi equilibrada com tampão de sulfato de amônio saturado a 50% e a solução de polissacarídeo (500 ml) foi então carregada na coluna na gama de pH 6 a 8, de preferência em pH de 6 a 7. A coluna foi ainda lavada com o tampão contendo 50% de sulfato de amônio saturado. Nessas condições, o polissacarídeo foi recuperado na passagem de fluxo e lavagem de equilíbrio da coluna.
[0054] A solução de polissacarídeo foi então concentrada usando um filtro MWCO de 100 KDa e depois diafiltrada com NaCl e água para injeção (WFI).
[0055] A coluna de cromatografia de permuta iônica (300 mL) (permutador de ânion forte) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio 20 mM e a solução de polissacarídeo (500 mL) foi então carregada na coluna na gama de pH 6 a 8, de preferência em pH de 6,5 a 7,5. A coluna foi ainda lavada com tampão. Os polissacarídeos
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18/35 adsorvidos foram eluídos em etapa de diluição de gradiente usando NaCl 1,0 M (vários polissacarídeos foram eluídos em diferentes forças iônicas de NaCl).
[0056] A solução de polissacarídeo foi então concentrada usando um filtro MWCO de 100 KDa e depois diafiltrada com água para injeção (WFI).
[0057] A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,22 μ em garrafas de polipropileno. O polissacarídeo purificado foi armazenado congelado a -20 ± 50°C.
[0058] 0 processo acima também foi utilizado
para os sorotipos 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 14, 18C, 19A, 19F
e 23F. [0059] Resultados: Cromatografia de pós permuta
de íon & cromatografia de interação pós C-polissacarídeo
foram estimadas por espectros H1/P31 de RMN. O processo resultou em redução de 2-3 vezes no conteúdo de contaminantes.
Exemplo 3: Dimensionamento de polissacarídeos [0060] Um aparelho homogeneizador (Microfluidics) foi utilizado para reduzir o peso molecular do polissacarídeo antes da etapa de ativação. Para 19A a redução de dimensão foi realizada a 24-28 KPSI, enquanto que para 19F a redução de dimensão foi realizada a 2 6-30 KPSI em que o número de passagens foi de cerca de 1 a 3. O polissacarídeo de tamanho foi diafiltrado e concentrado seguido por filtração de 0,22 μ. O polissacarídeo dimensionado foi então submetido a HPSEC-RI para estimar o peso molecular médio.
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Exemplo 4: Processo de Conjugação Geral [0061] A conjugação de polissacarideo com a proteína transportadora foi realizada utilizando o método de conjugação de CDAP de Lees e outro (Vacine 26: 190-198, 1996) . Os polissacarideos que apresentam tamanho reduzido mecanicamente (com exceção de 6A que foi usado na forma nativa ou dimensionado dependendo do tamanho de 6A) foram dissolvidos em NaCl 2M. O CDAP (em acetonitrila) a partir de uma solução de reserva de 100 mg/mL foi adicionado à solução de polissacarideo de acordo com a proporção de polissacarideo: CDAP. Aproximadamente 1 minuto depois, foi adicionado NaOH 2M para se obter o pH de ativação específico. A ativação do polissacarideo foi realizada a este pH durante 4-10 minutos a 22°C. CRM-197 (a quantidade depende da razão inicial de Ps/Proteína) foi adicionada ao polissacarideo ativado e a reação de acoplamento foi realizada em pH específico durante 3-8 horas, dependendo do sorotipo. A reação foi então extinta com glicina durante 1 hora a 220°C e durante a noite a 120°C. Os conjugados foram então purificados por uma filtração de 300kDa a 500kDa seguida de diafiltração de lOOkDa. Além disso foram determinados o teor do polissacarideo e da proteína dos conjugados filtrados de 0,22 pm.
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Tabela 1 - Variações do parâmetro de reação de conjugação especifico de sorotipo para 10 sorotipos:
Detalhes de Conjugação para 10 sorotipos
Caracte rística Condições de processo de diferentes sorotipos
1 5 6A 6B 7F 9V 14 19A 19F 23F
Conc. Ps (mg/mL) 4, 5 5 5 11 10 8 10 9, 5 9, 5 9
Dissolu ção de Ps 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaC 1 2M NaCl 2M NaCl
Tempo de ativaçã o (min.) 4 4 4 4 4 4 4 4 10 4
Proporç ão Ps/CDAP 1:1, 25 1 : 1 1:1 1:1, 15 1:1, 25 1:1, 2 1:1, 1 1:1 1:0, 8 1:1, 1
Conc. CRM 197 (mg/mL) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
Proporç ão de Ps/CRM 0,82 0,75 1,05 0,77 0,85 0,87 0,82 0,8 6 0, 96 0,71
pHa:pHc: pHq 9, 5: 9, 5: 9, 5 9, 5: 9, 5: 9, 5 9, 5: 9, 5: 9, 5 9, 5: 9, 5: 9, 5 9, 5: 9, 5: 9, 5 9, 5: 9, 5: 9, 5 9, 5: 9, 5: 9, 5 09: 09: 09 9, 5: 9, 5: 9, 5 9, 5: 9, 5: 9, 5
Ps livre (%) < 1 6, 3 2, 63 1,57 < 1 ND 2,53 1,5 1,07 2,59
Protein a livre (%) ND 1,54 2,2 ND ND ND ND ND 2,2 ND
Distrib uição de tamanho Mol, (%) 70,5 6 74, 9 3 67, 6 7 76, 5 2 75, 6 8 72,7 5 76, 5 9 78, 1 74,3 5 72, 9 1
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Tabela 2: Comparação na porcentagem de adsorção de sorotipos individuais das formulações de PCV-10 em uma abordagem de duas combinações do processo de formulação.
Núm ero Sor oti po Sorotipo s das Formulaç ões PCV10 Abordagem de uma combinação (todos antigenos juntos) % de Adsorção Abordagem de duas combinações (Combinação A e B) % de Adsorção
Exp - 1 Exp - 2 Exp - 3 Exp-4 Exp-5 Exp-6
1 Sorotipo 1 90 85 92 >99 >99 97
2 Sorotipo 5 84 82 85 90 88 97
3 Sorotipo 6A 67 51 61 77 71 93
4 Sorotipo 6B 82 72 83 84 80 86
5 Sorotipo 7F 83 77 81 87 86 84
6 Sorotipo 9V 67 43 74 89 85 85
7 Sorotipo 14 86 83 88 92 91 90
8 Sorotipo 19A 95 92 97 95 93 85
9 Sorotipo 19F 91 87 93 91 88 75
10 Sorotipo 23F 56 52 58 84 81 81
[0062] Na abordagem de uma combinação, os sorotipos 6A, 9V e 23F foram fracamente adsorvidos na formulação, enquanto que para a abordagem de duas misturas, a porcentagem de adsorção foi > 70% para todos os sorotipos.
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Tabela 3: Efeito do deslocamento do pH no comportamento de agregação das formulações de PCV-10
Número do Sorotipo Descrição das formulações Porcentagem de rejeição de frascos devido aos agregados (partículas brancaa/flocos)
Experimento-7 Experimento-8 Experimento-9
1 Formulações PCV-10 'sem deslocamento de pH' 10% 4% 6%
2 Formulações de PCV-10 ' com deslocamento de pH' a partir de pH 6, 8 para pH 5,6-5,8 Experiment-10 Experiment-11 Experiment- 12
Nenhum agregado (nenhuma rejeição de classificação) Nenhum agregado (nenhuma rejeição de classificação) Nenhum agregado (nenhuma rejeição de classificação)
Não foram encontrados agregados para pH 5,6-5,8 para a formulação PCV 10 quando comparados com o pH 6,8.
[0063] A proporção de polissacarideo para proteina (1: 1) teve efeito vantajoso na extensão da adsorção do conjugado pneumocócico na formulação.
Tabela 4: Efeito de Ps para proporção de CRM197 sobre adsorção de conjugado pneumocócico (sorotipo 6A) na
Formulação
Número S Sorotipo de conjugado pneumocócico 6A em volume Proporção de Ps para Proteina Adsorção (%)
1 ZPN6ACP1201 1, 95 34
2 ZPN6ACP1203 1,51 42
3 ZPN6ACP1204-A 1,32 87
4 ZPN6ACP1204-B 1,15 95
5 ZPN6ACP1205 1,09 86
[0064] O efeito da proporção de polissacarideo para proteina foi observado na adsorção de conjugados. Um conjugado 6A que tinha uma proporção de Ps para proteina de > 1,5 mostrou baixa adsorção. A maioria dos sorotipos
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23/35 utilizados na formulação PCV-10 continha a proporção Ps: Pr na faixa de 0,6-1,3, o que resultou na adsorção ótima de vários sorotipos, incluindo o sorotipo 6A. Com base nos dados de adsorção obtidos para sorotipo 6A e experimentos de formulação PCV-10, embora formulando valência 16, pode ser extrapolado que a proporção de Ps:Pr dos 6 conjugados restantes na proporção similar poderia assegurar uma adsorção consistente de todos os 16 conjugados de sorotipo.
Tabela 5: Especificações do impulsor de lâmina plana da turbina da Rushton para diferentes recipientes
Volume geométrico (L) 14
Volume de trabalho (L) 10,0
Diâmetro de lâmina (mm) 74,7
Altura das lâminas (mm) 17,3
Número de lâminas 6
Controle de agitação (rpm) 50-500
Velocidade de ponta (m/s) 0,19-1,95
Exemplo 6: Protocolo ELISA [0065] O conteúdo de antígeno e a porcentagem de adsorção foram determinados usando o ELISA Sanduíche modificado. O ELISA sanduíche convencional foi modificado em relação às seguintes condições de teste/condições de ensaio e, deste modo, possui os seguintes atributos vantajosos:
- i. quantificação do polissacarídeo conjugado na presença de outros 9 antígenos conjugados numa vacina de valência 10,
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- ii. eluição de todos os dez conjugados a partir de fosfato de aluminio onde a adsorção é superior a 80%, iii. em que a captura do conjugado ocorre mesmo se estiver em pH 9 sem danificar a antigenicidade conjugada.
[0066] O conteúdo de antígeno e a porcentagem de adsorção foram determinados utilizando ELISA de acordo com o protocolo abaixo:
[0067] 1. As placas foram revestidas com anticorpo de captura (anticorpo de antiproteína transportadora) seguido de incubação durante 1/2 a 2 horas a 35 ± 5°C.
[0068] 2. As placas foram lavadas 3-6 vezes usando lavadora de placa ELISA.
[0069] 3. As placas foram bloqueadas com tampão de bloqueio (3% de BSA em IX PBS e tampão tris para sorotipos 14 e 9V) seguido por incubação durante 1,5 a 2,5 horas a 30 ± 5°C.
[0070] 4. As placas foram lavadas 3 vezes usando lavador de placa ELISA.
[0071] [0072]
5. Foram adicionadas amostras nas placas.
6. As placas foram incubadas durante a noite a 5 + 3°C
Dia 2 [0073] 1. As placas chegaram a atingir a temperatura ambiente.
[0074] 2. Anticorpo primário foi adicionado após a lavagem das placas 3 vezes seguido por incubação à temperatura ambiente por 25 impulsor de turbina de tipo
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Rushton de seis lâminas ± 2 durante 30 minutos seguido por lavagem.
[0075] 3. Anticorpo secundário foi adicionado e seguiu-se a incubação a 25 ± 2 durante 30 minutos.
[0076] 4. Substrato TMB foi adicionado seguido de incubação à temperatura ambiente por 15-20 minutos no escuro.
[0077] 5. Solução de parada foi adicionada [0078] 6. As placas foram lidas a 450 nm.
Procedimento para a dissolução da amostra sem prejudicar o epítopo da proteína transportadora [0079] Uma quantidade apropriada de NaoH 0,5M-2M foi adicionada a 2 mL de amostra de vacina. A referida amostra foi submetida a vortex suavemente até a solução ficar clara. O pH da solução foi ajustado de 9-12 até a solução ficar clara. O pH da solução foi trazido de volta para 6-7,4 usando ácido cítrico 0,5M a 2M. A referida
solução foi submetida a centrifugação (amostras
dissolvidas) a 3.000 a 6.000 x g durante 5 min. e o
sobrenadante foi recolhido para o teste.
Tabela 6
Sorotipo Batelada 1 Batelada 2
Teor em pg/mL % de Adsorção Teor em pg/mL % de Adsorção
Sorotipo 1 3, 87 89 4, 66 99, 4
Sorotipo 5 3, 57 83 4,03 90,8
Sorotipo 6A 3, 39 83 4, 6 68,3
Sorotipo 6B 8,01 80 6, 8 85
Sorotipo 7F 4,72 97 4, 18 84,4
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Sorotipo 9V 4, 61 80 3, 95 70,4
Sorotipo 14 5, 11 94 5,06 92,5
Sorotipo 19A 4, 42 94 3, 65 91,8
Sorotipo 19F 4, 35 82 4, 14 81,4
Sorotipo 23F 3, 66 72 4,03 75
Exemplo 7: Vacina pneumocócica conjugada
Valência 10 (PCV10)
Tabela 7 - Composição PCV10:
Número do Sorotipo Nome do Ingrediente Quantidade/dose(0,5 mL)
1 Sorotipo 1, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 19A, 19F e 23F* de polissacarídeo 2 pg cada
2 Sorotipo 6B* de polissacarídeo 4 pg
3 Adjuvante-Fosfato de alumínio® 0, 12 5 mg as Al+++
4 Cloreto de sódio 4,5 mg
5 Acido succínico 1,18 mg
6 Polissorbato-20 50 pg
7 Tiomersal (apenas para apresentação de múltiplas doses) 25 pg
8 L-Histidina 1,55 mg
*Os ingredientes ativos são conjugados com a proteína transportadora CRM197
Exemplo 8: Formulação 1 (PCV16)
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Vacina pneumocócica conjugada - Valência 16 (PCV16)
Tabela 8 - Composição PCV16 I
Número do Sorotipo Composições Quantidade/dose
Ingredientes Ativos*
1 Sorotipo 1 2,0 pg
2 Sorotipo 2 2,0 pg
3 Sorotipo 3 2,0 pg
4 Sorotipo 4 2,0 pg
5 Sorotipo 5 2,0 pg
6 Sorotipo 6A 2,0 pg
7 Sorotipo 6B 4,0 pg
8 Sorotipo 7F 2,0 pg
9 Sorotipo 9V 2,0 pg
10 Sorotipo 12F 2,0 pg
11 Sorotipo 14 2,0 pg
12 Sorotipo 15B 2,0 pg
13 Sorotipo 18C 2,0 pg
14 Sorotipo 19A 2,0 pg
15 Sorotipo 19F 2,0 pg
16 Sorotipo 23F 2,0 pg
Ingredientes Inativos
17 Fosfato de alumínio NMT 1,2 5 mg de Al3+
18 Histidina 1,55 mg
19 Proteínas transportadoras 11,3 - 113,3 pg
20 Ácido succinico 1,18 mg
21 Cloreto de sódio 4,5 mg
22 Polissorbato 20 50 pg
23 Tiomersal** 25 pg
24 WFI q. s.
* Os ingredientes ativos da vacina são conjugados com pelo menos uma proteina transportadora selecionada de CRM197, TT e DT.
** Adicionado apenas em apresentação de múltiplas doses
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Exemplo 9: Formulação 1 (PCV16)
Tabela 9 - Composição PCV16 H
Número do sorotipo Composições Quantidade/dose
Ingredientes Ativos*
1 Sorotipo 1 2,0 pg
2 Sorotipo 2 2,0 pg
3 Sorotipo 3 2,0 pg
4 Sorotipo 4 2,0 pg
5 Sorotipo 5 2,0 pg
6 Sorotipo 6A 2,0 pg
7 Sorotipo 6B 4,0 pg
8 Sorotipo 7F 2,0 pg
9 Sorotipo 9V 2,0 pg
10 Sorotipo 12F 2,0 pg
11 Sorotipo 14 2,0 pg
12 Sorotipo 15B 2,0 pg
13 Sorotipo 18C 2,0 pg
14 Sorotipo 19A 2,0 pg
15 Sorotipo 19F 2,0 pg
16 Sorotipo 23F 2,0 pg
Ingredientes inativos
17 Fosfato de alumínio NMT 1,25 mg de Al3+
18 Histidina 1,55 mg
19 Proteínas Transportadoras 11,3 - 113,3 pg
20 Ácido Succinico 1,18 mg
21 Cloreto de Sódio 4,5 mg
22 Polissorbato 20 5 0 pg
23 2-Fenox Etanol** 10 mg
24 WFI q. s .
* Os ingredientes ativos da vacina são conjugados com pelo menos uma proteína transportadora selecionada de CRM197, TT e DT.
** Adicionado apenas em apresentação de múltiplas doses
Exemplo 10 :
I) Degradação de PnPs dimensionados (19A, 19F, 6A e 6B) na presença de DMAP.
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29/35 [0080] Os PnPs dimensionados na solução de reação foram tratados com DMAP em uma proporção de 1: 1,5 e verificados quanto ao seu perfil de degradação por SEC-HPRI.
Resultados:
[0081] Observou-se que apenas PnPs 19A sofrem degradação na presença de DMAP, enquanto que outros PnPs contendo fosfodiéster (19F, 6A e 6B) permanecem intactos. Vide as figuras 1 (sem DMAP) e 2 que mostram a degradação mediada por DMAP de PnPs.
[0082] Para minimizar tal degradação de 19A, os
PnPs ativados foram submetidos à diafiltração de 10 KDa
usando NaCl 2M para remover o DMAP formado a partir da
solução de reação antes da conjugação com CRM197.
II) Degradação e agregação de PnPs dimensionados (19A, 19F, 6A e 6B) na presença de CDAP:
[0083] Os PnPs dimensionados na solução de reação foram tratados com CDAP na proporção de 1: 1,5 durante a ativação. Observou-se que 50% de DMAP são gerados como subproduto (medido por RP-HPLC), o que leva à degradação de PnPs, bem como a agregação entre PnPs ativados após determinado tempo de ativação (vide Tabela 2). A degradação e agregação foram verificadas por perfil SEC-HP-RI. Vide as Figuras 3A (sem CDAP), 3B, 3C e 3D (para 19A) e 4A (sem CDAP) 4B (para 19F) que mostram a agregação e degradação mediadas por CDAP de PnPs.
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Tabela 10 - Fatores responsáveis pela reticulação e agregação de polissacarideos-polissacarideos [0084] Efeito da duração da ativação do CDAP na formação de agregados de polissacarídeospolissacarideos
Soroti pos Mw de PnPs dimensionados/ modificados (KDa) [SEC-HPRI] PnPs (KDa) [SEC-HP-RI] modificados ativados Efeitos
6A 432 435 Nenhuma agregação entre polissacarídeos ativados
6B 131 131 Nenhuma agregação entre polissacarídeos ativados
19A 178 254 (após 20 minutos) Nenhuma agregação entre polissacarídeos ativados
487 (após 60 minutos) Nenhuma agregação entre polissacarídeos ativados
1173 (após 120 minutos) Nenhuma agregação entre polissacarídeos ativados
19F 157 205 (após 30 minutos) Nenhuma agregação entre polissacarídeos ativados
III) Prevenção de degradação e agregação de PnPs dimensionados (19A e 19F) apresentando PnPs: CDAP de 1: 1,5 empregando a etapa de diafiltração:
[0085] Para minimizar tal degradação e agregação de 19A, os PnPs ativados foram submetidos à diafiltração de
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KDa usando NaCl 2M para remover o DMAP formado a partir da solução de reação antes da conjugação com CRM197.
Consulte as figuras 3E (conjugado sem 10 KDa DF) e 3F (conjugado com 10 KDa DF) que mostra o perfil de conjugado
SEC-HP-RI usando PnPs e CRM197 ativados diafiltrados com 10
KDa. Contudo, a etapa de diafiltração afetou negativamente
o rendimento do conjugado, resultando em uma diminuição de 30% a 40% no rendimento geral.
IV) Prevenção da degradação e agregação de PnPs de tamanho (19A e 19F) pela redução da proporção de PnPs:
CDAP para 1: 1 (19A) e 1: 0,8 (19F) sem empregar a etapa de
diafiltração
[0086] Os PnPs de tamanho na solução de reação
foram tratados com CDAP nas proporções de 1: 1 e 1: 0,8 para 19A e 19F, respectivamente, e verificaram seu perfil de degradação e agregação por SEC-HP-RI.
Resultados :
[0087] Foi observado que as proporções Ps: CDAP
modificadas (1: 1 para 19A e 1: 0,8 para 19F) foram
encontradas para evitar a degradação e agregação para os
PnPs 19A e 19F. Consulte as Figuras 3 (G & H para 19A) e 4 (C & D para 19F). Uma vantagem adicional de usar proporções
modificadas foi que elas estavam isentas de uma etapa de
diafiltração de 10 KDa garantindo assim uma perda minima no rendimento global.
[0088] Observou-se que, no caso do sorotipo 19A, quando a duração da ativação do CDAP era superior a 10 minutos, isso resultou na ligação do polissacarídeo ativado ao polissacarídeo ativado, de forma final levando a formação de agregados de polissacarídeos-polissacarídeos.
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32/35 [0089] Além disso, no caso do sorotipo 19F, quando a duração da ativação do CDAP foi superior a 20 minutos, isso resultou na ligação do polissacarídeo ativado ao polissacarídeo ativado, levando a formação de agregados de polissacarídeos-polissacarídeos. Além disso, verificouse que a duração da reação de conjugação foi mais longa que a duração necessária para a ligação cruzada do polissacarídeo ativado ao polissacarídeo ativado, resultando assim na formação de agregados. Vide as Figuras 3 e 4.
[0090] No entanto, para outros sorotipos como 6APnPs e 6BPnPs, essa ligação cruzada não foi observada.
Exemplo 11: Preparação de conjugados: PnPsl9A e PnPsl9F [0091] A conjugação de polissacarídeo com a proteína transportadora foi realizada utilizando o método de conjugação de CDAP de Lees e outros (Vacine 26: 190-198, 1996) com as seguintes modificações:
i) Para a preparação de conjugado 19A, utilizando uma proporção de polissacarídeo para CDAP de 1: 1 a 22°C com um período de ativação de 4 min. e utilizando uma razão de polissacarídeo para proteína de 1: 1 ii) Para preparação do conjugado 19F, utilizando uma proporção de polissacarídeo para CDAP de 1: 0,8 a 22°C com um período de ativação de 9 a 10 min. e uma proporção de polissacarídeo para proteína de 1: 1 para 19F.
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Tabela 10 - Comparação dos resultados conjugados para 19A e 19F com método de conjugação CDAP tradicional (Lote 1) e método de conjugação melhorada (Lote 2)
I) Detalhes da Reação de Conjugação
Conjugados Conjugado 19A Conjugado 19F
Número da Batelada Batelada 1 Batelada 2 Batelada 1 Batelada 2
Cone. PnPs (mg/mL) 9, 5 9, 5 9, 5 9, 5
Dissolução de PnPs 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl
Tempo de ativação (min.) 4 4 4 9 to 10
Proporção PnPs/CDAP 1,0:1,5 1,0:1,0 1,0:1,5 1,0:0,8
Cone. de CRM (mg/mL) 20 20 20 20
Proporção Inicial Ps/CRM197 1,0:1,5 1,0:1,0 1,0:1,5 1,0:1,0
pHa:pHc:pHq 9,0:9,0:9,0 9,0:9,0:9,0 9,5:9,5:9,5 9,5:9,5:9, 5
II) Características do Conjugado final
Conjugados Conjugado 19A 19F conjugate
Número da Batelada Batelada 1 Batelada 2 Batelada 1 Batelada 2
Proporção final PnPs/CRM197 0,53 0,86 0,52 0, 96
CRM197/PnPs 1,88 1, 16 1, 92 1,04
PnPs livre (%) 1, 9 1,5 1,7 1,07
CRM197 livre (%) ND ND ND 2,2
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Dimensionamento molecular médio SEC-HP-I)(KDa) 1081 853 994 847
Dimensionamento molecular médio (UV/RI/MALS) (KDa) 8212 6012 6393 4773
Resultados :
[0092] Observou-se que a proporção de polissacarideo modificado: CDAP, tempo de ativação de CDAP e proporção inicial de polissacarideo: proteína, minimizou a degradação mediada por 4-dimetilamino-piridina do polissacarideo dimensionado durante a ativação e também impediu a agregação polissacarídeo-polissacarideo
subsequente, melhorando assim as características do
conjugado final com respeito ao teor livre de
polissacarideos.
[0093] 0 método de conjugação melhorado
utilizado para a preparação de conjugados 19A e 19F
resultou em conjugados que não mostraram nenhum sinal de fosfono-monoéster nos respectivos perfis de conjugado (31P Proton NMR) que indicou que o método de conjugação modificado foi eficaz para prevenir a hidrólise de polissacarideos através de reações de conjugação.
[0094] Em vista das muitas formas de realização possíveis às quais os princípios da invenção descrita podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as formas de realização ilustradas são apenas exemplos preferidos da invenção e não devem ser considerados como limitativos do âmbito da invenção. Pelo contrário, o âmbito da invenção é definido pelas reivindicações que se seguem. Portanto,
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35/35 reivindicamos como nossa invenção todo o conteúdo do escopo e espírito dessas reivindicações.

Claims (8)

1. Método para a preparação de uma formulação de vacina pneumocócica conjugada de proteína-polissacarídeo multivalente estável, mostrando ótima adsorção para cada conjugado, o referido método caracterizado pela agregação ser evitada empregando pelo menos um dentre:
1. adsorção individual ou separada para conjugados que, de outro modo, mostram adsorção relativa mais baixa por adsorção combinada;
ii. sistema tampão de histidina-ácido succínico juntamente com mudança de pH desde pH neutro até pH ácido;
iii. uma proporção de polissacarídeo para proteína entre 0,5 a cerca de 1,4; e/ou iv. uso de um impulsor de turbina do tipo Rushton no recipiente de formulação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela adsorção estar na gama de 75 a 99%.
3. Composição de vacina pneumocócica conjugada multivalente preparada por um método conforme definido na reivindicação 1, a referida composição caracterizada por compreender, pelo menos, dois conjugados de proteínapolissacarídeo possuindo polissacarídeo escolhido entre os
sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9F, 9N, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F e 45. 4 . Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender pelo menos 10 conjugados de
proteína-polissacarídeo apresentando polissacarídeos dos sorotipos 1, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F e 23F.
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5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender mais de 16 conjugados de proteína-polissacarídeo possuindo polissacarídeo dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F e 23F.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender 17 conjugados de proteínapolissacarídeo possuindo polissacarídeo dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender 16 conjugados de proteínapolissacarídeo possuindo polissacarídeo dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F e 23F.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela proteína veículo ser selecionada de um ou mais dentre o grupo que consiste em CRM197, adesina A de superfície pneumocócica (PsaA), toxóide de difteria (DT), toxóide tetânico (TT), fragmento C de toxóide tetânico, toxóide pertussis, proteína D de H. influenzae, E. coli LT, E. coll ST e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, complexo C de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação de transferrina, pneumolisina, proteína de superfície pneumocócica A (PspA), adesina A de superfície pneumocócica (PsaA), PhtD pneumocócica, proteínas pneumocócicas de superfície BVH-3 e BVH-11, antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis e fator de edema desintoxicado (EF) e fator letal (LF) de Bacillus anthracis, ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro humano, albumina de soro bovino
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3/8 (BSA) e derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD), particularmente CRM197, toxóide tetânico, toxóide da difteria ou PsaA.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender:
i. pelo menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM197 como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo TT como proteína veículo; ou
11. pelo menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo DT como proteína veículo; ou iii. pelo menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo a adesina de superfície pneumocócica A (PsaA) como proteína veículo; ou iv. pelo menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo TT como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo DT como proteína veículo; ou
v. pelo menos um conjugado de proteínapolissacarídeo possuindo CRM 197 como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo TT como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo adesina de superfície pneumocócica A (PsaA) como proteína veículo; ou
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4/8 vi. pelo menos um conjugado de proteínapolissacarideo possuindo CRM 197 como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo DT como proteína veículo, pelo menos uma proteína-polissacarídeo possuindo a adesina de superfície pneumocócica A (PsaA) como proteína veículo.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo sorotipo 3 ser preferencialmente conjugado com CRM-197, pelo sorotipo 18C ser preferencialmente conjugado com CRM197, pelo sorotipo 4 poder ser conjugado com TT ou DT e pelo sorotipo 22F poder ser conjugado com TT ou DT.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido tampão de histidina-ácido succínico ter uma concentração entre 1 mM e 200 mM, de preferência entre 10 mM e 40 mM, mais preferencialmente 20 mM.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mudança de pH para o tampão histidinaácido succínico ocorrer de preferência de 6, 8 para um pH entre 5,6 e 5,8.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
i. adicionar moléculas de polissacarídeos a um veículo de proteína em uma proporção predeterminada, de preferência 0,8 a 1,4 e mais preferencialmente 1:1 e a um pH predeterminado, de preferência entre 5,2 e 5,9, para obter uma pluralidade de conjugados de proteínapolissacarídeo distintos;
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5/8 ii. adsorver individualmente sobre um primeiro adjuvante de sal de alumínio em um tampão de histidinaácido succínico tendo uma concentração predeterminada, um primeiro conjunto predeterminado de conjugados de proteínapolissacarídeo selecionado a partir da referida pluralidade de conjugados de polissacarídeo-proteína obtidos na etapa (i), em que a quantidade do referido adjuvante de sal de alumínio varia de 20 a 375 qg de Al+++ por dose de 0,5 mL da formulação de vacina final; em que o conjunto de conjugados de proteína-polissacarídeo compreende os sorotipos 6A, 9V e 23F;
iii. adsorver em um modo combinado sobre um segundo adjuvante de sal de alumínio em um tampão de histidina-ácido succínico tendo uma concentração predeterminada, um segundo conjunto predeterminado de conjugados de proteína-polissacarídeo selecionados a partir da referida pluralidade de conjugados de proteínapolissacarídeo obtida na etapa (i), em que a quantidade do referido adjuvante de sal de alumínio varia de 20 a 375 qg de Al+++ por dose de 0,5 mL da formulação de vacina final; em que o conjunto de conjugados de proteína-polissacarídeo compreende os sorotipos 1, 5, 6B, 7F, 14, 19A e 19F;
iv. misturar o referido primeiro conjunto adsorvido obtido na etapa (ii) com o referido segundo conjunto adsorvido obtido na etapa (iii) e opcionalmente adicionar um agente tensoativo, de preferência polissorbato-20, e/ou pelo menos um conservante selecionado do grupo constituído por conservantes de mercúrio tais como Timerosal, 2-fenóxi-etanol, metilparabenos, propilparabenos, álcool benzílico e suas misturas, com a ajuda de
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6/8 um impulsor de lâmina plana de turbina Rushton para obter uma formulação de vacina conjugada polimérica de polissacarídeo multivalente estável.
14. Método para reduzir a agregação de polissacarideos-polissacarideos em todas as reações de dimensionamento e conjugação, particularmente para o polissacarídeo de Streptococus pneumoniae contendo uma ligação fosfodiéster entre unidades repetidas ligadas covalentemente a uma proteína veículo utilizando a química de cianilação, proporcionando assim imunogenicidade e estabilidade melhoradas para cada conjugado, o método caracterizado por compreender:
i. reagir polissacarídeos com um tamanho médio entre 130 KDa e 190 KDa com um agente de cianilação em uma proporção entre 1:0,8 e 1:1 a uma temperatura de cerca de 22°C a cerca de 25°C durante um período de cerca de 4 minutos a cerca de 10 minutos, resultando em um polissacarídeo ativado com cianato; e ii. colocar o polissacarídeo ativado com cianato em contato com proteína em uma proporção de 1:1 a um pH de cerca de 9 a cerca de 9,5 durante um período de 3 a 5 horas seguido por extinção com glicina; em que o referido processo de conjugação minimiza a degradação de polissacarídeo mediada por subproduto do agente de cianilação do polissacarídeo dimensionado e evita a agregação polissacarídeo-polissacarídeo subsequente resultando em um conjugado com teor mínimo de polissacarídeo livre.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo polissacarídeo compreendendo uma ligação
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7/8 fosfodiéster entre unidades repetidas ser derivado de um dos sorotipos 19A, 19F, 6A ou 6B de Streptococus pneumoniae.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo polissacarídeo ser o polissacarídeo de sorotipo 19A de Streptococus pneumoniae e pelo agente de cianilação ser tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio misturado em uma proporção de 1:1 a 22 °C
durante um período de 4 minutos, resultando em um polissacarídeo ativado com cianato. 17 . Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo polissacarídeo ser o polissacarídeo de
sorotipo 19F de Streptococus pneumoniae e pelo agente de cianilação ser tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio misturado em uma proporção de 1:0,8 a 22 °C durante um período de 8 a 10 minutos, resultando em um
polissacarídeo ativado com cianato. 18 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 e 17 , caracterizado pelo referido conjugado possuir um teor de polissacarídeo livre inferior
a 1,6%.
19. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela porcentagem de adsorção ser medida por um ELISA sanduíche, compreendendo particularmente uma etapa de dissolução de amostras de conjugado adsorvido com alumínio utilizando hidróxido de sódio e ácido cítrico.
20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizada por PsaA ser utilizado como um adjuvante.
Petição 870190049343, de 27/05/2019, pág. 10/14
8/8
21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizada por incluir ainda a etapa de armazenar a referida formulação de vacina conjugada obtida em estado liofilizado, até a administração como uma formulação de dose de 1, 5 ou 10 com um diluente contendo gel de fosfato de alumínio e NaCl.
BR112017026343-2A 2015-06-08 2016-06-03 métodos para aperfeiçoar a adsorção de conjugados de proteína-polissacarídeo e formulação de vacina multivalente assim obtida BR112017026343A2 (pt)

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