PT1664319E - Processo para a produção de um polissacarídeo capsular para ser usado em vacinas de conjugados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLISSACARÍDEO CAPSULAR PARA SER

USADO EM VACINAS DE CONJUGADOS

Campo da invenção A presente invenção refere-se à produção e à recuperação de polissacarídeos capsulares bacterianos e ao seu uso para a produção de vacinas de conjugados.

Antecedentes da invenção A primeira etapa para fazer uma vacina é a de separar a actividade que produz a doença, da que induz a imunidade. Na prática isto significa isolar ou criar um organismo, ou parte de um que seja incapaz de causar o desenvolvimento da doença, mas que ainda retém os antigénios responsáveis para induzir a resposta imune do hospedeiro.

Distinguimos dois grupos principais de vacinas: as vacinas de um organismo inteiro e as vacinas de subunidades. As vacinas de um organismo inteiro são produzidas matando/inactivando ou atenuando/debilitando os organismos. As vacinas de subunidades incluem vacinas baseadas em por exemplo antigénios de proteínas e antigénios de hidratos de carbono.

As vacinas anti-bacterianas produzidas que usam antigénios de hidratos de carbono podem ser compostas por um polissacarídeo purificado (capsular) do organismo que provoca a doença. Exemplos destas vacinas são: as vacinas de polissacarídeos Haemophilus influenzae tipo b (Hib), Neisseria meningitidis (A, C, W e Y) , Salmonella typhi (Vi), e Streptococcus pneumoniae (23 serotipos diferentes). 1/29

As vacinas de polissacarídeos pareciam que não protegiam as crianças com menos de 2 anos de idade e não induziam a célula T da memória a longo prazo. Portanto, foi introduzida uma nova geração de vacinas de polissacarídeos conjugados. As vacinas conjugadas pareciam ser imunogenéticas nas crianças jovens e induzir uma memória a longo prazo. As vacinas conjugadas são principalmente produzidas juntando ao polissacarídeo um portador de proteína. A primeira vacina conjugada que foi mundialmente introduzida estava dirigida contra o Haemophilus influenzae tipo b (Hib). 0

Haemophilus influenzae tipo b provoca pneumonia e meningite, principalmente nas crianças jovens.

Ela espalha-se pelas gotículas da tosse, dos espirros e nas condições de vida superlotadas. Calcula-se que cada ano ele causa 2 a 3 milhões de casos de doença e aproximadamente 450.000 mortes, a grande maioria delas nos países em vias de desenvolvimento.

Nos países de rendimentos elevados várias vacinas contra a Hib já estão generalizadas, em que elas praticamente erradicaram a doença. As vacinas estão entre as mais seguras actualmente em uso. Os estudos confirmaram a eficácia destas vacinas nos países com menos rendimentos, mas relativamente poucos destes países começaram com o uso rotineiro nas crianças. A vacina Hib é uma das vacinas mais subutilizadas devido a seu custo relativamente elevado em comparação com as vacinas normalmente usadas no programa regular de imunização infantil.

Os processos de produção usados actualmente são relativamente caros, e incluem uma fase longa de cultura de aproximadamente 16-18 horas, ver por exemplo o Pedido de Patente norte-americana US 4,644,059 e o período para a cultura está habitualmente baseado em parâmetros arbitrários, tal como o tempo ou a densidade óptica, ver por exemplo o Pedido de Patente norte- 2/29 americana US 4,220,717. Desta maneira, não é possível compensar as mudanças nas condições de cultura e os rendimentos sub óptimos do polissacarídeo são um resultado inevitável. De forma adicional, são usados produtos químicos fortes tal como fenol para recuperar o polissacarídeo, ver por exemplo o Pedido de Patente norte-americana US 4,695624 e o Pedido de Patente europeia EP 0 528 635. A fim de contribuir para o objectivo da WHO (World Health Organization) e GAVI (Global Alliance for vacclnes and Immunizatlon), para pôr as vacinas conjugadas Hib à disposição de todas as crianças do mundo e a fim de dar às populações dos países em vias de desenvolvimento uma oportunidade de aceder à tecnologia-Hib, um processo de produção a grande escala relativamente simples e fácil tem de ser desenvolvido, patenteado e autorizado nestes países sob termos razoáveis. A vacina produzida deve cumprir os requisitos da WHO pertinentes.

Breve descrição das figuras

Figura 1: Concentração de OD590, pH e polirribosilribitol fosfato (PRP) durante uma cultura de teste numa escala de 40 1.

Figura 2: Processo de purificação simples do polirribosilribitol fosfato(PRP).

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a um método para recuperar um polissacarídeo de um caldo de fermentação como o da reivindicação 1. O método para produzir o polissacarídeo compreende: - cultivar uma bactéria encapsulada num meio de cultura adequado a um pH e temperatura adequada 3/29 - ajustar o pH do meio de cultura a um valor constante com uma base ou um ácido até que o seu ajuste com a base ou o ácido respectivamente já não seja possível - atrasar a lise celular, preferencialmente por arrefecimento a uma temperatura inferior à usada para a cultura - opcionalmente, recuperar o polissacarídeo do meio de cultura.

Uma das vantagens do método de produção do polissacarídeo é que os polissacarídeos capsulares, isto é o antigénio capsular extraído de uma bactéria patogénica, pode ser obtido num rendimento elevado (aproximadamente 200-400 mg/1) num tempo muito curto. A optimização adicional do meio e/ou do método de cultura (alimentação contínua em vez de descontínua) naturalmente resultará numa concentração polissacarídea muito mais alta. Enquanto que os métodos do estado da técnica para a produção de polissacarídeos capsulares requerem entre aproximadamente 16 e 18 horas de fermentação, habitualmente no método da presente invenção, a fermentação pode ser completada, isto é no momento óptimo em que a terminação é atingida, entre aproximadamente 6 e 14 horas, preferencialmente ela é completada entre aproximadamente 7, 8, 9, 10 ou 11 horas. Habitualmente não demorará mais de aproximadamente 12 a 14 horas. É evidente que os tempos exactos dependem das bactérias e estirpes utilizadas e podem ser ligeiramente diferentes dependendo da "condição física" das bactérias. Neste contexto, a "condição física" das bactérias refere-se entre outras, à qualidade do inoculo e se reflecte em por exemplo na duração da fase de latência da cultura.

Outras vantagens do método são que o método é simples, reproduzível e rentável e dá rendimentos óptimos, mesmo depois de uma mudança nas condições de cultura. Além disso, as bactérias são cultivadas utilizando um meio simples que não 4/29 contém componentes de origem animal, com excepção da hemina. Isto produz um meio limpo, que é uma grande vantagem, porque actualmente a tendência é a de minimizar a transferência daa doença animal, como a BSE, usando tanto quanto possível meios livres de componentes animais.

Ainda outra vantagem é que ele é também muito flexível, porque logo que o arrefecimento é iniciado, a lise celular é atrasada e a colheita do polissacarídeo pode ser feita em qualquer momento conveniente, sempre e quando ela comece dentro de aproximadamente 24 horas, preferencialmente dentro de aproximadamente 8, 10, 12, 14 ou 16 horas, mais preferencialmente dentro de aproximadamente 2, 4 ou 6 horas depois de começar o arrefecimento. O técnico especializado entenderá que quanto mais alta é a temperatura depois do arrefecimento, mais rápida ter-se-á que começar a colheita, para obter melhores resultados. Numa forma de realizar a invenção, a colheita começa aproximadamente 1.5 horas depois do abaixamento da temperatura. 0 método é aperfeiçoado sem problemas substanciais especialmente porque a colheita está baseada num parâmetro físico (pH) e não em algo arbitrário como por exemplo o tempo ou a densidade óptica (OD) . Além disso o método resulta num volume de polissacarídeo muito estável que pode ser purificado usando um processo relativamente simples. O processo de purificação tem como basea o sobrenadante concentrado, portanto a quantidade de materiais auxiliares é mínima. A purificação resulta num polissacarídeo purificado que é estável durante muito tempo e que supera todos os requisitos da WHO.

Os polissacarídeos capsulares podem ser extraídos de qualquer bactéria encapsulada, seja ela Gram-negativa ou Gram-positiva.

Exemplos não limitativos de bactérias, que podem ser usadas, são estirpes de Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus,

Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Clostridium, Haemophilus,

Pneumococcus, Neisseria e Escherichia. São de particular interesse para os seres humanos os polissacarídeos capsulares de 5/29

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis. Especialmente o Haemophilus influenzae tem sido amplamente usado, ver por exemplo Rosenberg et al. (1961) J.

Biol. Chem. 236: 2845 e Zamenhof et al. (1953) J. Biol. Chem. 203:695. Qualquer estirpe de Haenzofilus influenzae tipo b (Hib) pode ser usada. Exemplos de estirpes adequadas incluem a estirpe Hib de referência, Eagan e a estirpe A760705.

Os métodos para cultivar estas bactérias são bem conhecidas na técnica, por exemplo de Meritt et al. (2000) J Biotechnology 81: 189. Em geral, um meio de cultura adequado está baseado em aminoácidos e/ou extracto de levedura ou peptona, cloreto de sódio (NaCl) e glicose, suplementado com NAD e hemina e tamponado usando um tampão fosfato. Preferencialmente, o meio não deve conter componentes de origem animal com excepção da hemina. Um pH adequado é geralmente um pH entre aproximadamente 6 e 8, preferencialmente aproximadamente 6.5 e 7.5 ou aproximadamente 6.8 e 7.2. Habitualmente a temperatura da cultura é de aproximadamente 30 a 37 °C, preferencialmente entre aproximadamente 35 e 37 °C.

De acordo com o método, o pH é mantido constante num valor desejado utilizando tanto um ácido como uma base. Qualquer base ou ácido que é convencionalmente usada para ajustar o pH nas culturas das células. As bases e os ácidos adequados incluem NaOH, preferencialmente numa concentração de aproximadamente 1-5 mol/1 e HC1, preferencialmente na forma concentrada. A determinado momento, o pH já não pode ser mais ajustado com o uso do ácido ou da base seleccionada, porque o pH mostra agora uma tendência a diminuir ou aumentar respectivamente. Este momento corresponde a aproximadamente à fase logarítmica tardia (ver também a figura 1) . O pH é monitorizado sem outro ajuste. passado algum tempo a diminuição ou o aumento do pH será mais lento, normalmente aproximadamente 2-4 horas depois dos ajustes do pH terem sido interrompidos se a cultura está a 6/29 aproximadamente 35 °C. As temperaturas mais baixas, ele demorará mais tempo. Justamente antes de que a diminuição ou aumento comece a ser mais lenta, o que será previsível do teste executado (ao contrário de por exemplo a densidade óptica), a

fermentação é terminada e o caldo da cultura é colhido. A fermentação é preferencialmente terminada por arrefecimento, já que esta tem muitas vantagens. Em primeiro lugar, não envolve o uso de produtos químicos fortes, como o formaldeído, que também pode ser usado para a terminação. Em segundo lugar, é uma maneira muito económica de terminar o crescimento, porque não envolve materiais adicionais. Em terceiro lugar, tem a vantagem concomitante de que a possibilidade de lise é minimizada durante a colheita. Devido a que a colheita é um processo que habitualmente não é completado em poucos minutos, o arrefecimento dá-nos a flexibilidade e o tempo para a colheita sob circunstâncias óptimas e no momento óptimo. Colher mais cedo pode conduzir a por exemplo um rendimento 50% inferior de polissacarídeos, dependendo do tempo de colheita (ver por exemplo a figura 1) . Colher num momento posterior contaminará a fracção de polissacarídeo, porque as células terão lisado e todo o tipo de material celular terá acabado no meio do qual o polissacarídeo será isolado (ver por exemplo a figura 1). Estas contaminações celulares complicarão qualquer outro isolamento e procedimento de purificação do polissacarídeo.

Para terminar a fermentação para a colheita, a temperatura é preferencialmente descida a abaixo de 30 °C, mais preferencialmente a abaixo de 25 °C, da forma mais preferida a abaixo de 20 °C. A colheita real, isto é o esvaziamento do fermentador, pode começar uns minutos depois de que a fermentação tenha terminado, mas o arrefecimento torna o procedimento muito flexível e permite um atraso de várias horas de acordo com a conveniência da pessoa que faz a colheita. Não é necessário esperar toda a noite, o que é quase inevitável quando o formaldeído é usado para matar as células. Numa forma de realizar a invenção, a colheita começa pelo menos 2 horas depois 7/29 de que a fermentação tenha terminado. Noutra forma de realizar a invenção, a colheita começa pelo menos 3, 4, 5 ou 6 horas depois de que o crescimento tenha terminado. A colheita é tipicamente feita por centrifugação, e que opcionalmente é seguida da inactivação, concentração e preferencialmente dia filtração do sobrenadante. Preferencialmente a centrifugação é a uma velocidade de aproximadamente 3000-6000 rpm. A centrifugação é opcionalmente seguida pela inactivação. A inactivação, que é feita para matar qualquer tipo de vida microbiana, pode ser executada usando formaldeido, preferencialmente numa concentração final que não exceda 0.1% (p/v) durante toda a noite a aproximadamente entre 2 e 8 °C. Numa forma de realizar a invenção foi usado 0.04% p/p de formaldeido para inactivar o sobrenadante. O sobrenadante concentrado pode ser armazenado antes da recuperação do polissacarideo, preferencialmente por congelamento, da forma mais preferida por congelamento a <-20 °C, onde ele manter-se-á estável durante pelo menos dois anos se ele é produzido de acordo com este método. Numa forma de realizar a invenção, ele manteve-se estável durante pelo menos três anos.

Numa forma de realizar a invenção, a produção do polissacarideo durante a fermentação foi calculada usando ELISA e habitualmente foi de entre aproximadamente 200 e 400 mg/1 no sobrenadante, e a massa molecular relativa foi bastante elevada (700-800 kDa).

Recuperação do polissacarideo O polissacarideo pode ser recuperado do meio, habitualmente do seu sobrenadante, usando técnicas do estado da arte. A recuperação pode conduzir a um polissacarideo parcial, substancial ou completamente purificado. Preferencialmente, é obtido um produto que contém mais de 80%, 85%, 90% ou 95% do polissacarideo inicial. No entanto, a fermentação de acordo com o método da presente invenção permite ainda um processo de 8/29 recuperação muito simples, que também pode ser usado em combinação com processos de produção do polissacarídeo do estado da técnica. Este processo de recuperação e de purificação simples é caracterizado por não se usarem produtos químicos fortes tal como o fenol. Além disso, não há necessidade de centrifugação de alta velocidade ou ultra centrifugação, ou cromatografia. Isto torna a purificação em termos económicos atractiva, porque não há necessidade de investir num centrifugador de alta velocidade (extra) ou ultra centrifugadora ou num material de coluna caro. 0 processo compreende quatro fases de precipitação simples, que não têm de ser repetidas várias vezes, como é habitual no caso de esquemas de purificação do estado da técnica (Tanizaki et al. (1996), J. Microbiol. Meth., 27, 19-23) em que cada uma delas tem uma duração máxima de 24 horas. Numa forma de realizar a invenção, a precipitação é convenientemente executada durante a noite, isto é durante 15 a 18 horas.

Este processo de recuperação simples compreende: a) usar um detergente catiónico para precipitar o polissacarídeo ou parte dos contaminantes do sobrenadante para obter uma primeira fracção do polissacarídeo; b) usar álcool para precipitar o polissacarídeo da primeira fracção do polissacarídeo para obter uma segunda fracção do polissacarídeo; c) submeter a segunda fracção do polissacarídeo a uma precipitação de álcool na presença de um detergente aniónico, pelo qual o álcool está presente numa concentração que é inferior à concentração a que o polissacarídeo precipita; d) precipitar o polissacarídeo da fracção solúvel usando álcool para obter um precipitado de polissacarídeo; 9/29 e) dissolver o precipitado do polissacarídeo e submetê-lo a uma concentração e a uma dia filtração. 0 detergente catiónico em a) é preferencialmente Cetavlon (bromido de amónia hexadeciltrimetil, preferencialmente numa concentração final de aproximadamente 0.01-1% (p/v). O detergente aniónico em c) é preferencialmente desoxicolato de sódio (DOC), preferencialmente numa concentração final de aproximadamente 0.1-1% (p/v). O álcool que é usado nas fases de precipitação é preferencialmente etanol, preferencialmente numa concentração final de aproximadamente 60-74% (v/v) em b) ; de aproximadamente 10-50% (v/v) em c) ; e de aproximadamente 60-85% (v/v) em e) . Em cada uma das fases, os sólidos e os fluidos (também referidos como granulados e sobrenadantes) são separados por quaisquer ou com uma combinação de centrifugação, decantação e filtração. Depois da última precipitação de álcool, o granulado é preferencialmente separado do sobrenadante por decantação e não por centrifugação. Em qualquer uma das fases, o granulado pode ser dissolvido com o polissacarídeo precipitado em qualquer solvente ou líquido conveniente, por exemplo utilizando água ou 1 mol de NaCl. Este processo de recuperação simplificado que pode ser usado para todos os tipos de polissacarídeos é também parte da invenção.

Preferencialmente, a purificação é executada usando sobrenadante concentrado. A quantidade de detergente e/ou de etanol necessária é baseada no volume do concentrado. O polissacarídeo purificado mantém-se assim estável durante pelo menos dois anos a < -20 °C. Numa forma de realizar a invenção, o polissacarídeo purificado manteve-se estável durante pelo menos três anos.

Numa forma de realizar a invenção, o polissacarídeo é recuperado por um processo que compreende 0.65% (p/v) de precipitação de Cetavlon, 72% (v/v) de precipitação de etanol, 32% (v/v) de precipitação de etanol na presença de 0.5% (p/v) de DOC e 64% 10/29 (v/v) de precipitação de etanol, preferencialmente depois da clarificação.

Noutra forma de realizar a invenção, o polissacarideo é purificado usando 0.04% (p/v) de precipitação de Cetavlon em a). O polissacarideo manter-se-á assim no sobrenadante. A precipitação de álcool pode ser executada adicionando directamente o álcool ao sobrenadante. O resto do processo é como o anteriormente mencionado.

Ainda noutra forma de realizar a invenção, o processo de recuperação compreende 0.65% (p/v) de precipitação de Cetavlon assim como 0.04% (p/v) de precipitação de Cetavlon. O 0.04% (p/v) de precipitação de Cetavlon pode por exemplo ser usado para purificar de forma adicional o polissacarideo obtido depois da fase de 64%(v/v) de etanol. O álcool em c) pode ser adicionado antes ou depois da adição do detergente. De forma alternativa, é adicionado simultaneamente, isto é separadamente ao mesmo tempo ou como uma mistura. Preferencialmente, o álcool é adicionado depois do detergente.

Uma combinação do método de fermentação e de recuperação da invenção permite a alta pureza do polissacarideo. Por exemplo, o polissacarideo capsular de Haemophilus influenzae tipo b isolado de acordo com esta combinação de métodos da invenção, cumpre todas as especificações da WHO do polissacarideo purificado para ser usado na produção de vacinas Hib conjugadas.

Preferencialmente, a fracção do polissacarideo purificado contém pelo menos 90% (p/p) de polissacarideo, mais preferencialmente pelo menos 94, 95 ou 96% (p/p) de polissacarideo, tendo como base o seu peso seco. O teor da endotoxina é preferencialmente menos do que 10 Ul/microgramas, mais preferencialmente menos do que 8, menos do que 5, menor do que 2 ou menos do que 1

Ul/microgramas, da forma mais preferida, é menos do que 0.5 ou 11/29 menos do que 0.2 UI/microgramas da fracção de polissacarídeo. O teor de ácido nucleico é preferencialmente menos de que 1% (p/p), mais preferencialmente menos de que 0.8 (p/p).

Produção das vacinas

Um polissacarídeo que é produzido usando o método da presente invenção pode ser usado para aumentar a capacidade do sistema imunológico humano ou animal para combater as infecções. Em particular, pode ser usado para a preparação de uma composição farmacêutica para ser administrada a um sujeito humano ou animal. O polissacarídeo ou um conjugado dele é preferencialmente administrado por via parenteral, por exemplo por injecção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra arterial ou intralesional. O polissacarídeo ou um conjugado dele pode ser combinado com um meio ou veículo de libertação aceite na Indústria Farmacêutica por técnicas convencionais conhecidas na arte. Os métodos para preparar as composições parenteralmente administráveis são bem conhecidas na técnica e descritas mais detalhadamente em várias fontes, que incluem, por exemplo, Remington's pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA. O polissacarídeo é preferencialmente administrado numa dose terapeuticamente efectiva, isto é uma que aumentará a capacidade do sistema imunológico humano ou animal para combater as infecções.

Preferencialmente, ele é usado para a produção de uma vacina, por exemplo uma vacina conjugada de polissacarídeo. Os métodos para produzir vacinas conjugadas são conhecidas na técnica e são por exemplo descritas em Ada et al (2003) Clin. Microbiol. Infect. 9(2): 79-85, Dick et al (1986) Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10: Conjugate Vaccines: 48-114, e Jennings et al (1994) Neoglycoconjugates: Preparation and Applications: 325-371. Apesar de que há ligeiras variações nos 12/29 métodos utilizados para produzir vacinas conjugadas, habitualmente os métodos de produção compreendem: - a activação do polissacarídeo e/ou do portador da proteína - a conjugação do polissacarídeo (activado) com o portador de proteína (activado) opcionalmente, a purificação do conjugado proteína- polissacarídeo opcionalmente, a formulação do conjugado proteína- polissacarídeo. 0 polissacarídeo pode ser reduzido em tamanho a uma massa molecular consistente antes da conjugação, usando métodos controlados de despolimerização conhecidos na técnica. Os métodos adequados de despolimerização compreendem a oxidação dos dióis vicinais, submetê-los a ultra-sons, e à hidrólise ácida ou alcalina. A hidrólise alcalina pode ser convenientemente efectuada num tampão, para garantir a estabilidade do pH ao longo da reacção. Um tampão alcalino adequado é o tampão bicarbonato-carboneto, 0.1 a 1 mo1/1 a um pH acima de 9, preferencialmente um pH acima de 10 Estas reacções de despolimerização podem ser conduzidas à temperatura ambiente, mas preferencialmente a frio, tal como de 2 a 8 °C, para minimizar as reacções secundárias indesejadas, e preferencialmente sob agitação vigorosa. 0 polissacarídeo pode ser activado antes da conjugação ou antes da redução de tamanho por métodos de activação conhecidos na técnica, tal como por exemplo usando um reagente cianilante (Kohn et al (1986) Appl. Biochem. Biotechnol. 9: 285 305). Os agentes cianilantes adequados incluem brometo cianogénio (CNBr), tetrafluoroborato de l-ciano-4-(dimetilamino)-piridinio (CDAP), tetrafluoroborato de N-ciano-IV, N, N-trietilamónio (CTEA) , e p-nitrof enilcianato (pNPC). De forma alternativa, os grupos terminais aldeídos podem 13/29 ser formados no polissacarídeo via clivagem oxidativa dos dióis vicinais e seguidamente pode ser efectuada a conjugação por aminação reductiva com um reagente de redução adequado, tal como cianoborohidreto de sódio. 0 portador de proteína pode também ser activado antes da conjugação por métodos de activação conhecidos na técnica, tal como por exemplo utilizando um reagente halogéneo alquilante (Bernatowicz et al (1986) Anal. Biochem. 155(1): 95-102). Este reagente adequado é o éster de N-hidroxisuccinimido de ácido bromoacético. O polissacarídeo pode ser conjugado directamente no portador da proteína ou depois da activação (adicional) via moléculas de separação ou de ligação, introduzidas no polissacarídeo (activado) e/ou no portador de proteína (activado). Por exemplo, depois da activação do polissacarídeo com um agente cianilante, podem ser introduzidos separadores de (di)amino ou aminoácidos, tal como cistamina ou glicina no polissacarídeo. Alguns separadores de diamino podem também ser reduzidos para gerar grupos de tiol livres (de Weers et al (1998) Bioconjugate Chem. 9(3): 309-315). Outro separador adequado é a dihidrazida do ácido adípico (ADH) (Chu et al (1983) Infect. Immun. 40(1): 245-256). De forma alternativa, estes separadores podem ser introduzidos no portador da proteína por uma reacção de amidação. A remoção de um excesso de separadores pode ser efectuada por métodos de purificação conhecidos na técnica, tal como cromatografia de permeaçao em gel, precipitação diferencial, e ; diafiltração. Um sistema de diafiltração adequado faz uso do princípio de filtração de fluxo tangencial nas membranas microporosas. As soluções tamponadas salinas demonstraram que facilitavam este processo de purificação. Uma solução adequada é um tampão de fosfato, de aproximadamente 0.01 a 0.2 mol/1, com cloreto de sódio ou o sal equivalente, aproximadamente 0.5 a 3 mol/1. Com este método, um separador tal como ADH pode ser removido a níveis de

contaminação abaixo de aproximadamente 0.05 a 0.5% (p/p) da ADH ligada ao polissacarídeo. Esta descontaminação pode ser monitorizada pelo uso de cromatograf ia de permeação em gel de alta eficiência (HP-GPC), com um detector de UV ajustado num 14/29 comprimento de onda baixa, tal como aproximadamente de 210 a 230 nm. A quantificação do ADH residual é seguidamente feita através do uso de uma calibração Standard. Depois da introdução de separadores no polissacarídeo, a conjugação à proteína portadora pode ser efectuada pela mediação de um reagente da amidação de carbodiimida. Um reagente de amidação adequado é N-(3-dimetilaminopropil)-N '-etil-carbodiimida hidrocloreto (EDC), que pode ser suplementado com IV-hidroxisuccinimida (NHS) para facilitar a reacção. De forma alternativa, as ligações de tioéter podem ser formadas por condensação entre um polissacarídeo tiolado e um portador de proteína acetilado com halogéneo, sem a ajuda de um reagente adicional.

Uma reacção da conjugação mediada por carbodiimida pode dar-se num pH ligeiramente ácido, habitualmente pH entre 4 e 6, assegurando assim a amidação preferencial dos grupos separadores de hidrazida sobre os grupos amino que se encontram no portador de proteína. Numa forma de realizar a invenção, a reacção de conjugação dá-se num tampão adequado, a fim de assegurar a estabilidade do pH ao longo da reacção. Isto impede a necessidade de ter acesso ou investir num medidor de pH equipado com titulador automático para fazer as adições ácidas regulares.

Numa forma preferida de realizar a invenção, é usado um tampão desprovido de grupos carboxílicos que reagem com as carbodiimidas, prejudicando assim a reacçao da conjugação desejada. Por exemplo, pode ser usado um tampão feito de ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES), de 0.05 a 0.2 mol/1, e cloreto de sódio, de 0.2 a 1 mol/1, a um pH de 5.5 a 6.1. A reacção de conjugação pode ser atenuada pela adição de alcali ou de um tampão alcalino, que eleva o pH da mistura reactiva a aproximadamente pH 7 ou superior, impedindo assim ou tornando dramaticamente mais lenta a amidação mediada por carbodiimida adicional. Um tampão alcalino adequado é um tampão fosfato, de aproximadamente 0.1 a 0.4 mol/1, com pH entre 8 e 9, adicionado em quantidades suficientes para neutralizar a mistura reactiva a aproximadamente pH 7. 15/29 A remoção do polissacarídeo e da proteína que não reagiram pode ser efectuada por métodos de purificação conhecidos na técnica, tal como cromatografia de permeação em gel, cromatografia de interacção hidrofóbica, precipitação diferencial, e diafiltração. Um sistema de cromatografia de permeação em gel adequado usa a Sepharose CL-4B, Sephacryl S 500 HR (Amersham), ou meios de gel equivalentes, com uma solução salina neutra tamponada como eluente. Um sistema de cromatografia de interacção hidrofóbica adequado usa Butil, Octil-, ou Fenil Sepharose 6 Fast Flow (Amersham) , ou meios equivalentes de gel, com uma solução de sulfato de amónio neutro tamponada como eluente de ligação. Um sistema de precipitação diferencial adequado usa soluções concentradas de sulfato de amónio. O polissacarídeo e a proteína residual que não reagiram podem ser detectados e quantificados usando cromatografia de permeação em gel de alta eficiência (HP-GPC) , com um detector de UV ajustado a 280 nm., e um detector de índice de refracção diferencial. O polissacarídeo residual que não reagiu pode ser também quantificado por um ensaio colorimétrico específico depois da precipitação do conjugado. estão também descritos nos Pedidos US 4,644,059, US 4,673,574, US 7,667,170, EP 0 161 188, EP 0 477 A preparação dos conjugados de Patentes US 4,356,170, 4,695,624, US 4,902,506, US 508 e EP 0 848 011. O polissacarídeo, que é preferencialmente um poliribosilribitol fosfato (PRP), que pode ser acoplado a qualquer portador da proteína. Os portadores da proteína adequados aumentam a sua imunogenicidade e incluem proteínas de membrana imunogénicas, subunidades de proteína virai, polipetídeos sintéticos e outras proteínas imunogénicas. Da forma mais preferida, o portador da proteína é um toxóide. Os toxóides bem conhecidos utilizados nas vacinas conjugadas são o toxóide do tétano e o toxóide de difteria. 16/29 0 polissacarídeo produzido pode ser usado para produzir uma vacina monovalente. Um exemplo adequado de uma vacina monovalente é um polissacarídeo ou uma vacina conjugada só contra a Haemophilus influenzae tipo b (Hib) . De forma alternativa, o polissacarídeo da invenção pode ser usado para produzir uma vacina multivalente. Ele pode por exemplo ser usado para produzir uma vacina tetravalente, tal como para a difteria-tétano-polio-Hib ou para a difteria-pertussis-tétano-Hib, ou uma vacina pentavalente, tal como difteria-pertussis-tétano-polio-Hib, ou difteria-pertussis-tétano-hepatite B-Hib. A vacina pode ser formulada de qualquer maneira conveniente. Por exemplo, uma vacina Hib monovalente pode estar liofilizada ou na forma líquida, com ou sem a adição de um estabilizador, tal como a lactose, ou de um adjuvante, tal como fosfato de alumínio. A um técnico especializado será óbvio que o método de produção também pode ser usado para a produção de polissacarídeos de outros microrganismos que contenham polissacarídeos.

Exemplos

Exemplo 1 Teste de crescimento da Haemophilus Influenzae tipo b

Uma estirpe de Haemophilus Influenzae tipo b (A760705) isolada em Amesterdão foi cultivada usando um biorreactor de 50 1 (volume de trabalho de 40 1) com um sistema de controlo NOVO. Esta estirpe foi identificada como um Haenzophilus Influenzae tipo b utilizando testes de uso habitual, tal como os testes de imuno e serotipificação, e de morfologia. O biorreactor foi primeiro cheio com o meio basal (composto de 1 a 5 no quadro 1 dissolvido em 35.5 1) antes de este ter sido esterilizado in situ durante 20 minutos a 110 °C. Mesmo antes da inoculação foi adicionada uma a quantidade apropriada de soluções padrão ao meio (ver quadro 2) . O biorreactor foi inoculado usando 11 pré-culturas, cultivadas a uma escala de 3.5 usando o mesmo meio e um lote de semente congelada a -70 °C da estirpe Hib. 17/29 Ο ρΗ foi mantido constante a 7.0 utilizando 5 mol/1 NaOH. A temperatura foi mantida constante a 35 °C. O oxigénio dissolvido (OD) foi mantido constante 30% utilizando ar e oxigénio através da câmara de ar usando um fluxo de gás de 5 1/min. A velocidade do agitador foi aumentada gradualmente de 300 para 700 rpm.

Foram tiradas diferentes amostras usando um dispositivo amostrador automático. A cultura foi monitorizada medindo a densidade óptica a 590 nm (OD59o) , concentração de pH e PRP (ver figura 1). Para monitorizar a lise da cultura uma coloração Gram de um número de amostras foi controlada.

Primeiro a concentração PRP aumentou à volta de 320 mg/1, que era mais ou menos paralela ao crescimento. O pH começou a aumentar depois de aproximadamente 7 horas de cultura, a OD590 era a ideal e igual a 6.88. Depois de aproximadamente 12 horas de cultura o PRP era mais ou menos constante a 330 mg/1 enquanto o pH aumentou mais, a OD590 diminuiu também e a lise celular começou lentamente. Depois de 16 horas de cultura as células não estavam ainda totalmente lisadas e o pH era igual a 7.92. 18/29

Quadro 1: Composição do meio

No. Composto Concentração (g/D 1 Ácido L-glutâmico 1.3 2 Na2HP04.2H20 2.5 3 KC1 0 .09 4 NaCl 6 5 NH4C1 1.25 6 Extracto de levedura (só fracção de massa molecular baixa <30 kDa) 10 7 Cistina 0.015 8 MgS04.7H20 0.6 9 Dextrose 5 10 Hemina (continuação) 0.005 No . Composto Concentração (g/i) 11 NAD 0.0 02

Notas: Os compostos de 1 a 5 podem ser dissolvidos em água, submetidos a autoclave depois de o pH ter sido ajustado a 7.5 e armazenado (meio basal) . Os compostos de 6 a 11 são armazenados separadamente (quadro 2 seguinte).

Depois de algumas horas mais à temperatura ambiente, foi observada a lise total das células, o pH era igual a 8.43 e a OD590 a 4.08. A concentração de PRP era igual a 480 mg/1, devido à lise total. 19/29

Quadro 2: Soluções padrão para a produção do meio

Solução padrão Composto Meio(g/1) Solução padrão (g/D ml de solução padrão/1 1 6 : Extracto de levedura 10 120 83.33 2 7 : Cistina 0.015 0.6 25 8 : MgS04.7H20 0.6 24 9 : Dextrose 5 200 3 10 : Hemina 0.005 1 5 4 11 : NAD 0.002 0.4 5

Esta experiência tinha a intenção de monitorizar a cultura de Hib, o sobrenadante não foi purificado de acordo com o processo acima descrito. 0 tempo óptimo de colheita desta cultura foi depois de aproximadamente 10 horas de cultura. Para adiar a lise, a cultura teve de ser arrefecida a uma temperatura inferior à temperatura da cultura, e mais algum PRP pode ter sido segregado durante o arrefecimento. A colheita na fase exponencial significou um rendimento de PRP baixo.

Exemplo 2 Produção de poliribosilribitol fosfato (PRP) O PRP foi produzido com as condições do exemplo 1 numa escala de 350. A cultura não foi continuada até que todas as células estivessem lisadas mas foi parada passadas 8.3 horas a um pH de 7.43 e uma Οϋ590 de 4.4 começando o arrefecimento usando água corrente através da camisa do biorreactor. A cultura foi colhida 1.5 hora mais tarde usando uma centrifugadora continua. No inicio da colheita a concentração de PRP no sobrenadante era igual a 277-377 mg/1, e a temperatura da cultura era igual a 19 °C. O sobrenadante foi inactivado adicionando uma solução de 2.7 mol/1 de formaldeído ao sobrenadante até uma concentração de aproximadamente 0.1% (v/v). O sobrenadante foi concentrado a 20/29 aproximadamente 9.61 e diafiltrado usando PBS. 0 sobrenadante concentrado foi armazenado a ^ -20 °C.

Exemplo 3 purificação de poliribosilribitol fosfato(PRP) 1.5 1 do sobrenadante concentrado do exemplo 2 foi purificado usando o processo da figura 2 quatro meses depois da cultura.

Depois da purificação, 12 frascos contendo cada um deles 30 ml de PRP liquido puro foram liofilizados para determinar a pureza baseada na massa seca (WHO TRS 814 Annex 1 1991 and TRS 897

Annex 1, 2000) .

Todas as amostras (liquidas e liofilizadas, incluindo amostras IPC) foram analisadas quanto ao seu teor PRP, ácidos nucleicos e proteínas. 0 PRP purificado foi também analisado usando HP-GPC (Hennessey et al (1993) J. Liq. Chromatogr. 16(8): 1715 1729), NMR (Lemercinier et al (2000) Biolgicals 28(3): 175-183), e espectroscopia UV. A determinação da ribose (reacção de orcinol: Ashwell et al (1957) Meth. Enzymol. III: 73-105), fósforo (Ames et al (1966) Meth. Enzymol. VIII: 115-118), e proteína residual (Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275), foi feita por ensaios colorimétricos. A endotoxina foi medida com o ensaio LAL .

Ver o quadro 3 para a composição do PRP purificado. 0 PRP tinha uma massa molecular relativa de 765 kDa. O PRP cumpria todas as especificações da WHO para o polissacarídeo purificado para ser usado na produção de vacinas Hib conjugadas. O rendimento de purificação baseado no ensaio orcinol foi igual a 80%. A concentração DOC no produto final foi inferior a 5 μρ/ιηΐ (limite de detecção) e o formaldeído menor do que 0.005 nmol/1. 21/29

Quadro 3: Composição do PRP purificado

Componente Composição PRP Especificações WHO Massa total (g); 100% 7.39 - Massa seca (%) 98.62 - PRP (%) 96.81 - Fósforo (%) 7.84 6.8-9 Pentose (%) 35.22 32-38 Ácidos nucleicos (%) 0 . 75 <1 Proteina (%) 0.33 <1 Endotoxina (UI/ μρ) 0.11 <10 UI = Unidades Internacionais

Exemplo 4 activação do poliribosilribitol fosfato (PRP) 0 PRP (1.023 g; endotoxina: 0.02 UI por μρ de PRP) foi concentrado a ~10 g/1 com a ajuda de um sistema de filtração de fluxo tangencial, equipado com um cartucho de filtro com peso molecular de corte de 100 kDa (MWCO). Recuperação: 999 mg (98%). Seguidamente o concentrado do PRP foi transferido para um recipiente revestido, e arrefecido a ~4 °C. Seguidamente foi adicionado rapidamente um volume igual de tampão de

bicarbonato/carboneto de sódio (0.4 mol/1, pH 10.5) previamente arrefecido, e a mistura reactiva resultante foi mantida a -4 °C sob agitação vigorosa (-400 rpm.) durante 90 minutos. A diminuição da massa molecular relativa média (Mr) do PRP foi monitorizado por HP-GPC.

No fim desta fase de degradação alcalina, CNBr (5 mol/1 em acetonitrilo) foi adicionado a (2.2 ml por g de PRP). As condições anteriores foram mantidas durante mais 10 minutos. A partir de ai, três volumes de reagente de ADH previamente arrefecidos (18 g por g de PRP), 30 g/1 em solução de bicarbonato (1 mol/1) foram rapidamente adicionados. As condições anteriores foram mantidas durante mais -16 h (a pH -9) . 22/29 0 PRP activado (PRP-ADH) foi seguidamente concentrado a -20 g/1, com o sistema TFF, equipado com um cartucho de filtro de 10 kDa MWCO. Uma diafiltração extensiva deu-se seguidamente para remover o excesso de reagentes, principalmente ADH. A primeira fase usou -20 volumes de tampão de fosfato de sódio (0.1 mol/1, pH 7.2; com NaCl, 1.5 mol/1) . O progresso da remoção do excesso de ADH foi seguido por HP-GPC a 215 nm, em relação a uma curva de calibração Standard. Quando o excesso de ADH estava abaixo de 0.05% (p/p) da ADH total, a diafiltração continuou com ~5 volumes de tampão MES (0.1 mol/1, pH 6.1; com NaCl, 0.5 mol/1) . 0 PRP-ADH foi seguidamente concentrado a uma concentração calculada de -25 g/1. O PRP-ADH concentrado foi analisado para a ribose e para os grupos amino (reacção TNBS: Habeeb et al (1966) Anal. Biochem. 14: 328-336), e armazenado entre 2 e 8 °C. Recuperação: 764 mg (75%). Rácio de activação: 25 unidades de repetição (UR) de PRP por grupo ADH, ou 1.9% (p/p) ADH.

Exemplo 5 Conjugação de poliribosilribitol fosfato activado (PRP-ADH) para o toxóide do tétano (TTd) O toxóide do tétano (TTd; 1.327 g; 1.623 Lf/mg PN; 1.900 Lf/ml) foi concentrado a -20 g/1, com o sistema TFF (cartucho de filtro de 10 kDa MWCO) . A diafiltração deu-se seguidamente em parte para remover o excesso de componentes do meio, com -5 volumes de tampão MES (pH 6.1). O TTd foi seguidamente concentrado a uma concentração calculada de ~30 g/1. O TTd concentrado foi analisado para o teor de proteína (reacção Lowry), e armazenado entre 2 e 8 °C. Recuperação: 1.186 g (89%). O PRP-ADH concentrado (707 mg) foi seguidamente transferido a um reactor com camisa, e arrefecido a ~4 °C. O TTd concentrado (786 mg), foi seguidamente adicionado e a mistura reduzida resultante a ~4 °C, sob agitação suave (-200 rpm), para impedir a formação de espuma. O reagente EDC pré-arref ecido (1 g por g TTd) foi seguidamente adicionado a 100 g/1 em tampão MES (pH 6.1). 23/29

Finalmente, o tampão MES (pH 6.1) foi adicionado para completar o volume total. Esta mistura da reacção (rácio PRP/TTd de 0.93 p/p) foi mantida a ~4 °C, sob agitação suave. A reacção foi parada passadas 3 h 30, quando o nivel residual de TTd atingiu 4.4%, como o medido por HP-GPC a 280 nm. A reacção foi atenuada pela adição de um volume igual de tampão de fosfato de sódio (0.1 mol/1, pH 8.0; com EDTA, 0.005 mol/1), e foi seguidamente armazenada entre 2 e 8 °C.

Exemplo 6 Purificação do conjugado de proteina-polissacarideo A mistura da conjugação foi clarificada numa unidade de filtro em linha de 0.45 μιη. Ela foi seguidamente purificada em cinco partes iguais numa coluna de GPC (diâmetro de 4.4 cms, 45 cm de altura de leito compacto), cheia com Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech), e eluida com tampão de fosfato de sódio (0.1 mol/1, pH 7.0; com EDTA, 0.005 mol/1) a uma velocidade de fluxo de 6 ml/min. A eluição foi monitorizada com o índice de refracção diferencial, UV (226 nm), e detectores de condutividade. As fracções foram colhidas de 2 em 2 minutos para ~0.9 CV. As fracções da primeira execução foram analisadas para a ribose e para o teor de proteínas (reacção de BCA: Smith et al (1985) Anal. Biochem. 150(1): 76-85), e armazenadas entre 2 e 8 °C. As fracções correspondentes ao primeiro pico que continha ribose (187 mg PRP) e proteína (440 mg TTd), e com um rácio homogéneo de PRP/TTd (0.43 p/p), foram agrupadas de todas as execuções (grupo 1): Este é o grupo conjugado Mr mais alto usado mais tarde para a preparação das vacinas. As fracções restantes que compreendem principalmente PRP não conjugado, também foram agrupadas (grupo 2) para calcular o balanço de massa: este grupo continha o meio e o conjugado Mr baixa, PRP-ADH livre (isto é, não conjugado), e TTd livre. O balanço de massa foi de: 78% de PRP, e 76% de TTd, tendo como base as quantidades de materiais primários de conjugação (ver quadro 4). O grupo de conjugado Mr mais alto (grupo 1) foi seguidamente concentrada a -4 g/1, com o 24/29 sistema TFF (cartucho de filtro de 10 kDa MWCO) . A diafiltração deu-se com ~10 volumes de tampão Tris (0.02 mol/1; pH 7.0) . O conjugado do tampão-mudado (PRPTTd) foi seguidamente concentrado a ~1 g/1, e esterilizado por filtração numa unidade de filtro em linha 0.22 μιη. O volume de PRPTTd concentrado estéril foi seguidamente analisado por HP-GPC, e para o teor da ribose, e da proteína (reacção de BCA), e seguidamente armazenado entre 2 e 8 °C. Recuperação: 170 mg de PRP (22%), e 372 mg de TTd (45%). O rácio PRP/TTd final foi de 0.46 (p/p) (especificação da WHO: 0.3-0.6) e o teor da endotoxina de 6.58 UI por μρ de PRP. A análise de PRP livre (Guo et al (1998) Biologicals 26 (1): 33- 38) deu 12.7% (especificação da WHO: <20%). A estabilidade do volume de PRPTTd concentrado estéril foi seguidamente estudado durante um total de seis meses enquanto armazenada entre 2 e 8 °C.

Quadro 4: Recuperações e balanço de massa de PRPTTd PRP TTd PRP/TTd Especificação da WHO (mg) (%) (mg) (%) (p/p) (p/p) Mistura inicial 768 100 829 100 0.93 - GPC Grupo 1 187 24 440 53 0.43 - GPC Grupo 2 415 54 188 23 - - Balanço de massa 602 78 628 76 - - Volume 170 22 372 45 0.46 O co 1 o <T\ final estéril

Notas: As massas moleculares relativas (Mr) foram determinadas em relação a standards puros de Pullulan em colunas OHpak (Shodex) SB-805 e SB-804 HP-GPC. Detecção: índice de refracção diferencial, e UV (215, e 280 nm) . Os cálculos de Mr estão baseados no sinal UV 280 nm.

Exemplo 7 formulação do conjugado de proteína-polissacarideo para uma vacina de Hib monovalente.

Noutra experiência, o volume de PRPTTd concentrado estéril (121 mg de PRP; 348 mg de TTd; num rácio PRP/TTd de 0.35 p/p; 1.9% PRP livre, endotoxina 7.27 UI por μρ de PRP) com tampão Tris e sacarose, na preparação para a liofilização. O volume da vacina 25/29 foi primeiro diluido com tampão Tris, (0.1 mol/1; pH 7.0), seguidamente foi adicionada sacarose (0.5 mol/1), e foi adicionada água para a injecção até completar o volume total. As partes de 1.4 ml foram transferidas a vários frascos com a dose de vacina, e seguidamente deu-se a liofilização. Devido às perdas inerentes ao processo de enchimento automático, finalmente foram obtidos -1.500 frascos de doses múltiplas, para um total de 7.500 doses injectáveis (isto é, 5 por frasco). Cada frasco continha de 8-12 μρ de PRP por ml de doses humana, para ser reconstituída com solução NaCl. A estabilidade da vacina PRPTTd liofilizada foi seguidamente estudada durante 18 meses (para um total previsto de 36 meses), à temperatura ambiente normal, e sob condições de tensão a 37 °C (ver quadro 5) . A temperatura de transição vítrea (medida por DSC) manteve-se alta a aproximadamente 63 °C, e manteve-se constante, mostrando que a vacina liofilizada estava num estado físico estável. Para a determinação de PRP livre, a sacarose teve primeiro de ser removida por troca de tampão, usando dispositivos de ultrafiltração centrífuga (10 kDa de MWCO). A estabilidade da massa de PRPTTd concentrada estéril foi também estudada durante um total de seis meses (ver quadro 5) . Durante estes estudos, a Mr manteve-se constante, e não foi observado nenhum aumento significativo de PRP livre. 26/29

Quadro 5: Estabilidade de PRPTTd

Mr (kDa) PRP livre (%) Transição vítrea (°C) pH Volume estéril final T= semana 0 1,463 1.9 - 7.00 T= semana 4 n. d. 1.8 - 7.00 T= semana 24 1,439 2.7 - 6.90 Vacina liofilizada T = mê s 0 1,381 10.1 64 6.56 T = mê s 3 1,325 n. d. - - T = mê s 6 1,396 5.5 - - T= mês 12 1,306 6.3 - - T= mês 18 1,334 5.7 - - Estudo da tensão (37 °C) (vacina liofilizada) T = semana 1 1,337 6.9 63 - T= semana 4 1,337 4.1 63 - Especificação da WHO <20 - -

Notas: A determinação de PRP livre nas vacinas liofilizadas só é possível depois da remoção do excesso de sacarose por troca de tampão. Os valores altos (>10%) são em parte devidos à sacarose residual, que interfere com o ensaio de orcinol para ribose. Cálculos de Mr: ver quadro 4. A transição vítrea foi medida usando calorimetria diferencial de varrimento (DSC).

Lisboa, 09 de Junho de 2010 27/29

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

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Claims (5)

1. Reivindicações 1. Um método para a recuperação de um polissacarídeo de um caldo de fermentação, e caracterizado por a recuperação incluir: - usar um detergente catiónico para precipitar o polissacarídeo ou parte dos contaminantes do sobrenadante para obter uma primeira fracção do polissacarídeo; - usar álcool para precipitar o polissacarídeo da primeira fracção do polissacarídeo para obter uma segunda fracção do polissacarídeo; submeter a segunda fracção do polissacarídeo a uma precipitação de álcool na presença de um detergente aniónico, pelo qual o álcool está presente numa concentração que é inferior à concentração a que o polissacarídeo precipita; - precipitar o polissacarídeo da fracção solúvel usando álcool para obter um precipitado de polissacarídeo; - dissolver o precipitado do polissacarídeo e submetê-lo a uma concentração e a uma diafiltração.
2. 2. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polissacarídeo ser obtido do Haemophilus influenzae tipo b.
3. 3. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o detergente aniónico ser desoxicolato de sódio.
4. 4. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o detergente catiónico ser bromido de amónia hexadeciltrimetil. 1/2
5. 5. Um método de acordo com qualquer uma anteriores, caracterizado por o álcool ser o Lisboa, 09 de Junho de 2010 das reivindicações etanol. 2/2 9 350

   PRP(mg/l) 3 2 1 Ο □ —θ— ρΗ Δ π Α QD59Q □ —Β— PRP Δ_Δ S._Ε 100 50 Ο Κ Κ « 11 (ο οο CM 00 Ό Csj 00 10 <μ C0 ο 50 <Ν| <Μ 00 ΙΟ ΙΟ Κ CM <35 05 ο CM η· ΙΟ Ν. α> CSÍ •q·' ιτΓ <©' c\í ιο' 50’ ΝΓ 00' αί >> Ί- Tempo (hora) Fiq 1 1/2 V PRP concentrado 4000 rpm, 30 mín. Getavlon 4 °G durante a hoité 1 MNaCI 4000 rpm, 30 min. 96% etanol, 4 °C durante a noite WFI 4000 rpm, 30 min. DQC Na-acetato 96% etanol 4000 rpm, 30 min. Na-acetato 96% etanol PBS ► Centrifugação J, sobrenadante * T 0.65% precipitação Getavlon i _ : P ▼ | Centrifugação/Dissolução [ ^ granulado P 72% precipitação de etanol 1 P T Centrifugação/Dissolução granulado _—---v— 32% precipitação de etanol -i P T Centrifugação/Clarificação r . . i P T 64% precipitação de etanol precipitado p ... J Dissoluçâo/Diafíltração (300kd) J_ concentrado Ψ Filtração estéril L. . ...... T Congelação < -20 °C *RP PURO granulado J*· sobrenadante sobrenadante granulado >· sobrenadante p permeado

   2/2