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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur Extraktion von organischen
Komponenten aus Emulsionen bzw. zur Verhinderung der Emulsionsbildung,
insbesondere bei Ganzzell-Biotransformationsansätzen und
Fermentationen.
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Die
biotechnologisch-chemische Synthese von Chemikalien mit Hilfe von
Mikroorganismen oder Enzymen wird heute in vielen Bereichen der
Synthesechemie angewandt Dabei erfolgt eine biokatalytische Stoffumwandlung
(Biotransformation) einer nicht-natürlichen (xenobiotischen)
organisch-chemischen Verbindung (Substrat) in eine andere (Produkt)
(Csuk, R., Glaenzer, B. I. 1991 Chem. Rev. 91, 49–9;
Yamada, H.; Shimizu, S., 1988 Angew. Chem. 100, 640–661).
Die Biotransformation wird durch ein isoliertes oder ein in Zellen
vorliegendes Enzym bzw. Enzymsystem katalysiert. Erfolgt die enzymatische
Umwandlung durch ein in lebenden Zellen vorliegendes Enzym oder
Enzymsystem, spricht man von einer Ganzzell-Biotransformationen.
Bei den lebenden Zellen handelt es sich zumeist um Mikroorganismen
wie z. B. Saccharomyces cerevisiae, die in hohen Zelldichten kultiviert
werden können. Im Unterscheid zu einer Ganzzell-Biotransformation
wird bei einer Fermentation ein natürliches Substrat umgesetzt.
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Bei
der Extraktion von organischen Komponenten aus Hochzelldichte-Ganzzellbiotransformationen oder
Fermentationen kommt es, aufgrund der Bildung von Bioemulgatoren,
die durch die Zellen in das Medium abgegeben werden, beim Kontakt
mit Extraktionsmitteln zur Ausbildung von äußerst
stabilen Gelen und Schleimen. Diese Gele und Schleime verhindern
eine klare Phasentrennung und behindern eine einfache extraktive
Gewinnung, was zu einem erheblichen Produktverlust führt.
Auch in zellfreien Systemen können, wenn technische Enzyme
verwendet werden, entsprechende Probleme durch die in der Enzympräparation
enthaltenen Bioemulgatoren entstehen.
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Die
Gewinnung von organischen Komponenten aus Biotransformationsansätzen,
speziell Hochzelldichte-Ganzzellbiotransformationen oder Fermentationen
im technischen Maßstab, stellt daher eine große
Herausforderung dar.
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Im
Stand der Technik erfolgt die Isolierung von organischen Komponenten
aus Ganzzellbiotransformationsansätzen oder Fermentationen
daher in der Regel durch eine aufwendige Membranfiltration oder
eine chemische Spaltung von Bioemulgatoren durch Enzyme. Durch diese
zusätzlichen Aufarbeitungsschritte wird die Biotransformation
oder Fermentation aufwendig und kostenintensiv. Um eine problemlose
Extraktion zu ermöglichen, müssen zunächst
die Zellen vom Medium abgetrennt werden und im Anschluss die in
der wässrigen Lösung zurückgebliebenen
Bioemulgatoren durch eine chemische Spaltung unter Verwendung von
Enzymen zersetzt werden. Erst nach diesen Arbeitsschritten ist eine
problemlose Extraktion möglich. Die große Anzahl
der Schritte, aber vor allem der hohe zeitliche Aufwand hat eine
schlechte Raum-Zeit-Ausbeute zur Folge.
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DE 10 2005 031 536
A1 offenbart ein Verfahren zur Isolierung von Produkten
einer Biotransformation aus einer Zellsuspension oder dem zellfreien
Kulturmedium, wobei der Zellsuspension oder dem zellfreien Kulturmedium
nach der Biotransformation Bakterien zugesetzt werden, die in der
Zellsuspension oder im zellfreien Kulturmedium enthaltene emulgierende
Substanzen abbauen.
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In
US 4 704 360 wird Schweröl
durch den Zusatz von Wasser und einer emulgierenden Substanz (Emulsan)
zu einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit geringer Viskosität
umgesetzt, die leichter zu transportieren ist, als Schweröl
selbst. Zur Rückgewinnung des Öls ist nach erfolgtem
Transport die Spaltung der Emulsion notwendig, was durch die emulsionsstabilisierenden
Eigenschaften des Emulsans erschwert wird. Zur Abbau des Emulsans
wird daher in
US 4 704 360 zielgerichtet
ein Enzym (Emulsanase) aus Bakterien isoliert, das in der Lage ist,
Emulsan abzubauen. Das isolierte Enzym Emulsanase wird in
US 4 704 360 eingesetzt,
um Emulsan zu spalten und so die Emulsion wieder zu brechen.
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US 61 71 500 offenbart ein
Verfahren zum Brechen einer Öl-Wasser-Emulsion, die zusätzlich
Feststoffe enthält. Dieses Verfahren dient zur Aufarbeitung
von Rückständen der Erdölgewinnung, sog. „slop
oil”. Bei der Erdölaufbereitung werden Emulsionen
aus Rohöl und Wasser durch chemische oder physikalische
Methoden gebrochen (Zentrifugation, Hitze, emulsionsbrechende Chemikalien,
usw.). Zurück bleibt eine nur schwer zu brechende stabile
Emulsionsschicht, das sog. „slop oil”. Beim Verfahren
nach
US 61 71 500 werden
zum Abbau des „slop oils” Mikroorganismen eingesetzt,
die Kohlenwasserstoffe (Öl) abbauen können. Diese
werden in
US 61 71 500 durch
Anreicherung von Bakterienkulturen, die Petroleum, Diesel, Motorenöl
usw. verwerten können, gewonnen. Die Zusammensetzung der
eingesetzten Kultur(en) ist nicht bekannt.
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US 44 32 887 offenbart ein
Verfahren zum Brechen einer Öl-Wasser-Emulsion, insbesondere
zur Aufarbeitung von industriellen Abwässern, die Altöl
enthalten bzw. zur Herstellung von Kunstkautschuk. Beim Verfahren
nach
US 44 32 887 werden
Kulturbrühen eingesetzt, die durch die Fermentation von
Bakterien der Gattungen Nocardia, Rhodococcus, Arthrobacter, Corynebacterium,
Mycobacterium in Hexadecan-haltigem Medium gewonnen werden.
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GB 20 07 205 offenbart ein
Verfahren zur Aufarbeitung der flüssigen Rückstände,
die bei der Extraktion von Palmöl aus der Palmfrucht anfallen.
Diese Rückstände enthalten noch Reste von Palmöl
sowie einen hohen Anteil Pektin, der dazu führt, dass die
Rückstände beim Abkühlen leicht aushärten.
Nach dem Verfahren von
GB 20
07 205 wird der wässrige Rückstand einer
Fermentation unter thermophilen und anaeroben Bedingungen unterzogen,
was zum Abbau des Pektins führt. Die so behandelte Mischung
kann leicht in Öl, Wasser und festen Rückstand
getrennt werden. Die Deemulsifikation des Öl-Wasser-Gemisches
wird in
GB 20 07 205 mittels
Hitzebehandlung (60–85°C) durchgeführt.
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EP1870390 offenbart ein
Verfahren zur Aufarbeitung von Reaktionslösungen, enthaltend
Ganzzellkatalysatoren, eine wässrige Komponente und eine
organische Komponente, wobei die organische Komponente das anzureichernde
Produkt enthält. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch
die folgenden Schritte: a) Einstellen des pH-Wertes auf kleiner
4 und b) Filtration der Reaktionslösung in Anwesenheit
eines Filterhilfsstoffes, vorzugsweise in der Reaktionslösung.
Problematisch an dem Verfahren ist der saure pH-Wert, bei dem einige
Produkte instabil sind. So eignet sich das Verfahren z. B. nicht
für die Gewinnung von stereoisomerenreinen β-Hydroxyestern,
da die bei pH-Werten unter 4 partiell racemisieren und dehydratisieren.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, die Extraktion von organischen Substanzen
aus Emulsionen zu vereinfachen bzw. die Bildung von Emulsionen,
insbesondere Biotransformationsansätzen und Fermentationen,
zu unterdrücken. Insbesondere soll die Erfindung die Aufarbeitung
von Reaktionsansätzen und die Aufreinigung von organischen
Substanzen erleichtern.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zur Aufreinigung von organischen Komponenten aus Reaktionsansätzen,
insbesondere Biotransformationsansätzen und Fermentationen
wie in Anspruch 1 definiert.
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Die
Reaktionsansätze enthalten eine wässrige Komponente,
Bioemulgatoren und eine organische Komponente, wobei das zu isolierende
oder anzureichernde Produkt bevorzugt die organische Komponente ist
oder in der organischen Komponente enthalten ist.
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Während
der Reaktion oder nach erfolgter Durchführung der Reaktion
wird dem Reaktionsansatz zur Aufarbeitung erfindungsgemäß ein
kationisches Tensid zugesetzt.
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Die
Zugabe des kationischen Tensids im Vorfeld der Zugabe des organischen
Extraktionsmittels führt vorteilhaft zur Agglomeration
der Bioemulgatoren und verhindert damit vorteilhaft die bei Biotransformationen und
Fermentationen auftretende Gelbildung. Bevorzugt wird das kationischen
Tensid bereits während der Biotransformation oder Fermentation
zugegeben. Bevorzugt erfolgt die Zugabe des Tensids 0 bis 30 Minuten nach
Beginn der Biotransformation.
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Anschließend
erfolgt die Aufarbeitung bevorzugt durch Filtration und Extraktion.
Durch das durch das kationische Tensid vermittelte Agglomerieren
der Bioemulgatoren und der anschließenden Abtrennung der
Agglomerate über Filtration kann die Phasentrennung, insbesondere
die benötigte Zeit zur vollständigen Trennung
erheblich verringert werden. Das erfindungsgemäße
Verfahren ist somit eine interessante Alternative zu herkömmlichen
Trennverfahren.
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Überraschend
kann die Phasentrennzeit (Phasenseparationszeit), die nach dem Stand
der Technik über 24 Stunden beträgt, durch die
Zugabe des Tensids auf wenige Minuten, bevorzugt unter 5 Minuten,
besonders bevorzugt 1 bis 3 Minuten, reduziert werden.
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Bevorzugt
werden dem Reaktionsansatz zur Aufarbeitung neben dem kationischen
Tensid zusätzlich Fluoridionen, vorzugsweise in Form anorganischer
Salze, zugesetzt. Die Salze sind bevorzugt ausgewählt aus Ammoniumsalzen
und Salzen der 1., 2. oder 3. Hauptgruppe oder ein oder zweiwertigen
2. Nebengruppe des Periodensystems, besonders bevorzugt ausgewählt
aus Ammoniumfluorid, Tetrabutylammoniumfluorid, Zinn(II)-fluorid
und Natriumfluorid.
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Durch
die Zugabe des Fluoridsalzes kann die Phasentrennzeit auf deutlich
unter 1 Minute weiter reduziert werden.
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Die
Inkubationszeit mit dem kationischen Tensid, d. h. die Zeit zwischen
Zugabe des Tensids und anschließender Aufarbeitung, beträgt
vorzugsweise unter 1 Stunde, bevorzugt 30 Sekunden bis 30 Minuten,
bevorzugt unter 5 Minuten.
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Bei
Ganzzellbiotransformationen bzw. Fermentationen erfolgt bevorzugt
zur Abtrennung der Zellen zusätzlich die Zugabe eines Filtrierhilfsstoffes,
wie z. B. Kieselgel, Kieselgur.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt die
Schritte:
- a.) Zugabe des kationischen Tensids
und gegebenenfalls Fluoridsalz und/oder Filtrierhilfsstoff,
- b.) Filtration,
- c.) optional: Waschen des in b.) erhaltenen Filtrierkuchens,
- d.) Extraktion des in b.) und ggf. c.) erhaltenen Filtrates
mit einem organischen Lösungsmittels oder einem Gemisch
organischer Lösungsmittel,
- e.) Entfernen des organischen Lösungsmittels.
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Das
zur Extraktion verwendete Lösungsmittel wird bevorzugt
im Schritt d.) zugegeben.
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Das
erfindungsgemäß verwendete kationische Tensid
ist bevorzugt ein tertiäres Amin. Dieses enthält bevorzugt
1 bis 4, besonders bevorzugt 2 oder 3, Ammoniumgruppen pro Molekül,
die bevorzugt über eine Methylenbrücke miteinander
verbunden sind.
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Das
kationische Tensid ist vorzugsweise ausgewählt aus folgender
allgemeinen Formel:
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X,
Y und Z sind unabhängig voneinander ausgewählt
aus Hydroxyl, Thiol, Phosphat, Carboxyl, Sulfonsäuren und
deren Ester, Halogen, Ester, Ether, Aminen, Thioether und Phosphorsäureestern,
bevorzugt einer der Reste OH, NH2, SH, OPO3H2, CO2H,
SO3H, OSO3H, F,
Cl, Br, I, CO2R, OR, NRR', NRR'R''R'''+, SR, SO3R, OSO3R, OPO3RR' Besonders
bevorzugt sind die Reste X, Y und Z Hydroxylgruppen.
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R1,
R2 und R3 sind unabhängig voneinander ausgewählt
aus Wasserstoff, Alkyl und Aryl. Bevorzugt sind einer oder zwei
der Reste R1 bis R3 unabhängig voneinander ausgewählt
aus Alkyl, vorzugsweise linearen Alkylresten, mit 10 bis 30 C-Atomen,
bevorzugt 15 bis 25 C-Atomen. Der oder die anderen verbleibenden Reste
R1, R2 und R3 sind bevorzugt unabhängig voneinander ausgewählt
aus H oder Alkyl mit 1 bis 7 C-Atomen oder Aryl mit 5 bis 7 C-Atomen,
bevorzugt Alkylresten mit 1 bis 3 C-Atomen.
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n
m, k und l sind unabhängig voneinander ausgewählt
aus 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5.
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Ein
besonders bevorzugtes kationische Tensid ist Olaflur, welches nach
dem Stand der Technik insbesondere in Zahnpasten zur Anwendung kommt:
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Das
zum Waschen des Filterkuchens und zur Extraktion verwendete Lösungsmittel
wird in Abhängigkeit von dem zu isolierenden Produkt gewählt,
es können vorteilhaft klassische Lösungsmittel
wie tert-Butylmethylether, Toluol, Essigester Chloroform und Methylenchlorid
verwendet werden.
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Das
kationische Tensid wird vorzugsweise in Konzentrationen von 0,001
bis 0,10 mmol/l, bevorzugt 1 bis 10 μmol/l, besonders bevorzugt
2 bis 5 μmol/l, eingesetzt.
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Das
Fluoridsalz wird bevorzugt in Konzentrationen von 1 μmol
bis 1 mol/l, bevorzugt 0,05 bis 0,5 mol/l, besonders bevorzugt 0,01
bis 0,1 mol/l bezogen auf die Fluoridionenkonzentration eingesetzt.
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Vorteilhaft
kann das erfindungsgemäße Verfahren bei Raumtemperatur
oder auch bei der Reaktionstemperatur (bei Biotransformationen oder
Fermentationen in der Regel zwischen 25 und 30°C) erfolgen.
Bevorzugt wird die Temperatur zwischen 0 und 80°C, bevorzugt
20 und 50°C gewählt.
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Der
pH-Wert kann vorteilhaft so gewählt werden, wie es für
die Stabilität des Produkts am besten ist. Für
Produkte wie stereoisomerenreine β-Hydroxyester, die im
Sauren oder Alkalischen zur Hydrolyse und/oder Racemisierung neigen,
wird der pH-Wert vorzugsweise mindestens 4 bzw. unter pH 10 gewählt.
Bevorzugt ist der pH-Wert im erfindungsgemäßen
Verfahren pH 5 bis 9, besonders bevorzugt pH 6 bis 8.
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Die
Biotransformation oder Fermentation wird durch ein isoliertes Enzym
oder ein in Zellen vorliegendes Enzym oder Enzymsystem katalysiert.
Bevorzugt werden zur Biotransformation (Ganzzell-Biotransformation)
oder Fermentation Hefezellen, Algen oder Bakterien oder andere Mikroorganismen
eingesetzt, die bevorzugt in hohen Zelldichten kultiviert werden
können. Diese Mikroorganismen gehören bevorzugt
der Gattung Saccharomyces, Candida, Lactobacillus oder Escherichia
an. Besonders bevorzugt werden Zelldichten von 108...1011 Zellen/ml eingesetzt.
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Durch
die Erfindung ergibt sich vorteilhaft eine Effizienzsteigerung bei
der Produktgewinnung durch
- – Verringerung
der Prozessschritte im Downstream-Prozess,
- – Agglomerieren der Bioemulgatoren.
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Durch
die Zugabe von kationischen Tensiden und ggf. Fluoriden während
der Biotransformation oder Fermentation können sowohl Organismen
als auch die Agglomerate der Bioemulgatoren nach Beendigung der Transformation über
Filtration von der wässrigen Phase abgetrennt werden. Die
gewonnene Lösung kann ohne weitere Aufreinigungsschritte
der Extraktion mit typischen Extraktionsmitteln, wie tert-Butylmethylether, zugeführt
werden.
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Der
nach dem Stand der Technik beobachtete und durch die Bildung von
Schleimen und Gelen hervorgerufene Produktverlust kann durch die
Abtrennung der Biotenside stark reduziert werden. Zudem kommt es
zu einer hohen Zeitersparnis, da eine chemische Spaltung der Bioemulgatoren
durch Enzyme nicht notwendig ist. Auch kann durch die mögliche
zeitgleiche Abtrennung von Zellmaterial und Bioemulgatoren eine
Minimierung der Prozessschritte erzielt werden.
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Gegenstand
der Erfindung ist auch eine Zubereitung zur Verhinderung der Gelbildung
in Emulsionen oder Suspensionen, insbesondere bei der Aufarbeitung
von Biotransformations- und Fermentationsansätzen enthaltend
- a.) ein kationisches Tensid, bevorzugt, wie
in einem der Ansprüche 2 bis 4 definiert,
- b.) ein Fluoridsalz und
- c.) optional ein Filtrierhilfsstoff.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung eines kationischen Tensids,
bevorzugt wie oben näher definiert, oder der erfindungsgemäßen
Zubereitung zur Verhinderung der Gelbildung in Emulsionen oder Suspensionen,
insbesondere bei der Aufarbeitung von Biotransformations- oder Fermentationsansätzen.
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Die
Erfindung wird nachfolgend durch Ausführungsbeispiele und
Vergleichsbeispiele näher erläutert, ohne auf
die Ausführungsbeispiele beschränkt zu sein.
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Ausführungsbeispiel 1:
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Die
Biotransformation von β-Ketoestern durch S. cerevisiae
zu den respektiven β-Hydroxyestern erfolgt bei 30°C.
In einem 1 l-Reaktor werden 600 ml Wasser, 125 g Hefe (FALA), 15
g CaCO3 sowie 100 g Zucker vorgelegt. Nach
30 min Temperieren auf 30°C werden bei konstanter Temperatur
und Luftzufuhr 10 ml β-Ketoester zugeführt. Die
Reaktion wird unter Sauerstoffversorgung und Rührung (120
UpM) über 24 h durchgeführt. Das Reaktionsgemisch
wird im Anschluss mit 0,0124 mol/l Olaflur, 0,02 mol/l Zinn(II)fluorid
(in wässriger Lösung) sowie 100 g/l Kieselgur
(Celit) versetzt, intensiv gerührt und über einen
Büchnertrichter abgesaugt. Die erhaltene klare Lösung
kann im Anschluss ohne die Bildung von Schäumen bzw. Gelen
mit tert-Butylmethylether extrahiert werden.
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Die
Eignung der Extraktionsmethode wurde unter anderem für
die β-Ketoester Acetessigester, 4,4,4-Trifluoracetessigester
und Cyclopentanoncarbonsäureethylester erfolgreich nachgewiesen.
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Ausführungsbeispiel 2:
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Die
Biotransformation und die Aufarbeitung wird wie in Ausführungsbeispiel
1 durchgeführt.
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Es
werden jedoch die Konzentrationen an Olaflur und Zinn(II)fluorid
variiert.
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Nachfolgend
werden die Phasentrennzeiten nach Zugabe verschiedener Mengen an
Olaflur ohne Zugabe von Zinn(II)fluorid verglichen:
| Menge
im Olaflur in ml/l | Trennzeit |
| 0
(Vergleichsbeispiel) | > 24 h |
| 1 | > 10 h |
| 2 | > 1 h |
| 3 | > 30 min |
| 4 | 240
s |
| 5 | 70
s |
| 6 | 82
s |
| 7 | 94
s |
| 8 | 87
s |
| 9 | 165
s |
| 10 | 175
s |
| 11 | > 300 s |
| 12 | > 1 h |
| |
| 1
ml/l Olaflur entspricht | 2 μmol/l. |
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Nachfolgend
werden die Phasentrennzeiten nach Zugabe von 3%iger Zinn(II)-fluorid-Lösung
(30 ml/l) und verschiedener Mengen an Olaflur verglichen:
| Menge
an Olaflur in ml/l | Trennzeiten |
| 6 | 41
s |
| 7 | 76
s |
| 8 | 52
s |
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste
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Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 102005031536
A1 [0006]
- - US 4704360 [0007, 0007, 0007]
- - US 6171500 [0008, 0008, 0008]
- - US 4432887 [0009, 0009]
- - GB 2007205 [0010, 0010, 0010]
- - EP 1870390 [0011]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Csuk, R.,
Glaenzer, B. I. 1991 Chem. Rev. 91, 49–9; Yamada, H.; Shimizu,
S., 1988 Angew. Chem. 100, 640–661 [0002]
