WO2011064259A1 - Verfahren zum isolieren eines alkanols aus einer wässrigen biotransformationsbrühe - Google Patents

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WO2011064259A1
WO2011064259A1 PCT/EP2010/068139 EP2010068139W WO2011064259A1 WO 2011064259 A1 WO2011064259 A1 WO 2011064259A1 EP 2010068139 W EP2010068139 W EP 2010068139W WO 2011064259 A1 WO2011064259 A1 WO 2011064259A1
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alkanol
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fraction
solvent
aqueous
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PCT/EP2010/068139
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Jürgen Däuwel
Michael Breuer
Bernhard Hauer
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Basf Se
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
    • C07C29/74—Separation; Purification; Use of additives, e.g. for stabilisation
    • C07C29/76—Separation; Purification; Use of additives, e.g. for stabilisation by physical treatment
    • C07C29/80—Separation; Purification; Use of additives, e.g. for stabilisation by physical treatment by distillation
    • C07C29/82—Separation; Purification; Use of additives, e.g. for stabilisation by physical treatment by distillation by azeotropic distillation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Definitions

  • the invention relates to a process for isolating an alkanol from an aqueous biotransformation broth.
  • biotransformation is the biotechnological-chemical synthesis of organic chemical compounds using isolated enzymes or enzymes present in cells known.
  • biotransformation the enzymatic
  • the biotransformation is characterized by a high chemo-, regio- and stereospecificity even with complex substrates and mixtures.
  • WO 2006/53713 describes a process for the preparation of (S) -butan-2-ol by reduction of butan-2-one in the presence of an alcohol dehydrogenase (ADH) with a specific polypeptide sequence.
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • the enantioselective reduction is carried out with the ADH in the presence of a reducing agent, such as glucose or formate, which regenerates the oxidized in the course of the reduction cofactor.
  • a second dehydrogenase e.g. Glucose dehydrogenase or formate dehydrogenase can be added.
  • WO 2005/108590 discloses a process for the preparation of optically active alkanols which comprises, in an alkanone-containing medium, an enzyme (E) selected from the classes of dehydrogenases, aldehyde reductases and carbonyl reductases incubated in the presence of reducing equivalents, wherein the reducing equivalents consumed in the course of the reaction are regenerated by reacting a sacrificial alcohol to the corresponding sacrificial ketone with the aid of the enzyme (E).
  • E enzyme selected from the classes of dehydrogenases, aldehyde reductases and carbonyl reductases incubated in the presence of reducing equivalents, wherein the reducing equivalents consumed in the course of the reaction are regenerated by reacting a sacrificial alcohol to the corresponding sacrificial ketone with the aid of the enzyme (E).
  • the biotransformation product is contaminated by lipophilic cell components to a considerable extent, which makes expensive cleaning operations necessary.
  • the prior art usually employs a thermal cleaning process (distillation) to separate the desired product from the lipophilic cell constituents. For steam-volatile compounds, high rates of loss are sometimes observed in this process.
  • the biotransformation products are treated with organic solvents, e.g. Ether, extracted from the aqueous culture medium.
  • organic solvents e.g. Ether
  • an up to tenfold excess of organic solvent has to be added to the aqueous phase.
  • the gel and slime formation in the extraction with organic solvents is due to the presence of emulsifying agents in the cell suspension or in the cell-free culture medium.
  • the presence of emulsifying agents in the extraction reduces the efficiency of the extraction in terms of quantity and purity of the product to be isolated.
  • the presence of emulsifying agents leads to the formation of gels or gums that are stable for several weeks or months.
  • bio emulsifiers As part of these emulsifying agents so called bio emulsifiers have been identified. Although it is known, these bioemulsifiers by the addition of hydrolases
  • the object of the invention is therefore to provide a process for isolating alkanols, in particular optically active alkanols, from an aqueous biotransformation broth, which is adapted to the high dilution of the desired products in the biotransformation broth and manages without long Phasenseparations doctrine in the extraction with organic solvents ,
  • the object is achieved by a process for isolating an alkanol from an aqueous biotransformation broth which comprises a) obtaining a first alkanol phase by distilling off an alkanol-water azeotrope from the aqueous biotransformation broth and, if the azeotrope is a heteroazeotrope, phase separation of the Azeotrope and separation of an aqueous phase,
  • step c) fractionally distilling the second alkanol phase to obtain a pure alkanol fraction.
  • the first alkanol phase has a first water content
  • the second alkanol phase has a second water content.
  • the second water content is lower than the first water content.
  • water content is meant the amount of water, based on the alkanol content.
  • biotransformation is understood to mean the reaction of a substrate which is catalyzed by isolated enzymes or enzyme systems, immobilized enzymes or enzyme systems, crude enzyme extracts, whole cells, quiescent cells and / or disrupted cells. These include fermentations.
  • the workup process according to the invention takes place after the biotransformation has ended, ie. once a desired conversion (of, for example, 90% or more) is achieved.
  • the process according to the invention has the advantage that the biotransformation broth does not undergo complex mechanical separation or purification operations.
  • M / 49266-PCT must be drawn, such as a separation of biomass, for example by centrifugation or filtration.
  • azeotrope of 2-butanol and water has a 2-butanol content of about 72% by weight.
  • the boiling point of the azeotrope is at normal pressure at about 87 ° C, well below the boiling points of water and 2-butanol of about 100 ° C.
  • the method is basically applicable to the isolation of any biotransformed alkanol which forms an azeotrope with water.
  • the azeotrope may be a homogeneous azeotrope or heteroazeotrope.
  • the alkanols include C 2 -C 8 alkanols, in particular C 4 -C 8 alkanols, whose alkyl chain may be straight-chain or branched and which may be primary, secondary or tertiary alcohols.
  • the alkanol is preferably selected from optically active alkanols, in particular optically active 2-alkanols. Particularly preferred examples are S-2-butanol, S-2-pentanol and S-2-hexanol.
  • an alkanol-water azeotrope is distilled off from the aqueous biotransformation broth.
  • the apparatus implementation of the distillation is possible in various embodiments.
  • the heating of the biotransformation broth to boiling may be carried out in any heatable vessel, e.g. a stirred tank reactor with heating jacket, or evaporator.
  • agitating vessels, falling film, thin layers, forced expansion circulation and other types of evaporators in natural or forced circulation can be used.
  • the use of evaporators is less preferred because certain components of the biotransformation broth can result in rapid fouling of the evaporator.
  • the biotransformation broth is heated directly after completion of the biotransformation in the reaction vessel.
  • the heating rate up to the boiling point is preferably at least 20 K / min. With slower heating, the risk of undesirable side reactions, in particular of racemization in optically active alcohols exist.
  • the distillation can be carried out as a simple distillation, i. essentially without material exchange between rising vapor and returning condensate, or be designed as a rectification. For the latter, all known types of distillation or rectification columns, e.g. run below.
  • the distilling off of the alkanol-water azeotrope takes place under suitable conditions of pressure and temperature. If desired, the distillation may be carried out under reduced pressure. In general, working under ambient pressure is preferred because of the lower equipment cost.
  • the vapor containing the alkanol-water azeotrope is at least partially condensed. Suitable for this purpose are any heat exchangers or condensers which may be air-cooled or water-cooled.
  • the first alkanol phase obtained as a condensate can be sent for further work-up. Part of the condensate can be added as reflux to the rectification column.
  • the condensate decomposes into an aqueous phase and an organic phase, which can be separated in a suitable phase separation vessel or decanter.
  • the aqueous phase may be returned to the evaporation vessel, e.g. as reflux to the rectification column.
  • the first alkanol phase is obtained as the organic phase.
  • the first alkanol phase contains dissolved water due to the solubility of water. Before further purification by distillation, the first alkanol phase must therefore be dried. In one embodiment, the drying of the first alkanol phase is carried out by liquid / liquid extraction with a solvent as the extraction agent. Suitable extractants are solvents in which water has only a very low solubility or is substantially insoluble. The water is due to the presence of the extractant, which reduces the solubility of water in the alkanol to be purified, eliminated and forms a separate phase that can be separated.
  • suitable equipment such as a stirred tank, centrifugal extractor, countercurrent extractor and the like.
  • the second alkanol phase obtained as the solvent phase now contains the alkanol dissolved in the solvent with a markedly reduced proportion of water.
  • the first alkanol phase may be subjected to azeotropic drying in the presence of a solvent as an entraining agent. During azeotropic drying, the dissolved water is removed from the system as a water-solvent azeotrope.
  • M / 49266-PCT For azeotropic drying, it is expedient to proceed by heating the first alkanol phase in a distillation vessel in the presence of the solvent and removing water as a water-solvent azeotrope, the second alkanol phase remaining in the distillation vessel.
  • the water-solvent azeotrope-containing bromide is distilled off and at least partially condensed, the condensate is separated into an aqueous phase and a solvent phase and the solvent phase is recycled to the distillation vessel.
  • the solvent suitable as extractant or entraining agent is, for example, aliphatic hydrocarbons, such as pentane, hexane, heptane, cyclohexane, methylcyclohexane; aromatic hydrocarbons, such as benzene, toluene, xylenes; halogenated hydrocarbons, such as dichloromethane, trichloromethane, dichloroethane, chlorobenzene.
  • Aliphatic hydrocarbons, such as in particular n-hexane are particularly preferred because of their comparative non-toxicity and easy separability from the alkanol.
  • the second alkanol phase is then fractionally distilled to give a pure alkanol fraction.
  • the alkanol is freed from the added solvent, unreacted substrate, residual water, by-products and the like.
  • distillation is possible in various embodiments. All known types of distillation or rectification columns are suitable.
  • a "rectification column” comprises separating internals such as slabs, fillers and / or packings. In order to improve the separation efficiency in the column, usually a partial flow of the condensate is returned to the column.
  • Packed columns can be filled with differently shaped packings.
  • the associated surface enlargement heat and mass transfer are optimized and thus increases the separation capacity of the column.
  • Typical examples of such fillers are the Raschig ring, Pall ring, Hiflow ring, Intalox saddle, Berl saddle and hedgehog.
  • the packing can be ordered, but also random (as a bed) are introduced into the column. Suitable materials include glass, ceramics, metal and plastics.
  • M / 49266-PCT Structured packings are a further development of the ordered packing. They have a regularly shaped structure. There are different versions of packages z. B. tissue or sheet metal packages. The material used can be metal, plastic, glass and ceramics. Packing columns have a very low liquid content compared to tray columns. This is often advantageous for rectification because it reduces the risk of thermal decomposition of the substances.
  • the second alkanol phase is introduced laterally into a fractionation column, the pure alkanol fraction is withdrawn as a side stream, a fraction boiling lower than the alkanol fraction overhead and a fraction boiling higher than the alkanol fraction in the bottom from.
  • the second alkanol phase is distilled discontinuously, successively obtaining a fraction boiling lower than the alkanol fraction, the pure alkanol fraction and a fraction which boils higher than the alkanol fraction.
  • the fraction boiling lower than the alkanol fraction contains the majority of the solvent used and can advantageously be recycled at least partially as solvent to step b).
  • the aqueous biotransformation broth used in the process of the invention is obtained by any biotransformation process which converts a substrate to an alkanol.
  • alkanols are produced by the metabolism of fermentable carbon sources by an alkanol-producing microorganism.
  • Enzymatic production is the selective chemical conversion of defined pure substances (educts) into products by enzymes, wherein the enzymes may be present in living, dormant or disrupted cells or may be enriched or isolated. a) Fermentative production of alkanols
  • WO 2008/137403 describes a process for the preparation of 2-butanol by fermentation.
  • suitable natural or recombinant, pro- or eukaryotic microorganisms for fermentative production are those which, under aerobic or anaerobic conditions, can be used for the fermentative production of the desired Al species.
  • bacteria are to be mentioned, which are selected from bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Rhizobiaceae, Clostridiaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae, Rhodocyclaceae and Nocardiaceae.
  • suitable genera include in particular Escherichia, Streptomyces, Clostridium, Corynebacterium and Bacillus.
  • Suitable fermentation conditions, media, fermenters and the like are determinable by one skilled in the art within the scope of his general knowledge. For this he can, for example, the embodiments in suitable technical literature, such. Rehm et al, Biotechnology, Vol. 3 Bioprocessing, 2nd ed., (Verlag Chemie, Weinheim).
  • the microorganisms can be cultivated continuously, with and without recycling of the biomass, or batchwise in the batch process (batch culturing) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process).
  • the fermentation can be carried out in stirred fermenters, bubble columns and loop reactors.
  • a sterile culture medium which contains the substrate (s) and other additives which are necessary for the growth of the microorganism and product formation, such as carbon and / or nitrogen sources, trace elements and the like, and with a suitable amount of a fresh preculture of the microorganism is inoculated.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • These media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good sources of carbon are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds such as molasses or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible sources of carbon are oils and fats such. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soy protein, yeast extract, meat extract and others. The nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds which may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • sulfur source inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides but also organic sulfur compounds, such as mercaptans and thiols can be used.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • growth factors and salts are often derived from complex media components, such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the exact composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis. Information about the media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol Physiology, A Practical Approach” (ed. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1, 5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately. All media components may be present at the beginning of the culture or added randomly or in batches as desired.
  • the temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be controlled during cultivation by addition of basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • foam anti-foaming agents such as. As fatty acid polyglycol, are used.
  • suitable selective substances such as e.g. As antibiotics, are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such. B. ambient air, registered in the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broth containing the alkanol can either be fed directly to the further processing according to the invention.
  • first biomass for example, separated by centrifugation or filtration and optionally washed and combined the washing liquid with the alkanol phase.
  • the fermentation broth can be pretreated, for example, the biomass of the broth can be separated.
  • Methods of separating the biomass are known to those skilled in the art, e.g. Filtration, sedimentation and flotation. Consequently, the biomass can be separated, for example, with centrifuges, separators, decanters, filters or in flotation apparatus. For complete recovery of the desired product is often recommended washing the biomass, z. B. in the form of a diafiltration.
  • the choice of method is dependent on the biomass fraction in the fermenter broth and the properties of the biomass, as well as the interaction of the biomass
  • the fermentation broth may in one embodiment be sterilized or pasteurized. b) Enzymatic production of alkanols
  • the preparation of the alkanol is carried out in preferred embodiments by reduction of an alkanone in the presence of an alcohol dehydrogenase.
  • a biotransforming broth containing 2-butanol is obtained by reduction of butan-2-one in the presence of an alcohol dehydrogenase (ADH) (EC 1 .1.1 .1).
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • Dehydrogenases convert ketones or aldehydes into the corresponding secondary or primary alcohols; In principle, the reaction is reversible. They catalyze the enantioselective hydride transfer to the prochiral C atom of the carbonyl compound.
  • the hydride ions are derived from cofactors, e.g. NADPH or NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or reduced nicotinamide adenine dinucleotide). Since these are very expensive compounds, they are added only in catalytic amounts of the reaction. The reduced cofactors are usually regenerated during the reaction by a concurrent, second redox reaction.
  • cofactors e.g. NADPH or NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate or reduced nicotinamide adenine dinucleotide). Since these are very expensive compounds, they are added only in catalytic amounts of the reaction. The reduced cofactors are usually regenerated during the reaction by a concurrent, second redox reaction.
  • the ADH is for example selected from dehydrogenases from microorganisms of the genus Clostridium, Streptomyces or Escherichia.
  • the ADH can be used in purified or partially purified form or else in the form of the microorganism itself.
  • Methods for recovering and purifying dehydrogenases from microorganisms are known to those skilled in the art, e.g. from K. Nakamura & T. Matsuda, "Reduction of Ketones" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzymes Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. IM, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim. Recombinant methods for generating dehydrogenases are also known, for example from W.
  • the reduction is carried out with the ADH in the presence of a suitable cofactor.
  • cofactors for the reduction of the ketone is usually NADH and / or NADPH.
  • ADH can be used as cellular systems that inherently contain cofactors or alternative redox mediators are added (A.
  • reaction takes place with simultaneous or delayed regeneration of the cofactor consumed during the reaction.
  • Regeneration can be carried out enzymatically, electrochemically or electroenzymatically in a manner known per se (Biotechnology Progress, 2005, 21, 1992, Biocatalysis and Biotransformation, 2004, 22, 89, Angew Chem Chem Ed Engl., 2001, 40, 169 Biotechnol Bioeng, 2006, 96, 18; Biotechnol Adv., 2007, 25, 369; Angew.Chem Int. Ed Engl., 2008, 47, 2275; Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14, 421; Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14, 583).
  • the reduction with the ADH preferably takes place in the presence of a suitable reducing agent which regenerates the cofactor oxidized in the course of the reduction.
  • suitable reducing agents are sugars, in particular hexoses, such as glucose, mannose, fructose, and also formate, phosphite or molecular hydrogen.
  • oxidizable alcohols in particular ethanol, propanol or inexpensive secondary alcohols such as, for example, / -propanol (so-called sacrificial alcohols) can occur as the final hydride donor of the reaction.
  • a regenerating enzyme may be added, such as a second dehydrogenase, e.g. Glucose dehydrogenase (GDH) (EC 1 .1 .1 .47) when using glucose as reducing agent, formate dehydrogenase (EC 1 .2.1.2 or EC 1 .2.1 .43) when using formate as reducing agent or phosphite dehydrogenase ( EC 1.20.1 .1) when using phosphite as a reducing agent.
  • GDH Glucose dehydrogenase
  • GDH Glucose dehydrogenase
  • formate dehydrogenase EC 1 .2.1.2 or EC 1 .2.1 .43
  • phosphite dehydrogenase EC 1.20.1 .1 when using phosphite as a reducing agent.
  • the regenerating enzyme can be used as a free or immobilized enzyme or in the form of free or immobilized cells. It can be produced either separately or by coexpression in a (recombinant) dehydrogenase strain.
  • the aqueous reaction media are preferably buffered solutions which generally have a pH of from 5 to 8, preferably from 6 to 8.
  • the aqueous solvent may also contain at least one water-miscible organic compound, such as isopropanol, n-butanol.
  • Suitable buffers include, for example, ammonium, alkali or alkaline earth metal phosphate buffer, or carbonate buffer, or TRIS / HCI buffer, used in concentrations of about 10 mM to 0.2 M.
  • the enzymatic reduction is generally carried out at a reaction temperature below the deactivation temperature of the dehydrogenase used and above
  • M / 49266-PCT from -10 ° C. It is particularly preferably in the range from 0 to 100 ° C, in particular from 15 to 60 ° C and especially from 20 to 40 ° C, for example at about 30 ° C.
  • the biotransformation can be carried out in stirred reactors, bubble columns and loop reactors.
  • stirred reactors bubble columns and loop reactors.
  • a detailed overview of the possible designs including stirrer shapes and geometrical designs can be found in "Chmiel: Bioprocessing Technology: Introduction to Bioprocess Engineering, Volume 1". In the process management are typically the following, known in the art or z. B. in “Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering” variants explained, such as batch, fed-batch, repeated fed-batch or even continuous fermentation with and without recycling of the biomass available.
  • fumigation with air, oxygen, carbon dioxide, hydrogen, nitrogen or appropriate gas mixtures can / must be carried out in order to achieve good yields.
  • the enzymatic reaction can also be carried out in a manner known from the literature, continuously or discontinuously, as described above for the fermentation.
  • concentrations for substrate, enzymes, reduction equivalents and sacrificial compound can be readily determined by one skilled in the art.
  • WO 2006/53713 describes a process for preparing (S) -butan-2-ol by reducing butan-2-one in the presence of an alcohol dehydrogenase (ADH) having a specific polypeptide sequence.
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • the enantioselective reduction is preferably carried out with the ADH in the presence of a reducing agent, such as glucose or formate, which regenerates the cofactor oxidized in the course of the reduction.
  • a second dehydrogenase e.g. Glucose dehydrogenase or formate dehydrogenase.
  • the butan-2-one is preferably used in a concentration of 0.1 g / l to 500 g / l, more preferably from 1 g / l to 50 g / l in the enzymatic reduction and can be followed continuously or discontinuously ,
  • the butan-2-one with the ADH, the solvent and optionally the cofactors optionally present a second dehydrogenase for the regeneration of the cofactor and / or other reducing agents and mix the mixture, z. B. by stirring or shaking.
  • a second dehydrogenase for the regeneration of the cofactor and / or other reducing agents and mix the mixture, z. B. by stirring or shaking.
  • immobilize the dehydrogenase (s) in a reactor for example in a column, and to pass through the reactor a mixture containing the butan-2-one and optionally cofactors and / or cosubstrates.
  • the mixture can be circulated through the reactor until the desired conversion is achieved.
  • the keto group of butan-2- ⁇ is reduced to an OH group, wherein essentially the (S) -enantiomer of the alcohol is formed.
  • the keto group of butan-2- ⁇ is reduced to an OH group, wherein essentially the (S) -enantiomer of the alcohol
  • M / 49266-PCT the reduction to a conversion of at least 70%, particularly preferably of at least 85% and in particular of at least 95%, based on the butane-2- ⁇ contained in the mixture.
  • the progress of the reaction ie the sequential reduction of the ketone, can be monitored by conventional methods such as gas chromatography or high pressure liquid chromatography.
  • WO 2005/108590 discloses a process for the preparation of optically active alkanols which comprises, in an alkanone-containing medium, an enzyme (E) selected from the classes of dehydrogenases, aldehyde reductases and carbonyl reductases incubated in the presence of reducing equivalents, wherein the reducing equivalents consumed in the course of the reaction are regenerated by reacting a sacrificial alcohol to the corresponding sacrificial ketone with the aid of the enzyme (E).
  • E enzyme selected from the classes of dehydrogenases, aldehyde reductases and carbonyl reductases incubated in the presence of reducing equivalents, wherein the reducing equivalents consumed in the course of the reaction are regenerated by reacting a sacrificial alcohol to the corresponding sacrificial ketone with the aid of the enzyme (E).
  • E enzyme selected from the classes of dehydrogenases, aldehyde reductases and carbonyl reduct
  • the enzymes used for alkanol production can be used freely or immobilized in the methods described herein.
  • An immobilized enzyme is an enzyme which is fixed to an inert carrier.
  • Suitable support materials and the enzymes immobilized thereon are known from EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 and DE-OS 100193773 and from the references cited therein. The disclosure of these documents is hereby incorporated by reference in its entirety.
  • Suitable support materials include, for example, clays, clay minerals such as kaolinite, diatomaceous earth, perlite, silica, alumina, sodium carbonate, calcium carbonate, cellulose powder, anion exchange materials, synthetic polymers such as polystyrene, acrylic resins, phenolformaldehyde resins, polyurethanes and polyolefins such as polyethylene and polypropylene.
  • the support materials are usually used to prepare the supported enzymes in a finely divided, particulate form, with porous forms being preferred.
  • the particle size of the carrier material is usually not more than 5 mm, in particular not more than 2 mm (grading curve).
  • Support materials are e.g. Ca alginate, and carrageenan.
  • Enzymes as well as cells can also be cross-linked directly with glutaraldehyde (cross-linking to CLEAs). Corresponding and further immobilization processes are described, for example, in J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim. Further information on biotransformations
  • M / 49266-PCT NEN and bioreactors for carrying out the process according to the invention are also found, for example, in Rehm et al. (Ed) Biotechology, 2nd Edn, Vol. 3, Chapter 17, VCH, Weinheim.
  • the contents of the kettle were stirred at an internal temperature of 25 ° C. for a further 24 hours.
  • the pH was kept at pH 6.3-6.7 by addition of 20% NaOH.
  • the reaction solution was stirred for a further 2h at 25 ° C.
  • reaction effluent from the enzymatic reduction was heated in the 16 m 3 stirred tank at atmospheric pressure to about 100 ° C internal temperature.
  • reaction effluent from the enzymatic reduction was heated in the 16 m 3 stirred tank at atmospheric pressure to about 100 ° C internal temperature.
  • product-containing upper phase were separated via a phase separator, while the aqueous phase was recycled to the stirred tank.
  • the break-off criterion for this step was the end of the two-phase distillation of the distillate.
  • the crude S-2-butanol from the azeotropic drying was pure-distilled via a continuous column.
  • the column with a diameter of 50 mm consisted of eight sections, each of which was equipped with 0.5 m structured tissue packing (Sulzer CY).
  • the distillation was carried out at atmospheric pressure.
  • the crude product was fed in liquid at a packing height of 3 m, overhead the lower boiling fractions, such as Hexane, 2-butanone and residual water, distilled off. About swamp coloring, higher boiling components were separated.
  • the pure fraction was withdrawn via a vaporous side take-off at a packing height of 0.5 m.
  • the S-2-butanol was present in a purity of more than 99%, the yield of the continuous purifying distillation was more than 90%.
  • the reaction effluent from the enzymatic reduction was heated in a 41-miniplantreaktor at atmospheric pressure to about 100 ° C internal temperature.
  • a single-stage distillation about 140 g of product-containing upper phase were separated off via a phase separator, while the aqueous phase was returned to the reactor. Stop criterion for this step was the end of the two-phase distillate. After reaching this criterion, in addition about 30 g of single-phase distillate were distilled off in order to achieve complete separation of the S-2-butanol from the reaction effluent. The yield in this step was more than 90%.
  • the hydrous S-2-butanol fraction from the azeotropic distillation was admixed with about 100 ml of n-hexane and extracted at room temperature. After phase separation, about 60 ml of an aqueous lower phase and about 240 ml of an organic upper phase were obtained. The water content of the upper phase was reduced by the hexane extraction to less than 5%. The yield in this step was more than 95%.

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Abstract

Ein Alkanol wird aus einer wässrigen Biotransformationsbrühe isoliert, indem man a) eine erste Alkanol-Phase erhält durch Abdestillieren eines Alkanol-Wasser-Azeotrops aus der wässrigen Biotransformationsbrühe und, falls das Azeotrop ein Heteroazeotrop ist, Phasentrennung des Azeotrops und Abtrennung einer wässrigen Phase, b) eine zweite Alkanol-Phase erhält durch (i) Flüssig/Flüssig-Extraktion der ersten Alkanol- Phase mit einem Lösungsmittel als Extraktionsmittel; oder (ii) azeotrope Trocknung der ersten Alkanol-Phase in Gegenwart des Lösungsmittels als Schleppmittel, und c) die zweite Alkanol-Phase unter Erhalt einer reinen Alkanol-Fraktion fraktionierend destilliert. Die Biotransformationsbrühe ist z.B. durch Reduktion eines Alkanons in Gegenwart einer Alkohol-Dehydrogenase erhalten. Das Verfahren ist an die starke Verdünnung der Wertprodukte in der Biotransformationsbrühe angepasst und kommt ohne lange Phasenseparationszeiten bei der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln aus.

Description

Verfahren zum Isolieren eines Alkanols aus einer wässrigen Biotransformationsbrühe Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren eines Alkanols aus einer wässrigen Biotransformationsbrühe.
Als so genannte "Biotransformation" ist die biotechnologisch-chemische Synthese von organisch-chemischen Verbindungen mit Hilfe von isolierten Enzymen oder in Zellen vorliegenden Enzymen bekannt. Bei der Biotransformation erfolgt die enzymatische
Umwandlung eines Substrats, d.h. einer nicht-natürlichen (xenobiotischen) Verbindung, in ein Wertprodukt.
Die Biotransformation zeichnet sich durch eine hohe Chemo-, Regio- und Stereospezi- fität auch bei komplexen Substraten und Mischungen aus. Diese Vorteile haben in
Verbindung mit hohen Raum-Zeit-Ausbeuten, vergleichsweise preiswerten, nachwachsenden Ausgangsstoffen sowie einer oftmals besseren Umweltverträglichkeit der Prozesse dazu geführt, dass die Anzahl der in der Industrie genutzten Biotransformations- Prozesse enorm anstieg.
Der Schwerpunkt für die Anwendung dieser Technologie liegt in der Herstellung von optisch aktiven Produkten.
Die WO 2006/53713 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von (S)-Butan-2-ol durch Reduktion von Butan-2-οη in Gegenwart einer Alkohol-Dehydrogenase (ADH) mit einer bestimmten Polypeptidsequenz. Bevorzugt erfolgt die enantioselektive Reduktion mit der ADH in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Glucose oder Formiat, welches den im Verlauf der Reduktion oxidierten Cofaktor regeneriert. Zur Regeneration des Coenzyms kann eine zweite Dehydrogenase, wie z.B. Glucosedehydrogenase oder Formiat-Dehydrogenase zugesetzt werden.
Die WO 2005/108590 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Al- kanolen, wobei man in einem Alkanon enthaltenden Medium, ein Enzym (E), ausgewählt aus den Klassen der Dehydrogenasen, Aldehydreduktasen und Carbonylreduk- tasen, inkubiert in Gegenwart von Reduktionsäquivalenten, wobei die im Laufe der Reaktion verbrauchten Reduktionsäquivalente durch Umsetzen eines Opfer-Alkohols zum entsprechenden Opfer-Keton mit Hilfe des Enzyms (E) wieder regeneriert werden.
Aus der Literatur sind verschiedene Verfahren zur Aufarbeitung von Biotransformati- onsprodukten aus der Kulturbrühe von Mikroorganismen bekannt. Die Aufarbeitungs-
M/49266-PCT verfahren müssen dabei an bestimmte Besonderheiten der Biotransformation ange- passt sein, wie insbesondere die starke Verdünnung der Wertprodukte in der Kulturbrühe und/oder Kontamination mit Zellbestandteilen. Flüchtige oder wasserdampfflüchtige Verbindungen können während der Umsetzung mit einem Strippgas aus der Kulturbrühe ausgetrieben werden. Ein derartiges Verfahren ist z. B. in der US 2005/089979 beschrieben. Das Verfahren eignet sich aber nur in Fällen, in denen die Ausgangssubstrate keine nennenswerte Flüchtigkeit aufweisen. Vielfach werden nach Abschluss der Biotransformation die rohprodukthaltigen Kulturbrühen bis zur Trockene eingeengt und die Biotransformationsprodukte anschließend mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Bei einer Ganzzell-Biotransformation erfolgt vor der Einengung gegebenenfalls ein Zellseparationsschritt, beispielsweise mittels Zentrifugation, Filtration, etc.
Bei diesen Verfahren wird das Biotransformationsprodukt durch lipophile Zellbestandteile in erheblichem Maße verunreinigt, was aufwändige Reinigungsoperationen notwendig macht. Nach dem Stand der Technik wird meist ein thermisches Reinigungsverfahren (Destillation) angewandt, um das gewünschte Produkt von den lipophilen Zellbestandteilen zu trennen. Für wasserdampfflüchtige Verbindungen werden bei diesem Verfahren mitunter hohe Verlustraten beobachtet.
Alternativ werden die Biotransformationsprodukte mit organischen Lösungsmitteln, z.B. Ether, aus dem wässrigen Kulturmedium extrahiert. Dazu muss üblicherweise ein bis zu zehnfacher Überschuss an organischem Lösungsmittel zur wässrigen Phase zugegeben werden.
Problematisch ist bei der Extraktion, dass bei der Zugabe des organischen Lösungsmittels zum Kulturmedium Gel- und Schleimbildungsphänomene auftreten. Diese er- schweren mitunter erheblich die Isolierung der biokatalytisch hergestellten Verbindungen und beeinträchtigen drastisch die Ausbeute.
Die Gel- und Schleimbildung bei der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln ist auf das Vorhandensein emulgierender Agentien in der Zellsuspension bzw. im zellfreien Kulturmedium zurückzuführen. Die Anwesenheit emulgierender Agentien bei der Extraktion erniedrigt die Effizienz der Extraktion bezüglich Quantität und Reinheit des zu isolierenden Produkts. Gleichzeitig führt die Anwesenheit von emulgierenden Agentien zur Bildung von über mehrere Wochen bzw. Monaten stabilen Gelen oder Schleimen. Als Bestandteil dieser emulgierenden Agentien wurden so genannte Bioemulgatoren identifiziert. Es ist zwar bekannt, diese Bioemulgatoren durch Zusatz von Hydrolasen
M/49266-PCT zu zerstören. Die für die enzymatische Deemulgation eingesetzten Hydrolasen tragen aber erheblich zur Komplexität und den Kosten des Verfahrens bei.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Isolieren von Alkanolen, insbe- sondere optisch aktiven Alkanolen, aus einer wässrigen Biotransformationsbrühe bereitzustellen, das an die starke Verdünnung der Wertprodukte in der Biotransformationsbrühe angepasst ist und ohne lange Phasenseparationszeiten bei der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln auskommt. Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Isolieren eines Alkanols aus einer wässrigen Biotransformationsbrühe, bei dem man a) eine erste Alkanol-Phase erhält durch Abdestillieren eines Alkanol-Wasser- Azeotrops aus der wässrigen Biotransformationsbrühe und, falls das Azeotrop ein Heteroazeotrop ist, Phasentrennung des Azeotrops und Abtrennung einer wässrigen Phase,
b) eine zweite Alkanol-Phase erhält durch
(i) Flüssig/Flüssig-Extraktion der ersten Alkanol-Phase mit einem Lösungsmittel als Extraktionsmittel; oder
(ii) azeotrope Trocknung der ersten Alkanol-Phase in Gegenwart des Lösungsmittels als Schleppmittel, und
c) die zweite Alkanol-Phase unter Erhalt einer reinen Alkanol-Fraktion fraktionierend destilliert. Die erste Alkanol-Phase weist einen ersten Wassergehalt, die zweite Alkanol-Phase einen zweiten Wassergehalt auf. Der zweite Wassergehalt ist niedriger als der erste Wassergehalt. Unter Wassergehalt wird hierbei die Menge an Wasser, bezogen auf den Alkanol-Anteil verstanden. Die fraktionierende Destillation im Schritt c) kann diskontinuierlich (Batch-Fahrweise) oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Unter Biotransformation wird vorliegend die Umsetzung eines Substrats verstanden, die durch isolierte Enzyme bzw. Enzymsysteme, immobilisierten Enzyme bzw. Enzym- Systeme, Enzym-Rohextrakte, ganze Zellen, ruhende Zellen und/oder aufgeschlossene Zellen katalysiert wird. Hierzu zählen auch Fermentationen.
Das erfindungsgemäße Aufarbeitungsverfahren erfolgt nach beendeter Biotransformation, d.h. sobald ein gewünschter Umsatz (von z.B. 90 % oder mehr) erreicht ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist den Vorteil auf, dass die Biotransformationsbrühe keinen aufwändigen mechanischen Trenn- oder Reinigungsoperationen unter-
M/49266-PCT zogen werden muss, wie z.B. einer Abtrennung von Biomasse, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration. Bereits im ersten Schritt des Verfahrens erfolgt eine wesentliche Aufkonzentrierung des Wertprodukts unter Verringerung der Volumina, die in den Folgeschritten gehandhabt werden müssen. So weist beispielsweise das Azeotrop von 2-Butanol und Wasser einen 2-Butanolgehalt von etwa 72 Gew.-% auf. Der Siedepunkt des Azeotrops liegt bei Normaldruck mit etwa 87 °C deutlich unterhalb der Siedepunkte von Wasser und 2-Butanol von jeweils etwa 100 °C.
Das Verfahren ist grundsätzlich auf die Isolierung eines beliebigen durch Biotransfor- mation hergestellten Alkanols anwendbar, das mit Wasser ein Azeotrop bildet. Bei dem Azeotrop kann es sich um ein homogenes Azeotrop oder Heteroazeotrop handeln. Zu den Alkanolen zählen C2-C8-Alkanole, insbesondere C4-C8-Alkanole, deren Alkylkette geradkettig oder verzweigt sein können und bei denen es sich um primäre, sekundäre oder tertiäre Alkohole handeln kann. Vorzugsweise ist das Alkanol unter optisch akti- ven Alkanolen, insbesondere optisch aktiven 2-Alkanolen ausgewählt. Besonders bevorzugte Beispiele sind S-2-Butanol, S-2-Pentanol und S-2-Hexanol.
In einem ersten Schritt destilliert man ein Alkanol-Wasser-Azeotrop aus der wässrigen Biotransformationsbrühe ab. Die apparative Durchführung der Destillation ist in ver- schiedenen Ausgestaltungen möglich.
Das Aufheizen der Biotransformationsbrühe zum Sieden kann in einem beliebigen beheizbaren Gefäß, z.B. einem Rührkesselreaktor mit Heizmantel, oder Verdampfer erfolgen. Apparativ können dazu Rührkessel, Fallfilm-, Dünnschicht, Zwangsentspan- nungsumlauf-, und sonstige Verdampferbauarten in Natur- oder Zwangsumlauffahrwei- se genutzt werden. Die Verwendung von Verdampfern ist allerdings weniger bevorzugt, da bestimmte Bestandteile der Biotransformationsbrühe zum raschen Fouling des Verdampfers führen können. In einer zweckmäßigen Ausführungsform heizt man die Biotransformationsbrühe nach Beendigung der Biotransformation direkt im Reaktionsge- fäß auf. Die Aufheizrate bis zur Siedetemperatur beträgt vorzugsweise wenigstens 20 K/min. Bei langsamerem Aufheizen kann die Gefahr unerwünschter Nebenreaktionen, insbesondere von Racemisierung bei optisch aktiven Alkoholen, bestehen.
Die Destillation kann als einfache Destillation, d.h. im Wesentlichen ohne Stoffaus- tausch zwischen aufsteigendem Brüden und rücklaufendem Kondensat, oder als Rektifikation ausgelegt sein. Für letztere eignen sich alle bekannten Bauformen von Destillations- bzw. Rektifikationskolonnen, wie z.B. weiter unten ausgeführt.
Das Abdestillieren des Alkanol-Wasser-Azeotrops erfolgt unter geeigneten Bedingun- gen von Druck und Temperatur. Gewünschtenfalls kann die Destillation unter vermindertem Druck durchgeführt werden. Im Allgemeinen ist wegen des geringeren apparativen Aufwands das Arbeiten unter Umgebungsdruck bevorzugt.
M/49266-PCT Der das Alkanol-Wasser-Azeotrop enthaltende Brüden wird zumindest teilweise kondensiert. Hierzu eignen sich beliebige Wärmetauscher oder Kondensatoren, die luftgekühlt oder wassergekühlt sein können.
Wenn das Alkanol mit Wasser ein homogenes Azeotrop bildet, kann die als Kondensat erhaltene erste Alkanol-Phase der weiteren Aufarbeitung zugeführt werden. Ein Teil des Kondensats kann als Rücklauf auf die Rektifikationskolonne gegeben werden. Wenn das Alkanol mit Wasser ein Heteroazeotrop bildet, zerfällt das Kondensat in eine wässrige Phase und eine organische Phase, die in einem geeigneten Phasentrennge- fäß oder Dekanter voneinander getrennt werden können. Die wässrige Phase kann in das Verdampfungsgefäß zurückgeleitet werden, z.B. als Rücklauf auf die Rektifikationskolonne. Bei der Phasentrennung wird die erste Alkanol-Phase als organische Phase erhalten.
Die erste Alkanol-Phase enthält aufgrund der Löslichkeit von Wasser gelöstes Wasser. Vor einer weiteren destillativen Reinigung muss die erste Alkanol-Phase daher getrocknet werden. In einer Ausführungsform erfolgt die Trocknung der ersten Alkanol- Phase durch Flüssig/Flüssig-Extraktion mit einem Lösungsmittel als Extraktionsmittel. Als Extraktionsmittel eignen sich Lösungsmittel, in denen Wasser nur eine sehr geringe Löslichkeit aufweist oder im Wesentlichen unlöslich ist. Das Wasser wird, bedingt durch die Anwesenheit des Extraktionsmittels, das die Löslichkeit von Wasser in dem zu reinigenden Alkanol herabsetzt, ausgeschieden und bildet eine eigene Phase, die abgetrennt werden kann.
Zur Flüssig-Flüssig-Extraktion geht man zweckmäßigerweise so vor, dass man die erste Alkanol-Phase mit dem Lösungsmittel innig in Kontakt bringt und eine wässrige Phase durch Dekantieren abtrennt, wobei man die zweite Alkanol-Phase erhält.
Zur intensiven Durchmischung eignen sich geeignete Apparaturen, wie z. B. ein Rührkessel, Zentrifugalextraktor, Gegenstromextraktor und dergleichen.
Anschließend werden die Lösungsmittelphase und die wässrige Phase voneinander getrennt. Die als Lösungsmittelphase anfallende zweite Alkanol-Phase enthält nun das im Lösungsmittel gelöste Alkanol mit einem deutlichen reduzierten Anteil an Wasser.
Alternativ kann man die erste Alkanol-Phase in Gegenwart eines Lösungsmittels als Schleppmittel einer azeotropen Trocknung unterziehen. Bei der azeotropen Trocknung wird das gelöste Wasser als Wasser-Lösungsmittel-Azeotrop ausgekreist.
M/49266-PCT Zur azeotropen Trocknung geht man zweckmäßigerweise so vor, dass man die erste Alkanol-Phase in einem Destilliergefäß in Gegenwart des Lösungsmittels erhitzt und Wasser als Wasser-Lösungsmittel-Azeotrop auskreist, wobei die zweite Alkanol-Phase im Destilliergefäß zurückbleibt. Der Wasser-Lösungsmittel-Azeotrop enthaltende Brü- den wird abdestilliert und zumindest teilweise kondensiert, das Kondensat in eine wässrige Phase und eine Lösungsmittelphase getrennt und die Lösungsmittelphase in das Destilliergefäß zurückgeführt.
Das als Extraktionsmittel oder Schleppmittel geeignete Lösungsmittel ist beispielsweise unter aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan, Methylcyclohexan; aromatischen Kohlenwasserstoffen, wie Benzol, Toluol, Xylolen; halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie Dichlormethan, Trichlormethan, Dichlorethan, Chlorbenzol, ausgewählt. Aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie insbesondere n-Hexan, sind aufgrund ihrer vergleichsweisen Ungiftigkeit und leichten Abtrennbarkeit vom Al- kanol besonders bevorzugt.
Die zweite Alkanol-Phase wird dann unter Erhalt einer reinen Alkanol-Fraktion fraktionierend destilliert. Bei der fraktionierenden Destillation wird das Alkanol vom zugesetzten Lösungsmittel, nicht umgesetzten Substrat, Restwasser, Nebenprodukten und der- gleichen befreit.
Die apparative Durchführung der Destillation ist in verschiedenen Ausgestaltungen möglich. Es eignen sich alle bekannten Bauformen von Destillations- bzw. Rektifikationskolonnen. Eine "Rektifikationskolonne" umfasst trennwirksame Einbauten wie Bö- den, Füllkörper und/oder Packungen. Um die Trennleistung in der Kolonne zu verbessern, wird gewöhnlich ein Teilstrom des Kondensats wieder in die Kolonne zurückgeleitet.
In typischen Bodenkolonnen sind Sieb-, Glocken- oder Ventilböden eingebaut, über welche die Flüssigkeit strömt. Durch spezielle Schlitze oder Löcher wird der Dampf geleitet, so dass eine Sprudelschicht entsteht. Auf jedem dieser Böden stellt sich ein neues Verdampfungsgleichgewicht ein.
Füllkörperkolonnen können mit unterschiedlich geformten Füllkörpern gefüllt werden. Durch die damit verbundene Oberflächenvergrößerung werden Wärme- und Stoffaustausch optimiert und die Trennfähigkeit der Kolonne somit erhöht. Typische Beispiele für solche Füllkörper sind der Raschig-Ring, Pall-Ring, Hiflow-Ring, Intalox-Sattel, Berl- Sattel und Igel. Die Füllkörper können geordnet, aber auch regellos (als Schüttung) in die Kolonne eingebracht werden. Als Materialien kommen in Frage Glas, Keramik, Me- tall und Kunststoffe.
M/49266-PCT Strukturierte Packungen sind eine Weiterentwicklung der geordneten Füllkörper. Sie weisen eine regelmäßig geformte Struktur auf. Es gibt verschiedene Ausführungen von Packungen z. B. Gewebe- oder Blechpackungen. Als Material können Metall, Kunststoff, Glas und Keramik eingesetzt werden. Packungskolonnen haben im Vergleich zu Bodenkolonnen einen sehr geringen Flüssigkeitsinhalt. Dies ist für die Rektifikation oft von Vorteil, da dadurch die Gefahr der thermischen Zersetzung der Substanzen vermindert wird.
In einer Ausführungsform führt man die zweite Alkanol-Phase seitlich in eine Fraktio- nierkolonne ein, zieht die reine Alkanol-Fraktion als Seitenstrom, eine niedriger als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion über Kopf und eine höher als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion im Sumpf ab.
In einer anderen Ausführungsform destilliert man die zweite Alkanol-Phase diskontinu- ierlich, wobei man nacheinander eine niedriger als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion, die reine Alkanol-Fraktion und eine höher als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion gewinnt.
Die niedriger als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion enthält die Hauptmenge des eingesetzten Lösungsmittels und kann vorteilhaft zumindest teilweise als Lösungsmittel in den Schritt b) zurückgeführt werden.
Die wässrige Biotransformationsbrühe, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, wird nach einem beliebigen Biotransformationsverfahren erhalten, das ein Substrat in ein Alkanol umwandelt. Hierzu zählt sowohl die fermentative Herstellung von Alkanolen als auch die enzymatische Herstellung von Alkanolen. Bei der fermenta- tiven Herstellung fallen Alkanole bei der Verstoffwechselung fermentierbarer Kohlenstoffquellen durch einen Alkanol-produzierenden Mikroorganismus an. Unter enzymati- scher Herstellung (oder Biotransformation im engeren Sinne) versteht man die selekti- ve chemische Umwandlung von definiert reinen Substanzen (Edukten) in Produkte durch Enzyme, wobei die Enzyme in lebenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Zellen vorliegen oder angereichert oder isoliert sein können. a) Fermentative Herstellung von Alkanolen
Die fermentative Herstellung von Alkanolen ist an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So beschreibt beispielsweise die WO 2008/137403 ein Verfahren zur Herstellung von 2-Butanol durch Fermentation. Als Beispiele für geeignete natürliche oder rekombinante, pro- oder eukaryotische Mikroorganismen für die fermentative Herstellung sind solche zu nennen, die unter aeroben oder anaeroben Bedingungen zur fermentativen Produktion des gewünschten Al-
M/49266-PCT kanols geeignet sind, Insbesondere sind Bakterien zu nennen, die ausgewählt sind unter Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae, Rhizobiaceae, Clostridiaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococca- ceae, Rhodocyclaceae und Nocardiaceae. Beispiele geeigneter Gattungen umfassen insbesondere Escherichia, Streptomyces, Clostridium, Corynebacterium und Bacillus.
Geeignete Fermentationsbedingungen, Medien, Fermenter und dergleichen sind vom Fachmann im Rahmen seines allgemeinen Fachwissens festlegbar. Dazu kann er sich z.B. der Ausführungen in geeigneter Fachliteratur, wie z.B. Rehm et al, Biotechnology, Vol. 3 Bioprocessing, 2nd Ed., (Verlag Chemie, Weinheim), bedienen. So können die Mikroorganismen kontinuierlich, mit und ohne Rückführung der Biomasse, oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Die Fermentation kann in Rührfermentern, Blasensäulen und Schlaufenreaktoren durchge- führt werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1 . Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Dazu wird ein steriles Kulturmedium hergestellt, das das oder die Substrate sowie weitere zum Wachstum des Mikroorganismus und der Produktbildung gegebenenfalls erforderliche Zusätze, wie Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquellen, Spurenelemente und dergleichen enthält, und mit einer geeigneten Menge einer frischen Vorkultur des Mik- roorganismus angeimpft wird.
Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cel- lulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder an- dere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl
M/49266-PCT und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachs- tumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Stan- dard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
M/49266-PCT Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder char- genweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabi- lität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Je nach Produktionsstamm kann eine Begasung mit Luft, Sauerstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff, Stickstoff oder entsprechenden Gasmischungen erforderlich werden, um gute Ausbeuten zu erzielen.
Nach beendeter Fermentation kann die Fermentationsbrühe, welche das Alkanol enthält, entweder direkt der erfindungsgemäßen Weiterverarbeitung zugeführt werden. Vorzugsweise wird jedoch zunächst Biomasse, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und gegebenenfalls gewaschen und die Waschflüssigkeit mit der Alkanolphase vereinigt.
Vor der Weiterverarbeitung der Fermentationsbrühe in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Fermentationsbrühe vorbehandelt werden, beispielsweise kann die Biomasse der Brühe abgetrennt werden. Verfahren zur Abtrennung der Biomasse sind dem Fachmann bekannt, wie z.B. Filtration, Sedimentation und Flotation. Folglich kann die Biomasse beispielsweise mit Zentrifugen, Separatoren, Dekantern, Filtern oder in Flotationsapparaturen abgetrennt werden. Zur möglichst vollständigen Gewinnung des Wertproduktes empfiehlt sich oftmals ein Waschen der Biomasse, z. B. in Form einer Diafiltration. Die Wahl der Methode ist abhängig von dem Biomassenanteil in der Fermenterbrühe und den Eigenschaften der Biomasse, sowie der Interaktion der Biomas-
M/49266-PCT se mit dem Wertprodukt. Die Fermentationsbrühe kann in einer Ausführungsform sterilisiert oder pasteurisiert werden. b) Enzymatische Herstellung von Alkanolen
Die Herstellung des Alkanols erfolgt in bevorzugten Ausführungsformen durch Reduktion eines Alkanons in Gegenwart einer Alkohol-Dehydrogenase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine 2-Butanol enthaltende Bio- transformationsbrühe durch Reduktion von Butan-2-οη in Gegenwart einer Alkohol- Dehydrogenase (ADH) (EC 1 .1.1 .1 ) erhalten.
Dehydrogenasen setzen Ketone bzw. Aldehyde in die entsprechenden sekundären oder primären Alkohole um; prinzipiell ist die Reaktion reversibel. Sie katalysieren den enantioselektiven Hydridtransfer auf das prochirale C-Atom der Carbonylverbindung.
Die Hydrid-Ionen stammen dabei von Cofaktoren, wie z.B. NADPH oder NADH (reduziertes Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat bzw. reduziertes Nicotinamid-Adenindi- nucleotid). Da es sich hierbei um sehr teure Verbindungen handelt, werden sie nur in katalytischen Mengen der Reaktion zugegeben. Die reduzierten Cofaktoren werden in der Regel während der Reaktion durch eine gleichzeitig stattfindende, zweite Redox- reaktion regeneriert.
Die ADH ist beispielsweise ausgewählt unter Dehydrogenasen aus Mikroorganismen der Gattung Clostridium, Streptomyces oder Escherichia. Die ADH kann in gereinigter oder teilweise gereinigter Form oder auch in Form des Mikroorganismus selbst verwendet werden. Verfahren zur Gewinnung und Aufreinigung von Dehydrogenasen aus Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt, z.B. aus K. Nakamura & T. Matsuda, "Reduction of Ketones" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. IM, 991 -1032, Wiley-VCH, Weinheim. Rekombinante Verfahren zur Erzeugung von Dehydrogenasen sind ebenfalls bekannt, beispielsweise aus W. Hummel, K. Abokitse, K. Drauz, C. Rollmann und H. Gröger, Adv. Synth. Catal. 2003, 345, Nr. 1 + 2, S. 153-159. Bevorzugt erfolgt die Reduktion mit der ADH in Gegenwart eines geeigneten Cofaktors. Als Cofaktoren für die Reduktion des Ketons dient üblicherweise NADH und/oder NADPH. Daneben können ADH als zelluläre Systeme eingesetzt werden, die inhärent Cofaktoren enthalten, oder alternative Redoxmediatoren zugesetzt werden (A.
Schmidt, F. Hollmann und B. Bühler "Oxidation of Alcohols" in K. Drauz und H. Wald- mann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol III, 991 -1032, Wiley-VCH, Weinheim).
M/49266-PCT Insbesondere erfolgt die Umsetzung unter gleichzeitiger oder zeitlich versetzter Regenerierung des bei der Umsetzung verbrauchten Cofaktors. Die Regeneration kann dazu in an sich bekannter Weise enzymatisch, elektrochemisch oder elektroenzymatisch erfolgen (Biotechnology Progress, 2005, 21 , 1 192; Biocatalysis and Biotransformation, 2004, 22, 89; Angew. Chem Int. Ed Engl., 2001 , 40, 169; Biotechnol Bioeng, 2006, 96, 18; Biotechnol Adv., 2007, 25, 369; Angew.Chem Int. Ed Engl., 2008, 47, 2275; Cur- rent Opinion in Biotechnology, 2003, 14, 421 ; Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14, 583). Bevorzugt erfolgt die Reduktion mit der ADH in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels, welches den im Verlauf der Reduktion oxidierten Cofaktor regeneriert. Beispiele für geeignete Reduktionsmittel sind Zucker, insbesondere Hexosen, wie Gluco- se, Mannose, Fructose, sowie Formiat, Phosphit oder molekularer Wasserstoff. Je nach der thermodynamischen und kinetischen Bedingungen der Gesamtreaktion kön- nen oxidierbare Alkohole, insbesondere Ethanol, Propanol oder preiswerte sekundäre Alkohole wie zum Beispiel /-Propanol (sogenannte Opferalkohole") als letztendlicher Hydriddonor der Reaktion auftreten.
Zur Oxidation des Reduktionsmittels und damit verbunden zur Regeneration des Co- faktors kann ein regenerierendes Enzym zugesetzt werden, wie eine zweite Dehydrogenase, wie z.B. Glucosedehydrogenase (GDH) (EC 1 .1 .1 .47) bei Verwendung von Glucose als Reduktionsmittel, Formiat-Dehydrogenase (EC 1 .2.1.2 bzw. EC 1 .2.1 .43) bei der Verwendung von Formiat als Reduktionsmittel oder Phosphitdehydrogenase (EC 1.20.1 .1 ) bei der Verwendung von Phosphit als Reduktionsmittel. Bei Verwendung eines Opferalkohols können Keton-Reduktion und Opferalkohol-Oxidation oft vom gleichen Biokatalysator durchgeführt werden. Das regenerierende Enzym kann als freies oder immobilisiertes Enzym oder in Form von freien oder immobilisierten Zellen eingesetzt werden. Seine Herstellung kann sowohl separat als auch durch Coexpression in einem (rekombinanten) Dehydrogenase-Stamm erfolgen.
Bei den wässrigen Reaktionsmedien handelt es sich vorzugsweise um gepufferte Lösungen, die in der Regel einen pH-Wert von 5 bis 8, vorzugsweise von 6 bis 8, aufweisen. Das wässrige Lösungsmittel kann neben Wasser außerdem wenigstens eine mit Wasser teilweise mischbare organische Verbindung enthalten, wie z.B Isopropanol, n- Butanol.
Als geeignete Puffer sind beispielsweise zu nennen Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalimetallphosphat-Puffer, oder -carbonat-Puffer, oder TRIS/HCI Puffer, die in Konzentration von etwa 10 mM bis 0,2 M eingesetzt werden.
Die enzymatische Reduktion erfolgt in der Regel bei einer Reaktionstemperatur unterhalb der Desaktivierungstemperatur der eingesetzten Dehydrogenase und oberhalb
M/49266-PCT von -10 °C. Besonders bevorzugt liegt sie im Bereich von 0 bis 100 °C, insbesondere von 15 bis 60 °C und speziell von 20 bis 40 °C, z.B. bei etwa 30 °C.
Die Biotransformation kann in Rührreaktoren, Blasensäulen und Schlaufenreaktoren durchgeführt werden. Ein ausführlicher Überblick über die möglichen Ausführungsarten inkl. Rührerformen und geometrischer Ausführungen ist in "Chmiel: Bioprozesstechnik: Einführung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1 " zu finden. Bei der Prozessführung stehen typischerweise die folgenden, dem Fachmann bekannten oder z. B. in "Chmiel, Hammes und Bailey: Biochemical Engineering" erläuterten Varianten, wie Batch, Fed- Batch, Repeated Fed-Batch oder aber auch kontinuierliche Fermentation mit und ohne Rückführung der Biomasse zur Verfügung. Je nach Produktionsstamm kann/muss eine Begasung mit Luft, Sauerstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff, Stickstoff oder entsprechenden Gasmischungen erfolgen, um gute Ausbeuten zu erzielen. Die Durchführung der enzymatischen Umsetzung kann ebenfalls, wie oben für die Fermentation beschrieben, in aus der Literatur bekannter Weise, kontinuierlich oder diskontinuierlich, erfolgen. Die optimalen Konzentrationen für Substrat, Enzyme, Reduktionsäquivalente und Opferverbindung", können vom Fachmann ohne Weiteres bestimmt werden.
So beschreibt beispielsweise die WO 2006/53713 ein Verfahren zur Herstellung von (S)-Butan-2-ol durch Reduktion von Butan-2-οη in Gegenwart einer Alkohol-Dehydro- genase (ADH) mit einer bestimmten Polypeptidsequenz. Bevorzugt erfolgt die enantio- selektive Reduktion mit der ADH in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie Glucose oder Formiat, welches den im Verlauf der Reduktion oxidierten Cofaktor regeneriert. Zur Regeneration des Coenzyms kann eine zweite Dehydrogenase, wie z.B. Glucose- dehydrogenase oder Formiat-Dehydrogenase zugesetzt werden.
Das Butan-2-οη wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 500 g/l, be- sonders bevorzugt von 1 g/l bis 50 g/l in die enzymatische Reduktion eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden.
Zur Durchführung kann man beispielsweise das Butan-2-οη mit der ADH, dem Lösungsmittel und gegebenenfalls den Cofaktoren, gegebenenfalls einer zweiten De- hydrogenase zur Regenerierung des Cofaktors und/oder weiteren Reduktionsmitteln vorlegen und das Gemisch durchmischen, z. B. durch Rühren oder Schütteln. Es ist aber auch möglich, die Dehydrogenase(n) in einem Reaktor, beispielsweise in einer Säule, zu immobilisieren, und durch den Reaktor eine das Butan-2-οη und gegebenenfalls Cofaktoren und/oder Cosubstrate enthaltende Mischung zu leiten. Hierzu kann man die Mischung im Kreislauf durch den Reaktor leiten bis der gewünschte Umsatz erreicht ist. Dabei wird die Ketogruppe des Butan-2-οη zu einer OH-Gruppe reduziert, wobei im Wesentlichen das (S)-Enantiomer des Alkohols entsteht. In der Regel wird
M/49266-PCT man die Reduktion bis zu einem Umsatz von wenigstens 70 %, besonders bevorzugt von wenigstens 85 % und insbesondere von wenigstens 95 %, bezogen auf das in der Mischung enthaltene Butan-2-οη führen. Das Fortschreiten der Reaktion, d. h. die sequentielle Reduktion des Ketons, kann dabei durch übliche Methoden wie Gaschroma- tographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie verfolgt werden.
Die WO 2005/108590 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Al- kanolen, wobei man in einem Alkanon enthaltenden Medium, ein Enzym (E), ausgewählt aus den Klassen der Dehydrogenasen, Aldehydreduktasen und Carbonylreduk- tasen, inkubiert in Gegenwart von Reduktionsäquivalenten, wobei die im Laufe der Reaktion verbrauchten Reduktionsäquivalente durch Umsetzen eines Opfer-Alkohols zum entsprechenden Opfer-Keton mit Hilfe des Enzyms (E) wieder regeneriert werden. Nach dem in der WO 2005/108590 beschriebenen Verfahren gelingt die Herstellung einer S-2-Pentanol enthaltenden Biotransformationsbrühe. c) Immobilisierung von Enzymen oder Mikroorganismen
Die zur Alkanol-Herstellung verwendeten Enzyme können in den hierin beschriebenen Verfahren frei oder immobilisiert eingesetzt werden.
Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypro- pylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Einsatz der Dehydrogenase als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobilisierte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Car- rageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-Iinking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991 - 1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben. Weitere Informationen zu Biotransformatio-
M/49266-PCT nen und Bioreaktoren zur Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren findet man z.B auch in Rehm et al. (Ed) Biotechology, 2nd Edn, Vol. 3, Chapter 17, VCH, Weinheim.
Die Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher veranschaulicht. Beispiel 1
Enzymatische Reduktion
In einem 16 m3 Kessel wurde eine enzymatische Reduktion von 2-Butanon zu S-2- Butanol durchgeführt. Dazu wurden 7000 I Wasser, 43,5 kg Dikaliumhydroge- northophosphat, 34 kg Kaliumdihydrogenorthophosphat und 2,4 kg Magnesiumchlorid- Hexahydrat eingefüllt. Nach Einschalten des Rührers wurden weitere 1000 I Wasser zugefahren und der Kessel auf 25°C aufgeheizt. Nach einer Stunde wurde der pH-Wert kontrolliert. Der pH-Wert sollte bei 6,3-6,7 liegen, wozu gegebenenfalls je nach pH- Wert 75%-ige Phosphorsäure oder 48%-ige Kalilauge nachdosiert wurden.
Nach Einstellen des pH-Wertes wurden 901 kg Glucose, 1 ,3 kg Cofaktor NAD in Was- ser gelöst, 500 I ADH-Biokatalysator, 400 I Glucosedehydrogenase-Präparation und 361 kg 2-Butanon zugegeben.
Nach Ende der Zugabe wurde der Kesselinhalt bei einer Innentemperatur von 25°C weitere 24h gerührt. Dabei wurde der pH-Wert durch Zugabe 20%-iger NaOH bei pH 6,3-6,7 gehalten. Wenn der Umsatz nach 24 h bei 90% oder mehr lag, war die Reaktion abgeschlossen, bei weniger als 90% Umsatz wurde die Reaktionslösung weitere 2h bei 25°C nachgerührt.
Azeotrope Destillation
Der Reaktionsaustrag aus der enzymatischen Reduktion wurde im 16 m3 Rührkessel bei Normaldruck auf etwa 100°C Innentemperatur aufgeheizt. In einer einstufigen Destillation wurden etwa 400 kg wertprodukthaltige Oberphase über einen Phasenscheider abgetrennt, während die wässrige Phase in den Rührkessel zurückgeführt wurde. Ab- bruchkriterium für diesen Schritt war das Ende der Zweiphasigkeit des Destillates.
Nach Erreichen dieses Kriteriums wurden zusätzlich etwa 100 kg einphasiges Destillat abdestilliert, um eine vollständige Abtrennung des S-2-Butanols aus dem Reaktionsaustrag zu erreichen. Die Ausbeute in diesem Schritt betrug mehr als 90%. Azeotrope Trocknung + Hexan-Destillation
M/49266-PCT Vier Fraktionen aus der azeotropen Destillation wurden vereinigt und mittels n-Hexan azeotrop getrocknet. Dazu wurden etwa 2000 kg Destillat aus der azeotropen Destillation im 16 m3 Rührkessel vorgelegt und mit 1600 kg n-Hexan versetzt. Der Kesselinhalt wurde bei Normaldruck auf etwa 60°C aufgeheizt. In einer einstufigen Destillation wur- den etwa 600 kg wässrige Unterphase über den Phasenscheider ausgekreist. Die organische Oberphase wurde in den Rührkessel rückgeführt. Abbruchkriterium für diesen Schritt war das Ende der Zweiphasigkeit des Destillates. Nach Erreichen dieses Kriteriums wurden etwa 1300 kg des verbliebenen n-Hexans über die aufgesetzte Kolonne abdestilliert und im Anschluss der Kesselinhalt auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Ausbeute in diesem Schritt betrug mehr als 95%.
Reindestillation
Das rohe S-2-Butanol aus der azeotropen Trocknung wurde über eine kontinuierliche Kolonne reindestilliert. Die Kolonne mit einem Durchmesser von 50 mm bestand aus acht Teilstücken, welche jeweils mit 0,5 m strukturierter Gewebepackung (Sulzer CY) bestückt waren. Die Destillation erfolgte bei Normaldruck. Der Rohaustrag wurde flüssig auf einer Packungshöhe von 3 m zugefahren, über Kopf wurden die leichter siedenden Anteile, wie z.B. Hexan, 2-Butanon und Restwasser, abdestilliert. Über Sumpf wurden farbgebende, höher siedende Komponenten abgetrennt. Die Reinfraktion wurde über einen dampfförmigen Seitenabzug auf einer Packungshöhe von 0,5 m abgezogen. Das S-2-Butanol lag in einer Reinheit von mehr als 99% vor, die Ausbeute der kontinuierlichen Reindestillation betrug mehr als 90%. Beispiel 2
Enzymatische Reduktion
In einem 4 I Miniplantreaktor wurde eine enzymatische Reduktion von 2-Butanon zu S- 2-Butanol durchgeführt. Dazu wurden 2600 ml Wasser, 15 g Dikaliumhydrogenortho- phosphat, 1 1 g Kaliumdihydrogenorthophosphat und 1 g Magnesiumchlorid-Hexa- hydrat eingefüllt. Nach Einschalten des Rührers wurde der Reaktor auf 25°C aufgeheizt. Nach einer Stunde wurde der pH-Wert kontrolliert. Der pH-Wert sollte bei 6,3-6,7 liegen, gegebenenfalls wurden je nach pH-Wert 75%-ige Phosphorsäure oder 48%-ige Kalilauge nachdosiert.
Nach Einstellen des pH-Wertes wurden 300 g Glucose, 0,5 g Cofaktor NAD in Wasser gelöst, 170 ml ADH-Biokatalysator, 130 ml Glucosedehydrogenase-Präparation und 120 g 2-Butanon zugegeben.
Nach beendeter Zugabe wurde der Kesselinhalt bei einer Innentemperatur von 25°C weitere 24h nachgerührt. Dabei wurde der pH-Wert durch Zugabe 20%-iger NaOH bei
M/49266-PCT pH 6,3-6,7 gehalten. Wenn der Umsatz nach 24 h bei 90% oder mehr lag, war die Reaktion abgeschlossen, bei weniger als 90% Umsatz wurde die Reaktionslösung weitere 2h bei 25°C nachgerührt. Azeotrope Destillation
Der Reaktionsaustrag aus der enzymatischen Reduktion wurde in einem 41 Mi- niplantreaktor bei Normaldruck auf etwa 100°C Innentemperatur aufgeheizt. In einer einstufigen Destillation wurden etwa 140 g wertprodukthaltige Oberphase über einen Phasenscheider abgetrennt, während die wässrige Phase in den Reaktor zurückgeführt wurde. Abbruchkriterium für diesen Schritt war das Ende der Zweiphasigkeit des Destillates. Nach Erreichen dieses Kriteriums wurden zusätzlich etwa 30 g einphasiges Destillat abdestilliert, um eine vollständige Abtrennung des S-2-Butanols aus dem Reaktionsaustrag zu erreichen. Die Ausbeute in diesem Schritt betrug mehr als 90%.
Hexan-Extraktion
In einem 500 ml Scheidetrichter wurde die wasserhaltige S-2-Butanolfraktion aus der azeotropen Destillation mit etwa 100 ml n-Hexan versetzt und bei Raumtemperatur extrahiert. Nach Phasentrennung erhielt man etwa 60 ml einer wässrigen Unterphase sowie etwa 240 ml einer organischen Oberphase. Der Wassergehalt der Oberphase wurde durch die Hexan-Extraktion auf weniger als 5% reduziert. Die Ausbeute in diesem Schritt betrug mehr als 95%. Hexan-Destillation + Reindestillation
Die organischen Oberphasen aus zwei Hexan-Extraktionen wurden in einem 1 I Mi- niplantreaktor mit aufgesetzter Kolonne (Packungslänge etwa 30 cm, Füllkörper 3 mm Maschendrahtringe) vereinigt und über eine Batchdestillation bei Normaldruck und va- riablem Rücklaufverhältnis getrennt. Nach einer Leichtsiederfraktion bestehend aus Hexan, 2-Butanon, S-2-Butanol und Wasser wurde eine Wertproduktfraktion mit einer Reinheit mehr als 99% sowie einer Ausbeute von mehr als 90% isoliert. Die höher siedenden, farbgebenden Komponenten verblieben im Sumpf des Reaktors.
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Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Isolieren eines Alkanols aus einer wässrigen Biotransformationsbrühe, bei dem man a) eine erste Alkanol-Phase erhält durch Abdestillieren eines Alkanol-Wasser- Azeotrops aus der wässrigen Biotransformationsbrühe und, falls das Aze- otrop ein Heteroazeotrop ist, Phasentrennung des Azeotrops und Abtrennung einer wässrigen Phase,
b) eine zweite Alkanol-Phase erhält durch
(i) Flüssig/Flüssig-Extraktion der ersten Alkanol-Phase mit einem Lösungsmittel als Extraktionsmittel; oder
(ii) azeotrope Trocknung der ersten Alkanol-Phase in Gegenwart des Lösungsmittels als Schleppmittel, und
c) die zweite Alkanol-Phase unter Erhalt einer reinen Alkanol-Fraktion fraktionierend destilliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Alkanol unter optisch aktiven 2-Alkanolen ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Alkanol unter S-2-Butanol, S-2-Pentanol und S-2-Hexanol ausgewählt ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Lösungsmittel unter aliphatischen Kohlenwasserstoffen ausgewählt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Lösungsmittel n-Hexan ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man zur Flüssig- Flüssig-Extraktion die erste Alkanol-Phase mit dem Lösungsmittel innig in Kontakt bringt und eine wässrige Phase abtrennt, wobei man die zweite Alkanol- Phase erhält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei man zur azeotropen Trocknung die erste Alkanol-Phase in einem Destilliergefäß in Gegenwart des Lösungsmittels erhitzt und Wasser als Wasser-Lösungsmittel-Azeotrop auskreist, wobei die zweite Alkanol-Phase im Destilliergefäß zurückbleibt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man zur fraktionierenden Destillation die zweite Alkanol-Phase kontinuierlich seitlich in eine Frakti-
M/49266-PCT onierkolonne einführt, die reine Alkanol-Fraktion als Seitenstrom abzieht, eine niedriger als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion über Kopf abzieht und eine höher als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion im Sumpf abzieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei man zur fraktionierenden Destillation die zweite Alkanol-Phase diskontinuierlich destilliert, wobei man nacheinander eine niedriger als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion, die reine Alkanol-Fraktion und eine höher als die Alkanol-Fraktion siedende Fraktion gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei man die niedriger als die Alkanol- Fraktion siedende Fraktion zumindest teilweise als Lösungsmittel in den Schritt b) zurückführt. 1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Biotransformationsbrühe lebende Zellen, ruhende Zellen oder aufgeschlossene Zellen enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Biotransformationsbrühe erhalten ist durch Reduktion eines Alkanons in Gegenwart einer Alko- hol-Dehydrogenase.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Biotransformationsbrühe erhalten ist durch Reduktion von 2-Butanon in Gegenwart einer Alkohol-Dehydrogenase.
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