DD241426A1

DD241426A1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von hop-22(29)-en

Info

Publication number: DD241426A1
Application number: DD28125185A
Authority: DD
Inventors: Barbara Vier; Beate Voigt; Uwe Iske; Horst Mueller
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-10-01
Filing date: 1985-10-01
Publication date: 1986-12-10

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Hop-22(29)-en. Erfindungsgemaess wird Bakterienbiomasse der Art Acetobacter methanolicus, beispielsweise des Stammes IMET B 346, hinterlegt am ZIMET Jena, auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle in kontinuierlicher, unsteriler Kultur erzeugt und Hop-22(29)-en unmittelbar oder im Anschluss an eine Produktbildungsphase aus der Biomasse in bekannter Weise gewonnen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Hop-22(29)-en.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Hop-22(29)-en ist ein pentacyclisches Triterperi folgender Struktur:

Hop-22(29)-en stellt eine Testsubstanz in der biochemischen Forschung dar.

Außerdem wurden bisher'für diese Verbindung verschiedene biologische Wirkungen nachgewiesen, beispielsweise wurde eine fungizide Wirksamkeit auf Phytophthora cactorum festgestellt (Chem. Abstr., 94,168551).

Hop-22(29)-en wurde in Moosen und Farnen, aber auch verschiedenen Prokaryonten gefunden. Pentacyclische Triterpeniode der Hopanfamilie wurden beispielsweise in ca. der Hälfte von 100 untersuchten Mikroorganismenstämmen nachgewiesen, die unterschiedlichen taxonomischen Gruppen angehören (M.Rohmeretal., J. Gen. Microbiol. 130 [1984], 1137 —1150).

Hop-22(29)-en war jedoch stets nur in Konzentrationen von 5 bis 300/xg · g"¹ enthalten und vergesellschaftet mit weiteren pentacyclischen Triterpenoiden (Hopan-22-ol oder Hopanpolyolen), die in bedeutend höheren Konzentrationen als Hop-22(29)-en auftreten. In verschiedenen methylotrophen Bakterienstämmen (Methylomonas, Methylocystis, Methylococcus) lagderHop-22(29)-en-Gehalt im Bereich von 10 bis 120/xg/g.und stellte damit nur maximal 4% der Hopanfraktion dar. Es sind jedoch auch methylotrophe Bakterienstämme bekannt, die zur Hop-22(29)-en-Gewinnung vorgeschlagen werden. In JP-PS 80165799 wird beispielsweise beschrieben, daß für die Gewinnung von Hop-22(29)-en und Hopan-22-ol ein Stamm der Gattung Pseudomonas auf Basis von Methanol kultiviert und aus dem Unverseifbaren der Lipidfraktion chromatographisch Hopan-22-ol und Hop-22(29)-en isoliert wurden. Die gleichzeitige Anwesenheit von Hopan-22-ol und Hop-22(29)-en erfordert einen bedeutenden Trenn- und Reinigungsaufwand.

Außerdem ist in dem beschriebenen Verfahren die Raum-Zeit-Ausbeute für Hop-22(29)-en niedrig (0,28mg · g~¹) sowie eine sterile Fermentationsfahrweise erforderlicrf.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren, das die mikrobielle Gewinnung von Hop-22(29)-en kostengünstig bei minimalem Hilfsstoffverbrauch und Arbeitsaufwand unter kontinuierlichen unsterilen Fermentationsbedingungen ermöglicht.

-2- 241 426 Darstellung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Hop-22(29)-en unter Verwendung eines Mikroorganismenstammes zu erzeugen, der sich durch einen überschnittlichen Gehalt an Hop-22(29)-en auszeichnet.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Verwendung von Bakterien der Art Acetobacter methanolicus in einem kontinuierlichen unsterilen Kultivierungsverfahren mit Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle gelöst, wobei unmittelbar oder im Anschluß an eine Produktbildungsphase Hop-22(29)-en in an sich bekannter Weise aus der Biomasse gewonnen wird.

Besonders vorteilhaft ist die Verwendung des in der Stammsammlung des ZIMET Jena unter der Bezeichnung IMET B 346 hinterlegten Stammes Acetobacter methanolicus.

Die Kultivierung der Mikroorganismen erfolgt im kontinuierlichen Prozeß mit möglichst hoher Durchflußrate im Bereich der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit. Der kontinuierliche Kultivierungsprozeß verläuft unter unsterilen Bedingungen so stabil, daß Ausbeuten von > 100 g Biomasse/l erzielbar sind. In der Biomasse wurde ein Gehalt an Hop-22(29)-en von—2000/ig/g gefunden, was einer Hop-22(29)-en-Ausbeute von >200mg/l entspricht. Weitere Hopan-Abkömmlingesind in der Biomasse nicht vorhanden.

Die hohe Konzentration an Hop-22(29)-en bleibt in der Biomasse auch erhalten, wenn die Mikroorganismen vor der Isolierung von Hop-22(29)-en zur mikrobiellen Produktsynthese herangezogen werden, beispielsweise zur Gewinnung von Glukonsäure aus Glukose. Für die Isolierung von Hop-22(29)-en können Verfahren genutzt werden, die üblicherweise zur Abtrennung von Produkten des Unverseifbaren verwendet werden. Dabei wird aus der getrockneten Biomasse mit einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, beispielsweise Aceton/Wasser, ein Lipidextrakt gewonnen. Hop-22(29)-en kann aus dem Lipidextrakt unmittelbar durch Kristallisation oder nach Verseifung aus dem Unverseifbaren durch Kristallisation oder Säulenchromatographie isoliert werden.

Nach der erfindungsgemäßen Verfahrensweise kann die Gewinnung von Hop-22(29)-en mit hoher Raum-Zeit-Ausbeute erfolgen, da sich die verwendeten Mikroorganismen durch einen gegenüber dem bekannten Stand derTechnik15bis20fach höheren Gehalt an dieser Verbindung auszeichnen, wobei die Gewinnung des Hop-22(29)-en ohne aufwendige Trenn- und Reinigungsverfahren erfolgen kann, da weitere pentacyclische Triterpenoide nicht oder in nur unbedeutenden Konzentrationen gebildet werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert:

Beispiel 1

In einem Laborrührkesselfermentorvon 121 Bruttovolumen mit 6 Blattscheibenrührern werden 51 eines Nährmediumsfolgender Zusammensetzung gegeben:

NH₄CI	2 g/l	H₃BO₃	7,0mg/l
K₂HPO₄	0,6 g/l	FeCI₂ 7 H₂O	4,2 mg/l
MgSO₄-7 H₂O	0,4 g/l	CaCI₂ · 6 H₂O	7,8mg/l
CaSO₄-5H₂O	2,4 mg/1	Na₂MoO₄-2 H₂O	7,8 mg/l
CoSO₄-5H₂O	0,6 mg/1	. ZnCI₂-7 H₂O	6,0 mg/l
MnSO₄-4 H₂O	4,7 mg/1	Hefeextrakt 0,1%

Dieses Nährmedium ermöglicht einen Organismenzuwachs von 5 g/l. Nach Einstellen eines pH-Wertes von 4,1 durch verdünnte Schwefelsäure und einer Temperatur von 32°Cwird das Fermentationsmedium mit der Kultur Acetobacter methanolicus IMET B 346 beimpft, so daß sich eine Startkonzentration von ca. 0,5g Biomasse/l ergibt. Das Medium wird mit einer Belüftungsrate von 1001/h begastund mit 1200 U/min gerührt. Durch Zusatz von 3g Methanol/l wird der diskontinuierliche Wachstumsprozeß gestartet und die Methanolkonzentration anschließend durch kontinuierliche Zugabe im Bereich von 0,1-0,3g/l Methanol gehalten.

Zur Regulierung des pH-Wertes wird 5%ige Natronlauge verwendet. Nach Erreichen einer Biomassekonzentration von ca. 5g/l

erfolgt der Übergang zur kontinuierlichen Prozeßführung mit einer Verweilzeit von 6,5 Stunden. Die im kontinuierlichen Prozeß eingesetzte Nährlösung ist bilanziert für einen Organismenzuwachs von 15g/l. Der Prozeß wird so geführt, daß die Stickstoffkonzentration im Fermentationsmedium 10mg/l nicht übersteigt. Ein weiterer Zusatz von Hefeextrakt im unsterilen kontinuierlichen Prozeß ist nicht erforderlich.

Bedingt durch die vorgegebene Nährstoffkonzentration wird im stationären Prozeßzustand eine Zellkonzentration von 15,8g/l erreicht, entsprechend einer Produktivität von 2,4g Biomasse/l · h (^4,8mg Hop-22(29)-en/l h).

1 kg der getrockneten Biomasse wird 2 x mit je 3 kg Aceton/Wasser (9; 1,V/V) bei Zimmertemperatur extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Wasserstrahlvakuum wird der Extrakt mit 240ml 10%iger methanolischer KOH 45min am Rückfluß verseift. Nach Zugabe von 180 ml Wasser wird die Seifenlösung 3 χ mit 250 ml η-Hexan extrahiert. Die vereinigten Hexanphasen werden mit Wasser neutral gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und der größte Teil des Lösungsmittels destillativ entfernt. Der Rückstand wird auf O⁰C bis 5°C gekühlt und das ausgefallene Hop-22(29)-en abgetrennt.

Eswerden 1,9g Hop-22(29)-en erhalten.

Beispiel 2

In einem 121 Rührkesselreaktor wird analog Beispiel 1 Biomasse der Kultur Acetobacter methanolicus IMET B 346 im kontinuierlichen Prozeß kultiviert. Aus dem Fermentationsmedium wird durch Separation eine Biomassesuspension mit einer Konzentration von 130g/l gewonnen. Mit dieser Suspension wird ein 250I Rührkesselreaktor mit 1501 einer 15%igen Glukoselösung beimpft, so daß sich eine aktuelle Zellkonzentration von 8g/l ergibt. Unter Belüften und Rühren wird die im Reaktor vorgegebene Glukose mikrobiell nach DD-WP 246334 quantitativ in Glukonsäure umgesetzt. Durch Zusatz weiterer Glukose wird der Prozeß so gesteuert, daß eine Endkonzentration von 300g Glukonsäure/I Fermentationsmedium erreicht wird. Nach Beendigung des Produktbildungsprozesses erfolgt vor der Weiterverarbeitung des Fermentationsmediums zu Glukonsäure oder Glukonaten die Abtrennung des Produzenten entweder durch Flockung oder Separation bzw. eine Kombination beider Verfahren. Nach Trocknung der Biomasse erfolgt die Gewinnung von Ho-22(29)-en analog Beispel 1 mit folgendem Ergebnis:

eingesetzte Biomasse 1,2 kg

Hop-22(29)-en-Gehalt 2,05 mg/g

Hop-22(29)-en isoliert 2,25 g

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Hop-22(29)-en, gekennzeichnet dadurch, daß Bakterien der Art Acetobacter methanolicus in einem kontinuierlichen unsterilen Verfahren mit Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert und das Hop-22(29)-en entweder unmittelbar oder im Anschluß an eine Produktbildungsphase aus der Biomasse mit einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch extrahiert und gereinigt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung des in der Stammsammlung des ZIMET Jena unter der Bezeichnung IMET B 346 hinterlegten Stammes von Acetobacter methanolicus.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Extraktion mit Aceton, dem 5 bis 15% Wasser zugesetzt werden, erfolgt
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß vor der Isolierung von Hop-22(29)-en die Biomasse zur Gewinnung von Glukonsäure verwendet werden.