DD236552A1

DD236552A1 - Verfahren zur herstellung von ubichinon-10

Info

Publication number: DD236552A1
Application number: DD27560085A
Authority: DD
Inventors: Beate Voigt; Martin Worbs; Uwe Iske
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-04-26
Filing date: 1985-04-26
Publication date: 1986-06-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Ubichinon-10. Erfindungsgemaess wird Biomasse eines Bakterienstammes der Gattung Acetobacter, vorzugsweise ein Species des Stammes Acetobacter methanolicus, hinterlegt am ZIMET Jena unter der Bezeichnung IMET B 346, auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequellen in kontinuierlicher, unsteriler Kultur erzeugt und das Ubichinon-10 unmittelbar oder im Anschluss an eine Produktionsbildungsphase aus der Biomasse in bekannter Weise gewonnen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Ubichinon—10.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ubichinone sind 2,3—Dimethoxy-B-methyl-i^-benzochinone, die in 6-Stellung des Chinonringseine Isoprenseitenkette enthalten und durch die allgemeine Formel

dargestellt werden können. Die Erfindung betrifft die Herstellung von Ubichinon der angegebenen Formel, wobei η die Zahl 10 bedeutet.

Für die Ubichinone, die coenzymatische Aktivität im Elektronentransportsystem'der Atmungskette aufweisen, wurden zahlreiche pharmakologische Wirkungen gefunden. So wurden beispielsweise bemerkenswerte Effekte auf das Kongestions-Herzversagen, die Coronarinsuffizienz, die durch Fehlernährung verursachte Muskeldystrophie und Anämien nachgewiesen. Insbesondere wird Ubichinon—1OaIs höchst wertvolles Arzneimittel angesehen, da das im Menschen vorkommende Ubichinon das Ubichinon—10 ist.

Es ist bekannt, daß für die Gewinnung von Ubichinon—10 auch mikrobielle Biomassen genutzt werden. Die Zahl der Mikroorganismen, die Ubichinon—10 enthalten, ist jedoch verhältnismäßig gering. In US-PS 1.343.066 wird beschrieben, daß einige Stämme der Gattungen Rhodotorula, Cryptococcus, Sporobolomyces, Candida, Torulopsis, Rhodosporidium, Trichosporon, Aureobasidium,Tremella, Bullera und Alcaligenes zur Bildung von Ubichinon—10 fähig sind, wenn sie auf Kohlehydraten, organischen Säuren oder Alkoholen als Kohlenstoffquelle kultiviert werden. Der in den Biomassen analytisch bestimmte Ubichinon—10-Gehalt liegt jedoch mit 60 bis 480^g/g "rockensubstanz im Hinblick auf eine ökonomisch effektive Gewinnung extrem niedrig. Wesentlich höhere Ubichinon—10-Gehalte wurden bei einem Stamm der Gattung Trichosporon nach Kultivierung auf Sulfitablauge mit 840^.g/g (DE-OS 2938377) oder bei dem Stamm Microcyclus methanolica nach Kultivierung auf Methanol mit 1 000^g/g (JP-PS 54—119079) gefunden. Jedoch konnte auch hier die Ubichinonausbeute bezogen auf die Zellkonzentration mit9,4mg/l bzw. 10mg/l nicht befriedigen.

Wiederholt wurde versucht, die Ausbeute an Ubichinon—10 durch Einsatz von Präkursorehzu verbessern. So werden in US-PS. 4.220.719 Isopentylalkohol und in DE-OS 2838252 Isopentenylalkohol, Dimethylallylalkohol, Geraniol, Isopentenylacetat, Dimethylallylacetat, Geranylacetat, ß-Methylcrotonsäure bzw. in US-PS 4.070.244 und US-PS 4.367.289 p-Hydroxybenzoesäure dem Nährmedium zugegeben. Die durch die Zugabe der Präkursoren erzielten Erhöhungen des Ubichinongehaltes betragen im Durchschnitt 20-30%. Nachteilig ist dabei, daß die Bereitstellung der chemisch kompliziert zusammengesetzten Präkursoren einen zusätzlichen präparativen und ökonomischen Aufwand erfordert.

In JP-PS 55—26 wird weiterhin berichtet, daß aus der Gattung Agrobacterium eine Mutante erzeugt und isoliert werden konnte, bei deren Kultivierung eine Ubichinon—10-Akkumulation von 57,8mg/l erreicht wurde. Derartige Mutanten weisen jedoch den entscheidenden Nachteil auf, daß sie sich nicht oder nur schwierig für kontinuierliche Fermentationen nutzen lassen. Der Mehrzahl der diskutierten Verfahren haftet als weiterer Nachteil an, daß die Kultivierung unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muß.

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Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren, das die mikrobielle Herstellung von Ubichinon—10 kostengünstig bei minimalem Hilfsstoffverbrauch und Arbeitsaufwand unter kontinuierlichen Fermentationsbedingungen in einem unsterilen Prozeß ermöglicht.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Ubichinon—lOmikrobiell in kontinuierlicher Kultur mit hoher Raum-Zeit-Ausbeute zu erzeugen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Biomasse eines Bakterienstammes der Gattung Acetobacter auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle in kontinuierlicher, unsteriler Kultur erzeugt wird und das Ubichinon—10 unmittelbar oder im Anschluß an eine Produktbildungsphase aus der Biomasse in bekannter Weise gewonnen wird.

Als Produktionskultur wird dabei vorzugsweise ein Species des Stammes Acetobacter methanolicus, hinterlegt am ZIMET Jena unter der Bezeichnung IMET B 346, verwendet. Die Kultivierung im kontinuierlichen Prozeß erfolgt mit möglichst hoher Durchflußrate im Bereich der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen und unter den Bedingungen der Stickstofflimitation. Als Kohlenstoff- und Energiequelle für das Organismenwachstum können neben reinem Methanol organisch hochbelastete, methanolhaltige technische Ab- und Nebenprodukte, wie sie z.B. in den verschiedensten Prozeßstufen der chemischen Industrie anfallen, als alleiniges Substrat oder in Mischung mit Methanol genutzt werden. Dadurch ist neben einer signifikanten Senkung der Rohstoffkosten eine Reduzierung der Umweltbelastung erreichbar. Der kontinuierliche Kultivierungsprozeß verläuftauch unter unsterilen Bedingungen außero'rdentlich stabil. Die Ausbeuten von > 100 g/m³ bzw. 12,5g/m³ · h übertreffen die bisher in der Patentliteratur angeführten Höchstwerte für Ubichinon—10 beträchtlich.

Überraschenderweise bleibt die hohe Konzentration an Ubichinon—10 in der Biomasse erhalten, wenn die Mikroorganismen vor der Ubichinonabtrennung zur mikrowellen Produktsynthese, z. B. zur Gewinnung von Glukonsäure aus Glukose, genutzt werden.

Für die Isolierung von Ubichinon—10 können üblicherweise eingesetzte Verfahren zur Anwendung kommen. Dabei wird aus der getrockneten Biomasse mit einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, beispielsweise Aceton/Wasser, ein Lipidextrakt gewonnen. Ubichinon—10 kann aus dem Lipidextrakt nach bekannten Verfahren, beispielsweise Säulenchromatographie oder Verseifung und nachfolgende säulenchromatographische Abtrennung aus dem Unverseifbaren oder multiplikative Verteilung isoliert werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert:

Beispiel 1

In einen Laborrührkesselfermentorvon 121 Bruttovolumen mit6-Blattscheibenrührern werden 51 eines Nährmediums folgender Zusammensetzung gegeben:

NH₂CI , 2 g/l H₃BO₃ 7,0 mg/1

K₂HPO₄ 0,6 g/l FeCI₂-7 H₂O 4,2 mg/1

MgSO₄-7H₂O . 0,4g/l CaCI₂-6H₂O 7,2 mg/1

CaSO₄-5H₂O 2,4 mg/1 Na₂Mo0₄-2H₂0 7,8 mg/1

CoSO₄-5 H₂O 0,6 mg/1 ZnCI₂-7 H₂O 6,0 mg/1

MnSO₄-4H₂O 4,7 mg/i Hefeextrakt 0,1 %

Dieses Nährmedium ermöglicht einen Organismenzuwachs von 5g/l.

Nach Einstellen eines pH-Wertes von 4,1 durch verdünnte Schwefelsäure und einer Temperatur von 32⁰C wird das Fermentationsmedium mit der Kultur MB 58 IMET B 346 beimpft, so daß sich eine Startkonzentration von ca. 0,5g Biomasse/l ergibt. Das Medium wird mit einer Belüftungsrate von 100l/h begast und mit 1 200 U/min gerührt. Durch Zusatz von 3g Methanol/l wird der diskontinuierliche Wachstumsprozeß gestartet und die Methanolkonzentration anschließend durch kontinuierliche Zugabe im Bereich von 0,1—0,3g/l Methanol gehalten.

Zur Regulierung des pH-Wertes wird 5%ige Natronlauge verwendet. Nach Erreichen einer Biomassekonzentration von ca. 5g/l erfolgt der Übergang zur kontinuierlichen Prozeßführung mit einer Verweilzeit von 6,5 Stunden. Die im kontinuierlichen Prozeß eingesetzte Nährlösung ist bilanziert für einen Organismenzuwachs von 15g/l. Der Prozeß wird so geführt, daß die Stickstoff konzentration im Fermentationsmedium 10mg/l nicht übersteigt. Ein weiterer Zusatz von Hefeextrakt im unsterilen kontinuierlichen Prozeß ist nicht erforderlich.

Bedingt durch die vorgegebene Nährstoffkonzentration wird im stationären Prozeßzustand eine Zellkonzentration von 15,8g/l erreicht, entsprechend einer Produktivität von 2,4g Biomasse/l · h (^2,6mg Ubichinon—10/1 h).

Die ubichinon—lOhaltige Biomasse wird entweder direkt oder nach einer vorgeschalteten Separationsstufe durch Sprühtrocknung aus dem Fermentationsmedium gewonnen.

1 kg der getrockneten Biomasse wird 2mal mit je 3 kg Aceton/Wasser 9:1 bei Raumtemperatur extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Wasserstrahlvakuum wird der Extrakt mit 240 ml 10%iger methanolischer KOH und 40 ml 10%iger wäßriger Natriumdithionitlösung45 Minuten am Rückfluß verseift. Nach Zugabe von 180 ml Wasser wird die Seifenlösung 3mal mit 250ml η-Hexan extrahiert. Die vereinigten Hexanphasen werden mit Wasser neutral gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet.

Nach Entfernen des η-Hexans wird der Rückstand aus Aceton umkristallisiert. Es werden 720 mg Ubichinon—10 erhalten.

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Beispiel 2

Ein 2m³Hochleistungs-IZ-Strahlreaktor wird mit 1,0 m³ einer Nährlösung analog Beispiel 1, jedoch bilanziert für ein Organismenwachstum von 10kg/m³, beschickt und nach Einstellen der Prozeßparameter.Temperatur (32°C) und pH-Wert (4,2) mit 1,5 kg/m³ der Kultur MB 58IMET B 346 beimpft. Durch kontinuierliche Zuführung von Methanol als Kohlenstoffquelle analog Beispiel 1 wird der Fermentationsprozeß unsteril gestartet und bis zu einer Konzentration von ca. 10 kg Biomasse/m³ geführt.

Danach erfolgt nach dem Prinzip der Fed-batch-Kultivierung die kontinuierliche Dosierung eines Nährlösungskonzentrates bilanziert für ein Organismenwachstum von ca. 350kg/m³ sowie von Methanol entsprechend der Substratverbrauchskoeffizienten. Zur Verbesserung der Sauerstoffübertragungsleistung wird der Reaktor mit einem Systemdruck bis max. 1,0MPa betrieben. Bei Erreichen einer Zellkonzentration von etwa 70 kg/m³ wird zur kontinuierlichen Prozeßführung mit einer Verweilzeit von 10 Stunden und einem Reaktorvolumen von 1,2m³ übergegangen. Die eingesetzte Nährlösung ist bilanziert für 110g Biomassezuwachs. Im stationären Prozeßzustand wird eine aktuelle Zellkonzentration von 104kg/m³ entsprechend einer Produktivität von 10,4kg/m³· herreicht.

Zur Reduzierung der Salzbelastung wird eine stickstofffreie Nährlösung verwendet. Der für das Organismenwachstum benötigte Stickstoff wird dem Prozeß über die pH-Regelung in Form einer Ammoniaklösung zugeführt, so daß die aktuelle Stickstoffkonzentration den Bereich 0-15mg nicht überschreitet.

Die Ubichinon—lOhaltige Biomasse wird ohne Vorbehandlung durch Sprühtrocknung gewonnen und analog Beispiel 1 aufgearbeitet.

Der Ubichinongehalt der Biomasse beträgt 1,2mg/g entsprechend einer Produktbildungsrate von 12,5g Ubichinon—10/m³h.

Beispiel 3

In einem 121 Rührkesselreaktor wird analog Beispiel 1 Biomasse der Kultur MB 58IMET B 346 im kontinuierlichen Prozeß kultiviert. Aus dem Fermentationsmedium wird durch Separation eine Biomassesuspension mit einer Konzentration von 130g/l gewonnen. Mit dieser Suspension wird ein 250I Rührkessel reaktor mit 1501 einer 15%igen Glukoselösung beimpft, so daß sich eine aktuelle Zellkonzentration von 8g/l ergibt. Unter Belüften und Rühren wird die im Reaktor vorgegebene Glukose mikrobiell nach DD — WP 246334 quantitativ in Glukonsäure umgesetzt. Durch Zusatz weiterer Glukose wird der Prozeß so gesteuert, daß eine Endkonzentration von 300g Glukonsäure/I Fermentationsmedium erreicht wird. Nach Beendigung des Produktbildungsprozesses erfolgt vor der Weiterverarbeitung des Fermentationsmediums zu Glukonsäureoder Glukonaten die Abtrennung des Produzenten entweder durch Flockung oder Separation bzw. eine Kombination beider Verfahren. Nach Trocknung der Ubichinon—lOhaltigen Biomasse erfolgt die Isolation und Gewinnung des Ubichinon—10 analog Beispiel 1 mit folgendem Ergebnis:

eingesetzte Biomasse ' .1,20 kg ' · »

rückgewonnene Biomasse 1,03 kg

Ubichinon—10-Gehalt 0,9 mg/g

Ubichinon—10 isoliert 690 mg

Claims

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Erfindungsanspruch:

\ 1. Verfahren zur Herstellung von Ubichinon—10, dadurch gekennzeichnet, daß Biomasse eines Bakterienstammes der Gattung A Acetobacter auf Methanol als Kohlenstoff-und Energiequelle in kontinuierlicher Kultur erzeugt wird und das Ubichinon—10

\ entweder unmittelbar oder im Anschluß an eine Produktbildungsphase aus der Biomasse in bekannter Weise gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien eines Stammes von Acetobacter methanolicus, hinterlegt am ZIMET Jena unter der Bezeichnung IMET B 346, verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung vorzugsweise bei maximaler Wachstumsgeschwindigkeit unter N-Limitation durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß methanolhaltige Abwässer als Kohlenstoffquelle verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Isolierung von Ubichinon—10 die Biomasse zur Gewinnung von Glukonsäure benutzt wird.

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