DE1593384B2

DE1593384B2 - Biochemisches Verfahren zur Herstellung von Aldosteron

Info

Publication number: DE1593384B2
Application number: DE1593384A
Authority: DE
Inventors: Eiji Ikeda Kondo; Takashi Senboku Mitsugi; Kazuo Kobe Hyogo Tori
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1965-06-11
Filing date: 1966-06-11
Publication date: 1974-08-22
Also published as: GB1097030A; DE1593384C3; US3631031A; DE1593384A1; US3709789A; CH488686A

Description

OR'

HO

oder

worin R einen niederen Alkylrest und R' ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkanoylrest oder R und R' zusammen eine niedere Alkylidengruppe oder einen zweiten Molekülrest des gleichen lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketals (C₂IH₂₈O₃) bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man Corticosteron oder ein enzymatisch annehmbares 21-Acylat davon mit Enzym eines Mikroorganismus des Genus Corynespora und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in Gegenwart einer Säure mit einem entsprechenden alkylierenden oder ketalisierenden Mittel behandelt und anschließend gegebenenfalls acyliert.

bedeutet, in der enzymatischen Hydroxylierung von Corticosteron (I) oder eines enzymatisch annehmbaren Acylderivats davon in Stellung 18 durch Einwirkung eines von einem Fungus des Genus Corynespora erzeugten Enzyms, wobei gewöhnlich andere monohydroxylierte Corticosterone, ζ. B. 6ß-, &ß-, 14a-, 15/5- und Ha-Hydroxycorticosteron in verhältnismäßig niedrigen Ausbeuten als Nebenprodukte gebildet werden.

Bei dieser Umsetzung konnte zwar nicht das 18-Hydroxycorticosteron der Formel

CH₂OH

HO C=O
HO

20

jedoch die entsprechende diniere 18,20-HemiketaI-verbindung der Formel

OH

HO

A/

(II)

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Aldosteron und insbesondere ein einfaches und direktes Verfahren zur Herstellung von Aldosteron aus Corticosteron über neue Zwischenstoffe durch Anwendung neuartiger biochemischer Hydroxylierungsreaktionen, die in Stellung 18 des Steroidkerns stattfinden, unter Verwendung eines zu dem Genus Corynespora gehörenden Mikroorganismus.

In den letzten Jahren wurde über verschiedene Untersuchungen, die sich mit der Partialsynthese von Aldosteron befaßten, berichtet, über die praktische Anwendung von Mikroorganismen zur Herstellung von Aldosteron ist jedoch bisher nichts bekannt. Die vorliegende Erfindung schafft ein neues Verfahren, das aus nur drei Stufen mit zwei mikrobiologischen Hydroxylierungsreaktionen in Stellung 18 besteht.

Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht, wie in der nachfolgenden Formel angegeben ist, in der R' einen enzymatisch annehmbaren Acylrest wahrscheinlich infolge der leicht eintretenden Dimerisierung, in etwa 20%-Ausbeute isoliert werden.
Die neue dimere Verbindung II konnte nicht in die entsprechende monomere Verbindung in funktionell freiem Zustand übergeführt werden, es gelang jedoch, sie durch Behandlung mit einem alkylierenden oder ketalisierenden Mittel in Gegenwart von Säure und — falls nötig — durch anschließende Acylierung in die monomere Form überzuführen. Die neuen 18,20-Hemiketalverbindungen können durch folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden, in der R einen niederen Alkylrest, R' ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkanoylrest oder R und R' zusammen eine niedere Alkylidengruppe oder einen zweiten Molekülrest des gleichen 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketals (C₂IH₂₈O₃) bedeuten.

OR'

HO

Die zweite Stufe besteht, wie es in dem nachstehenden Reaktionsschema dargestellt ist, in dem R und R' die gleiche Bedeutung wie oben haben, in der Isomerisierung einer 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketalverbindung der allgemeinen Formel ΙΓ durch Einwirkung einer Säure oder einer Mischung aus einer Säure und einem acylierenden Mittel mit einem enzymatisch annehmbaren Acylrest:

OR'

IO

HO

20

(VIII')

Bei der Umsetzung wird in manchen Fällen bei Gegenwart einer oxydierenden Atmosphäre, z. B. Luft oder Sauerstoff, die Bildung kleiner Mengen 11/3,18 - Dihydroxy - 4 - androsten - 17/i - carbonsäure-18,20-lacton (IX) als Nebenprodukt beobachtet, die Bildung dieses Nebenprodukts kann jedoch vollständig vermieden werden, wenn man die oxydierende Atmosphäre durch ein Inertgas, z. B. Stickstoff, ersetzt

Die dritte Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht, wie in dem folgenden Reaktionsschema, in dem R' die gleiche Bedeutung wie oben hat, dargestellt ist, in der Behandlung von 18-Deoxyaldosteron oder eines enzymatisch annehmbaren in Stellung 21 acylierten Derivats davon (VIII') mit Enzym eines Fungus des Genus Corynespora

CH₂OR'

O—ι C=O

(VIII')

CH₇OR'

C=O

50

55

60

wodurch man Aldosteron Qi) in etwa 20%-Ausbeute erhält. Bei der Umsetzung treten im allgemeinen kleine Mengen weiteroxydierter Nebenprodukte, z. B. 18-Dehydroaldosteron (XI) und/oder 9a-Hydroxyllj8,18-epoxy-4-androsten-3,17-dion (XII) auf. 18-Dehydroaldosteron (XI) kann jedoch leicht nach dem bekannten Verfahren von Reichstein et al, HeIv. Chim. Acta 38, 1423 (1955), in Aldosteron übergeführt werden.

Was die Mikroorganismen des Genus Corynespora betrifft, wie sie für das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere in der ersten und dritten Stufe, verwendet werden, kann man beliebige Stämme dieses Genus verwenden, C. caseiicola oder C. melonis werden jedoch bevorzugt. Die Züchtung dieser Mikroorganismen kann in üblicher Weise in einem geeigneten Nährmedium durchgeführt werden, beispielsweise in einem wäßrigen Flüssigmedium, das eine Kohlenstoffquelle, z. B. Glycose, eine Stickstoffquelle, z. B. Pepton, und kleinere Mengen Wachstumsfaktoren, wie sie z. B. durch Maisquellwasser geliefert werden, enthält.

Die biochemische Umsetzung in der ersten oder in der dritten Stufe wird in der Weise durchgeführt, daß man das Substrat mit dem Enzym des Mikroorganismus in einem Nährstoffmangelmedium und vorzugsweise in einem nährstofifreien Medium, z. B. Wasser oder einer einfachen Salzlösung mit geeignetem osmotischem Druck, bei enzymatisch optimalen Temperaturen, vorzugsweise von etwa 15 bis 40⁰C, für etwa 1 bis 5 Tage in Berührung bringt. Was das Enzyl betrifft, so kann beliebiges, bei Mikroorganismen des Genus Corynespora anfallendes Material verwendet werden. Davon ist das sogenannte Ruhemycel (resting mycelium) sehr zweckmäßig. Man vermischt also das vorher gezüchtete Mycel des Mikroorganismus, nachdem es nötigenfalls vorher gewaschen worden ist, direkt mit der Substratlösung in dem Medium und führt die Umsetzung durch.

Es sei hervorgehoben, daß die mikrobiologische Hydroxylierung von Corticosteron in Stellung 18 neu ist und daß darüber hinaus die Hydroxylierung eines in Stellung 18 oxydierten Steroids 18-Deoxyaldosteron = lS-Hydroxycorticosteron-ll.lS-äther in Stellung 18 einen beträchtlichen technischen Fortschritt bedeutet. Ferner sei darauf hingewiesen, daß ein weiterer erheblicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin liegt, daß der gleiche Mikroorganismus in zwei verschiedenen Stufen des Herstellungsverfahrens für eine Verbindung verwendet wird. Was die Substrate in beiden Stufen, nämlich der ersten und der dritten, betrifft, sind nicht nur freie Alkohole (I) und (VIII), sondern auch ebenso beliebige enzymatisch annehmbare in Stellung 21 acylierte Derivate davon geeignet. Unter dem enzymatisch annehmbaren in Stellung 21 acylierten Derivaten sind die entsprechenden Formiate, Acetate, Cathylate u. dgl. zu verstehen, die dem verwendeten Enzym als Substrat dienen können. Die Reaktionsprodukte können nach beliebigen üblichen Verfahren isoliert werden, man kann dabei jedoch eine einfache Modifizierung der Alkoholgruppe in Stellung 21 durch übliche Acylierung oder ähnliche Maßnahmen anwenden, um die Isolierung zu erleichtern.

Die Isomerisierung der 18,20-Hemiketalform zu der entsprechenden 11,18-intramolecularen Ätherform (II' zu VIII') in der zweiten Stufe wird unter Verwendung einer Säure oder einer Mischung aus einer Säure und einem acylierenden Mittel mit enzymatisch annehm-

barem Acylrest durchgeführt, wobei der Begriff »enzymatisch annehmbarer Acylrest« die oben erläuterte Bedeutung hat. Als Säure sind beliebige organische oder anorganische Säuren, z. B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Benzoesäure, p-Toluolsulfonsäure oder Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure gleichermaßen geeignet, wenn man ein wäßriges Medium verwendet. Bei Abwesenheit eines wäßrigen Mediums sind jedoch die geeigneten Säuren auf solche Säuren beschränkt, die den besagten enzymatisch annehmbaren Acylrest aufweisen, da sie gleichzeitig als acylierendes Mittel wirken und den Acylrest in Stellung 21 des Produkts (VIII') einführen. In Gegenwart des jeweiligen acyiierenden Mittels mit enzymatisch annehmbarem Acylrest, z. B. Acylhalogenid oder -anhydrid, beispielsweise Ameisensäure, Äthoxyformylchlorid, Acetylchlorid, Acetanhydrid oder dergleichen können aber auch beliebige Säuren angewandt werden. Man kann beliebige inerte Lösungsmittel bei dieser Behandlung verwenden. Die Verhältnisse in den Ausbeuten an den Produkten VIII und ihren 21-Acylderivaten schwanken in Abhängigkeit von den Mengen an Säure acylierendem Mittel und in manchen Fällen des inerten Lösungsmittels, z. B. Wasser. Eine Behandlung mit einer Säure in wäßrigem Medium liefert allgemein mit anderen Worten ausschließlich das freie Alkoholprodukt (VIII) und eine Behandlung mit einem acyiierenden Mittel ohne Verwendung eines wäßrigen Mediums vorwiegend das acylierte Produkt (Villa od. dgl.).

Die Umsetzung kann durchgeführt werden, indem man das Substrat (W) in der Säure oder in einer Mischung der Säure und des acyiierenden Mittels mit oder ohne Verwendung des inerten Lösungsmittels, z. B. Wasser, auflöst und vorzugsweise unter Rühren in einer nichtoxydierenden Atmosphäre, z. B. Stickstoff, bei einer Temperatur von etwa 0⁰C bis zur Rückflußtemperatur hält. Die Umsetzung erfolgt glatt und in kurzer Zeit von im allgemeinen etwa 10 Minuten bis zu 3 Tagen. Man kann die Reaktionsmischung in üblicher Weise aufarbeiten und dabei zur Erleichterung der Isolierung die einfache Umwandlung von freier und acylierter Form anwenden.

Die Umwandlung in 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketal (II') kann in Gegenwart einer beliebigen Säure (vermutlich über das freie Monomere 18-Hydroxycorticosteron) unter Einwirkung eines alkylierenden oder ketalisierenden Mittels (zur Fixierung der 18,20-Hemiketalstruktur) durchgeführt werden. Die Umsetzung verläuft glatt mit den üblichen Säuren und alkylierenden Mitteln, z. B. Alkoholen (z. B. Methanol, Äthanol od. dgl.) oder ketalisierenden Mitteln, z. B. Ketonen (z. B. Aceton od. dgl.), indem man kurze Zeit bis zu mehreren Stunden bei Zimmertemperatur oder höherer Temperatur hält. Nötigenfalls kann man an die Umwandlung eine übliche Acylierung in Gegenwart eines basischen Katalysators zur Einführung einer Acylgruppe, z. B. einer Acetylgruppe od. dgl., in Stellung 21 anschließen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

A. Ein Medium (pH 6,8 bis 7,0). das 3,5% Glycose, 2% Pepton und 0,3% Maisquellwasser enthält, beimpft man mit Corynespora cassiicola (IMI 56007) und züchtet 4 Tage lang bei 28° C unter Schütteln, wodurch man feuchte Mycel (6,5 g/100 ml Kulturbrühe) erhält. Das feuchte Mycel wird mit Wasser gewaschen und im Verhältnis von 6,5 g/100 ml in destilliertem Wasser suspendiert. Die erhaltene Ruhemycelsuspension (resting mycelium suspension) versetzt man mit Corticosteron (1:5,6 g) im Verhältnis von 70 g/100 ml und züchtet 48 Stunden bei 28° C und unter Schütteln.

Die Reaktionsmischung wird in üblicher Weise durch Extraktion der Produkte mit Äthylacetat und Eindampfen aufgearbeitet. Den erhaltenen Extrakt löst man in einer kleinen Menge einer Mischung von Chloroform und Methanol (1:1), verdünnt die Lösung mit Aceton und läßt dann abkühlen, wodurch man kristallines 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketaldimere (II: 1,6 g) erhält.

Die Mutterlauge dampft man ein und chromatographiert den Rückstand an Diatomeenerde (bekannt unter den Handelsnamen Celite, Hyflo Super CeI usw.). Aus dem Eluat mit einer Mischung von Hexan/Benzol (3:7) erhält man das gleiche 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketaIdimere (II :0,08 g), aus dem Anfangseluat mit Benzol 8/f-Hydroxycorticosteron (111:0,28 g), aus der mittleren Eluatfraktion mit Benzol 14«-Hydroxycorticosteron (IV :0,11g), aus dem Endeluat mit Benzol 17«-Hydroxycorticosteron (V :0,17 g), aus dem Anfangseluat mit einer Mischung von Benzol und Chloroform (1:1) 6/i-Hydroxycorticosteron (VI :0,16g) und aus dem Endeluat mit dem gleichen Lösungsmittelsystem 15ß - Hydroxycorticosteron (VII :0,56 g) in kristalliner Form.

18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketaldimer(II): F. 293 bis 296° C, (Vp₀ ⁵ + 206,5° (in Chloroform/Methanol 1:1). IR: J-Nj'3458,1668,1616 cm"¹. Anal. Ber. für C₄₂H₅₆O₈-V₂H₂O: C 72,31, H 8,17; gef.: C 72,08, H 8,02.

Molekulargewicht Ber.: 697;gef. 679.

8/i-Hydroxycorticosteron (III): F. 213 bis 215°C, [«]!« + 226,7° (in Chloroform mit 1% Äthanol). UV:;K^ElOH242mnO. = 16 000). IR: »·£*"3460,3352, 1709, 1666, 1625 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₁H₃₀O₅: C 69,58, H 8,34; gef.: C 69,66, H 8,37.

Ua-Hydroxycorticosteron (IV): F. 213 bis 215°C, IaYo" + 196,5° (in Methanol). UV: Λ«°ί^ΕιΟΗ243 πΐμ (f = 16 100). IR: >- ίίΤ'3438, 1705, 1651, 1619 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₁H₃₀O₅: C69,58, H8,34; gef.: C69,58, H 8,35.

Ha-Hydroxycorticosteron (Hydrocortison, V); F. 212 bis 215°C, fr]? + 160° (in Äthanol). IR: |.J**" 3472, 1715, 1645, 1613 cm"¹. Anal. Ber. Tür C₂₁H₃₀O₅: C 69,58, H 8,34; gef.: C69.41, H8,30.

6ß-Hydroxycorticosteron (VI): F. 225 bis 228°C,

]+ 128,8° (in Dioxan). UV: λ^^ΕιΟΗ237,5 πΐμ (ί = 14800). IR: i< Eat¹3420, 1704, 1661, 1615 cm"¹. Anal Ber. für C₂₁H₃₀O₅: C69,58, H 8,34; gef.: C69,61, H 8,35.

lS/f-Hydroxycorticosteron (VII): F. 240 bis 243° C, [α]?⁵ + 158° (in Dioxan). UV: λ^^ΕιΟΗ243πιιλ (» = 16 600). IR: .·";*"3380, 1701, 1660, 1616 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₁H₃₀O₅: C69,58, H8,34; gef.: C69,27, H 8,45.

Stellungen und Konfigurationen der neueingeführten Hydroxylgruppen in diesen Produkten wurden nach der in Steroids, 4, 713 (1964), beschriebenen Methode nachgewiesen und bestätigt.

B. Man löst 100 mg ■ 18-Hydroxycorticosteron-

509 616/57

[a]S"

18,20-hemiketaldimer (II) in 100 ml Eisessig und erwärmt die gebildete Lösung 70 Minuten unter Rückfluß. Die Reaktionsmischung wird mit 200 ml Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird mit verdünnter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird an Kieselsäuregel (Kieselgel GF usw.) mit Äthylacetat dünnschichtchromatographiert. Die polare Fraktion wird extrahiert und liefert 21 - Hydroxy - 11/ί,18 - epoxy - 4 - pregnen - 3,20 - dion (18-Deoxyaldosteron: VIII: 9,8 mg).. Die unpolarc Fraktion wird mit einem zweiten Lösungsmittel (Chloroform/Methanol 19:1) weiterentwickelt und liefert getrennt 18 - Deoxyaldosteron - 21 - acetat (Villa:61mg) und ll/^lS-Dihydroxy^-androsten-17/J-carbonsäure-18,20-lacton (iX : 10 ms).

18-Deoxyaldosteron (VIII): F. 140~ bis 14PC, [>]£? + 218° (in Chloroform mit 1% Äthanol). UV: ;.S^E|OH240,5 ΐημ (* = 15 800). IR: .· S^Ci)3500, 1712, 1665, 1621cm"¹. Anal. Ber. für C₂₁H₂₈O₄: C 73,23, H 8,19; gef.: C 72,99, H 8,32.

18-Deoxyaldosteron-21-acetat (Villa), das auch durch die übliche Acetylierung von VIII mit Acetanhydrid in Pyridin erhältlich ist: F. 160 bis 16ΓC, [α]|? + 216,4° (in Chloroform mit 1% Äthanol). UV: _Aw%Eton_{240m[jL (f = 16400) IR:} „ ™«»i75i; 1728, 1667, 1619 cm"¹. Anal. Ber. für C₃H₃₀O₅: C 71,48, H 7,82; gef.: C 71,26, H 7,82. Diese Substanz (Villa) liefert bei Hydrolyse in üblicher Weise mit-Kaliumcarbonat in wäßrigem Methanol bei Zimmertemperatur den entsprechenden freien Alkohol-(VIII) in nahezu quantitativer Ausbeute.

11/?,18- Dihydroxy-4-androsten- 17/i-carbonsäure-18,20-lacton. (IX): F. 263 bis 265° C, [u]? + 154,3° (in Chloroform mit 1% Äthanol). UV: λ«%^ΕιΟ"241,5 m₍x (f = 16 500). IR: >'L^Bx^r3406, 1770, 1645, 1620 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₀H₂₆O₄: C 72,70, H 7,93; gef.: C 72,74, H 7,87. Diese Substanz wird auch durch Oxydation von 1 S-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketaldimer (II) mit Natriumwismutat erhalten.

C. Nach der gleichen Arbeitsweise wie in (A) wird 18-Deoxyaldosteron (VIII: 200 mg) durch Einwirkung von Ruhemycel von Corynespora cassiicola (IMI 56 007 in einer Konzentration von 25 mg/100 ml in Wasser hydroxyliert.

Die Reaktionsmischung wird in üblicher Weise mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt (180 mg) wird an Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen Kieselgel GF usw.) mit einer Mischung von Chloroform und Methanol (8:1) dünnschichtchromatographiert. Die polare Fraktion wird extrahiert und liefert Aldosteron (X: 34 mg). Die unpolare Fraktion wird erneut mit dem zweiten Lösungsmittel Äthylacetat chromatographiert, wodurch man getrennt 18-Dehydroaldosteron (XI :4,1mg) und 9a-Hydroxyllftl/?-epoxy-4-androsten-3,17-dion (XII: 3,1 mg) erhält.

Aldosteron (X): F. 165 bis 167°C, [α]? + 163,3° (in Chloroform mit 1% Äthanol). UV: A^^ElOH240,5 πΐμ (f = 16 600). IR: v™^a'3721, 3571, 3461, 1705, 1667, 1618 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₁H₂₈O₅: C 69,97, H 7,83; gef.: C 69,85, H 7,76.

Aldosteron-21-acetat (Xa), das dyreh übliche Acetylierung von X mit Acetanhydrid in Pyridin erhalten wird: F. 192 bis 194°C, [a]S" + 127,5° (in Chloroform mit 1% Äthanol). IR: i-chc^H, 3591, 3431, 1738, 1718, 1666, 1617 cm-¹. Anal. Ber. für C₂₃H₃₀O₆:

C 68,63, H 7,51; gef.: C 69,07, H 7,74.

18-Dehydroaldosteron (XI), das auch durch Chrom-

trioxydoxydation von X in Pyridin erhältlich ist: F. 208 bis 213°C, IR: vSJj"· 3486, 1772, 1710, 1671, 1621 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₁H₂₆O₅: C 70,37, H 7,31; gef.: C 69,98, H 7,19.

18-Dehydroaldosteron-21-acetat (XIa), das durch

übliche Acetylierung von XI mit Acetanhydrid in ίο Pyridin oder durch Oxydation von mit Chromtrioxyd in Pyridin erhalten wird: F. 202 bis 204°C, [«]£" + 118,4° (in Chloroform mit 1% Äthanol). IR: >£!<<'< 1772, 1750, 1728, 1669, 1621 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₃H₂₈O₆:C 68,82, H 7,16; gef.: C 69,11, H 7,10.
9a-Hvdroxy-ll/i,18-epoxy-4-androsten-3,17-dion

(XlI): F. 234 bis 236°C, UV: /£V^E|OH241 mu

U- = 15 800). IR: ν Sf 3421, 1728. 1659, 1624 cm"¹.

Anal. Ber. für C₁₉H₂₄O₄: C72,12, H7,65; gef.: C72,07, H 7,49.

Beispiel 2

A. Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 (A) liydroxyliert man Corticosteron-21-acetat (Ia: 2,8 g) durch Einwirkung von Ruhemycel von Corynespora cassiicola (IMI 56007) in Wasser in einer Konzentration von 50 mg/100 ml, arbeitet die Reaktionsmischung auf und trennt die rohen Produkte in die gleichen Einzelprodukte auf: U, 0,81 g; III, 0,15 g; IV, 0,05 g; V, 0,06 g und VIII,'0,11 g.

18 - Hydroxycorticosieron - 18,20 - hemiketaldimer (II :100 mg) wird in einer Mischung aus Methanol (40 ml) und Chloroform (10 ml) gelöst. Die Lösung wird nach Zugabe von 2 n-Salzsäure (6 ml) 3 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Dann verdünnt man die Reaktionsmischung mit Wasser, neutralisiert mit wäßriger Natriumcarbonatlösung, extrahiert mit Chloroform und chromatographiert das erhaltene Rohprodukt an einer Dünnschicht aus Kieselsäuregel (Kieselgel GF usw.) mit einer Mischung von Chloroform und Methanol (19:1). Die polare Fraktion wird extrahiert und liefert amorphes pulvriges Methylhemiketal (lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketal-20-methyläthcr, Ha: 70 mg).

lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketal^O-methyläther (Ha): IR: ν IT¹3410, 1660, 1617 cm-¹. Rm-H(CDCl₃): 8,59, 6,8Or.

Eine Lösung von 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketaldimer (II: 70 mg) in Aceton (6 ml) versetzt man mit 4 n-Schwefelsäure (0,1 ml), um einen kristallinen Niederschlag zu erzeugen. Nach 10 Minuten filtriert man die gebildeten Kristalle ab und extrahiert die Mutterlauge nach Neutralisieren mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung mit Chloroform. Die Rohprodukte werden vereinigt und an Kieselsäuregel (Kieselgel GF usw.) dünnschichtchromatographiert, wobei man mit einem Lösungsmittelsystem

6o-aus Chloroform/Methanol (19:1) entwickelt. Aus dem polaren Adsorptionsband erhält man 18-Hydroxycorticosterondimer (II: 10 mg) und aus dem nichtpolaren Adsorptionsband 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketal-20.21-acetonid (Hb: 6,6 mg in Form von Kristallen.

18 - Hydroxycorticosteron - 18,20 - hemiketal-20,21-acetonid (lib): F. 230 bis 233⁰C, [α]? + 212° (in Chloroform mit 1% Äthanol). IR: 1· S⁰'3374, 1657,

1613 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₄H₃₄O₅: C 71,61, H 8,51;-gef.: C 71,89, H 8,44.

18 - Hydroxycorticosteron - 18,20 - hemiketal-20-methyläther (Ha: 70 mg) wird in üblicher Weise in einer Mischung aus Acetanhydrid (3 ml) und Pyridin 5 ml), die man 18 Stunden bei Zimmertemperatur hält, acetyliert. Man dampft die Reaktionsmischung anter vermindertem Druck ein und chromatographiert den erhaltenen Rückstand an einer Dünnschicht ms Kieselsäuregel (Kieselgel GF usw.) mit Chloroform/Methanol (19:1). Die Hauptfraktion wird extrahiert und liefert das entsprechende 21-Monoacetat file: 52mg).

18 - Hydroxycorticosteron - 18,20 - hemiketal-20-methyläther-21-acetat (lic): F. 185 bis 187°C, [«]£" + 169,7° (in Chloroform mit 1% Äthanol). UV: /.S^Et0" 242,5 ΐημ (f = 16400). IR: r ^f 3396, 1739, 1643, 1617 cm"¹. Anal. Ber. für C₂₄H₃₄O₆: C 68,87, H 8,19; gef.: C 68,76, H 8,32.

B. lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketaldimer (II: 60 mg) wird in 50%iger Essigsäure (120 ml) gelöst und 90 Minuten unter Rückfluß erwärmt. Die Reaktionsmischung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 (B) beschrieben aufgearbeitet, wodurch die gleichen Produkte erhalten werden: VIII, 36,5 mg; Villa 6,1 mg und K, 5,7 mg.

Versuche mit äquivalenten Mengen 18-Hydroxycorticosteron-18,20-hemiketal-20-methyläther (Ha), lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketal^O^l-acetonid (Hb) und lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketal-21-acetat (lic) an Stelle des vorstehend verwendeten 18-Hydroxycorticosteroh- 18,20-hemiketal-* dimeren (II) liefern die gleichen Ergebnisse.

C. Nach der gleichen Arbeitsweise, wie sie unter (A) beschrieben wurde, wird 18-Deoxyaldosteron-21-acetat (Villa: 100 mg) durch Einwirkung von Ruhemycel von Corynespora cassiicola (IMI 56 007) in Wasser in einer Konzentration von 50 mg/100 ml hydroxyliert. Man extrahiert die Reaktionsmischung mit Äthylacetat und chromatographiert den erhaltenen Extrakt an einer Dünnschicht aus Kieselsäuregel (Kieselgel GF usw.) mit einer Mischung von Chloroform und Methanol (19:1), wodurch man folgende Ergebnisse erhält: X, 19 mg, XI, 1,0 mg und XII, 0,8 mg.

Beispiel 3

A. In der gleichen Weise, wie sie im Beispiel 1 (A) beschrieben wurde, wird Corticosteron (I: 100 mg) durch Einwirkung von Ruhemycel von Corynespora melonis (Cke) Lindau (12 g) in destilliertem Wasser (100 ml) 48 Stunden lang unter Schütteln hydroxyliert. Man extrahiert die Reaktionsmischung mit Äthylacetat und arbeitet den Extrakt in der beschriebenen Weise auf, wodurch man folgende Ergebnisse erhält: 11,21%; III, 3,8%; IV, 1,1%; V, 1,8%; VI, 1,2% und VII, 6,0% Ausbeute..

B. lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketaldimer (II: 500 mg) wird in einer Mischung aus Eisessig (480 ml) und Acetanhydrid (20 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung'wird nach Zugabe von p-Toluolsulfonsäure (8 g) 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man verdünnt die Reaktionsmischung mit Wasser (1 1) extrahiert mit Chloroform und kristallisiert das extrahierte Produkt aus einer Mischung von Ace'ton und Äther um, wodurch man 18-Deoxyaldosteronacetat (Villa: 351,5 mg erhält. Die Mutterlauge wird eingedampft, und der erhaltene Rückstand wird in der im Beispiel 1 (B) beschriebenen Weise dünnschichtchromatographiert, wodurch man eine weitere Fraktion von Villa (56,5 mg) und 18-Deoxyaldosteron (VIII: 25 mg) erhält.

Bei einer zweiten Arbeitsweise wird 18-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketaldimer (II: 20 mg) mit einer Mischung von Eisessig (20 ml) und p-ToIuoI-sulfonsäure (200 mg) 20 Stunden bei Zimmertemperatur behandelt und dann in der gleichen Weise wie oben aufgearbeitet, wodurch man ähnliche Ergebnisse erhält: VIII, 2,2 mg und Villa, 14,1 mg.

C. In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 (C) beschrieben, wird 18-Deoxyaldosteron (VIII: 20mg) durch Einwirkung von Ruhemycel von Corynespora melonis (Cke) Lindau (10 g) in destilliertem Wasser (100 ml) 48 Stunden unter Schütteln hydroxyliert, die Reaktionsmischung wird mit Äthylacetat extrahiert, und das erhaltene Rohprodukt wird an Kieselsäuregel dünnschichtchromatographiert, wodurch man im Chromatogramm entsprechende Flecken erhält, die die Anwesenheit von X, XI und XlTanzeigen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Aldosteron, 18-Dehydroaldosterdn und/oder 9a-Hydroxy-1 l/i, 1 S-epoxy-^-androsten^n-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man Corticosteron oder ein enzymatisch annehmbares 21-Acylat davon mit Enzym eines Mikroorganismus des Genus Corynespora behandelt, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel

IO

man eine Verbindung der Formel

OR'

/Ov

OR

HO

OR'

HO

.

30

in der R einen niederen Alkylrest und R' ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkanoylrest oder R und R' zusammen eine niedere Alkylidengruppe oder einen zweiten Molekülrest desgleichen lS-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketals (C₂IH₂₈O₃) bedeuten, mit einer Säure oder mit einer Mischung aus einer Säure und einem acylierenden Mittel mit enzymatisch annehmbarem Acylrest behandelt und das erhaltene 18-Deoxyaldosteron oder ein enzymatisch annehmbares 21-Acylat davon mit Enzym eines Mikroorganismus des Genus Corynespora behandelt.

2. Verfahren zur Herstellung von Aldosteron, 18-Dehydroaldosteron und/oder 9a-Hydroxyll/?,18-epoxy-4-androstan-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man 18-Deoxyaldosteron oder ein enzymatisch annehmbares 21-Acylat davon mit Enzym eines Mikroorganismus des Genus Corynespora behandelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung in einem Nährstoffmangelmedium bei enzymatisch optimalen Temperaturen für eine Zeit von etwa 1 bis 5 Tagen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung in Wasser bei etwa 15 bis 40° C etwa 1 bis 5 Tage mit Ruhemycel eines Mikroorganismus des Genus Corynespora durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsstoff 18-Deoxyaldosteron oder sein 21-Acetat verwendet und in Wasser bei etwa 15 bis 40° C etwa 1 bis 5 Tage mit Ruhemycel von Corynespora cassiicola oder Corynespora melonis behandelt.

6. Verfahren zur Herstellung von 18-Deoxyaldosteron oder eines enzymatisch annehmbaren 21-Acylats davon, dadurch gekennzeichnet, daß worin R einen niederen Alkylrest und R' ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkanoylrest oder R und R' zusammen eine niedere Alkylidengruppe oder einen zweiten Molekülrest des gleichen 18 - Hydroxycorticosteron - 18,20 - hemiketals (C₂₁H₂₈O₃) bedeutet, mit einer Säure oder einer Mischung aus einer Säure und einem acylierenden Mittel mit enzymatisch annehmbarem Acylrest behandelt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung bei einer Temperatur von 0° C bis zum Siedepunkt des verwendeten Mediums für eine Zeit von etwa 10 Minuten bis zu 3 Tagen durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung in Gegenwart von Wasser mit einer Säure durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial 18-Hydroxycorticosteron - 18,20 - hemiketaldimcres, 18 - Hydroxycorticosteron - 18,20 - hemiketal - 20 methyläther, 18 - Hydroxycortiposteron - 18.20 hemiketal-20-methyläther-21-acetat oder 18-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketal^O^l-acetonid verwendet und mit einer wäßrigen oder nichtwäßrigen Säure oder Mischung aus einer Säure und einem acylierenden Mittel mit enzymatisch annehmbarem Acylrest bei 0°C bis zum Siedepunkt des Mediums für eine Zeit von etwa 10 Minuten bis zu 3 Tagen durchführt, wobei man als Säure organische und anorganische Säuren und als acylierendes Mittel Säureanhydride oder -halogenide organischer Säuren verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als acylierendes Mittel Acetanhydrid verwendet.

11. Verfahren zur Herstellung von 18-Hydroxycorticosteron-lS^O-hemiketaldimerem mit oder ohne Erzeugung von 6ß-, &ß-, 14a-, 15/i- und Ha-Monohydroxycorticosteron als Nebenprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß man Corticosteron oder ein enzymatisch annehmbares 21-Acylat davon mit Enzym eines Mikroorganismus des Genus Corynespora behandelt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung in einem Nährstoffmangelmedium bei enzymatisch opti-j malen Temperaturen etwa 1 bis 5 Tage lang durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung in Wassci bei etwa 15 bis 40° C etwa 1 bis 5 Tage mi Ruhemycel eines Mikroorganismus des Genui Corynespora durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Corticosteron oder sein 21-Acetat verwendet und in Wasser bei etwa 15 bis 40⁰C etwa 1 bis 5 Tage mit Ruhemycel von Corynespora cassiicola oder melonis behandelt.

15. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel