DE2008819A1 - Spirostanderivat - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Spirostanderivat, nämlich die 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-säure. Diese Verbindung wird erfindungsgemäß dadurch erhalten, dass man Diosgenin mit einer Kultur von Proactinomyces restrictus Turfitt CBS 157.45 oder dessen Enzymen behandelt.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann analog den für die aerobe Fermentierung von Steroiden mit Mikroorganismen bekannten Arbeitsbedingungen erfolgen.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus kann auf festen oder flüssigen Nährmedien, die eine assimilierbare Stickstoffquelle und eine assimilierbare Kohlenstoffquelle nebst anorganischen

Salzen enthalten, gezüchtet werden.

Als assimilierbare Stickstoffquellen kommen tierische, pflanzliche, mikrobielle und anorganische Stickstoffverbindungen in Frage, wie z.B. Fleischextrakte, Peptone, Cornsteep, Hefeextrakt, Glycin und NaNo[tief]3 und dergleichen, wobei Mischungen verschiedener Stickstoffquellen vorteilhaft sein können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kommen alle Zucker und Polymere davon, wie z.B. Glucose, Maltose, Saccharose, Stärke und Dextrose sowie Aminosäuren, Proteine, Peptone, Fettsäuren, Fette in Betracht. Oft sind Mischungen verschiedener Kohlenstoffquellen
<NichtLesbar>

4-9, vorzugsweise 5-8, eingestellt werden. Die Züchtung des Mikroorganismus kann auf übliche Weise erfolgen, z.B. in Rühr- oder Schüttelfermentern bei 18-40°C, vorzugsweise bei 28°C.

Das Diosgenin kann dem Fermentierungsansatz zu irgendeiner Entwicklungszeit des Mikroorganismus zugesetzt werden, auch vor der Sterilisierung des Nährmediums. In der Regel aber wird dem Mikroorganismus eine gewisse Vorwachstumszeit gelassen und das Diosgenin erst 15-96 Stunden nach Inoculation zugesetzt. Das Diosgenin kann in jeder geeigneten Form zugesetzt werden, jedoch mit Vorteil in solcher Weise, dass eine maximale Kontaktfläche zwischen Steroid und Mikroorganismus entstehen kann, beispielsweise durch mechanische Dispersion oder mittels Dispergiermitteln oder durch Lösen in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Aceton, Propylenglykol, Dimethylsulfoxyd, Alkoholen oder Dimethylformamid.

Nach beendigter Fermentation wird das fermentierte Steroid aus dem Ansatz isoliert. Besonders vorteilhaft hierfür ist die Extraktion mittels eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels für Steroide, wie Dichlormethan, Chloroform, Essigester, Methylisobutylketon, Trichloräthylen und dergleichen.

Die Zellmasse kann auch gesondert mit den oben aufgezählten Lösungsmitteln und auch mittels wassermischbarer Lösungsmittel wie z.B. Aceton, Dimethylsulfoxyd, Aethylalkohol etc., extrahiert werden. Das aus den Extrakten erhaltene erwünschte Produkt kann durch Umkristallisieren, Chromatographieren oder mittels Gegenstrom-Verteilung gereinigt und von den nicht erwünschten Produkten der Gärung getrennt werden.

Die 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-säure kann als Zwischenprodukt zur Herstellung von Steroiden, z.B. von 9kleines Beta, 10kleines Alpha-Steroiden, Verwendung finden. Die Verbindung lässt sich beispielsweise wie folgt in das DesA-25D-spirost-9-en-5-on überführen, aus dem wiederum, gegebenenfalls nach vorherigem Abbau der Diosgeninseitenkette, vgl. Fieser und Fieser, Steroids; New York 1959, Seite 549 ff., in Analogie zu bekannten Verfahren durch Hydrierung der 9,10-Doppelbindung und Kondensation mit Methylvinylketon ein 9kleines Beta, 10kleines Alpha-Steroid erhalten werden kann:

Ein Gemisch von 400 ml Essigester, 0,5 ml 72%-iger Perchlorsäure und 48 ml Acetanhydrid wird mit Essigester auf 500 ml aufgefüllt. 400 ml dieser Lösung werden mit 7,28 g 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-säure 25 Minuten bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und darauf in 300 ml einer kalten, gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen. Die Essigesterschicht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Benzol versetzt und erneut im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Benzol/Aether gelöst, über 80 g Kieselgel filtriert und das Filtrat eingeengt. 34,6 g des so erhaltenen Rückstandes werden in 250 ml Tetrahydrofuran gelöst und tropfenweise unter Rühren bei 70° zu 55 ml einer 2-molaren ätherischen Lösung von Aethylmagnesiumbromid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff 2,5 Stunden bei -50 bis -60° gerührt und darauf langsam auf 0° erwärmt. Die Lösung wird dann auf eine eiskalte gesättigte Ammoniumchloridlösung gegossen und mit 1,75 Liter Aether versetzt. Die organische Phase wird abgetrennt, mit kalter Natriumhydrogensulfatlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst und über 35 g Kieselgel filtriert. Eindampfen des Filtrates liefert ein Öl. Eine Lösung von 18,8 g dieses Öls und 16,8 g Kaliumhydroxid in 200 ml Aethanol und 45 ml Wasser wird 3 Stunden unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird die Reaktionslösung auf 2 Liter Eiswasser gegossen und mit 2 Liter Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird an 600 g Kieselgel chromatographiert. Elution mit Benzol/Cyclohexan/Aether (10:10:1) liefert DesA-25D-spirost-9-en-5-on, das aus Aceton/Hexan umkristallisiert wird.

Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren:

Beispiel

a) Bereitung der Schüttelkultur:

Schrägagar der Zusammensetzung 1% Difco-Neopepton, 4% Maltose, 1,5% Agar in Leitungswasser wird mit Proactinomyces restrictus Turfitt CBS 157.45 beimpft und 3 Tage bei 28° incubiert. Ab dieser Kultur werden mit Schikanen versehene Erlenmeyerkolben, die 100 ml eines Nährmediums der Zusammensetzung 0,25% NaCl, 0,4% Pepton, 1% Glucose, 0,4% Fleischextrakt, 0,1% Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthalten, beimpft. Das Medium wird vor der Beimpfung sterilisiert; der ph-Wert nach der Sterilisation ist etwa 6,3. Die Schüttelkultur wird 24 Stunden bei 28° incubiert.

b) Fermentation:

Ein Kleinfermenter mit 8 Liter Nährmedium der gleichen Zusammensetzung, wie bei der Schüttelkultur verwendet, wird sterilisiert und mit dem Inhalt eines Schüttelkolbens beimpft. Man incubiert 24 Stunden unter Rühren bei 28° und belüftet mit 5-6 Liter Luft/Minute. Danach werden 60 ml einer 3 1/3%-igen Lösung von Diosgenin in Dimethylformamid unter sterilen Bedingungen zugesetzt. Die Belüftung wird während der Fermentation je nach Schaumentwicklung auf 4-2 Liter/Minute reduziert. Der Verlauf der Fermentation wird kontrolliert, indem Proben der Fermentationslösung bei pH 2 mit Chloroform extrahiert und die Extrakte dünnschichtchromatographisch analysiert werden. Nach etwa 70 Stunden ist die Fermentation beendet. c) Isolierung des Reaktionsproduktes:

Der Inhalt von drei Kleinfermentern wird vereinigt und die Zellmasse abzentrifugiert. Das Mycel wird mit 7 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Danach wird die Lösung durch Zusatz von Salzsäure auf pH 2 gestellt und zweimal mit je 20 Liter Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte werden im Vakuum zur Trockne gebracht. Der Rückstand (12 g) wird in 2 Liter Dichlormethan gelöst, die Lösung mit 6 Liter gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert, dieser Extrakt mit Salzsäure auf pH 2 gestellt und nochmals in Dichlormethan aufgenommen. Der nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird an Silicagel mit Benzol, das steigende Mengen Aceton (bis 1:1) enthält, chromatographiert. Man erhält 4,4 g 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-säure, Schmelzpunkt 110-112° (aus Petroläther), [kleines Alpha] [hoch]25 [tief]D - 67° (in Dioxan, c = 0,1).

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-säure, dadurch gekennzeichnet, dass man Diosgenin mit einer Kultur von Proactinomyces restrictus Turfitt CBS 157.45 oder dessen Enzymen behandelt.

2. 1,2,3,4,10,19-Hexanor-9-oxo-5,9-seco-25D-spirostan-5-säure.