DE2318594C2

DE2318594C2 - Verfahren zur Herstellung von 2-substituierten-3-alpha-hydroxy-5-oxo-1cyclopenten-1-heptansäurederivaten durch stereospezifische mikrobiologische Hydrolyse

Info

Publication number: DE2318594C2
Application number: DE2318594A
Authority: DE
Inventors: Frank Benjamin Evanston Ill. Colton; William John Zurich Ill. Marsheck; Masateru Morton Grove Ill. Miyano
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1972-04-14
Filing date: 1973-04-13
Publication date: 1982-04-15
Also published as: US3801459A; FR2180050B1; GB1419892A; DE2318594A1; FR2180050A1

Description

(CH₂J₆COOR

(U)

OR"

in der R, R' und die gestrichelte Linie die oben angegebene Bedeutung haben, R" ein Acylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist und die Wellenlinie anzeigt, daß es sich um ein racemisches Gemisch handelt, mit Saccaromyces sp. NRRL Y-7342 oder dessen Enzymen behandelt, worauf die entsprechenden 3 «-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel (I) gebildet werden. Beispiele für den Alkylrest R in den obigen Formeln sind der Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptylrest und deren verzweigtkettige Isomere. Beispiele für den Acylrest R" sind der Acetyl-, Propionyl- und Isobutyrylrest.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Saccharomyces sp. NRRL Y-7342 und dessen Enzyme racemische Verbindungen der allgemeinen Formel (II) selektiv zu den entsprechenden l-3«-Hydroxyverbindungen der allgemeinen Formel (I) hydrolysieren, während die 3j3-Acyloxyisomeren nicht reagieren. Die Produkte dieses Verfahrens können in herkömmlicher Weise durch Extraktions- oder chromatographische Verfahren, wie sie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben sind, gewonnen werden.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Substrat der wachsenden Kultur oder dem Nährmedium vor der Inkubation mit dem Mikroorganismus zugefügt werden. Das Kulturmedium sollte verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquel'en enthalten und in entsprechender Weise mit steriler Luft versorgt werden. Luft kann dadurch zugeführt werden, daß man eine große Oberfläche des Kulturmediums der Luft aussetzt oder Luft durch eine submerse Kultur leitet. Geeignete Stickstoffquellen sind z. B. Sojabohnenrnehl, Maisquellwasser, Fleischextrakte, Pepton und/oder lösliche Stoffe aus der Alkoholdestillation sowie andere brauchbare organische Materialien.

Synthetische Substanzen, wie Nitrate und Ammoniumverbindungen können ebenfalls verwendet werden.

Geeignete Kohlenstoffquellen für das erfindungsgemäße Verfahren sind Fleischextrakte, Pepton und ähnliche Materialien. Weitere brauchbare Verbindungen sind Glycerin, Glucose, Fructose, Dextrose, Saccharose, Lactose, Maltose, Dextrine, Stärke und Molke. Diese Materialien können entweder in gereinigtem Zustand oder in Form von Konzentraten verwendet werden, z. B. von Molkekonzentrat, Maisquellwasser, Getreidemaischen, Melasse oder Gemischen aus diesen Materialien.

Oft ist es erwünscht, dem Kulturmedium ein Anti-Schaummittel zuzufügen. Auch Quellen für Phos-

phat-. Magnesium- und/oder Eisen-II-Ionen können als das Wachstum fördernde Mittel in das Kulturmedium einverleibt werden. Ferner können Puffersubstanzen zugefügt werden, um den pH-Wert auf den gewünschten Werten zu halten.

Die Verfahrensbedingungen können variiert werden und sich nicht kritisch. Sie sollten jedoch nicht so streng sein, daß die Reaktion verzögert oder der Organismus zerstört wird. Üblich sind Substratkonzentrationen im Bereich von 0,01 bis 5,0%, Temperaturen im Bereich von 25 bis 35° C und Reaktionszeiten von 1 bis 10 Tagen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird gewöhnlich in dem Medium durchgeführt, in dem der Organismus gezüchtet wird. Es ist jedoch auch möglich, die Hefezellen durch Zentrifugieren oder auf andere Weise vom Kulturmedium zu trennen und für die Durchfürung des Verfahrens das so erha'tene Zellmaterial zu verwenden. Darüber hinaus kann rne-i die Zellen mit Ultraschall oder auf andere Weise aufbrechen und so den Zugang zu den Enzymen erleichtern, die durch Filtrieren isoliert oder mit einem Lösungsmittel, wie Aceton oder Wasser extrahiert und anstelle des Organismus oder von dessen Zellen verwendet werden können.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen stellen wertvolle Ausgangsstoffe für die Herstellung entsprechender optisch aktiver Prostansäurederivate mit der allgemeinen Formel

(CHJ₆COOR

dar, in der Z eine Carbonyl- oder Hydroxynethylengruppe ist und R und die gestrichelte Linie die oben angegebene Bedeutung haben. Ein spezielles Beispiel für die Herstellung einer dieser Verbindungen besteht in der Umsetzung von 1 ^-Formyl-Sa-hydroxy-S-oxo-1 -cyclopenten-1-heptansäuremethylester mit n-Hexanoylmethylen-triphenylphosphoran unter Bildung von l-llct-Hydroxy-9,15-dioxo-8(12),13-prostadiensäuremethylester. Diese Prostansäurederivate haben wertvolle pharmakologische Eigenschaften. Sie wirken z. B. blutdrucksenkend, auf die glatte Muskulatur kontrahierend, antibakteriell, anti-protozoal, antifungal und pepsinhemmend.

Für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbare Ausgangsstoffe werden zweckmäßig aus Styrylglyoxal, das man durch Selensäureoxydation von 4-Phenyl-3-buten-2-on herstellen kann, und den Dialkylestern von 3-Oxoundecan-l,ll-disäure hergestellt. 3-Oxoundecan-1,11 -disäuredimethylester wird z. B. mit Kaliumhydroxid verseift und die so erhaltene Disäure mit Styrylglyoxal umgesetzt, worauf man dl-ll-Hydroxy-9,12-dioxo-14-phenyltetradec-13-ensäure erhält. Die Cyclisierung dieser Verbindung in Gegenwart von Kaliumhydroxid ergibt dl^-Hydroxy-S-oxo^-styryl-1 -cyclopenten-1 heptansäure. Die 3-Hydroxyverbindungen werden dann zu den entsprechenden 3-Acyloxyverbindungen der allgemeinen Formel (II) acyliert. Typische Acylierungsmittel sind die Säureanhydride, wie Essigsäure- und Propionsäureanhydrid. Die Alkylester werden nach herkömmlichen Methoden hergestellt Zum Beispiel wird dl-3-Hydroxy-5-oxo-2-styry]-l -cyclopenten-1 heptansäure mit Diazomethan zum entsprechenden Methylester umgesetzt. Der MethyJester wird darauf mit Essigsäureanhydrid behandelt, worauf man den

dI-3-Acetoxy-5-oxo-2-styryl-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester erhält

Die 2-(a,j?-Dihydroxyphenäthyl)-Ausgangsstoffe der allgemeinen Formel (II) erhält man leicht durch

ίο Hydroxylierung der entsprechenden 2-StyryIverbindungen. Ein geeignetes Reaktionsmittel ist Osmiumtetroxid. Zum Beispiel ergibt dl-S-Acetoxy-S-oxo^-styryl-l-cyclopenten-1-heptansäuremethylester bei Raumtemperatur mit Osmiumtetroxid in Dioxan dl-3-Acetoxy-2-(a,j3-dihydroxyphenäthyl)-5-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester.

Ein geeignetes Verfahren für die Herstellung der 2-FormyIverbindungen der allgemeinen Formel (II) besteht in der Abspaltung der Glycolgruppe der entsprechenden 2-(<x,/?-Dihydroxyphenäthyl)-Verbindungen. Zum Beispiel ergibt dI-3-Acetoxy-2-(a,/S-dihydroxyphenäthyly-5-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäure-

methylester in Äthanol bei Behandlung mit wäßrigem Natriumperjodat dl-3-Acetoxy-2-formyl-S-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester.

Die Reduktion der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Δ ^u-Ausgangsstoffe ergibt die entsprechenden Cyc'iOpentanheptansäuren und deren Ester. Typische Reduktionsmittel sind Chrom-II-sulfat oder metallisches Zink. Zum Beispiel ergibt die Reduktion von dl-3-Acetoxy-2-formyl-5-oxo-1 -cyclopenten-1 heptansäure mit Zinkpulver in wäßriger Essigsäure dl-3-Acetoxy-2j3-f ormyl-5-oxocyclopentan-1 a-heptansäure.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. In diesen Beispielen sind, sofern nichts anderes angegeben ist, die Temperaturen in ⁰C und die verwendeten Substanzmengen in Gewichtsteilen angegeben. Die Beziehung zwischen Gewichtsteilen und Volumteilen ist die gleiche wie die zwischen Gramm und Milliliter. Die optische Drehung wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung der D-Linie des Natriums (5893 A) als Wellenlänge des Lichts bestimmt. Die kernmagnetischen Resonanzspektren wurden mit einer 60-mega-Hertzvorrichtung unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Bezugswert bestimmt und sind in Teilen je Million (δ) angegeben. Die IR-Absorptionsmaxima sind in cm-' und die UV-Absorptionsmaxima in ΐημ ausgedrückt.

Herstellung der Ausgangsstoffe

A 450 Teile dl-S-Hydroxy-S-oxo^-styryl-l-cyclopenten-1-heptansäure wurden unter Rühren in 3920 Teilen Pyridin gelöst. Darauf wurden innerhalb von 15 Minuten 1350 Teile Essigsäureanhydrid zugefügt und das erhaltene Gemisch wurde 2 Tage stehengelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde unter Rühren und Kühlen ein Überschuß an Wasser zugefügt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gekühlt und dann in 6000 Teile Eiswasser gegossen und eine Stunde gerührt. Mit konzentrierter Salzsäure wurde der pH-Wert des Gemisches auf etwa 2 gebracht. Die angesäuerte Lösung wurde viermal mit Äthyläther

extrahiert. Der Ätherextrakt wurde mit Wasser neutral gewaschen. Dann wurde er mit wäßriger gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach der Entfernung des

Lösungsmittels erhielt man ein Öl aus dl-3-Acetoxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure. Dieses Produkt schmilzt nach geeigneter Reinigung bei etwa 65 —66"C; UV-Absorptionsmaximum in Methanol bei etwa 324 ιτιμ bei einem Molekularex inktionskoefficienten von 31 000; IR-Absorptionsir.axima in Chloroform bei etwa 1738, 1710, 1630 und 1377 cm-'; kernmagnetische Resonanzspitzen in Deuterochloroform bei etwa ö 7,07 (breies Singlett), <5 6,22 (breite Doublette), <5 2,97 (Quartett) und ö 2,13 (Singlett).

Bei Verwendung der äquivalenten Menge dl-2-Formyl-S-hydroxy-S-oxo-l-cydopenten-l-heptansäure im obigen Verfahren erhielt man dl-S-Acetoxy^-formyl-S-OXO-1 -cyclopemen-1 -heptansäure.

In ähnlicher Weise ergab die Verwendung der äquivalenten Menge dl^jS-Formyl-S-hydroxy-S-oxocyclopentan-la-heptansäure im ersten Absatz des unter A beschriebenen Verfahrens dl-3-Acetoxy-2/?-formyl-5· oxocyclopentan-1 a-heptansäure.

B Zu einer Lösung von 5 Teilen d'-3-Hydroxy-5-oxo-2-siyry]-i-cyclopenten-1-heptansäure in 49 Teilen Pyridin wurden 23,2 Teile Propionsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch ließ man dann 5 Tage stehen. Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch in 400 Teile Eiswasser gegossen. Das überschüssige Propionsäureanhydrid wurde zersetzt, 50 Volumteile konzentrierte Salzsäure wurden zugesetzt und die angesäuerte Lösung wurde mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wurde mit einer wäßrigen 2gewichtsprozentigen Salzsäurelösung gewaschen. Dann wurde mit einer wäßrigen 1 gewichtsprozentigen Natriumchloridlösung neutral gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, worauf man ein öliges Produkt erhielt. Dieses Rohprodukt wurde über Kieselsäuregel Chromatographien und mit 5 Volumprozent Essigsäure in Chloroform eluiert. Man erhielt kristalline dl-5-Oxo-3-propionyloxy-2-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure vom Schmelzpunkt etwa 71-72°C; UV-Absorptionsmaximum in Methanol bei etwa 324 ΐημ bei einem Molekularextinktionskoeffizienten von etwa 33 000; 1R-Absorptionsmaxima in Chloroform bei etwa 1738, 1709,1629 und 1377 cm-'; kernmagnetische Resonanzspitzen in Deuterochloroform bei etwa δ 7,05 (Quartett), <5 6,23 (breite Doubletle), 0 2,97 (Quartett) und ö 1,17 (Triplett).

C Die Verwendung der äquivalenten Menge Isobutyrylanhydrid im Verfahren B ergab dl-3-Isobutyryloxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure. Sie schmilzt bei etwa 79 —80⁰C; UV-Absorptionsmaximum in Methanol bei etwa 325 ιτιμ bei einem Molekularextinktionskoeffizienten von etwa 33 000; IR-Absorptionsmaxima in Chloroform bei etwa 1729,1705,1624,1372 und 1150 cm-'; kernmagnetische Resonanzspitzen in Deuterochloroform bei etwa <5 7,04 (Quartett), ö 6,23 (breite Doublette), δ 2,98 (Quartett) und δ 1,20 (Doublette).

D Eine Lösung von 0,19 Teilen Triphenyl-2-oxo-nheptyl-phosphoniumbromid in 75 Teilen Chloroform wurde mit verdünntem wäßrigen Kaliumhydroxid geschüttelt, mit verdünntem wäßrigen Natriumchlorid gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und bei Raumtemperatur unter verringertem Druck getrocknet. Der erhaltene Rückstand aus 0,16 Teilen n-Hexanolylmethylen-triphenylphosphoran wurde mit 0,13 Teilen dl-S-Acetoxy^-formyl-S-oxo-lcyclopenten-1-heptansäuremethylester vereinigt und in 13,2 Teilen Benzol gelöst. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde etwa 24 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt, dann gekühlt und unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit Der Rückstand wurde durch trockene Säulenchromatographie über Kieselsäuregel, das 8 Gewichtsprozent Wasser enthielt, gereinigt, wobei man für die Elution Äthylacetat und Benzol im Volumenverhältnis 1 :4 verwendete. Man erhielt dl-3-Acetoxy-5-oxo-2-(3-oxooct-1 -trans-en-1 -yl)-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester; IR-Absorptions-

Ki maxima in Chloroform bei etwa 1730 und 1592 cm-'.

Die Verwendung der äquivalenten Menge dl-3-Acetoxy-2-formyl-5-oxo-!-cyclopenten-l-heptansaure im obigen Verfahren ergab dl-3-Acetoxy-5-oxo-2-(3-oxooct-1 -trans-en-1 -yl)-1 -cyclopenten-1 -heptansäure.

ι -> E Zu einer Lösung von 12 Teilen dl-3-Acetoxy-5-oxo-2-(3-OXOOCt-I -trans-en-1 -yl)-1 -cyclopenten-1 -heptansäure in 28 Teilen Äthanol, die auf 0—5°C gekühlt wurde, wurde tropfenweise eint· Lösung von 3 Teilen Triethylamin in 275 Teilen Wasser gegeben. Dieses Gemisch wurde tropfenweise unter Kühlen und Rühren mit einer Lösung von 0,32 Teilen Natriumborhydrid und 32 Teilen Wasser versetzt. Es wurde bei etwa 10° C noch etwa 25 Minuten gerührt, dann wurde das Reaktionsgemisch sorgfältig in einen Überschuß wäßriger Zitronensäure gegossen. Die durch Extraktion mit Äther erhaltene organische Lösung wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingeengt. Man erhielt dl-3-Acetoxy-2-(3-hydroxyoct-l-trans-en-1 -yl)-5-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäure.

F Eine Lösung von 8,27 Teilen dl-3-Acetoxy-2-formyl-5-oxo-l-cyclopenlen-l-heptansäure in 150 Volumteilen 50gewichtsprozenliger wäßriger Essigsäure wurde bei 0—5° C etwa 2 Stunden mit 15 Teilen Zinkpulver gerührt. Danach wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat mit etwa 200 Volumteilen gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung verdünnt. Die durch Extraktion des Gemischs mit Äther erhaltene organische Lösung wurde mit einer wäßrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der erhaltene Rückstand wurde mit n-Hexanoylmethylen-triphenylphosphoran (hergestellt aus 27,2 Teilen n-Hexanoylmethyl-triphenylphosphoniumchlorid nach dem Verfahren D) vereinigt und dann in einem Gemisch aus 100 Teilen Dioxan und 440 Teilen Benzol gelöst. Das erhaltene Gemisch wurde unter Stickstoff etwa 5'/2 Stunden auf die Rückflußtemperatur erhitzt und dann unter verringertem Druck zur

so Trockene eingeengt.

Der Rückstand wurde mit Äther extrahiert und der Ätherextrakt mit kalter Salzsäure und dann mit kaltem Wasser gewaschen und schließlich mit kalter wäßriger Kaliumbicarbonatlösung extrahiert. Der alkalische Extrakt wurde durch Zugabe von Zitronensäure angesäuert und das saure Gemisch mit Äther extrahiert. Die Ätherlösung wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Man erhielt dl-3-Acetoxy-5-oxo-2j3-(3-oxooct-l -trans-en-1-yl)-cyclopentan-1 a-heptansäure.

Beispiel 1

Ein Medium aus 5 Teilen handelsüblichem mit c 5 Pankreatin hydrolysiertem Kasein 5 Teilen handelsüblichem mit Pepsin hydrolysiertem tierischen Gewebe, 20 Teilen Dextrose und 1000 Teilen destilliertem Wasser wurde in gleichen Anteilen in 5 Kolben gegeben. Das

Medium wurde durch 20 Minuten langes Erhitzen in einem Autoklaven auf 120⁰C bei einem Druck von 1,034 bar sterilisiert. Zu dem erhaltenen auf 25°C gekühlten sterilen Medium wurden 2 Teile flüssige Kultur von Saccharomyces sp. NRRL Y-7342 gegeben. Die Kolben wurden auf einen Rotationsschüttler gegeben, der sich auf einem Kreisumfang von 2,54 cm mit 170 Umdrehungen pro Minute bewegte. Der Mikroorganismus wurde unter diesen Bedingungen etwa 48 Stunden bei 28⁰C gezüchtet. Danach wurde zu jedem Kolben eine Lösung von 0,2 Teilen dI-3-Acetoxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure in 1 Teil Aceton gegeben. Die Inkubation wurde bei starker Belüftung und 230 Umdrehungen pro Minute 68 Stunden fortgesetzt. Dann wurde die Kultur bei einem pH-Wert von 3,2 mit Methylenchlorid extrahiert und das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Das zurückgebliebene Rohprodukt wurde in Äther gelöst und dreimal mit 5gewichtsprozentiger wäßriger Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Bicarbonatextrakte wurden mit Zitronensäure angesäuert und mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Durch Umkristallisation aus einer Mischung von Äthylacetat und Benzol erhielt man reine l-3a- Hydroxy-5-oxo-2-styryl-1 -cyclopenten-l -heptansäure vom Schmelzpunkt etwa 115^rC; die spezifische Drehung in Methanol betrug etwa - 16.7^C.

Die Äthermutterlaugen wurden eingeengt, mit n-Pentan verdünnt und mit wäßriger 5gewichtsprozentiger Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Bicarbonatextrakte wurden mit einer Mischung aus n-Pentan und Methanol im Volumenverhältnis 2,5 : 1 gewaschen. Durch Ansäuern der Bicarbonatlösung mit Zitronensäure und Extraktion mit Äther. Trocknen des Ätherextrakts über wasserfreiem Natriumsulfat und Einengen zur Trockene erhielt man einen öligen Rückstand. Dieser Rückstand wurde über Kieselsäure Chromatographien und nvt Benzol, das steigende Mengen Äthylacetat enthielt, eluiert. Man erhielt l-3j3-Acetoxy-5-oxo-2 stvrvl-l-cvclopenten-i-heptansäure: die spezifische Drehung in Methanol betrug etwa —21.1'.

Beispiel 2

Ein Medium aus 25 Teilen handelsüblichem mit Pankreatin hydrolysiertem Kasein. 25 Teilen handelsüblichem mit Pepsin hydrolysiertem tierischen Gewebe, 100 Teilen Dextrose. 5 Teilen Silikon-Antischaumemulsion und 5000 Teilen destilliertem Wasser wurde in einem nichtrostenden Stahlkessel durch 50 Minuten langes Erhitzen mit Wasserdampf von 1.034 bar auf i2ö"C in einem Autoklaven sterilisiert. Zu dem erhaltenen sterilen auf 25^; C gekühlten Medium wurden 250 Teile einer flüssigen Kultur von Saccharomyces sp. NRRL Y-7342 gegeben. Das Gemisch wurde mechanisch mit 200 Umdrehungen pro Minute gerührt, wobei man sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 4000 Volumteilen pro Minute einleitete. Der Mikroorganismus wurde unter diesen Bedingungen etwa 20 Stunden bei etwa 30^eC gezüchtet Dann wurde eine Lösung von 1 Teil dl-S-Acetoxy-S-oxo^-styryl-l-cyclopenten-1-heptansäure in 10 Teilen Aceton zugefügt Darauf ließ man die Umsetzung etwa 76 Stunden vor sich gehen. Anschließend wurde die Kultur bei einem pH-Wert von etwa 3.1 mit Methylenchiorid extrahiert und das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt Das Rohprodukt wurde in 500 Volumteilen der oberen Phase eines Gemisches gelöst die man durch Schütteln von 1500 Volumteüen Benzol, 500 Volumteilen Methanol und 200 Volumteüen destilliertem Wasser erhalten hatte, und dann mil der unteren Phase dieses Gemisches extrahiert. Die mit der unteren Phase erhaltenen Extrakte wurden vereinigt und eingeengt. Nach der Zugabe von Äthylacetat-Benzol erhielt man l-3a-Hydroxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure, die mit dem Produkt des Beispiels 1 identisch war. Die Mutterlaugen wurden über Kieselsäure chromatographiert und mit Benzol eluiert, das steigende Mengen Äthylacetat enthielt. Man erhielt aufeinander folgend j3-(2-Hydroxyäthyl)-indol und l-3/?-Aceloxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure.

Beispiel 3

Ein Medium aus 1000 Teilen handelsüblichem mit Pankreatin hydrolysiertem Kasein, 200 Teilen handelsüblichem enzymatisch hydrolysiertem Protein, 200 Teilen handelsüblichem autolysiertem Hefeextrakt, 4000 Teilen Dextrose, 100 Teilen Salzsäure, 20 Teilen Silikon-Antischaumemulsion und 200 000 Teilen Leitungswasser wurde in einem nicht-rostenden Slahlkessel gemischt und durch Einleiten von unter Druck stehendem Wasserdampf unter Erzielung einer Temperatur von 120⁰C und einem Endvolumen von etwa 250 000 Teilen sterilisiert. Zu dem erhaltenen sterilen auf 28°C gekühlten Medium wurden 2000 Teile einer flüssigen Kultur von Saccharomyces sp. NRRL Y-7342 gegeben. Dieses Gemisch wurde mechanisch mit 200 Umdrehungen pro Minute gerührt, wobei man sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 000 Volum-Teilen pro Minute einleitete. Der Mikroorganismus wurde unter diesen Bedingungen etwa 25 Stunden bei 28° C gezüchtet. Danach wurde eine Lösung von 49 Teilen dl-3-Acetoxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-lheptansäure in 200 Teilen Aceton zugefügt Die Umsetzung ließ man 30 Stunden vor sich gehen. Dann wurde die Kultur bei einem pH-Wert von 3,8 mit Methylenchlorid extrahiert und das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Das zurückgebliebene Rohproduk' wurde nach dem Verfahren des Beispiels 1 gereinigt. Man erhielt reine l-3a-Hydroxy-5-oxo-2-styryl-1-cyclopenten-l-heptansäure. die mit dem Produkt des Beispiels 1 identisch war.

Beispiel 4

Ein Medium aus 1000 Teilen handelsüblichem mit Pankreatin hydrolysiertem Kasein. 200 Teilen handelsüblichem enzymatisch hydrolysiertem Protein, 200 Teilen handelsüblichem autolysiertem Hefeextrakt 4000 Teilen Dextrose. 100 Teilen Salzsäure. 50 Teilen Siiikon-ÄntiscnaumernuKiori und 200 000 Teilen Leitungswasser wurde in einem nicht-rostenden Stahlkessel mit unter Druck stehendem Wasserdampf auf eine Temperatur von 120⁰C erhitzt und auf ein Endvolumen von etwa 250 000 Teilen gebracht Zu dem erhaltenen sterilen auf 28° C gekühlten Medium wurden 1000 Teile einer flüssigen Kultur von Saccharomyces sp. NRRL Y-7342 gegeben. Das Gemisch wurde mechanisch mit

bo 200 Umdrehungen je Minute gerührt wobei man sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 60 000 Volumteflen je Minute einleitete. Der Mikroorganismus wurde unter diesen Bedingungen etwa 17 Stunden bei etwa 28° C gezüchtet Dann wurde eine Lösung von 44 Teilen

ft5 dl-3-Acetoxy-5-oxo-2-styryi-l -cyclopenten-l -heptansäure in 200 Teile Aceton zugefügt Die biochemische Umwandlung ließ man etwa 53 Stunden vor sich gehen, worauf die Kultur mit Methylenchloriri extrahiert und

das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt wurde. Das zurückgebliebene rohe Material wurde nach dem Verfahren des Beispiels 1 gereinigt. Man erhielt reine l-Sa-Hydroxy-S-oxo^-styryl-l-cyclopenten-lheptansäure, die mit dem Produkt des Beispiels 1 identisch war.

Beispiel 5

Die Verwendung der äquivalenten Menge dl-3-Acetoxy-2-formyl-5-oxo-1-cyclopenten-l-heptansäure im Verfahren des Beispiels 1 ergab l^-Formyl-Sct-hydroxy-5-OXO-1 -cyclopenten-1-heptansäure.

Beispiel 6

Verwendete man im Verfahren des Beispiels 1 die äquivalente Menge dl-3-Acetoxy-2-(a,/?-dihydroxyphenäthyl)-5-oxo-l-cyc!openten-l-heptansäuremethylester, so erhielt man l-2-(a,j3-Dihydroxyphenäthyl)-3a-hydroxy-5-oxo-l-cyclopenten-l-heptansäuremethylester.

Beispiel 7

20

Die Verwendung der äquivalenten Menge dl-3-Acetoxy-2-(3-hydroxyoct-l-trans-en-l-yl)-5-oxo-l-cyclopenten-1-heptansäure im Verfahren des Beispiels 1 ergab l-3a-Hydroxy-2-(3-hydroxyoct-1-trans-en-1-yl)-5-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäure.

Beispiel 8

Verwendete man im Verfahren des Beispiels 1 die äquivalente Menge dl-S-Acetoxy-S-oxo^-styryl-l-cyclopenten-1-heptansäuremethylester, so erhielt man l-3a-Hydroxy-5-oxo-2-styryl-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester.

Beispiel 9

35

Die Verwendung der äquivalenten Menge dl-3-Acetoxy^/S-formyl-S-oxocyclopentan-1 «-heptansäure im Verfahren des Beispiels 1 ergab l-2|3-Formyl-3«-hydroxy-5-oxocyclopentan-1 «-heptansäure.

Beispiel 10

Verwendete man im Verfahren des Beispiels 1 die äquivalente Menge dl-3-Acetoxy-5-oxo-2jS-(3-oxooct-ltrans-en-l-ylj-cyclopentan-la-heptansäure, so erhielt man l-3ce-Hydroxy-5-oxo-2j3-(3-oxooct-1 -trans-en-1 -yl)-cyclopentan-l«-heptansäure.

Beispiel 11

Die Verwendung der äquivalenten Menge dl-5-Oxo-S-propionyloxy^-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure im Verfahren des Beispiels 1 ergab l-3oc-Hydroxy-5-oxo-

50 2-styryl-l-cyclopenten-1-heptansäure, die mit dem Produkt des Beispiels 1 identisch war.

Beispiel 12

Verwendete man im Verfahren des Beispiels 1 die äquivalente Menge dl-S-Isobutyryloxy-S-oxo^-styryl-lcyclopenten-1-heptansäure, so erhielt man l-3cx-Hydroxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-l-heptansäure die mit dem Produkt des Beispiels 1 identisch war.

Beispiel 13

Die Verwendung der äquivalenten Menge dl-3-Acetoxy-5-oxo-2-(3-oxooct-1 -trans-en-1 -yl)-1 -cyclopenten-1-heptansäure im Verfahren des Beispiels 1 ergab l-3a-Hydroxy-5-oxo-2-(3-oxooct-l-trans-en-l-yl)-l-cyclopenten-1 -heptansäure.

Beispiel 14

Verwendete man im Verfahren des Beispiels 1 die äquivalente Menge dl-3-Aceloxy-5-oxo-2-(3-oxooct-ltrans-en-1 -y I)-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester, so erhielt man l-3«-Hydroxy-5-oxo-2-(3-oxooct-l-transen-1 -yl)-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester.

Beispiel 15

Die Verwendung der äquivalenten Menge dl-3-Acetoxy-2-formyl-5-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester im Verfahren des Beispiels 1 ergab 1-2- Formyl-3«-hydroxy-5-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäuremethylester.

Beispiel 16

Saccharomyces sp. NRRL Y-7342 wurde in einem Nährmedium 24 Stunden nach dem Verfahren des Beispiels 3 gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann wieder in Kaliumphosphatpufferlösung beim pH-Wert 6 suspendiert. Die Zellensuspension wurde in Gegenwart von Glasperlen Schallwellen ausgesetzt, wobei man sie durch Eintauchen in ein Eisbad auf 4° C hielt. Nach dieser Behandlung wurde die Suspension zur Entfernung von Zellbruchstücken zentrifugiert Zu der überstehenden Flüssigkeit wurden 49 Teile feinst zerkleinerte dl-3-Acetoxy-S-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-1-heptansäure gegeben und das erhaltene Gemisch wurde 12 Stunden unter Rühren auf 30⁰C gehalten. Dann wurde mit Zitronensäure auf pH 4 eingestellt und mit Methylenchlorid extrahiert Anschließend wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt und der rohe Rückstand nach dem Verfahren des Beispiels 1 gereinigt Auf diese Weise erhielt man reine l-3ix-Hydroxy-5-oxo-2-styryl-l-cyclopenten-1-heptansäure, die mit dem Produkt des Beispiels 1 identisch war.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 2-substhuierten-3ahydroxy-5-oxo-1 -cyclopenten-1 -heptansäurederivaten der allgemeinen Formel

(C HJ₆CO OR

OH

in der R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen und R' ein Styryl-, Λ,/S-Dihj'droxyphenäthyl-, FormyJ-, 3-Oxooct-]-en-1-yl- oder 3-Hydroxyoci-l-en-l-yl-rest ist, und die unterbrochene Linie anzeigt, daß sich in 1 ^-Stellung auch eine Doppelbindung befinden kann, wobei, wenn die 1 (2)-Stellung gesättigt ist, der Substituent-(CH₂)6COOR die «-Konfiguration und der Substituent R' die jS-Konfiguration besitzt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel

(CH₂)₆COOR

OR

in der R, R' und die unterbrochene Linie die oben angegebene Bedeutung haben, R" ein Acylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist und die Wellenlinie ein racemisches Gemisch anzeigt, mit Saccharomyces sp. NRRL Y-7342 oder mit dessen Enzymen behandelt.

Die Erfindung betrifft ein stereospezifisches mikrobiologisches Verfahren zur Hydrolyse von 2-subst.-3-Acyloxy-5-oxo-l-cyclopenten-1-heptansäuren und deren Estern und verwandten Verbindungen unter Bildung von Verbindungen der allgemeinen Formel

(CH₂)₆COOR

OH

in der R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen und R' ein Styryl-, a,J?-Dihydroxyphenälhyl-, Formyl-, 3-Oxooct-i-en-l-yl- oder 3-HydroxyocM-en-i-yl-rest ist, und die gestrichelte Linie anzeigt, daß sich in 1 (2)-Stellung auch eine Doppelbindung befinden kann, wobei, wenn die 1 (2)-Stellung gesättigt ist, der Substituent-(CH₂)6COOR die α-Konfiguration und der Substituent R' die ^-Konfiguration einnimmt Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine racemische Verbindung der allgemeinen Formel