Verfahren zur Darstellung von ILetosteroiden. Die Dehydrierung von Steroiden mit,de- hydrierbaren Hydroxylgruppen zu den ent sprechenden Ketos teroiden auf chemischem Weg ist bekannt. Es wurde nun gefunden, dass man diese Reaktion mit Vorteil auch auf biochemischem Wege durchführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Verfahren zur Darstellung von Ketosteroiden durch Dehydrierung von de- hydrierbare. Hydroxylgruppen enthaltenden Steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass ein biochemischer Wasserstoffaaceptor den akti vierten Wasserstoff der zu dehydrierenden Hy droxylgruppen aufnimmt.
Für die Durchführung des Verfahrens kann man sich der Hilfe gewisser Mikro organismen, zum Beispiel der Hilfe von Bakterien oder von Schimmelpilzen bezw. der Hilfe von hieraus erhältlichen Enzymen, be dienen. Von den Bakterien seien zum Beispiel genannt dieBakterien derAcetobactergruppe, insbesondere des Baeterium (Acetobacter) Pasteurianum, ferner Bakterien wie Micro- coccus oblongus, sowie Sorbosebakterien;
von den Schimmelpilzen können .gewisse As pergillaceen mit Vorteil verwendet werden.
Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von sogenannter "verarmter" Hefe erwiesen, wie sie zum Beispiel nach Wieland, "Annalen der Chemie", Bd. 492, S. 183 ff., durch Schütteln von Hefesuspen sionen in Toluolwasser mit Sauerstoff erhält lich ist.
Die biochemische Dehydrierung wird zweckmässig unter aeroben Bedingungen oder in Gegenwart von sekundären Wasserstoff acceptoren, wie Methylenblau, Chinon oder dergleichen durchgeführt.
Zu den als Ausgangsmaterialien für die biochemische Dehydrierung in Betracht kom menden Steroidverbindungen gehören zum Beispiel die dehydrierbare Hydroxylgruppen enthaltenden Sterine und Gallensäuren sowie Abbauprodukte derselben, dehydrierbare Hydroxylgruppen enthaltende Verbindungen vom Typ des- Cortins und der tierischen. und pflanzlichen Herzgifte.
Weiterhin können dehydrierbare Hydroxylgruppen enthaltende Verbindungen@derPregnanreihe als Ausgangs materialien verwendet werden sowie dehy- drierbare Hydroxylgruppen enthaltende Ver bindungen der Oestrau- und Androstanreihe. Von den zuletzt genannten seitenkettenfreien Verbindungen seien zum Beispiel Verbindun gen wie Oes:
tratriod, Octahydrooestron, sowie die ungesättigten Verbindungen der Andro- stanreihe, die Androstanverbindungen De- hydroandrosteron und Androstend:iol, beson ders angeführt.
Sind im Ausgangsmaterial ausser der oder den zu dehydrierenden Hydroxylgruppen noch andere dehydrierbare Hydroxylgruppen enthalten., so kann man diese, falls erforder lich, vor dem Angriff der biochemischen De- hydrierungsmittel schützen.
<I>Beispiel 1:</I> Als Nährlösung für die Bakterien wurde ungehopfte Bierwürze für Lagerbier verwen- den. Der Maltosegehalt der Würze wurde be stimmt und durch Verdünnen mit Wasser auf einen Gehalt von etwa 4/10 gebracht. Die Nährlösung wurde dann nach Zusatz von Calciumcarbonat 20 Minuten bei<B>115'</B> im Autoklaven erhitzt und nach dem Abkühlen klar filtriert. Die erneut unter Druck er hitzte Nährlösung wurde darauf in sterile ge räumige Petrischalen gefüllt und mit dem Bacterium Pasteurianum beimpft.
Nach drei tägigem Stehen bei Zimmertemperatur wurde in jede Petrischale, die<B>300</B> cm' Nährlösung enthielt, eine Lösung von 200 mg Dehydro- androsteron in 15 cm' Äthylalkohol vorsich tig hinzugegeben. Nach dreitägigem Stehen wurde mit Äther extrahiert, die ätherische Lösung gewaschen, getrocknet und ver dampft.
Der Rückstand wurde dann zur Ent fernung des unveränderten Dehydroandro- sterons vier Stunden in absolutem Pyridin mit Phthalsäureanhydrid behandelt, das Re aktionsgemisch in Wasser gegossen, mit. Äther extrahiert und das Pyridin durch Wa schen mit säurehaltigem Wasser entfernt.
Der saure Phthalsäureester des Dehydroan- drosterons liess sich dann mit Alkali ab trennen, und die ätherische Lösung hint,3rliess nach dem Verdampfen ein Kristallisat, das mit sä.tirehaltigem lIethanol behandelt wurde und naeh dem Umkristal.lisieren aus Hexan Androstendion vom Drehwert
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und Fp. <B>173'</B> ergab.
<I>Beispiel 2:</I> Ebenso wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde in einem weiteren Versuch Androsten- diol-monopropionat-17 der Oxydation unter worfen. und zwar wurden 300 mg dieses Pro duktes (Fp. 146 ;
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für eine Bakterienkultur mit 300 cm' Sub strat benutzt. Nach viertägigem Stehen bei Zimmertemperatur wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet, auch das unver änderte Monopropionat als saurer Phthal- Aureester entfernt.
Das nae.h der Isomerisa- tion verbleibende Testosteronpropionat wurde dann aus Hexan kristallisiert Tina hatte fol gende Daten:
Fp. 121 ;
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Beispiel <I>3:</I> Auf 1 Litereiner Nährlösung von der Zu sammensetzung:<B>1%</B> P'epton, 0,2 aö Amnio- niumbiphosphat, 0,1 ö Kaliumbiphosphat, 0,025% 1llagnnesiumpliosphat werden Sor- bosebakterien zum gutenWachstum gebracht.
Dann werden zu dieser Kulturlösung por- tionsweise 10 cm' einer 2 % igen Lösung von Cholesterin .in Alkohol gegeben. Nach länge rem Stehen wird das gesamte Reaktions gemisch mit Äther extraliiert. Die Ätherlö sung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft.. Der Rückstand. wird darauf in iNlethanol mit Semic@irbazidacetat umge setzt. Dabei tritt Abscheidung von Choleste- nonsemica.rbazon ein.
Das Semicarbazon lie fert nach der Spaltung das Cholestenon mit den Daten:<B>F p.</B> 84-81 ;
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Die Ausbeute beträgt 29/o. <I>Beispiel</I> .l: 8 g Hefe (Mailand flockige Fermente) werden in 30 cm' Wasser suspendiert und mit 10 cni \ n/.; Na@HPO,-Lösung und 10<B>cm'</B> ni, $X2P04-Lösung versetzt. Die Suspension wird 20 Stunden lang in Sauerstoffatmo sphäre bei 32 geschüttelt;
dann werden 190 mg Androstendiol, in 30 cm' Wasser sus pendiert, hinzugefügt und anschliessend wird die Mischung noch weitere 47 Stunden in Sauerstoffatmospä.re geschüttelt. Hiernach wird das Reaktionsgemisch mit Äther extra- hiert; die ätherische Lösung wird mit Was ser, Natronlauge, nj, Salzsäure und wiederum mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die ätherische Lö sung zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in 30 cm' Alkohol gelöst, mit 3 g Eisessig und 1.5 g P. Rea genz (Girard, Helv. Chem. Acta 19, 1095, 1936) versetzt und eine Stunde unter Rück fluss zum Sieden erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Ganze in 140 cm' Wasser, 60 g Eis und die zur Neutralisierung von 2,7 g Eis- essig notwendige Menge Natriumhydroxyd gegossen. Man extrahiert dann dreimal mit Äther, um den ketogruppenfreien Anteil zu entfernen.
Zur wässerigen Lösung fügt man 20 g 50%ige Schwefelsäure hinzu, wodurch eine Trübung entsteht. Man lässt die Lösung eine Stunde stehen und extrahiert sie dann dreimal mit Äther, wäscht die ätherische Lösung mit Wasser, trocknet sie über Natriumsulfat und dampft den Äther ab. Versetzt man den Rückstand wieder mit etwas Äther, so kann man ihn in kristalliner Form gewinnen.
Nach Umkristallisieren des Rückstandes aus verdünntem Aceton erhält man eine Sub stanz vom F. 168-169', die sich als iden tisch mit Androstendion erweist. Auf Grund der erfindungsgemässen Ver fahren gelingt es, in verhältnismässig ein facher Weise und unter Erzielung verhält nismässig hoher Ausbeuten wertvolle Keto- steroide zu erzielen, die bisher nur auf ver hältnismässig umständlichem Wege bezw. nur in verhältnismässig geringer Ausbeute zu gänglich waren.