DE1909152C3

DE1909152C3 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 11 a-Hydroxy-3-oxo- 8I4-Stero'de"der Pregnanund Androstanreihe

Info

Publication number: DE1909152C3
Application number: DE19691909152
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr. Kieslich; Karl Dr. Petzold
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1969-02-19
Filing date: 1969-02-19
Publication date: 1978-05-03
Also published as: DE1909152A1; CS164849B2; CH540893A; DE1909152B2; GB1302903A; BE746211A; DK122811B; NL7002303A; FR2035596A5

Description

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Die Erfindung betrifft ein neues mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 1 la-Hydroxy-S-oxo-^¹·⁴-Steroiden der Pregnan- und Androstanreihe mittels Mischfermentation.

lla-Hydroxy-3-oxo-J "-Steroide sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung wirksamer Hormonsubstanzen, beispielsweise zur Herstellung wertvoller Corticosteroide, die eine Ketogruppe in 11-Stellung, eine 9λ-Halogen-110-Hydroxyl- oder eine 9a,l 10-Dihalogenstruktur aufweisen. Solche wertvollen Endprodukte sind zum Beispiel:

17,21-Dihydri>xy-l,4-pregnadien-3,l 1,20-trion,
9-Fhior-l 10,17-21-trihydroxy-16«-methyll,4-pregnadien-3,20-dion,

hd

6«£-Difluor-ll/},21-dihydroxy-16«-methyll,4-pregnadien-3,20-dion u. a.

Die Herstellung eines ll«-Hydroxy-3-oxo-d'-⁴-Steroids erfolgt im allgemeinen durch mikrobiologische Hydroxylierung eines 3-Oxo-4⁴-Steroids in U «-Stellung, Isolierung des Fermentationsproduktes aus der Kulturbrühe und Wiedereinsatz zur mikrobiologischen oder auch chemischen Dehydrierung in 1 ^-Stellung.

Man hat auch schon versucht, Hydroxylierung» und Dehydrierungen von Steroiden in einem Prozeß mit Hilfe von Mischkulturen durchzuführen, indem man verschiedene Mikroorganismen gleichzeitig oder nacheinander, im letzteren Fall ohne Isolierung der Zwischenprodukte, auf das Substrat einwirken ließ. So wird im Schweizer Patent 352330 ein Verfahren beschrieben, nach dem man ohne Isolierung der Zwischenprodukte Sauerstoff in eine der Stellungen 11, 17 oder 21 und eine Doppelbindung in 1,2-Stellung mittels Enzyme verschiedener Pilzstimme einfahren so kann. Im deutschen Patent DT-BP 1050335 und im US-Patent 29 93 839 werden 110-Hydroxylierungen mit einem Pilz und U-Dehydrierungen mit einem Bakterium in einer Reaktionsstufe beschrieben.

Diese Mischfermentationen haben jedoch den Nachteil, ganz allgemein nur mißige Ausbeuten zu liefern.

Die schlechten Ausbeuten werden in der Literatur darauf zurückgeführt, daß es in der mikrobiologischen Technik schwierig ist, einen Mikroorganismus in einer Kulturbrühe zu züchten, die mit einem anderen to Mikroorganismus priincubiert war. Man hat auch versucht, die antagonistische Wachstumshemmung des Sekundärstammes durch den Primärstamm dadurch aufzuheben, daß man die Dehydrierung in Gegenwart eines Antibiotikums durchführte (deutsche Patentschrift DT-BP 1093 792). Aber auch diese Methode ist nach den Angaben in der DDR-Patentschrift 33 325 »schwer realisierbar, da die optimal benötigte Konzentration eines Antibiotikums selbst innerhalb analoger Versuchsansätze großen Schwankungen unterliegt«.

Demgegenüber wurde nun gefunden, daß man mittels einer Mischfermentation mit einem Pilz der Gattung Aspergilhis, vorzugsweise Aspergilhis ochraceus, und mit einem Bakterium der Spezies Bacillus lentus, vorzugsweise Bacillus lentus MB 284 (ATCC 13 805) in guten Ausbeuten lIa-Hydroxy-3-oxo-d¹⁴-Steroide aus 3-Oxo--4⁴-Steroiden herstellen kann.

Bei dem erfindungsgemißen Verfahren kann überraschenderweise auf jegliche Maßnahmen zur Unterdrükkung möglicher Wachstumshemmungen verzichtet werden. Es ist weder eine Inhibition des in 1,2-Stellung dehydrierenden Enzyms des Bakteriums durch den Pilz noch eine Beeinflussung der Hydroxylierungsaktivität durch die Bakterienkultur im Falle der Zugabe vor Vollendung der Hydroxylierungsreaktion festzustellen. Bemerkenswert ist die hohe Dehydrierungsgeschwindigkeit, die vermutlich darauf zurückzufuhren ist, daß das Substrat nach vollzogener Hydroxylierung bzw. zu Beginn der zweiten Reaktionsstufe in einem für eine enzymatische Transfonnation idealen Lösungszustand vorliegt.

Besonders überraschend sind jedoch die für mikrobiologische Reaktionen hohen Ausbeuten, die Ober beide Reaktionsstufen bis zu etwa 90% der theoretisch möglichen Ausbeute betragen.

Das Ergebnis überrascht um so mehr, als mit Helminthosporium sativum und Bacillus pulvifaciens bei der 1 l/J-Hydroxylierung und /!'-Einführung nur sehr mäßige Ausbeuten erzielt werden (US-Patent 2993 839).

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Einsparung der Zwischenaufarbeitung. Auf diese Weise werden die mit dem Extraktionsprozeß verbundenen Substanzverluste vermieden.

Die Erfindung betrifft also ein neues mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von lla-Hydroxy-3-oxo-J'-«-Steroiden der Pregnan- und Androstanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein entsprechendes 3-Oxo-4⁴-Steroid mit einem Pilz der Gattung Aspergillus in U «-Stellung hydroxyliert und vor Beendigung oder nach Abschluß der Hydroxylierung das Fermentationsprodukt mit einem Bakterium der Spezies Bacillus lentus in 1,2-Stellung dehydriert

Die als Ausgangsstoffe des erfindungsgemäßen Verfahrens benutzten 3-Oxo-4⁴-Steroide können der Pregnan- und Androstanreihe angehören. So kann man beispielsweise ausgehen von Pregnanderivaten, die in 17-Stelhing die Progesteron-, Hydroxyprogesteron-, Desoxycortkosteron- oder Reichstein-S-Seitenkette enthalten, wobei die Hydroxylgruppen der genannten Seitenketten auch in funktionell abgewandelter Form z.B. als Acylate oder als Bismethylendioxygruppe vorliegen können. Geeignete Ausgangsprodukte sind auch Androstanderivate, die in 17-Stelhing eine Keto-, Hydroxy-, Acyloxy- oder eine 17«-Alkyl-17/i-hydroxy- oder 17/i-acyloxy-Gruppe enthalten können. Ferner können sich Substituenten wie Fluor, Chlor oder eine Methylgruppe in 6-Stellung, eine Methyl- oder eine Methylengruppe in 16-Stelhmg und Fluor in 17<x- oder 21 -Stellung befinden.

Die Durchführung der mikrobiologischen Umwandhing erfolgt nach den dem Fachmann dafür bekannten Methoden. So werden in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Reaktionsbedingungen für die aerobe, submerse Fermentation ermittelt Die Umwandlung des als Lösung oder Suspension zugesetzten

Substrates wird durch dflnnschichtchromatographische Analyse von Probenextrakten verfolgt Nach beendeter Fermentation wird das Verfahrensprodukt mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus der Kuhurbruhe extrahiert und aus dem Extrakt z. B. s durch Eindampfen und bekannte Reinigungsoperationen wie beispielsweise durch Umkristallisieren und/oder Chromatographieren an Sflicagel gereinigt Um möglichst hohe Ausbeuten zu erzielen, fermentiert man bei einem bestimmten pH-Wert, vorzugsweise bei pH 6\2 bis 6Λ Zur besseren pH-Stabilität wird zweckmäßigerweise etwas Puffer in Form von KH₂PO₄ zugesetzt Die Kultur wird vorzugsweise bei etwa 25 bis 30⁰C bebrütet Zur Dehydrierung wird wieder ein bestimmter pH-Wert, vorzugsweise pH 7, eingestellt und die Temperatur bei etwa 30° C gehalten.

Beispiel 1

In einem 250 Liter fassendeu Stahlfermenter werden 117,5 Liter eines flüssigen Nährbodens folgender Zusammensetzung sterilisiert:

1,000% Cornsteep,

1,000% Sojapuder, 0,005% Sojaöl,

0,750% KH₂PO₄,

Leitungswasser,

pH auf 62 eingestellt

Das sterile Medium wird anschließend mit 7JS Liter einer 18 Stunden gewachsenen Vorfermenter-Kultur des Stammes Aspergilius ochraceus beimpft und bei 29⁰C, 128 UpM Rührgeschwindigkeit und 20 m³ steriler Luft/Stunde weiterbebrütet Das Substrat eine steril nitrierte Lösung von 125 g 6a-Fluor-21-acetoxy-16amethyl-4-pregnen-3£0-dion in 1,25 Liter Dimethylsulfoxyd, wird 10 Stunden nach der Beimpfung zugegeben.

Gleichzeitig wird der pH-Wert auf 62—6J5 eingestellt und durch Nachstellen in 4stündigen Abständen während der ersten Reaktionsstufe in diesem Bereich gehalten.

Der Verlauf der mikrobiologischen Umwandlung wird kontrolliert, indem in Zeitabständen von 1 Stunde Proben aus dem Fermenter entnommen werden, die man nach Extraktion mittels Methylisobutylketon durch Dünnschichtchromatographie analysiert (Kieselgel-Fertigplatten der Fa. Merck, System Benzol-Essigester-Eisessig 5+4+1} Nach einer Kontaktzeit von 23 Stunden ist das Substrat bis auf Spuren in 6«-Fluor- so 1 la£l-dihydroxy-l&x-methyl-4-pregnen-3,20-dion umgewandelt

Inzwischen werden in einem zweiten Fermentationsgefäß 124 Liter flüssiges Nährmedium folgender Zusammensetzung sterilisiert: SS

0,2% Hefeextrakt,

1,0% Cornsteep,

0,1% Stärkezucker,

Leitungswasser,

pH auf 7,0 eingestellt

Bebrütung fortgesetzt Der pH-Wert des Substratfermenters wird vor der Vereinigung mit der Bakterienkultur auf 7,0 gebracht und dann nicht mehr nachgestellt

Auch die Dehydrierung wird dünnschichichronwtographisch verfolgt (Kieadgel-Fertigplatten der Fa. Merck, vor dem Auftragen der Probelösung mit HzSQt/Äthanol angesprüht und nochmals aktiviert; System Chloroform-Methanol 96+4}

8 Stunden nach Zugabe der Bacillus-lentus-Kultur ist die Dehydrierung beendet Anschließend filtriert man das Mycel ab und extrahiert das Filtrat in einem Luwesta-Dreistufen-Extraktor mit Methylisobutylketon im Verhältnis 2:1. Den Methylisobutylketon-Extrakt dampft man im Vakuum am Umlaufverdampfer auf 500 ml ein und stellt das Konzentrat über Nacht im Kühlschrank ab.

Das ausgefallene Kristallin wird abgesaugt mit wenig kaltem Methylisobutylketon gewaschen, im Vakuum getrocknet und anschließend analysiert Der Gehalt an reinem &%-Fluor-l Ia^ 1-dihydroxy-16«-methyl-l,4-pregnadien-3,20-dion beträgt 95,4%. Nach Abzug der Substanzverluste durch Probenentnahmen errechnet sich die Reaktionsausbeute über beide Stufen zu 71% der Theorie. Weitere 15,5% der theoretisch möglichen Ausbeute an Umwandlungsprodukt werden durch Säulenchromatographie der Kristallisationsmutterlauge gewonnen und schließlich 23% durch Extraktion des abfiltrierten Mycels isoliert Insgesamt werden bei diesem Einstufen-Prozeß 883% der theoretisch möglichen Reaktionsausbeute wiederge

Die Beimpfung erfolgt mit 1 Liter einer 24 Stunden im Schüttelkolben angezogenen BaciUus-lentus-Kultur. Nach einer Anwachszeit von 10 Stunden wird die gesamte Bakterienkultur in den Substratfermenter, in dem die 11 at-Hydroxylierung nach einer Kontaktzeit von 23 Stunden beendet ist überführt und die wonnen.

Beispiel 2

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 wird 17,21 -Dihydroxy-16«-methyl~4-pregnen-3,20-dion mit Aspergilius achraceus/Bacillus lentus MB 284 incubiert und nach einer Gesamtkontaktzeit von 56 Stunden aufgearbeitet Nach Umkristallisieren des Rohproduktes aus Essigester/Methanol erhält man 11 «,17,21-Trihydroxy-16a-methyl-l,4-pregnadien-3,20-dion (Ausbeute: 79% der Theorie).

Beispiel 3

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 wird 17,21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion mit Aspergilius ochraceus/Bacillus lentus MB 284 incubiert und nach einer Gesamtkontaktzeit von 52 Stunden aufgearbeitet Nach chromatographischer Reinigung des Rohproduktes an einer Kieselgelsäule erhält man 11 «,17,21-Trihydroxy-l,4-pregnadien-3,20-dion in einer Ausbeute von 60% der Theorie.

Beispiel 4

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 wird 17«-Hydroxy-Progesteron mit Aspergilius ochraceus/ Bacillus lentus MB 284 incibiert und nach einer Gesamtkontaktzeit von 61 Stunden aufgearbeitet Nach chromatographischer Reinigung des Rohproduktes an einer Kieselgelsäule erhält man llo,17-Dihydroxy-l,4-pregnadien-3£0-dion in einer Ausbeute von 67% der Theorie.

Beispiel 5

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 wird Testosteron mit Aspergilius ochraceus/Bacillus lentus MB 284 incubiert und nach einer Gesamtkontaktzeit von 41 Stunden aufgearbeitet Nach chromatographischer Reinigung des Rohproduktes an einer Kieselgel-

säule erhält man !!«,n/J-Dihydroxy-l^androstadien-3-on in einer Ausbeute von 52% der Theorie.

Beispiel 6

Unter den Bedingungen des Beispiels 1 wird 21-Hydroxy-6flt,16«-dimethyl-4-pregnen-3iO-dion mit

Aspergillus ochraceus/Badllus lentus MB 284 incubiert uad nach einer Gesamtkontaktzeit von 54 Stunden aufgearbeitet Nach Umkristallisieren des Rohproduktes aus Aceton/Hexan erhält man 1 lac£l-Dihydroxy-6a,16a-dimethyl-l,4-pregnadien-3^0-dion in einer Ausbeute von 70% der Theorie.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von lla-Hydroxy-3-oxo-4^w-Steroiden der Pregnan- und Androstanreihe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein entsprechendes 3-Oxo-.4⁴-Steroid mit einem Pilz der Gattung Aspergilhis in Πα-Stellung hydroxyliert und vor oder nach Abschluß der Hydroxylierung das Fermentationsprodukt mit einem Bakterium der Spezies Bacillus lentus in 1,2-Stellung dehydriert