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Verfahren zur Herstellung von A4-6a-Fluor- oder -Chlor-16 a-alkyl-11
a,17 a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dionen und 41,4-6 a-Fluor oder -Chlor-16 a-alkyl-11a,17
a,21-trihydroxypregnadien-3,20-dionen Gegenstand der Erfindung ist ein ergiebiges
Verfahren zur Herstellung von 44-6a-Fluor- oder -Chlor-16a-alkyl-1 la,17a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dionen
und 41.4-6a-Fluor- oder -Chlor-16a-alkyl-l1a,17a,21-trihydroxy-pregnadien-3,20-dionen
auf mikrobiologischem Wege. Diese Verbindungen sind wichtige Zwischenprodukte zur
Herstellung der entsprechenden 44- bzw. 41.4-6a,9a-Difluor- oder -6a,9a-Dichlor-16a-alkyl-llß,17a,21-trihydroxy-pregnen-
bzw. -pregnadien-3,20-dionen oder der entsprechenden 11-Oxo-Verbindungen, welche
sich durch eine äntiinflammatorische, glucocorticoide, thymolytische, katabole,
antiandrogene und antioestrogene Wirkung auszeichnen.
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Es ist bekannt, daß 44- und 41.4-3-Keto-steroide, z. B. 41 ,4-16a-Methyl-17a,21-dihydroxy-pregnadien-3,20-dion,
in 11-Stellung mikrobiologisch hydroxyliert werden können. Bei den in 6-Stellung
halogenierten Derivaten bereitete jedoch bisher die mikrobiologische Einführung
einer Hydroxylgruppe in die 11-Stellung mittels der bekannten 11-hydroxylierenden
Pilze große Schwierigkeiten.
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Es wurde nun gefunden, daß Enzyme des Pilzes Aspergillus ochraceus
dL4-6a-Fluor- oder -Chlor-16a -alkyl-17a,21-dihydroxy-pregnadien-3,20-dione, insbesondere
4L4-6a-Fluor- oder -Chlor-16a-methyl-17a,21-dihyGroxy-pregnadien-3,20-dion, und
44-6a-
Fluor- oder -Chlor-16a-alkyl-17a,21-dihydroxy-pregnen-3,20-dione, insbesondere
44-6a-Fluor- oder -Chlor- 16a-methyl-17a,21-dihydroxy-pregnen-3,20-dion, in fast
quantitativer Ausbeute zu den entsprechenden lla-Hydroxyverbindungen oxydieren.
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Die Umsetzung der obigen Ausgangsstoffe mit dem genannten Pilz bzw.
den daraus gewonnenen Enzymen kann unter den für die mikrobiologische Hydroxylierung
an sich bekannten Arbeitsmethoden ausgeführt werden. Man inkubiert die Ausgangsstoffe
meistens direkt mit unter aeroben Bedingungen wachsenden Kulturen der genannten
Stämme. Diese werden zweckmäßig bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten
assimiherbaren Kohlenstoff, insbesondere Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische
Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen
brauchbar. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert: Man
züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei
der Antibiotikafabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Die Temperatur
wird vorzugsweise bei 24 bis 27° C gehalten; unter diesen Bedingungen sind die Kulturen
nach 1 bis 2 Tagen voll entwickelt. Man gibt sodann den Ausgangsstoff unter sterilen
Bedingungen, in feiner Dispersion oder Lösung, z. B. in Methanol, Äthanol, Aceton,
Dioxan oder Propylenglykol, entweder in einer Operation oder zeitlich gestaffelt
zu, und inkubiert weiter. Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert gegebenenfalls
das Mycel, z. B. mit Methanol oder Aceton, und gibt den eingedampften Extrakt dem
Kulturfiltrat zu; man extrahiert dieses mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel,
wie Essigester, Chloroform, Äthylenchlorid oder Methylenchlorid, wäscht den Extrakt
mit verdünnter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser und dampft ihn schließlich
ein. Aus dem Rückstand kann das Oxydationsprodukt auf eine der folgenden Arten isoliert
werden: Entweder wird der Rückstand direkt aus einem passenden Lösungsmittel, z.
B. Aceton-Petroläther, Methylenchlorid-Äther oder wäßrigem Methanol, kristallisiert,
oder aber man unterzieht ihn einer der folgenden Vorbehandlungen: Verteilung zwischen
Petroläther und Methanol-Wasser (80:20), wobei sich die Verfahrensprodukte in der
Methanolphase anreichern; Behandlung einer Lösung des Rückstandes in einem passenden
Lösungsmittel, z. B. Methanol, Äthanol oder Aceton, mit
einem Absorptionsmittel,
wie Aktivkohle oder Aluminiumoxyd. Auf diese Weise erhält man die 11 a-Hydroxy-derivate
in reiner Form.
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Die Ausgangsstoffe sind neu: sie lassen sich z. B. nach dem Verfahren
gemäß dem belgischen Patent 587 500 herstellen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den folgenden Beispielen erläutert.
Die Temperaturen sind in Celsiusgraden- angegeben.
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Beispiel 1 Es werden 41 einer Nährlösung hergestellt, die auf 1 1
Leitungswasser folgende Zusätze enthält: 10 g Rohglukose, 10 g stickstoffhaltige
Abfallprodukte der Whiskyherstellung, bekannt unter dem Handelsnamen Distillers
solubles, 5 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat und 10 g Calciumcarbonat. Man stellt
den pH-Wert auf 7,5 ein und sterilisiert die Lösung in einem Schüttelgefäß 30 Minuten
bei 1,1 atü. Nach dem Abkühlen wird die Nährlösung mit einer Kultur von Aspergillus
ochraceus (CIBA 924) beimpft, worauf das Gefäß bei 25° geschüttelt wird. Nach 2
Tagen gibt man zu der gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung
von 1 g 44-6a-Fluor-16a-methyl-17a,21-dihydroxy-pregnen-3,20-dion-21-acetat in 25
cm3 Methanol zu und läßt bei der gleichen Temperatur weitere 48 Stunden schütteln.
Dann trennt man das Mycel ab, suspendiert es 1 Stunde lang in 800 cm3 warmem Aceton
und filtriert es nochmals ab. Hierauf wird das Acetonfiltrat im Vakuum stark eingeengt
und dann mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Man extrahiert die vereinigten Filtrate
dreimal mit je 0,81 Essigester und wäscht dann- die Extrakte mit einer 2o/oigen
Lösung von Natriumhydrogencarbonat und mit Wasser, trocknet sie über Natriumsulfat,
filtriert sie und dampft sie im Vakuum bei 30 bis 35° zur Trockne ein. Es werden
1,4 g eines öligen Rückstandes erhalten, dessen Steroidanteil gemäß papierchromatographischer
Auswertung fast ausschließlich aus A4-6a-Fluor- 16a-methyl-11 a,17a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dion
besteht. Man löst diesen Rückstand in 80 cm3 Methanol und gibt zu der Lösung 100
cm3 Petroläther und 20 cm3 Wasser und schüttelt das Gemisch. Die methanolische Phase
wird hierauf abgetrennt, noch zweimal mit je 35 cm3 Petroläther aufgeschüttelt und
nach der Abtrennung der Petrolätherphase bei 30 bis 35° im Vakuum eingedampft. Man
erhält 980 mg eines teilweise kristallinen Rückstandes. Durch Umkristallisation
aus einem Aceton-Äther-Gemisch erhält man 695 mg reines 44-6a-Fluor-16a-methyl-11
a,17a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dion ; F. 214 bis 217°; 1. R.-Absorptionsbanden
bei 2,79, 2,94, 5,82, 6,01 und 6,15 In analoger Weise erhält man aus dem 41A-6a-Fluor-16a-methyl-17a,21-dihydroxy-pregnadien-3,20-dion-21-acetat
durch Kristallisation des erhaltenen rohen Oxydationsprodukts aus einem Aceton-Äther-Gemisch
das 41,4-6a-Fluor-16a-methyl-11 a,17a, 21-trihydroxy-pregnadien-3,20-dion in farblosen
Kristallen. 1. R.-Absorptionsbanden bei 2,93, 5,81, 6,00, 6,14 und 6,21 #t; Ausbeute
670%.
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Wird das 44-6a-Fluor-16a-methyl-17a,21-dihydroxypregnen-3,20-dion-21-acetat
unter analogen Bedingungen mit Aspergillus niger oder Rhizopus arrhizus umgesetzt,
so erhält man das d4-6a-Fluor-16a-methyl-11a,17a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dion
nur in einer Ausbeute von 38 bzw. 47%.
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Beispiel 2 Man stellt; wie im Beispiel 1 beschrieben, eine 4=1-Kultur
von Aspergillus ochraceus (CIBA 924) her und gibt dazu unter sterilen Bedingungen
eine Lösung von 1 g 44-6a-Fluor-16a-methyl-17a,21-dihydroxy-pregnen-3,20-dion in
25 cm3 Methanol. Nach Inkubation und Aufarbeitung gemäß den Angaben im Beispiel
1 erhält man einheitliches 44-6a-Fluor- l da-methyl- l l a,17a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dion;
Ausbeute 79%.
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Beispiel 3 Verwendet man eine Nährlösung, die auf 11 Leitungswasser
2,6 g Ammoniumtartrat, 2,6 g Weinsäure, 0,4 g Kaliumcarbonat, 0,4 g Ammoniumphosphat,
0,27 g Magnesiumcarbonat, 0,17 g Ammoniumsulfat und 50 g Rohglukose enthält, und
verfährt man im übrigen gemäß den Angaben im Beispiel 1, so erhält man aus A4-6a-Fluor-
16a-methyl-17a,21-dihydroxy-pregnen-3,20-dion oder dem entsprechenden 21-Acetat
das 44-6a-Fluor-16a-methyl-11 a,17a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dion in einerAusbeute
von 80 bzw. 710%.
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Beispiel 4 Werden 21 der im Beispiel 1 beschriebenen Kulturflüssigkeit
mit 0,5 g d4-6a-Chlor-16a-äthyl-17a,21-dihydroxy-pregnen-3,20-dion versetzt und
arbeitet man nach 48stündigem Schütteln das Kulturmedium wie im Beispiel 1 beschrieben
auf, so erhält man das d4-6a-Chlor-16a-äthyl-11 a,17a,21-trihydroxy-pregnen-3,20-dion;
I. R.-Absorptionsbanden bei 2,80, 2,93, 5,83, 6,00 und 6,15 #t; Ausbeute 75%.