DE1568932C

DE1568932C - Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17dion durch mikrobiologischen Abbau

Info

Publication number: DE1568932C
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Koninklijke Nederlandsche Gist en Spiritusfabriek BV
Current assignee: DSM Delft BV
Publication date: 1972-11-16

Description

Zur Herstellung von Steroidhormonen werden natürlich vorkommende Steroide als Ausgangsmaterial verwendet. Es fehlte jedoch an einem Verfahren, Steroide, die in 17-Stellung eine aliphatische Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen enthalten, in einfacher Weise in 17-Ketosteroide umzuwandeln, die als Ausgangsverbindungen für die Herstellung von anderen Steroiden mit androgener, östrogener, anabolischer und konzeptionsverhindernder Wirkung dienen können.

Es war bekannt, daß Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium in der Lage sind, Steroide mit einer aliphatischen Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung, wie Cholesterin, vollständig abzubauen (vgl. Zentralblatt Bakteriologie, II, Abt. 37 [1913], S. 595).

Im Jahre 1942 widmete T a k dem gleichen Phänomen eine Forschungsarbeit, in deren Verlauf er ein Bacterium isolierte, das er Mycobacterium cholesterolicum nannte (vgl. Ant. van Leeuwenhoek, Bd. 8 [1942], S. 32). Danach erschien eine Reihe von anderen Veröffentlichungen über die Einwirkung von Mikroorganismen der Gattungen Proactinomyces, Azotobacter, Flavobacterium, Aerobacter, Pseudomonas, Nocardia und Streptomyces auf Cholesterin.

Bei diesen Verfahren wird Cholesterin vollständig zu Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht abgebaut, und es fallen keine nennenswerten Mengen von Verbindungen mit unversehrtem Steroidgerüst an. Bisweilen wurden 4-Cholesten und 7-Dehydrocholesterin in geringen Mengen gefunden. T a k fand bei seinen Untersuchungen geringe Mengen von 4-Cholesten-3,6-dion.

Beim Abbau von Cholesterin mit einer Nocardia-Art in Gegenwart von 8-Hydroxychinolin gelang es, 3-Keto-bisnor-4-cholensäure, 3-Ketonbisnor-l,4-choladiensäure sowie geringe Mengen von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion nachzuweisen (vgl. Biochemical Journal, Bd. 90 [1964], S. 23P).

Die Einwirkung von Mikroorganismen der Gattungen Nocardia und Mycobacterium auf 1,3,5(10)-Cholestatrien bringt keinen Abbau (vgl. Abstracts of Papers of the 150th Meeting of the American Chemical Society [1965], 13Q). Andererseits wurden 19-Hydroxy-4-cholesten-3-on und 6,19-Oxido-4-cholesten-3-on durch diese Mikroorganismen leicht in östron bzw. 6,19-Oxido-4-androsten-3,17-dion umgewandelt.

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß man die Seitenkette in 17-Stellung von Steroiden unter Ausbildung einer 17-Ketogruppe und Erhaltung des Steroidgerüstes mit Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium abbauen kann, wenn man bestimmte Ausgangssteroide verwendet und die mikrobiologische Umwandlung in Gegenwart eines Inhibitors durchführt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion durch mikrobiologischen Abbau von Steroiden mit einer gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung und einer Sauerstoff-Funktion in 3-Stellung unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Mycobacterium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die mikrobiologische Umwandlung in Gegenwart von Nickel-, Kobalt-, Blei-, Cadmium- oder Selenitionen als Inhibitor durchführt.

Als Ausgangssteroide kommen z. B. Ester von Sterinen, insbesondere Cholesterylbetainchlorid, Cholesterylacetat, Cholesterylhemisuccinat, Sa-Chlorcholestanol, oder auch Sterine, in denen der Α-Ring einen oder mehrere zusätzliche Substituenten enthält, in Frage.

Die Menge des zuzusetzenden Inhibitors hängt von den Umständen ab. Wenn die Konzentration zu gering ist, werden die Steroide vollständig zu Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht abgebaut.

Ist die Konzentration zu hoch, so wird die Umwandlung des Steroids erheblich inhibiert und die Bakterien werden abgetötet. Bei Verwendung von NiSO₄ · 7 H₄O genügt im allgemeinen eine Konzentration von 10 bis 1000 mg pro Liter. Bei Verwendung von Kobaltchlorid, Bleiacetat, Cadmiumsulfat oder Natriumselenit liegt die Konzentration vorzugsweise ebenfalls im vorgenannten Bereich.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Mycobacterium phlei und Mycobacterium butyricum verwendet.

Das Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise folgendermaßen ausgeführt:

Der Mikroorganismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das anorganische oder organische Stickstoffquellen enthält, wie Aminosäuren, Ammoniumsalze, Alkalinitrate oder Erdalkalinitrate. Peptone, , Maisquellwasser, Hefeextrakte, Baumwollsaatmehl, j Sojabohnenmehl oder lösliche Rückstände der Aiko- j holherstellung können ebenso mit Vorteil verwendet I werden. Die Nährmedien brauchen keine assimilier- ! bare Kohlenstoffquelle wie Zucker, Stärke oder mehr- [ wertige Alkohole enthalten, deren Anwesenheit im J übrigen keine nachteilige Wirkung auf den Verlauf j des Verfahrens ausübt. ■ j

Ein für das Verfahren der Erfindung geeignetes ! Nährmedium enthält vorzugsweise außerdem die j üblichen Mengen von Salzen, wie Phosphate, Sulfate, j Alkalichloride und Erdalkalichloride. Die erforderlichen Spurenelemente sind in hinreichenden Mengen dann vorhanden, wenn Leitungswasser verwendet wird.

Wenn als natürliche Stickstoffquelle ein kompliziertes Gemisch wie Maisquellwasser verwendet wird,

so kann der Zusatz von Mineralsalzen meist unterbleiben.

Die Nährmedien werden in üblicher Weise sterilisiert und auf einen pH-Wert von 4,0 bis 8,5 eingestellt. Ein pH-Wert von etwa 7 ist in den meisten Fällen bevorzugt.

Wenn die Bakterien unter konstanter Belüftung in dem Nährmedium sich hinreichend vermehrt haben, kann das Ausgangssteroid z. B. Cholesterin oder /J-Sitosterin, zugegeben werden, entweder gelöst in einem geeigneten Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, oder in Form einer feinen wäßrigen Suspension.

Das Ausgangssteroid wird 0 bis 72 Stunden nach der Beimpfung zugegeben; auch bei späterer Zugabe werden recht gute Resultate erreicht. Die Zugabe des Steroids wird vorzugsweise 24 bis 48 Stunden nach der Beimpfung des Nährmediums vorgenommen, wenn die Mikroorganismen sich hinreichend vermehrt haben. Eine sehr frühe Zugabe, z. B. unmittelbar nach der Beimpfung, ist ebenfalls möglich und ergibt gute Resultate.

Die Umwandlung des Steroids findet im allgemeinen bei konstanter Belüftung bei Temperaturen von 20 bis 45⁰C statt; das Verfahren verläuft jedoch auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen. Die Umwandlung läßt man vorzugsweise bei einer Temperatur vor sich gehen, die die Optimaltemperatur für den betreffenden Mikroorganismus ist. Diese Temperatur liegt im allgemeinen bei etwa 30⁰C. Es ist nicht notwendig, daß Wachstum und Umwandlung bei der gleichen Temperatur vor sich gehen. So kann z. B. der Mikroorganismus zuerst während 24 Stunden bei 26° C gezüchtet werden, und nach Zugabe des Steroids und des Inhibitors wird die Temperatur auf 30° C erhöht.

Die Umwandlung des Steroids nimmt 1 bis 7 Tage in Anspruch; im allgemeinen nimmt die Menge des Endproduktes nach drei Tagen nicht merklich zu.

Wenn als Ausgangssteroide Verbindungen verwendet werden, die im Α-Ring keine weiteren Substituenten enthalten, entsteht als Hauptprodukt l,4-Androstadien-3,17-dion zusammen mit geringen Mengen 4-Androsten-3,17-dion.

Die gebildeten Produkte können aus der Kulturflüssigkeit gewonnen und nach üblichen Methoden weiter gereinigt werden. Nach Vollendung der Fermentierung können sie aus der Kulturflüssigkeit mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Äthylacetat, Methylenchlorid oder Chloroform extrahiert werden. Diese Extrakte werden zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem geeigneten Lösungsmittel umkristallisiert oder wenn nötig z. B. durch Chromatographie und nachfolgende Kristallisation in seine Komponenten getrennt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Anzuchtkultur von Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 70 wird hergestellt durch Überimpfen einer Kultur dieses Bakteriums auf Bouillon-Agar und Inkubieren während drei Tagen bei 30° C in ein Nährmedium, das aus einer Lösung von 10 g Hefeextrakt in 11 Leitungswasser vom pH-Wert 6,8 besteht, das vorher während 30 Minuten bei 110° C sterilisiert worden ist. Das Nährmedium befindet sich in 2 1 fassenden Flaschen, und jede Flasche enthält 500 ml Nährmedium.

Die Kultur wird 48 Stunden bei 30°C auf einer Drehschüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute und einem Hub von 2V₂ cm geschüttelt, wonach die Bakterien sich hinreichend vermehrt haben.

Das Hauptfermentationsmedium wird durch Verdünnen von 5 g Maisquellwasserfiüssigkeit (berechnet als Trockensubstanz) mit Leitungswasser auf 11 und Einstellen der Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 7

ίο mit verdünnter Natronlauge hergestellt. Das Nährmedium wird in drei Flaschen während 30 Minuten bei 110° C sterilisiert. Jede der drei 21 fassenden Flaschen enthält 11 Nährmedium. Die Flaschen werden nun mit jeweils 50 ml der vorgenannten

is Anzuchtkultur beimpft. Dann werden die Flaschen 48 Stunden bei 30° C geschüttelt.

Hierauf werden in jede der Flaschen 1 g Cholesterin in Form einer wäßrigen Suspension gegeben, die durch Vermählen des Steroids unter Zugabe von Wasser erhalten wurde, das 0,1 °/o eines nichtionischen Netzmittels enthielt. Ferner wurde jede Flasche mit einer sterilen wäßrigen Lösung von 750 mg NiSO₄ · 7H₂O versetzt. Diese Menge entspricht 157 mg Nickelionen. Die Flaschen werden nun weiter geschüttelt. Bereits 12 Stunden nach der Zugabe von Cholesterin kann l,4-Androstadien-3,17-dion durch Dünnschichtchromatographie an Silikagel G nachgewiesen werden. Als Lösungsmittel wird ein Gemisch von Chloroform und Äthylacetat im Volumenverhältnis 10:1 verwendet.

Nach 3 Tagen Schütteln wird der Inhalt der drei Flaschen vereinigt und das Gemisch dreimal mit einem Fünftel seines Volumens Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft; der Rückstand wird mit 20 ml siedendem Methanol extrahiert. Aus dem Rückstand können 1,6 g Cholesterin wiedergewonnen werden. Der Methanolextrakt wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 8 ml Benzol aufgenommen. Die Benzollösung wird säulenchromatographisch an 30 g Aluminiumoxid (Al₂O₃ neutral, Aktivität III) gereinigt. Als Lösungsmittel wird ein Gemisch aus Benzol und Aceton (10:1) verwendet. Durch Dünnschichtchromatographie wird festgestellt, in welchen Fraktionen das 1,4-Androstadien-3,17-dion zugegen ist. Diese Fraktionen werden aufgefangen und eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Aceton und Heptan (1: 3) umkristallisiert. Ausbeute 160 mg. Nach nochmaliger Umkristallisation werden 138 mg reines Produkt vom F. 137,5 bis 139°C erhalten. Ausbeute 13,4%» bezogen auf umgesetztes verbrauchtes Cholesterin.

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 wird eine Anzuchtkultur von Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 75-3/53 hergestellt.
Die Hauptfermentation wird in drei 500 ml fas-

^fio senden Flaschen durchgeführt, von denen jede 100 ml des Nährmediums enthält. Auch hier wird die Anzuchtkultur in der gleichen Konzentration, d. h. von 5 % verwendet, bezogen auf das Volumen des Hauptfermentationsmediums. Die Flaschen werden 48 Stunden geschüttelt. Danach wird jede Flasche mit 200 mg. Cholesterin sowie 50 mg NiSO₄ · 7H₂O versetzt und weiter geschüttelt. Nach 3 Tagen enthalten die drei Flaschen zusammen l,4-Androstadien-3,17-dion in

5 6

einer Menge von 188,9 bis 236 mg. Gewöhnlich sind 5 mg Cadmiumsulfat zu jeder der Flaschen gegeben, noch geringe Mengen 4-Androsten-3,17-dion vor- Nach ltägigem Schütteln kann die Anwesenheit von handen. '"' l,4-Androstadien-3,17-dionund4-Androsten-3,17-dion

Die Ausbeute liegt zwischen 42,8 und 53,6 %, durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen bezogen auf eingesetztes Cholesterin. 5 werden. Ferner sind zwei andere unbekannte Flecken

sichtbar, die eine positive Zimmerman-Reaktion B e i s ρ i e 1 3 zeigen.

Die Flaschen enthalten ein Gemisch von 1,4-Andro-

Gemäß Beispiel 2 wird eine Anzuchtkultur von stadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion in einer Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 70 verwendet. io Menge von 29,4 mg. Ausbeute von 10 %, bezogen

Jede Flasche wird mit 400 mg Cholesterin versetzt. auf eingesetztes Cholesterin.
Nach 4 Tagen können 93 mg 1,4-Androstadien-

3,17-dion auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise Beispiel 9

isoliert werden. Die Menge des nicht umgewandelten

Cholesterins beträgt pro Flasche 230 mg. Es werden 15 Das Verfahren des Beispiels 7 wird wiederholt, also mindestens 170 mg Cholesterin in jeder Flasche jedoch werden an Stelle von Kobaltchlorid 50 mg umgewandelt. Die theoretische Ausbeute würde Bleiacetat zu jeder der Flaschen gegeben. Nach 124 mg l,4-Androstadien-3,17-dion betragen. Diese 2 Tagen kann schon eine Menge an 1,4-Androstadien-Zahlen zeigen, daß die Umwandlung in einer Aus- 3,17-dion durch Dünnschichtchromatographie nachbeute von 75%, bezogen auf umgewandeltes Chole- 20 gewiesen werden,
sterin, und von 31,6%) bezogen auf eingesetztes Beisniel 10

Cholesterin, erfolgt.

ή ■ · · · 1 /ι ^^as Verfahren des Beispiels 7 wird wiederholt,

Beispiel 4 jedoch werden an Stelle von Kobaltchlorid 50mg

Gemäß Beispiel 2 wird das Verfahren mit Myco- 25 Natriumselenit zu jeder der Flaschen gegeben. Durch bacteriumbutyricum ATCC 11 314 durchgeführt. Die Dünnschichtchromatographie kann die Anwesenheit Isolierung und Reinigung erfolgt gemäß Beispiel 1. von l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-Es werden 30 mg l,4-Androstadien-3,17-dion in jeder 3,17-dion nachgewiesen werden.
Flasche nach 3tägigem Schütteln erhalten. Die Ausbeute beträgt 20,4 ⁰J₀, bezogen auf eingesetztes Chole- 30 Beispiel 11
sterin.

BeisDiel5 ^^as Verfahren des Beispiels 3 wird wiederholt, an

Stelle von Cholesterin werden jedoch 200 mg 4-Chole-

Gemäß Beispiel 2 wird das Verfahren mit Myco- sten-3-on in jede Flasche gegeben. Nach dreitägigem bacterium phlei, Stamm KNGSF 70 durchgeführt. 35 Schütteln kann an Hand des UV-Absorptionsspek-An Stelle von Cholesterin werden jedoch 400 mg trums die Gegenwart von 25 bis 30 mg 1,4-Andro-/3-Sitosterin in jede Flasche gegeben. Nach 4 Tagen stadien-3,17-dion festgestellt werden. Ausbeute 16,9 werden 37 mg l,4-Androstadien-3,17-dion aus jeder bis 20,2 %, bezogen auf eingesetztes 4-Cholesten-3-on. der Flaschen gemäß Beispiel 1 isoliert. Ausbeute
13,5%. bezogen auf eingesetztes /?-Sitosterin. -40 Beispiel 12

Beispiele _Das γ^^η des Beispiels 3 wird wiederholt, an

Es wird nach dem Verfahren des Beispiels 3 gear- Stelle von Cholesterin werden jedoch 200 mg des

beitet, jedoch werden 400 mg Stigmasterin in jede wasserlöslichen Cholesterylbetainchlorids in jede der

der Flaschen gegeben. Nach 3 Tagen kann durch 45 Flaschen gegeben. Nach 4tägigem Schütteln wird

Dünnschichtchromatographie, wie im Beispiel 1 be- das Produkt auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise

schrieben, l,4-Androstadien-3,17-dion nachgewiesen isoliert und gereinigt. Es werden 20 bis 25 mg 1,4-An-

werden. . . drostadien-3,17-dion und kleine Mengen von 4-Andro-

B ei s pi el 7 sten-3,17-dion erhalten. Ausbeute 18,3 bis 22,9%,

50 bezogen auf eingesetztes Cholesterylbetainchlorid.
• Gemäß Beispiel 3 wird eine Anzuchtkultur von

Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 70 hergestellt, Beispiel 13
wobei an Stelle von 50 mg Nickelsulfat eine gleiche

Menge Kobaltchlorid in jede der Flaschen gegeben Das Verfahren des Beispiels 4 wird wiederholt, an

wird. Nach 2tägigem Schütteln bei 30°C kann 55 Stelle von Cholesterin werden jedoch 200 mg 5a-Chlor-

durch Dünnschichtchromatographie 1,4-Androstadien- cholestanol in jede der Flaschen gegeben. Die Iso-

3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion nachgewiesen lierung und Reinigung erfolgt gemäß Beispiel 1. Es

werden. werden 16,7 mg l,4-Androstadien-3,17-dion und

Beisniel 8 3,9 mg 4-Androsten-3,17-dion erhalten; die Gesamt-

60 ausbeute beträgt 15,3%, bezogen auf eingesetztes

Es wird nach dem Verfahren des Beispiels 7 gear- 5a-Chlorcholestanol. Die gebildeten Produkte ent-

beitet, jedoch werden an Stelle von Kobaltchlorid halten 18,9% 4-Androsten-3,17-dion.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion durch mikrobiologischen Abbau von Steroiden mit einer gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung und einer Sauerstoff-Funktion in der 3-Stellung unter Verwendung eines Mikroorganismum der Gattung Mycobacterium, dadurch gekennzeichnet, daß man die mikrobiologische Umwandlung in Gegenwart von Nickel-, Kobalt-, Blei-, Cadmium- oder Selenitionen als Inhibitor durchführt.