Verfahren zur Herstellung von 11- und 19-Hydroxysteroiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy- und 19-Oxy- steroiden auf enzymatischem Wege. Unter den in 11- Stellung oxydierten Steroiden finden sich verschie dene wichtige Verbindungen, wie z. B. 17-Oxycortico- steron und 17-Oxy-11-dehydrocorticosteron, welche sich in der Medizin als wertvoll erwiesen haben.
An dere in 11 -Stellung oxydierte Steroide, welche direkt in der Medizin nicht verwendet worden sind, können als Zwischenprodukte in der Synthese von solchen wertvollen Verbindungen der genannten Art verwen-. det werden.
Aus diesem Grunde wurde das Gebiet der Oxy dation von Steroiden in 11-Stellung ausgedehnt be arbeitet. Das Studium der biochemischen Oxydation unter Verwendung von durch Mikroorganismen er zeugten Enzymen hat grosses Interesse geweckt. Bei den meisten bisher bekanntgewordenen biochemi schen Methoden wurden Pilze verwendet, welche einer der folgenden Klassen angehören, nämlich Mucorales (Thycomycesklasse), Moniliales (Klasse der Fungi imperfecti) oder Sphaeropsidales (Klasse der Fungi imperfecti).
Es wurde nun gefunden, dass man Steroide in 11- oder 19-Stellung hydroxylieren kann, wenn man das Enzym verwendet, welches durch Pilzsorten aus der Art Corticium (Agaricales, Klasse der Basidomy- cetes) erzeugt wird, wobei man gute Ausbeuten er hält.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher da durch gekennzeichnet, dass man ein in 11- bzw. 19- Stellung unsubstituiertes Steroid der Einwirkung des durch einen Pilz der Gattung Corticium erzeugten Enzyms unterwirft.
In der vorliegenden Beschreibung soll unter Corticium eine Pilzart verstanden sein, welche zur Familie der Thelephoraceae (Agaricaies, Klasse der Basidiomycetes) gehört, wobei man diese Klassifizie rung gemäss A Dictionary of the Fungi , G. C. Ains- worth and G. R. Bisby, publiziert 1954, vornimmt.
Unter den Spezies, welche in der erfindungs gemässen Methode anwendbar sind, sind z. B. zu ver stehen Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto, Corti- cium microsclerotia (Matz) Weber und Corticium pra- ticola Kotila. Die Klassifizierung von Pilzen ist aller dings sehr kompliziert und in manchen Fällen ver zwickt.
So wird das vorgenannte Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto oft auch Hypochnus sasakii Shirai, Corticium Vagum Br. et Cav., Rhizoctonia@ solani Kuhn oder Pellicularia filamentosa (Pat.) Rogers genannt.
Gemäss Rogers (1943) und Exner (1953) sind die oben erwähnten drei Spezies (Corti- cium sasakii, Corticium microsclerotia und Corticium praticola) in der Gattung Pellicularia eingerdnet. Dieser allgemeine Pellicularia wurde allerdings sehr selten durch europäische Taxonomisten verwendet,
wie dies aus der Aufstellung der Gattungen in A Dictionary of the Fungi (1954) hervorgeht, dessen Nomenklatur im vorliegenden Falle zur Anwendung gelangt. In dieser Beschreibung soll daher unter der Gattung Corticium auch die Gattung Pellicularia nach Rogers verstanden sein.
Im übrigen soll in der vor liegenden Beschreibung unter der Gattung Corticium jede Pilzform verstanden sein, welche die Fähigkeit besitzt, in 11- oder 19-Stellung von Steroiden Sauer stoff einzuführen und zur Gattung Corticium gemäss Klassifikation von G. C. Ainsworth und G. R. Bisby gehört, und zwar auch dann, wenn sie nach andern allgemeinen Namen bezeichnet würden.
Zu Corticium gehörende Stämme, welche im er findungsgemässen Verfahren zur Anwendung gelan gen, sind allesamt in bekannten Kulturkollektionen, wie z. B. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Holland, und Institute for Fermentation, Osaka, zu- gänglich. Deren wilde Kulturen lassen sich leicht aus kultivierten Pflanzenerkrankungen herstellen, wie z. B. sklerotischen Erkrankungen und Mehltau auf Reis, Zuckerrohr, Bohnen, Feig-,n usw.
Gemäss vor liegender Erfindung kann man Sauerstoff in die 11- Stellung von Steroiden durch Einwirkung des Enzyms, welches in einem zur Gattung Corticium gehörenden Pilz enthalten ist, einführen. Die Oxydation kann dadurch bewirkt werden, dass man die Steroiden mit einem Stamm eines zur Gattung Corticium gehören den Pilzes oder mit dem aus einem Mikroorganismus erzeugten Enzym in Kontakt bringt.
Die gemäss vorliegender Erfindung zu oxydieren den Steroide sind z. B. Progesteron, 17,21-Dioxy- progesteron, 21-Oxyprogesteron, 1-Dehydroprogeste- ron oder andere Cyclopentanpolyhydrophenanthren- Derivate mit einem oder mehreren Substituenten, wie z.
B. Keto-, Hydroxyl-, Halogen- und Alkylgruppen, an einer oder mehreren Stellungen der 16-Stellungen des Cyclopentan-polyhydrophenanthrenkerns - ausser in 11- und 19-Stellung.
Obzwar man das zu verwendende Enzym als Rohprodukt, das heisst als unreines Produkt, verwen den kann, ist es würschenswert, dasselbe in verhält nismässig reinem Zustand zu verwenden. Die Reini gung des Enzyms kann nach für mikrobiologische Zwecke üblichen Methoden geschehen.
Das Enzym liegt im allgemeinen im Mycelium des zu verwendenden Pilzes vor. Daher kann man sich einer der beiden nachstehenden Methoden bedienen: 1. Ein Stamm von Pilzen wird in einem Medium, enthaltend geeignete Nährmittel, sowie ein zu oxy dierendes Steroid, angeimpft.
2. Ein Stamm von Pilzen wird in einem Nähr medium angeimpft und das erhaltene Mycelium aus dem Nährbouillon isoliert und hierauf mit einem zu oxydierenden Steroid unter geeigneten Bedingungen in Berührung gebracht.
Gemäss den beiden vorgenannten Methoden ge schieht die Inkubation des Mikroorganismus im all gemeinen in einem wässerigen Nährmedium, wie dies bei gewöhnlichen Mikroorganismen der Fall ist. Als Kohlenstoffquelle verwendet man Stärke, Zuckerrohr, Lactose, Dextrin, Glycerin und Maltose, während als Stickstoffquelle verschiedene organische und anorga nische, stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B.
Soja bohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Casein, Hefe, Maiseinweichflüssigkeit, Nitrate, Harnstoff und Ammoniumsalze in Frage kommen. Gewünschtenfalls kann man auch geringe Mengen anorganischer Salze oder Spurenelemente zusetzen.
Erfolgt die Oxydation nach der vorgenannten, ersten Methode, so ist wünschenswert, eine Vor inkubation des Stammes während einer geeigneten Zeitdauer vorzunehmen und hierauf den Inkubations- vorgang in Gegenwart des zu oxydierenden Steroids fortzuführen. Die Dauer der Vorinkubation schwankt je nach Bedingungen, z. B. je nach Art des Stammes und des Mediums, doch werden im allgemeinen zwei bis drei Tage zufriedenstellende Resultate ergeben. Geeignete Temperaturen und pH-Werte für die Vor inkubation sind in den meisten Fällen Werte zwi schen etwa 20 und 30 C und 4-8.
Je nach Bedin gungen können jedoch diese Werte ändern. Es ist auf alle Fälle überaus wichtig, die Vorinkubation derart zu lenken, dass das Enzym in seinen aktivsten Zu stand übergeführt wird.
Der so erhaltene Nährbouillon der Vorinkubation wird hierauf mit einer Suspension oder Lösung des zu oxydierenden Steroids gemischt und die Inkuba tion beispielsweise während weiteren 1-3 Tagen fortgesetzt. Als Lösungsmittel für die Suspension oder die Lösung verwendet man in den meisten Fällen ein wässeriges Lösungsmittel, doch kann man auch in gewissen Fällen ein organisches Lösungsmit tel, z. B. Aceton, Methanol, Äthanol, Äthylenglykol oder Propylenglykol, verwenden. Um die Oxydation einfacher zu gestalten, kann man gewünschtenfalis ein die Dispersion förderndes Mittel, z. B. ein ober flächenaktives Mittel, dem Steroid zusetzen.
Erfolgt die Oxydation nach der obengenannten, zweiten Methode, so wird man den Nährbouillon, in welchem das Enzym hinreichend angereichert wurde, filtrieren, um das Mycelium zu filtrieren, weiches hierauf einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Ringers Lösung, zusammen mit dem zu oxydieren den Steroid zugesetzt wird. In diesem Fall kann man das Steroid gleichfalls in Form einer Suspension oder einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmit tel der vorgenannten Art zusetzen.
Arbeitet man in dieser Weise, so erfolgt die Oxydation in 11-Stellung, wobei man das Reaktions produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert, indem man sich Unterschiede zwischen dem Endprodukt und den Verunreinigungen, z. B. Löslichkeit, Adsorp- tionsfähigkeit, Verteilungskoeffizient zwischen den Lösungsmitteln usw., zunutze macht. Die bequemste Art der Isolierung des Produktes besteht darin, dass man das Reaktionsgemisch mit einem Lösungsmittel extrahiert, welches das Produkt leicht zu lösen ver mag. Als Lösungsmittel verwendet man vorzugsweise chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Chloro form, Methylenchlorid und Essigsäurcester, z. B.
Äthylacetat und Butylacetat.
Im allgemeinen sind die so erhaltenen, in 11- Stellung oxydierten Steroide nicht rein. Sie lassen sich aber nach üblichen Methoden, z. B. durch Um kristallisieren, Chromatographie oder im Gegen stromprinzip, reinigen. Als Lösungsmittel für das Umkristallisieren kann man Alkohole, Aceton, Wasser und chlorierte Kohlenwasserstoffe und als Chromatographiermittel Aluminiumoxyd, Magnesium silikat und Aktivkohle verwenden. Andere Metho den für die Reinigung von Steroiden lassen sich gleichfalls im vorliegenden Falle anwenden.
Beim erfindungsgemässen Verfahren können als Nebenprodukte Steroide entstehen, welche in anderer Stellung als der 11- oder 19-Stellung oxydiert sind. Auch können während der Oxydation in den Aus gangsmaterialien vorhandene Substituenten beein- flusst werden, was allerdings für die Bedeutung der vorliegenden Erfindung keine Rolle spielt, weil sich diese Erfindung lediglich auf die Oxydation der 11- oder 19-Stellung von Steroiden bezieht.
In den folgenden Beispielen handelt es sich bei d-.n Temperaturwerten um nicht korrigierte Werte, während die Analysenwerte in Prozenten angegeben sind.
<I>Beispiel 1</I> Eine Mischung, bestehend aus 30 g Zuckerrohr, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,5g Magnesiumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 40 cm3 Malzextrakt und 250 cm3 20 '/aigem Kartoffelsaft, wird mit Brunnen wasser versetzt, bils 1 Liter Medium hergestellt ist.
Unter Schütteln während 70-80 Stunden wird auf dem Medium ein Stamm von Corticium vagem ge impft und der Inkubation unterworfen. Dann ver setzt man mit einer Lösung von 200 mg 17-Oxy- desoxycorticosteron in 20 em3 Methylalkohol und führt die Inkubation während weiteren 48 Stunden durch. Der aus dem Mycelium abgeschiedne, fil trierte Nährbouillon wird dreimal mit je 300 cm3 Methylenchlorid extrahiert.
Das Mycelium wird dreimal mit heissem Aceton extrahiert und hierauf das Aceton abdestilliert. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst und die Lösung mit dem vor genannten Methylenchloridextrakt vereinigt. Nach dem Waschen mit Wasser wird die vereinigte Lö sung unter vermindertem Druck in einer Stickstoff atmosphäre konzentriert, wobei man 250 mg eines gelben Rückstandes erhält.
Dieser Rückstand wird mit einer Magnesiumsilikatkolonne der Adsorptions- chromatographie unterworfen, worauf man das Pro dukt aus Aceton umkristallisiert, um 75 mg Hydro- cortison vom Smp. 205-207 C zu erhalten.
Das in diesem Beispiel und im Beispiel 3 ver wendete Corticium vagem wurde beim National Institute of Agriculturel Science, Tokyo, Japan, unter der Bezeichnung Corticium vagem Br. et Cav. be zogen.
Dieser Stamm ähnelt jedoch hinsichtlich der mikrobiologischen Eigenschaften dem Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto. <I>Beispiel 2</I> Ein Stamm von Corticium sasakii wird unter Schütteln während 70-80 Stunden auf dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 geimpft und der Inkuba tion unterworfen.
Der aus dem Kulturnährbouillon ausgeschiedene Mycelium wird zweimal mit je 500 cm-' Ringers Lösung gewaschen und hierauf so fort in 1 Liter Ringers Lösung suspendiert, wobei man gleichzeitig eine Lösung von 200 mg 17-Oxy- desoxycorticosteron in 20 cm3 Äthanol zusetzt. Dann wird das Gemisch während 16 Stunden unter Rühren auf 28 C gehalten.
Hierauf extrahiert man sowohl das Mycelium als auch die Ringers Lösung dreimal mit je 500 cm- Äthylacetat. Die Äthylacetat- schicht wird mit einem Fünftel ihres Volumens einer 1 O/uigen Natriumbicarbonatlösung und zweimal nach einander mit Wasser gewaschen. Die Athylacetat- schickt wird unter vermindertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre konzentriert, wobei man 96 mg eines rohen Produktes erhält. Dieses rohe Produkt wird aus Chloroform umkristallisiert, wobei man 54 mg Hydrocortison vom Smp. 205-207 C erhält.
<I>Beispiel 3</I> Einer Mischung, bestehend aus 600 g Zuckerrohr, 10g Kaliumchlorid, 10g Magnesiumsulfat, 20 g Kaliumdihydrogenphosphat und 5000 cm3 Malz extrakt, gibt man Brunnenwasser hinzu, bis ein Me dium von 20 Litern entstanden ist. Hierauf wird ein. Stamm von Corticium vagem auf diesem Medium gezüchtet und in einem Tank während 70 Stunden unter aeroben Bedingungen der Inkubation unterwor fen.
Hierauf versetzt man mit einer Lösung von 15 g 17-Oxy-desoxycorticosteron in 700 cm3 Äthanol und führt die Inkubation während weiteren 24 Stunden durch. Der Mycelium enthaltende Nährbouillon wird mit 30 Liter Äthylacetat extrahiert und die Äthyl- acetatlösurig auf 500 cm3 eingeengt.
Nach dem Wa schen mit 1'11/oiger Natriumbicarbonatlösung wird die Äthylacetatlösung unter vermindertem Druck einge engt, wobei man 16 g eines gelben kristallinen Rück standes erhält. Der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen, wonach man 10,5 g eines rohen Steroids erhält. Dieses besteht aus einem Gemisch von oxy dierten Steroiden, welche eine kleine Menge an un verändertem 17-Oxy-desoxycorticosteron enthält.
Das Gemisch wird mit Chloroform gewaschen, worauf man 3,5g Kristalle erhält, während Verun reinigungen in der Mutterlauge zurückbleiben. Die Kristalle werden aus Methanol umkristallisiert, worauf man 1,2 g an Kristallen A vom Smp. von ungefähr 200 C erhält. Das Methanol wird aus der Mutter lauge, welche von der Umkristallisierung herrührt, abdestilliert und der Rückstand aus Chloroform um kristallisiert, wobei man 2,0 g Kristalle B vom Smp. 190-19811 C erhält.
Die Kristalle A werden aus Methanol wieder holt umkristallisiert, wobei man schliesslich Kristalle erhält, die folgende Eigenschaften aufweisen: Smp. 233-236 C, [a]D + 143 (Äthanol, d.aX 243,2 mA (e, 15 500), empirische Formei C21H3o05.
Analyse ber. C 69,58 H 8,34 gef. C 69,89 H 8,11 Das Diacetat davon schmilzt bei 190-191 C. Der Analysenwert stimmt mit jenem von Trioxyprogeste- ron überein. Somit werden die Kristalle A als eine Steroidverbindung angesehen, welche durch Eintritt einer Hydroxylgruppe in das 17-Oxy-desoxycortico- steron erzeugt wurde.
Die Strukturaufklärung hat gezeigt, dass es sich bei dieser Substanz um 17,19-Dihydroxy-desoxy- corticosteron handelt.
Die Kristalle B wurden aus Methanol wieder holt umkristallisiert und liefern Kristalle folgender Eigenschaften Smp. 212-216 C, [a]D + 120 (Ätha- nol), Ama2, 242 mu (E, 14 400), empirische Former CziHso0s. Analyse her. C 69,58 H 8,34 gef. C 69,36 H 8,27 Das Diacetat davon schmilzt bei 20l-203 C.
[a]D + 120 (Chloroform), nm"1 240 ma (E, 15 000). Analyse her. für C24H3407: C 67,24 H 7,68 gef. C 67,09 H 7,48 Diese Eigenschaften sind beinahe gleich wie jene von Epihydrocortison, dessen Konstanten laut Litera tur die folgenden sind:
Smp. 209-212 C [ab + l17 (Äthanol), Am", 242 ma (±, 14 700), Smp. des Di- acetats 202-203 C, n.",.,, 240 ma (a, 14 900). Das IR-Spektrum dieses Produktes stimmt ebenfalls weit gehend mit jenem von Epihydrocortison überein.
Überdies kann keine Schmelzpunktdepression beob achtet werden, wenn das Diacetat des Produktes mit einer authentischen Probe des Diacetats von Epi- hydrocortison schmilzt.
Aus den obigen Resultaten geht hervor, dass die Kristalle B Epihydrocortison sein dürften. <I>Beispiel 4</I> Ein Stamm von Corticium sasakii wird während 72 Stunden in 1 Liter des gleichen Mediums, wie in Beispiel 1, einer Vorinkubation unterworfen. Dann versetzt man mit einer Lösung von 200 mg Desoxy- corticosteron in 20 cm3 Methanol und lässt die Inku bation während weiteren 48 Stunden unter Schütteln weiter andauern.
Nach Beendigung dieser Periode wird der Nährbouillon in der im Beispiel 1 beschrie benen Weise behandelt, wobei man ungefähr 280 mg eines gelben Rückstandes erhält. Der Rückstand wird in einer Aluminiumoxydkolonne der Chromatogra- phie unterworfen. Die Fraktion, welche das gleiche Verhalten auf dem Papierchromatogramm zeigt wie Corticosteron, wird gesammelt und dieses Produkt hierauf aus einer Mischung von Aceton und Hexan umkristallisiert. Dabei erhält man 60 mg Kristalle vom Smp. 178-180 C,
[a]D + 216 (Äthanol).
Analyse her. für C21H@n04: C 72,80 H 8,73 gef. C 72,76 H 8,55 Diese Eigenschaften stimmen weitgehend überein mit jenen von Corticosteron gemäss Literaturangaben (Smp. 178-180 C, [a]D: 210,5 [Äthanol]). Das gleiche trifft auch zu für das IR-Spektrum.
<I>Beispiel 5</I> Nach der Vorinkubation eines Stammes von Corticium sasakii in 1 Liter de Mediums während 72 Stunden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise versetzt man das Medium mit einer Lösung von 200 mg 1-Dehydro-17-oxy-desoxycorticosteron in 20 cm3 Methylalkohol. Die Inkubation wird während 48 Stunden unter Schütteln weitergeführt. Nach der Inkubation wird der Nährbouillon in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise weiterbehandelt, wobei man 350 mg eines Rückstandes erhält.
Auf Grund des Papierchromatogramms, welches man unter Verwen dung einer Mischung von Propylenglykol und Toluol als Lösungsmittel erhält, darf man den Rückstand als eine Mischung betrachten, welche ausser 1-Dehydro- hydrocortison 3 oxydierte Steroide enthält. Der Rück stand wird auf einer Magnesiumsilikatkolonne chro- matographiert und die 1-Dehydro-hydrocortison ent haltende Fraktion gesammelt. Die so erhaltene rohe Substanz schmilzt bei 223-226 C. Die Ausbeute be trägt 75 mg.
Durch Umkristallisieren der rohen Sub stanz aus Aceton erhält man 40 mg 1-Dehydro- hydrocortison, Smp. 232-236 C (Zers.), [a]D + 100 (Dioxan). Sowohl die UV- als auch IR-Spektren des Produktes stimmen mit einer authentischen Probe der Verbindung ziemlich genau überein.
<I>Beispiel 6</I> Eine Mischung, bestehend aus 30g Kornstärke, 0,5g Kaliumchlorid, 0,5g Magnesiumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat und 250 cm3 20o/oiger Kartoffelsaft, wird mit gewöhnlichem Wasser versetzt, bis man ein Medium von 1 Liter erhalten hat, worauf man das Medium unter Wasserdampfdruck von 1,05 kg,'cm2 während 15 Minuten sterilisiert. Dieses Medium wird dann mit 100 cm3 einer Kultur eines Stammes von Corticium mikrosklerotia versetzt und während 48 Stunden bei 28\ C der Inkubation unter worfen.
Der so erhaltene Nährbouillon wird einer Lösung von 17-Oxy-desoxycorticosteron in 20 cm3 Äthylalkohol zugesetzt und die Inkubation während weiteren 48 Stunden fortgesetzt. Hierauf werden Steroide durch dreimaliges Extrahieren mit je 500 cm3 Äthylacetat aus dem Nährbouillon entnom men und die Äthylacetatiösung nacheinander zuerst mit 200 em3 einer 1 Q/oigen Natriumhydroxydlösung und hierauf zweimal mit 200 cm3 destilliertem Wasser gewaschen.
Die Äthylacetatlösung wird hierauf unter vermindertem Druck in einer Stickstoff atmosphäre eingeengt, wobei man 110 mg eines öligen Rückstandes erhält. Dieser wird in einer Ma gnesiumsilikatkolonne chromatographiert und jener Teil, welcher auf dem Papierchromatogramm dem Hydrocortison entspricht, gesammelt, wobei man ein rohes Steroid erhält. Durch Umkristallisation dieses Produktes aus Aceton erhält man 15 mg Hydrocorti- son, Smp. 205-207 C, [a] D + 162 (Äthanol).
<I>Beispiel 7</I> Ein gemäss Beispiel 1 beschriebenes Medium wird mit Dampf unter einem Druck von 1,05 kgJcm2 während 15 Minuten sterilisiert. Dann wird das Medium mit 100<B>CM 3</B> einer Kultur eines Stammes von Corticium praticola versetzt und während 48 Stunden bei 280 C der Inkubation unterworfen. Die ses Medium wird mit einer Lösung von 100 mg 17-Oxy-desoxycorticosteron in 20 cm3 Äthanol ver setzt und die Inkubationsdauer während weiteren 48 Stunden unter ähnlichen Bedingungen wie jenen, welche oben erwähnt wurden, weitergeführt.
Dann wird der Nährbouillon gemäss Angaben in Beispiel 6 weiterbearbeitet, worauf man einen öligen Rückstand erhält. Aus diesem Rückstand lassen sich beim Ar- beiten gemäss Beispiel 6 3,2 mg Hydrocortison er halten.
<I>Beispiel 8</I> Zu einem Gemisch von 900 g löslicher Stärke, 60 g Ammoniumnitrat, 30 g dibasischem Kalium phosphat, 15 g Ferrochlorid, 15 g Kaliumchlorid, 15g Magnesiumsulfat und 300 cm3 Vitaminlösung wird Leitungswasser zugesetzt, um 30 Liter eines Mediums zu erhalten.
1 Liter der oben verwendeten Vitaminlösung enthält 0,2 mg Biotin, 40 mg Calcium- pantothenat, 0,2 mg Pteroylglutaminsäure, 200 mg Inosit, 40 mg Nicotinamid, 20 mg p-Aminobenzoe- säure, 40 mg Pyrodoxinhydrochlorid,
20 mg Ribo- flavinmononucleotid und 40 mg Thiaminhydrochlo- rid. Zu dem Medium wird eine Portion von etwa <B>10/0</B> einer Kultur eines Stammes von Corticium microsclerotia gegeben und bei 28 C 48 Stunden lang unter Rührung und Belüftung inkubiert. Dann wird eine Lösung von 20 g 4-Pregnen-17a,21-diol- 3,20-dion-21-acetat in 600 cm3 Propylenglykol zu gegeben. Die aerobe Inkubation wird 12 Stunden lang unter Rühren weiter fortgesetzt.
Der so erhal tene Nährbouillon wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 behandelt, um ein rohes Steroid zu liefern. Quantitative papierchromatographische Analyse des rohen Steroids zeigt, dass es etwa 65 %, bezogen auf das Ausgangssteroid, an 4-Pregnen-17a,19,21-triol- 3,
20-dion und etwa 7 bis 8 %, bezogen auf das Aus- gangssteroid, an 4-Pregnen-11f,17a,21-triol-3,20- dion enthält. Umkristallisation des rohen Produktes ergibt 8,4 g 4-Pregnen-17a,19,21-triol-3,20-dion als Kristalle vom Smp. 235-236 C, [a] ri = + 121 (Äthanol). Die Ausbeute beträgt 42,1/o.
In der Mutterlauge von der Umkristallisation be obachtet man das Vorhandensein einer grossen Menge 4-Pregnen-17a,19,21-triol-3,20-dion und einer klei nen Menge 4-Pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 9</I> In der in Beispiel, 8 beschriebenen Weise werden 30 Liter des gleichen Mediums wie in Beispiel 8 hergestellt,
und ein Stamm von Corticium microscle- rotia wird in das Medium geimpft und bei 28 C 48 Stunden lang unter Belüftung und Rührung inku- biert. Dann wird eine Lösung von 15 g Desoxy- corticosteron (4-Pregnen-21-ol-3,20-dion) in 300 cm3 Äthanol zu der Kultur gegeben, und die Inkubation wird 8 Stunden lang aerob fortgesetzt.
Der so erhal tene Kulturbouillon wird mit Äthylacetat extrahiert, und das Äthylacetat wird verdampft. Der Extrakt wird auf einer Aluminiumoxydsäule der Adsorptions- chromatographie unterworfen, und aus der mit Benzol : Äthanol (9 : 1) eluierten Fraktion wird ein rohes Produkt erhalten.
Umkristallisation des rohen Produktes aus Methanol-Aceton-Äther gibt 4-Pregnen- 19,21-diol-3,20-dion vom Smp. 153-156 C. Acety- lierung dieses Produktes mittels des üblichen Ver fahrens liefert das Diacetat desselben (das heisst 19,21-Diacetoxy-4-pregnen-3,20-dion) als Kristalle vom Smp. 122-l24 C, [a118 = + 215 (Chloro form).
Die obigen beiden Produkte zeigen keine Schmelzpunktserniedrigung, wenn sie mit entspre chenden authentischen Proben geschmolzen werden. Ihre IR-Spektren sind in guter übereinstimmung mit denjenigen der authentischen Proben. <I>Beispiel 10</I> Nach der Inkubation von Corticium microsclero- tia wie in Beispiel 8 wird eine Lösung von 12 g 4-Androsten-3,17-dion in 200 cm3 Äthanol zuge geben, und die aerobe Inkubation wird unter Rühren. 8 Stunden lang weiter fortgesetzt.
Der so erhaltene Nährbouillon wird mit Athylacetat extrahiert, und die Äthylacetatlösung wird konzentriert. Der Rück stand wird auf einer Aluminiumoxydsäul'e der Ad- sorptionschromatographie unterworfen, und die Säule wird mit Benzol eluiert. Aus dem Eluat kann ein rohes Produkt vom Smp. 156 C isoliert werden.
Umkristallisation des Produktes aus Aceton-Äther gibt 4-Androsten-19-ol-3,17-dion als Kristalle vom Smp. 165 C, [a]20 = + 180 (Chloroform). Das IR- Spektrum des Produktes ist in guter Übereinstimmung mit demjenigen einer authentischen Probe.
<I>Beispiel 11</I> In ähnlicher Weise wie bei dem in Beispiel 8 be schriebenen Verfahren wird ein Stamm von Corti- cium microsclerotia aerob inkubiert. Dann wird eine Lösung von 20 g Progesteron (4-Pregnen-3,20-dion) in 800 cm3 Propylenglykol zu der Kultur gegeben. Die aerobe Inkubation wird 12 Stunden lang unter Rühren weiter fortgesetzt.
Die Isolierung des ent stehenden Steroids wird wie in Beispiel 10 ausge führt, wobei 4-Pregnen-19-ol-3,20-dion als Kristalle vom Smp. 170-171 C [a]18 = + 175 (Äthanol), <B>A</B> mtOH 242 mA, erhalten werden.
Das Produkt kann in bekannter Weise in das Acetat übergeführt werden, und das Acetat zeigt einen Smp. von 125-126 C, [a]18 = 215 , # nä H 239 mu. <I>Beispiel 12</I> Zu einem Gemisch von 600 g Rohrzucker, 10 g Kaliumchlorid, 10 g Magnesiumsulfat, 20 g dibasi- schem Kaliumphosphat und 5 Liter Malzextrakt wird Wasser zugegeben, um 20 Liter eines Mediums zu erhalten.
Das Medium wird mit einem Stamm von Corticium microsclerotia geimpft und unter Rührung und Belüftung 48 Stunden lang inkubiert. Dann wird eine Lösung von 15 g 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 700 cm3 Propylenglykol zu der Kultur gegeben, und die aerobe Inkubation wird weitere 16 Stunden lang fortgesetzt. Der Nährbouillon wird mit 30 Liter Athylacetat extrahiert, und der Extrakt wird auf 500 cm3 konzentriert.
Das Konzentrat wird mit 1 o/äiget wässriger Natriumbicarbonatlösung gewa schen. Das Äthylacetat wird unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 16 g eines gelben kristalli- nen Rückstandes erhalten werden. Der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen, wobei 10,5 g rohes Steroid, das mit einer kleinen Menge des unveränder ten Ausgangssteroids verunreinigt ist, erhalten werden.
Nach dem Waschen mit Chloroform wird das rohe Steroid aus Methanol umkristallisiert, wobei es 3,0 g bei etwa 200 C schmelzende Kristalle gibt. Weitere Umkristallisation aus Methanol gibt ein kri stallines Produkt vom Smp. 235-236 C.
Analyse: ber. für CziH3,0,: C 69,58 H 8,34 gef.: C 69,46 H 8,35 [a]D = + 123 (Äthanol), UV-Spektrum: A n#oH 242,5 mu, (E 15 500).
Das Produkt wird als 4-Pregnen-17a,19,21-triol- 3,20-dion, das in Beispiel 3 erhalten wurde, identi- fiziert.
Das in üblicher Weise erhaltene Diacetat des Pro duktes schmilzt bei 190 C, und es wird keine Schmelzpunktemiedrigung beobachtet, wenn dieses Diacetat zusammen mit dem in Beispiel 3 erhaltenen Diacetat von 4-Pregnen-17a,19,21-triol-3,20-dion ge schmolzen wird.