Verfahren zur Herstellung von 11- und 19-Hydroxysteroiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy- und 19-Oxy- steroiden auf enzymatischem Wege. Unter den in 11- Stellung oxydierten Steroiden finden sich verschie dene wichtige Verbindungen, wie z. B. 17-Oxycortico- steron und 17-Oxy-11-dehydrocorticosteron, welche sich in der Medizin als wertvoll erwiesen haben.
An dere in 11 -Stellung oxydierte Steroide, welche direkt in der Medizin nicht verwendet worden sind, können als Zwischenprodukte in der Synthese von solchen wertvollen Verbindungen der genannten Art verwen-. det werden.
Aus diesem Grunde wurde das Gebiet der Oxy dation von Steroiden in 11-Stellung ausgedehnt be arbeitet. Das Studium der biochemischen Oxydation unter Verwendung von durch Mikroorganismen er zeugten Enzymen hat grosses Interesse geweckt. Bei den meisten bisher bekanntgewordenen biochemi schen Methoden wurden Pilze verwendet, welche einer der folgenden Klassen angehören, nämlich Mucorales (Thycomycesklasse), Moniliales (Klasse der Fungi imperfecti) oder Sphaeropsidales (Klasse der Fungi imperfecti).
Es wurde nun gefunden, dass man Steroide in 11- oder 19-Stellung hydroxylieren kann, wenn man das Enzym verwendet, welches durch Pilzsorten aus der Art Corticium (Agaricales, Klasse der Basidomy- cetes) erzeugt wird, wobei man gute Ausbeuten er hält.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher da durch gekennzeichnet, dass man ein in 11- bzw. 19- Stellung unsubstituiertes Steroid der Einwirkung des durch einen Pilz der Gattung Corticium erzeugten Enzyms unterwirft.
In der vorliegenden Beschreibung soll unter Corticium eine Pilzart verstanden sein, welche zur Familie der Thelephoraceae (Agaricaies, Klasse der Basidiomycetes) gehört, wobei man diese Klassifizie rung gemäss A Dictionary of the Fungi , G. C. Ains- worth and G. R. Bisby, publiziert 1954, vornimmt.
Unter den Spezies, welche in der erfindungs gemässen Methode anwendbar sind, sind z. B. zu ver stehen Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto, Corti- cium microsclerotia (Matz) Weber und Corticium pra- ticola Kotila. Die Klassifizierung von Pilzen ist aller dings sehr kompliziert und in manchen Fällen ver zwickt.
So wird das vorgenannte Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto oft auch Hypochnus sasakii Shirai, Corticium Vagum Br. et Cav., Rhizoctonia@ solani Kuhn oder Pellicularia filamentosa (Pat.) Rogers genannt.
Gemäss Rogers (1943) und Exner (1953) sind die oben erwähnten drei Spezies (Corti- cium sasakii, Corticium microsclerotia und Corticium praticola) in der Gattung Pellicularia eingerdnet. Dieser allgemeine Pellicularia wurde allerdings sehr selten durch europäische Taxonomisten verwendet,
wie dies aus der Aufstellung der Gattungen in A Dictionary of the Fungi (1954) hervorgeht, dessen Nomenklatur im vorliegenden Falle zur Anwendung gelangt. In dieser Beschreibung soll daher unter der Gattung Corticium auch die Gattung Pellicularia nach Rogers verstanden sein.
Im übrigen soll in der vor liegenden Beschreibung unter der Gattung Corticium jede Pilzform verstanden sein, welche die Fähigkeit besitzt, in 11- oder 19-Stellung von Steroiden Sauer stoff einzuführen und zur Gattung Corticium gemäss Klassifikation von G. C. Ainsworth und G. R. Bisby gehört, und zwar auch dann, wenn sie nach andern allgemeinen Namen bezeichnet würden.
Zu Corticium gehörende Stämme, welche im er findungsgemässen Verfahren zur Anwendung gelan gen, sind allesamt in bekannten Kulturkollektionen, wie z. B. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Holland, und Institute for Fermentation, Osaka, zu- gänglich. Deren wilde Kulturen lassen sich leicht aus kultivierten Pflanzenerkrankungen herstellen, wie z. B. sklerotischen Erkrankungen und Mehltau auf Reis, Zuckerrohr, Bohnen, Feig-,n usw.
Gemäss vor liegender Erfindung kann man Sauerstoff in die 11- Stellung von Steroiden durch Einwirkung des Enzyms, welches in einem zur Gattung Corticium gehörenden Pilz enthalten ist, einführen. Die Oxydation kann dadurch bewirkt werden, dass man die Steroiden mit einem Stamm eines zur Gattung Corticium gehören den Pilzes oder mit dem aus einem Mikroorganismus erzeugten Enzym in Kontakt bringt.
Die gemäss vorliegender Erfindung zu oxydieren den Steroide sind z. B. Progesteron, 17,21-Dioxy- progesteron, 21-Oxyprogesteron, 1-Dehydroprogeste- ron oder andere Cyclopentanpolyhydrophenanthren- Derivate mit einem oder mehreren Substituenten, wie z.
B. Keto-, Hydroxyl-, Halogen- und Alkylgruppen, an einer oder mehreren Stellungen der 16-Stellungen des Cyclopentan-polyhydrophenanthrenkerns - ausser in 11- und 19-Stellung.
Obzwar man das zu verwendende Enzym als Rohprodukt, das heisst als unreines Produkt, verwen den kann, ist es würschenswert, dasselbe in verhält nismässig reinem Zustand zu verwenden. Die Reini gung des Enzyms kann nach für mikrobiologische Zwecke üblichen Methoden geschehen.
Das Enzym liegt im allgemeinen im Mycelium des zu verwendenden Pilzes vor. Daher kann man sich einer der beiden nachstehenden Methoden bedienen: 1. Ein Stamm von Pilzen wird in einem Medium, enthaltend geeignete Nährmittel, sowie ein zu oxy dierendes Steroid, angeimpft.
2. Ein Stamm von Pilzen wird in einem Nähr medium angeimpft und das erhaltene Mycelium aus dem Nährbouillon isoliert und hierauf mit einem zu oxydierenden Steroid unter geeigneten Bedingungen in Berührung gebracht.
Gemäss den beiden vorgenannten Methoden ge schieht die Inkubation des Mikroorganismus im all gemeinen in einem wässerigen Nährmedium, wie dies bei gewöhnlichen Mikroorganismen der Fall ist. Als Kohlenstoffquelle verwendet man Stärke, Zuckerrohr, Lactose, Dextrin, Glycerin und Maltose, während als Stickstoffquelle verschiedene organische und anorga nische, stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B.
Soja bohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Casein, Hefe, Maiseinweichflüssigkeit, Nitrate, Harnstoff und Ammoniumsalze in Frage kommen. Gewünschtenfalls kann man auch geringe Mengen anorganischer Salze oder Spurenelemente zusetzen.
Erfolgt die Oxydation nach der vorgenannten, ersten Methode, so ist wünschenswert, eine Vor inkubation des Stammes während einer geeigneten Zeitdauer vorzunehmen und hierauf den Inkubations- vorgang in Gegenwart des zu oxydierenden Steroids fortzuführen. Die Dauer der Vorinkubation schwankt je nach Bedingungen, z. B. je nach Art des Stammes und des Mediums, doch werden im allgemeinen zwei bis drei Tage zufriedenstellende Resultate ergeben. Geeignete Temperaturen und pH-Werte für die Vor inkubation sind in den meisten Fällen Werte zwi schen etwa 20 und 30 C und 4-8.
Je nach Bedin gungen können jedoch diese Werte ändern. Es ist auf alle Fälle überaus wichtig, die Vorinkubation derart zu lenken, dass das Enzym in seinen aktivsten Zu stand übergeführt wird.
Der so erhaltene Nährbouillon der Vorinkubation wird hierauf mit einer Suspension oder Lösung des zu oxydierenden Steroids gemischt und die Inkuba tion beispielsweise während weiteren 1-3 Tagen fortgesetzt. Als Lösungsmittel für die Suspension oder die Lösung verwendet man in den meisten Fällen ein wässeriges Lösungsmittel, doch kann man auch in gewissen Fällen ein organisches Lösungsmit tel, z. B. Aceton, Methanol, Äthanol, Äthylenglykol oder Propylenglykol, verwenden. Um die Oxydation einfacher zu gestalten, kann man gewünschtenfalis ein die Dispersion förderndes Mittel, z. B. ein ober flächenaktives Mittel, dem Steroid zusetzen.
Erfolgt die Oxydation nach der obengenannten, zweiten Methode, so wird man den Nährbouillon, in welchem das Enzym hinreichend angereichert wurde, filtrieren, um das Mycelium zu filtrieren, weiches hierauf einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Ringers Lösung, zusammen mit dem zu oxydieren den Steroid zugesetzt wird. In diesem Fall kann man das Steroid gleichfalls in Form einer Suspension oder einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmit tel der vorgenannten Art zusetzen.
Arbeitet man in dieser Weise, so erfolgt die Oxydation in 11-Stellung, wobei man das Reaktions produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert, indem man sich Unterschiede zwischen dem Endprodukt und den Verunreinigungen, z. B. Löslichkeit, Adsorp- tionsfähigkeit, Verteilungskoeffizient zwischen den Lösungsmitteln usw., zunutze macht. Die bequemste Art der Isolierung des Produktes besteht darin, dass man das Reaktionsgemisch mit einem Lösungsmittel extrahiert, welches das Produkt leicht zu lösen ver mag. Als Lösungsmittel verwendet man vorzugsweise chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Chloro form, Methylenchlorid und Essigsäurcester, z. B.
Äthylacetat und Butylacetat.
Im allgemeinen sind die so erhaltenen, in 11- Stellung oxydierten Steroide nicht rein. Sie lassen sich aber nach üblichen Methoden, z. B. durch Um kristallisieren, Chromatographie oder im Gegen stromprinzip, reinigen. Als Lösungsmittel für das Umkristallisieren kann man Alkohole, Aceton, Wasser und chlorierte Kohlenwasserstoffe und als Chromatographiermittel Aluminiumoxyd, Magnesium silikat und Aktivkohle verwenden. Andere Metho den für die Reinigung von Steroiden lassen sich gleichfalls im vorliegenden Falle anwenden.
Beim erfindungsgemässen Verfahren können als Nebenprodukte Steroide entstehen, welche in anderer Stellung als der 11- oder 19-Stellung oxydiert sind. Auch können während der Oxydation in den Aus gangsmaterialien vorhandene Substituenten beein- flusst werden, was allerdings für die Bedeutung der vorliegenden Erfindung keine Rolle spielt, weil sich diese Erfindung lediglich auf die Oxydation der 11- oder 19-Stellung von Steroiden bezieht.
In den folgenden Beispielen handelt es sich bei d-.n Temperaturwerten um nicht korrigierte Werte, während die Analysenwerte in Prozenten angegeben sind.
<I>Beispiel 1</I> Eine Mischung, bestehend aus 30 g Zuckerrohr, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,5g Magnesiumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 40 cm3 Malzextrakt und 250 cm3 20 '/aigem Kartoffelsaft, wird mit Brunnen wasser versetzt, bils 1 Liter Medium hergestellt ist.
Unter Schütteln während 70-80 Stunden wird auf dem Medium ein Stamm von Corticium vagem ge impft und der Inkubation unterworfen. Dann ver setzt man mit einer Lösung von 200 mg 17-Oxy- desoxycorticosteron in 20 em3 Methylalkohol und führt die Inkubation während weiteren 48 Stunden durch. Der aus dem Mycelium abgeschiedne, fil trierte Nährbouillon wird dreimal mit je 300 cm3 Methylenchlorid extrahiert.
Das Mycelium wird dreimal mit heissem Aceton extrahiert und hierauf das Aceton abdestilliert. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst und die Lösung mit dem vor genannten Methylenchloridextrakt vereinigt. Nach dem Waschen mit Wasser wird die vereinigte Lö sung unter vermindertem Druck in einer Stickstoff atmosphäre konzentriert, wobei man 250 mg eines gelben Rückstandes erhält.
Dieser Rückstand wird mit einer Magnesiumsilikatkolonne der Adsorptions- chromatographie unterworfen, worauf man das Pro dukt aus Aceton umkristallisiert, um 75 mg Hydro- cortison vom Smp. 205-207 C zu erhalten.
Das in diesem Beispiel und im Beispiel 3 ver wendete Corticium vagem wurde beim National Institute of Agriculturel Science, Tokyo, Japan, unter der Bezeichnung Corticium vagem Br. et Cav. be zogen.
Dieser Stamm ähnelt jedoch hinsichtlich der mikrobiologischen Eigenschaften dem Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto. <I>Beispiel 2</I> Ein Stamm von Corticium sasakii wird unter Schütteln während 70-80 Stunden auf dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 geimpft und der Inkuba tion unterworfen.
Der aus dem Kulturnährbouillon ausgeschiedene Mycelium wird zweimal mit je 500 cm-' Ringers Lösung gewaschen und hierauf so fort in 1 Liter Ringers Lösung suspendiert, wobei man gleichzeitig eine Lösung von 200 mg 17-Oxy- desoxycorticosteron in 20 cm3 Äthanol zusetzt. Dann wird das Gemisch während 16 Stunden unter Rühren auf 28 C gehalten.
Hierauf extrahiert man sowohl das Mycelium als auch die Ringers Lösung dreimal mit je 500 cm- Äthylacetat. Die Äthylacetat- schicht wird mit einem Fünftel ihres Volumens einer 1 O/uigen Natriumbicarbonatlösung und zweimal nach einander mit Wasser gewaschen. Die Athylacetat- schickt wird unter vermindertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre konzentriert, wobei man 96 mg eines rohen Produktes erhält. Dieses rohe Produkt wird aus Chloroform umkristallisiert, wobei man 54 mg Hydrocortison vom Smp. 205-207 C erhält.
<I>Beispiel 3</I> Einer Mischung, bestehend aus 600 g Zuckerrohr, 10g Kaliumchlorid, 10g Magnesiumsulfat, 20 g Kaliumdihydrogenphosphat und 5000 cm3 Malz extrakt, gibt man Brunnenwasser hinzu, bis ein Me dium von 20 Litern entstanden ist. Hierauf wird ein. Stamm von Corticium vagem auf diesem Medium gezüchtet und in einem Tank während 70 Stunden unter aeroben Bedingungen der Inkubation unterwor fen.
Hierauf versetzt man mit einer Lösung von 15 g 17-Oxy-desoxycorticosteron in 700 cm3 Äthanol und führt die Inkubation während weiteren 24 Stunden durch. Der Mycelium enthaltende Nährbouillon wird mit 30 Liter Äthylacetat extrahiert und die Äthyl- acetatlösurig auf 500 cm3 eingeengt.
Nach dem Wa schen mit 1'11/oiger Natriumbicarbonatlösung wird die Äthylacetatlösung unter vermindertem Druck einge engt, wobei man 16 g eines gelben kristallinen Rück standes erhält. Der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen, wonach man 10,5 g eines rohen Steroids erhält. Dieses besteht aus einem Gemisch von oxy dierten Steroiden, welche eine kleine Menge an un verändertem 17-Oxy-desoxycorticosteron enthält.
Das Gemisch wird mit Chloroform gewaschen, worauf man 3,5g Kristalle erhält, während Verun reinigungen in der Mutterlauge zurückbleiben. Die Kristalle werden aus Methanol umkristallisiert, worauf man 1,2 g an Kristallen A vom Smp. von ungefähr 200 C erhält. Das Methanol wird aus der Mutter lauge, welche von der Umkristallisierung herrührt, abdestilliert und der Rückstand aus Chloroform um kristallisiert, wobei man 2,0 g Kristalle B vom Smp. 190-19811 C erhält.
Die Kristalle A werden aus Methanol wieder holt umkristallisiert, wobei man schliesslich Kristalle erhält, die folgende Eigenschaften aufweisen: Smp. 233-236 C, [a]D + 143 (Äthanol, d.aX 243,2 mA (e, 15 500), empirische Formei C21H3o05.
Analyse ber. C 69,58 H 8,34 gef. C 69,89 H 8,11 Das Diacetat davon schmilzt bei 190-191 C. Der Analysenwert stimmt mit jenem von Trioxyprogeste- ron überein. Somit werden die Kristalle A als eine Steroidverbindung angesehen, welche durch Eintritt einer Hydroxylgruppe in das 17-Oxy-desoxycortico- steron erzeugt wurde.
Die Strukturaufklärung hat gezeigt, dass es sich bei dieser Substanz um 17,19-Dihydroxy-desoxy- corticosteron handelt.
Die Kristalle B wurden aus Methanol wieder holt umkristallisiert und liefern Kristalle folgender Eigenschaften Smp. 212-216 C, [a]D + 120 (Ätha- nol), Ama2, 242 mu (E, 14 400), empirische Former CziHso0s. Analyse her. C 69,58 H 8,34 gef. C 69,36 H 8,27 Das Diacetat davon schmilzt bei 20l-203 C.
[a]D + 120 (Chloroform), nm"1 240 ma (E, 15 000). Analyse her. für C24H3407: C 67,24 H 7,68 gef. C 67,09 H 7,48 Diese Eigenschaften sind beinahe gleich wie jene von Epihydrocortison, dessen Konstanten laut Litera tur die folgenden sind:
Smp. 209-212 C [ab + l17 (Äthanol), Am", 242 ma (±, 14 700), Smp. des Di- acetats 202-203 C, n.",.,, 240 ma (a, 14 900). Das IR-Spektrum dieses Produktes stimmt ebenfalls weit gehend mit jenem von Epihydrocortison überein.
Überdies kann keine Schmelzpunktdepression beob achtet werden, wenn das Diacetat des Produktes mit einer authentischen Probe des Diacetats von Epi- hydrocortison schmilzt.
Aus den obigen Resultaten geht hervor, dass die Kristalle B Epihydrocortison sein dürften. <I>Beispiel 4</I> Ein Stamm von Corticium sasakii wird während 72 Stunden in 1 Liter des gleichen Mediums, wie in Beispiel 1, einer Vorinkubation unterworfen. Dann versetzt man mit einer Lösung von 200 mg Desoxy- corticosteron in 20 cm3 Methanol und lässt die Inku bation während weiteren 48 Stunden unter Schütteln weiter andauern.
Nach Beendigung dieser Periode wird der Nährbouillon in der im Beispiel 1 beschrie benen Weise behandelt, wobei man ungefähr 280 mg eines gelben Rückstandes erhält. Der Rückstand wird in einer Aluminiumoxydkolonne der Chromatogra- phie unterworfen. Die Fraktion, welche das gleiche Verhalten auf dem Papierchromatogramm zeigt wie Corticosteron, wird gesammelt und dieses Produkt hierauf aus einer Mischung von Aceton und Hexan umkristallisiert. Dabei erhält man 60 mg Kristalle vom Smp. 178-180 C,
[a]D + 216 (Äthanol).
Analyse her. für C21H@n04: C 72,80 H 8,73 gef. C 72,76 H 8,55 Diese Eigenschaften stimmen weitgehend überein mit jenen von Corticosteron gemäss Literaturangaben (Smp. 178-180 C, [a]D: 210,5 [Äthanol]). Das gleiche trifft auch zu für das IR-Spektrum.
<I>Beispiel 5</I> Nach der Vorinkubation eines Stammes von Corticium sasakii in 1 Liter de Mediums während 72 Stunden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise versetzt man das Medium mit einer Lösung von 200 mg 1-Dehydro-17-oxy-desoxycorticosteron in 20 cm3 Methylalkohol. Die Inkubation wird während 48 Stunden unter Schütteln weitergeführt. Nach der Inkubation wird der Nährbouillon in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise weiterbehandelt, wobei man 350 mg eines Rückstandes erhält.
Auf Grund des Papierchromatogramms, welches man unter Verwen dung einer Mischung von Propylenglykol und Toluol als Lösungsmittel erhält, darf man den Rückstand als eine Mischung betrachten, welche ausser 1-Dehydro- hydrocortison 3 oxydierte Steroide enthält. Der Rück stand wird auf einer Magnesiumsilikatkolonne chro- matographiert und die 1-Dehydro-hydrocortison ent haltende Fraktion gesammelt. Die so erhaltene rohe Substanz schmilzt bei 223-226 C. Die Ausbeute be trägt 75 mg.
Durch Umkristallisieren der rohen Sub stanz aus Aceton erhält man 40 mg 1-Dehydro- hydrocortison, Smp. 232-236 C (Zers.), [a]D + 100 (Dioxan). Sowohl die UV- als auch IR-Spektren des Produktes stimmen mit einer authentischen Probe der Verbindung ziemlich genau überein.
<I>Beispiel 6</I> Eine Mischung, bestehend aus 30g Kornstärke, 0,5g Kaliumchlorid, 0,5g Magnesiumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat und 250 cm3 20o/oiger Kartoffelsaft, wird mit gewöhnlichem Wasser versetzt, bis man ein Medium von 1 Liter erhalten hat, worauf man das Medium unter Wasserdampfdruck von 1,05 kg,'cm2 während 15 Minuten sterilisiert. Dieses Medium wird dann mit 100 cm3 einer Kultur eines Stammes von Corticium mikrosklerotia versetzt und während 48 Stunden bei 28\ C der Inkubation unter worfen.
Der so erhaltene Nährbouillon wird einer Lösung von 17-Oxy-desoxycorticosteron in 20 cm3 Äthylalkohol zugesetzt und die Inkubation während weiteren 48 Stunden fortgesetzt. Hierauf werden Steroide durch dreimaliges Extrahieren mit je 500 cm3 Äthylacetat aus dem Nährbouillon entnom men und die Äthylacetatiösung nacheinander zuerst mit 200 em3 einer 1 Q/oigen Natriumhydroxydlösung und hierauf zweimal mit 200 cm3 destilliertem Wasser gewaschen.
Die Äthylacetatlösung wird hierauf unter vermindertem Druck in einer Stickstoff atmosphäre eingeengt, wobei man 110 mg eines öligen Rückstandes erhält. Dieser wird in einer Ma gnesiumsilikatkolonne chromatographiert und jener Teil, welcher auf dem Papierchromatogramm dem Hydrocortison entspricht, gesammelt, wobei man ein rohes Steroid erhält. Durch Umkristallisation dieses Produktes aus Aceton erhält man 15 mg Hydrocorti- son, Smp. 205-207 C, [a] D + 162 (Äthanol).
<I>Beispiel 7</I> Ein gemäss Beispiel 1 beschriebenes Medium wird mit Dampf unter einem Druck von 1,05 kgJcm2 während 15 Minuten sterilisiert. Dann wird das Medium mit 100<B>CM 3</B> einer Kultur eines Stammes von Corticium praticola versetzt und während 48 Stunden bei 280 C der Inkubation unterworfen. Die ses Medium wird mit einer Lösung von 100 mg 17-Oxy-desoxycorticosteron in 20 cm3 Äthanol ver setzt und die Inkubationsdauer während weiteren 48 Stunden unter ähnlichen Bedingungen wie jenen, welche oben erwähnt wurden, weitergeführt.
Dann wird der Nährbouillon gemäss Angaben in Beispiel 6 weiterbearbeitet, worauf man einen öligen Rückstand erhält. Aus diesem Rückstand lassen sich beim Ar- beiten gemäss Beispiel 6 3,2 mg Hydrocortison er halten.
<I>Beispiel 8</I> Zu einem Gemisch von 900 g löslicher Stärke, 60 g Ammoniumnitrat, 30 g dibasischem Kalium phosphat, 15 g Ferrochlorid, 15 g Kaliumchlorid, 15g Magnesiumsulfat und 300 cm3 Vitaminlösung wird Leitungswasser zugesetzt, um 30 Liter eines Mediums zu erhalten.
1 Liter der oben verwendeten Vitaminlösung enthält 0,2 mg Biotin, 40 mg Calcium- pantothenat, 0,2 mg Pteroylglutaminsäure, 200 mg Inosit, 40 mg Nicotinamid, 20 mg p-Aminobenzoe- säure, 40 mg Pyrodoxinhydrochlorid,
20 mg Ribo- flavinmononucleotid und 40 mg Thiaminhydrochlo- rid. Zu dem Medium wird eine Portion von etwa <B>10/0</B> einer Kultur eines Stammes von Corticium microsclerotia gegeben und bei 28 C 48 Stunden lang unter Rührung und Belüftung inkubiert. Dann wird eine Lösung von 20 g 4-Pregnen-17a,21-diol- 3,20-dion-21-acetat in 600 cm3 Propylenglykol zu gegeben. Die aerobe Inkubation wird 12 Stunden lang unter Rühren weiter fortgesetzt.
Der so erhal tene Nährbouillon wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 behandelt, um ein rohes Steroid zu liefern. Quantitative papierchromatographische Analyse des rohen Steroids zeigt, dass es etwa 65 %, bezogen auf das Ausgangssteroid, an 4-Pregnen-17a,19,21-triol- 3,
20-dion und etwa 7 bis 8 %, bezogen auf das Aus- gangssteroid, an 4-Pregnen-11f,17a,21-triol-3,20- dion enthält. Umkristallisation des rohen Produktes ergibt 8,4 g 4-Pregnen-17a,19,21-triol-3,20-dion als Kristalle vom Smp. 235-236 C, [a] ri = + 121 (Äthanol). Die Ausbeute beträgt 42,1/o.
In der Mutterlauge von der Umkristallisation be obachtet man das Vorhandensein einer grossen Menge 4-Pregnen-17a,19,21-triol-3,20-dion und einer klei nen Menge 4-Pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 9</I> In der in Beispiel, 8 beschriebenen Weise werden 30 Liter des gleichen Mediums wie in Beispiel 8 hergestellt,
und ein Stamm von Corticium microscle- rotia wird in das Medium geimpft und bei 28 C 48 Stunden lang unter Belüftung und Rührung inku- biert. Dann wird eine Lösung von 15 g Desoxy- corticosteron (4-Pregnen-21-ol-3,20-dion) in 300 cm3 Äthanol zu der Kultur gegeben, und die Inkubation wird 8 Stunden lang aerob fortgesetzt.
Der so erhal tene Kulturbouillon wird mit Äthylacetat extrahiert, und das Äthylacetat wird verdampft. Der Extrakt wird auf einer Aluminiumoxydsäule der Adsorptions- chromatographie unterworfen, und aus der mit Benzol : Äthanol (9 : 1) eluierten Fraktion wird ein rohes Produkt erhalten.
Umkristallisation des rohen Produktes aus Methanol-Aceton-Äther gibt 4-Pregnen- 19,21-diol-3,20-dion vom Smp. 153-156 C. Acety- lierung dieses Produktes mittels des üblichen Ver fahrens liefert das Diacetat desselben (das heisst 19,21-Diacetoxy-4-pregnen-3,20-dion) als Kristalle vom Smp. 122-l24 C, [a118 = + 215 (Chloro form).
Die obigen beiden Produkte zeigen keine Schmelzpunktserniedrigung, wenn sie mit entspre chenden authentischen Proben geschmolzen werden. Ihre IR-Spektren sind in guter übereinstimmung mit denjenigen der authentischen Proben. <I>Beispiel 10</I> Nach der Inkubation von Corticium microsclero- tia wie in Beispiel 8 wird eine Lösung von 12 g 4-Androsten-3,17-dion in 200 cm3 Äthanol zuge geben, und die aerobe Inkubation wird unter Rühren. 8 Stunden lang weiter fortgesetzt.
Der so erhaltene Nährbouillon wird mit Athylacetat extrahiert, und die Äthylacetatlösung wird konzentriert. Der Rück stand wird auf einer Aluminiumoxydsäul'e der Ad- sorptionschromatographie unterworfen, und die Säule wird mit Benzol eluiert. Aus dem Eluat kann ein rohes Produkt vom Smp. 156 C isoliert werden.
Umkristallisation des Produktes aus Aceton-Äther gibt 4-Androsten-19-ol-3,17-dion als Kristalle vom Smp. 165 C, [a]20 = + 180 (Chloroform). Das IR- Spektrum des Produktes ist in guter Übereinstimmung mit demjenigen einer authentischen Probe.
<I>Beispiel 11</I> In ähnlicher Weise wie bei dem in Beispiel 8 be schriebenen Verfahren wird ein Stamm von Corti- cium microsclerotia aerob inkubiert. Dann wird eine Lösung von 20 g Progesteron (4-Pregnen-3,20-dion) in 800 cm3 Propylenglykol zu der Kultur gegeben. Die aerobe Inkubation wird 12 Stunden lang unter Rühren weiter fortgesetzt.
Die Isolierung des ent stehenden Steroids wird wie in Beispiel 10 ausge führt, wobei 4-Pregnen-19-ol-3,20-dion als Kristalle vom Smp. 170-171 C [a]18 = + 175 (Äthanol), <B>A</B> mtOH 242 mA, erhalten werden.
Das Produkt kann in bekannter Weise in das Acetat übergeführt werden, und das Acetat zeigt einen Smp. von 125-126 C, [a]18 = 215 , # nä H 239 mu. <I>Beispiel 12</I> Zu einem Gemisch von 600 g Rohrzucker, 10 g Kaliumchlorid, 10 g Magnesiumsulfat, 20 g dibasi- schem Kaliumphosphat und 5 Liter Malzextrakt wird Wasser zugegeben, um 20 Liter eines Mediums zu erhalten.
Das Medium wird mit einem Stamm von Corticium microsclerotia geimpft und unter Rührung und Belüftung 48 Stunden lang inkubiert. Dann wird eine Lösung von 15 g 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 700 cm3 Propylenglykol zu der Kultur gegeben, und die aerobe Inkubation wird weitere 16 Stunden lang fortgesetzt. Der Nährbouillon wird mit 30 Liter Athylacetat extrahiert, und der Extrakt wird auf 500 cm3 konzentriert.
Das Konzentrat wird mit 1 o/äiget wässriger Natriumbicarbonatlösung gewa schen. Das Äthylacetat wird unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 16 g eines gelben kristalli- nen Rückstandes erhalten werden. Der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen, wobei 10,5 g rohes Steroid, das mit einer kleinen Menge des unveränder ten Ausgangssteroids verunreinigt ist, erhalten werden.
Nach dem Waschen mit Chloroform wird das rohe Steroid aus Methanol umkristallisiert, wobei es 3,0 g bei etwa 200 C schmelzende Kristalle gibt. Weitere Umkristallisation aus Methanol gibt ein kri stallines Produkt vom Smp. 235-236 C.
Analyse: ber. für CziH3,0,: C 69,58 H 8,34 gef.: C 69,46 H 8,35 [a]D = + 123 (Äthanol), UV-Spektrum: A n#oH 242,5 mu, (E 15 500).
Das Produkt wird als 4-Pregnen-17a,19,21-triol- 3,20-dion, das in Beispiel 3 erhalten wurde, identi- fiziert.
Das in üblicher Weise erhaltene Diacetat des Pro duktes schmilzt bei 190 C, und es wird keine Schmelzpunktemiedrigung beobachtet, wenn dieses Diacetat zusammen mit dem in Beispiel 3 erhaltenen Diacetat von 4-Pregnen-17a,19,21-triol-3,20-dion ge schmolzen wird.
Process for the production of 11- and 19-hydroxysteroids The present invention relates to a process for the production of 11-oxy- and 19-oxy-steroids by an enzymatic route. Among the steroids oxidized in the 11-position there are various important compounds such. B. 17-oxycorticosterone and 17-oxy-11-dehydrocorticosterone, which have proven to be valuable in medicine.
Other steroids oxidized in the 11-position, which have not been used directly in medicine, can be used as intermediates in the synthesis of such valuable compounds of the type mentioned. be det.
For this reason, the field of oxidation of steroids in the 11 position has been expanded to be worked. The study of biochemical oxidation using enzymes produced by microorganisms has generated great interest. In most of the previously known biochemical methods, fungi were used which belong to one of the following classes, namely Mucorales (Thycomyces class), Moniliales (class of Fungi imperfecti) or Sphaeropsidales (class of Fungi imperfecti).
It has now been found that steroids can be hydroxylated in the 11- or 19-position if the enzyme is used which is produced by types of fungus from the species Corticium (Agaricales, class of the Basidomycetes), with good yields being obtained.
The method according to the invention is therefore characterized in that a steroid which is unsubstituted in the 11- or 19-position is subjected to the action of the enzyme produced by a fungus of the genus Corticium.
In the present description, Corticium is to be understood as a species of fungus belonging to the Thelephoraceae family (Agaricaies, class of Basidiomycetes), this classification being made according to A Dictionary of the Fungi, GC Ainsworth and GR Bisby, published 1954 .
Among the species that are applicable in the fiction, contemporary method are, for. These include, for example, Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto, Corticium microsclerotia (Matz) Weber and Corticium praticola Kotila. The classification of mushrooms is, however, very complicated and in some cases tricky.
The aforementioned Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto is often also called Hypochnus sasakii Shirai, Corticium Vagum Br. Et Cav., Rhizoctonia @ solani Kuhn or Pellicularia filamentosa (Pat.) Rogers.
According to Rogers (1943) and Exner (1953), the three species mentioned above (Corticium sasakii, Corticium microsclerotia and Corticium praticola) belong to the genus Pellicularia. However, this general Pellicularia was very rarely used by European taxonomists,
as can be seen from the list of genres in A Dictionary of the Fungi (1954), whose nomenclature is used in the present case. In this description, the genus Corticium should therefore also be understood to mean the genus Pellicularia according to Rogers.
In addition, in the present description, the genus Corticium should be understood to mean any form of fungus which has the ability to introduce oxygen in the 11- or 19-position of steroids and belongs to the genus Corticium according to the classification of GC Ainsworth and GR Bisby, namely even if they were referred to by other general names.
Strains belonging to Corticium, which gelan conditions in the method according to the invention for use, are all in known culture collections, such as. B. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Holland, and Institute for Fermentation, Osaka. Their wild cultures can easily be produced from cultivated plant diseases such as B. sclerotic diseases and powdery mildew on rice, sugar cane, beans, fig, etc.
According to the present invention, oxygen can be introduced into the 11-position of steroids by the action of the enzyme which is contained in a fungus belonging to the genus Corticium. The oxidation can be brought about by bringing the steroids into contact with a strain of a fungus belonging to the genus Corticium or with the enzyme produced from a microorganism.
According to the present invention to oxidize the steroids are z. B. progesterone, 17,21-dioxy-progesterone, 21-oxyprogesterone, 1-dehydroprogeste- rone or other Cyclopentanpolyhydrophenanthren- derivatives with one or more substituents, such.
B. keto, hydroxyl, halogen and alkyl groups, in one or more positions of the 16-positions of the cyclopentane-polyhydrophenanthrene nucleus - except in the 11- and 19-position.
Although the enzyme to be used can be used as a crude product, that is to say as an impure product, it is worthwhile to use the same in a relatively pure state. The cleaning of the enzyme can be done by methods customary for microbiological purposes.
The enzyme is generally present in the mycelium of the fungus to be used. Therefore one of the following two methods can be used: 1. A strain of mushrooms is inoculated in a medium containing suitable nutrients and a steroid to be oxidized.
2. A strain of mushrooms is inoculated in a nutrient medium and the mycelium obtained is isolated from the nutrient broth and then brought into contact with a steroid to be oxidized under suitable conditions.
According to the two aforementioned methods, the incubation of the microorganism generally takes place in an aqueous nutrient medium, as is the case with ordinary microorganisms. The carbon source used is starch, sugar cane, lactose, dextrin, glycerin and maltose, while various organic and inorganic nitrogen-containing substances such as nitrogen sources are used. B.
Soy bean meal, meat extract, peptone, casein, yeast, corn steep liquor, nitrates, urea and ammonium salts are possible. If desired, small amounts of inorganic salts or trace elements can also be added.
If the oxidation takes place according to the aforementioned, first method, it is desirable to carry out a pre-incubation of the strain for a suitable period of time and then to continue the incubation process in the presence of the steroid to be oxidized. The duration of the preincubation varies depending on the conditions, e.g. Depending on the type of strain and medium, but generally two to three days will give satisfactory results. Suitable temperatures and pH values for the pre-incubation are in most cases values between about 20 and 30 C and 4-8.
However, these values can change depending on the conditions. In any case, it is extremely important to direct the preincubation in such a way that the enzyme is converted into its most active state.
The pre-incubation nutrient broth obtained in this way is then mixed with a suspension or solution of the steroid to be oxidized and the incubation is continued, for example, for a further 1-3 days. In most cases, an aqueous solvent is used as the solvent for the suspension or the solution, but in certain cases an organic solvent can also be used, e.g. B. acetone, methanol, ethanol, ethylene glycol or propylene glycol, use. In order to make the oxidation easier, a dispersion promoting agent, e.g. B. an upper surface-active agent to add the steroid.
If the oxidation is carried out by the above-mentioned second method, the nutrient broth in which the enzyme has been sufficiently enriched will be filtered in order to filter the mycelium, which is then replaced with a suitable solvent, such as B. Ringer's solution, along with which the steroid is added to be oxidized. In this case, the steroid can also be added in the form of a suspension or a solution in a suitable solvent of the aforementioned type.
If you work in this way, the oxidation takes place in the 11-position, the reaction product being isolated from the reaction mixture by looking at differences between the end product and the impurities, e.g. B. solubility, adsorption capacity, partition coefficient between the solvents, etc., makes use of. The most convenient way of isolating the product is to extract the reaction mixture with a solvent which can easily dissolve the product. The solvent used is preferably chlorinated hydrocarbons, such as. B. chloro form, methylene chloride and acetic acid ester, e.g. B.
Ethyl acetate and butyl acetate.
In general, the 11-oxidized steroids thus obtained are not pure. But you can use conventional methods, such. B. by order crystallize, chromatography or in the countercurrent principle, purify. Alcohols, acetone, water and chlorinated hydrocarbons can be used as solvents for recrystallization, and aluminum oxide, magnesium silicate and activated carbon can be used as chromatography agents. Other methods for cleaning steroids can also be used in the present case.
In the process according to the invention, steroids can arise as by-products, which are oxidized in a position other than the 11- or 19-position. Substituents present in the starting materials during the oxidation can also be influenced, but this is irrelevant for the significance of the present invention, because this invention only relates to the oxidation of the 11- or 19-position of steroids.
In the following examples, d-.n temperature values are uncorrected values, while the analytical values are given in percentages.
<I> Example 1 </I> A mixture consisting of 30 g sugar cane, 0.5 g potassium chloride, 0.5 g magnesium sulfate, 1 g potassium dihydrogen phosphate, 40 cm3 malt extract and 250 cm3 20% potato juice is mixed with well water , until 1 liter of medium is produced.
While shaking for 70-80 hours, a strain of Corticium vagem is inoculated on the medium and subjected to incubation. Then a solution of 200 mg of 17-oxydesoxycorticosterone in 20 cubic meters of methyl alcohol is added and the incubation is carried out for a further 48 hours. The filtered nutrient broth separated from the mycelium is extracted three times with 300 cm3 of methylene chloride each time.
The mycelium is extracted three times with hot acetone and the acetone is then distilled off. The residue is dissolved in methylene chloride and the solution is combined with the aforementioned methylene chloride extract. After washing with water, the combined solution is concentrated under reduced pressure in a nitrogen atmosphere to give 250 mg of a yellow residue.
This residue is subjected to adsorption chromatography using a magnesium silicate column, whereupon the product is recrystallized from acetone to obtain 75 mg of hydrocortisone with a melting point of 205-207 ° C.
The Corticium vagem used in this example and in Example 3 was obtained from the National Institute of Agricultural Science, Tokyo, Japan under the name Corticium vagem Br. Et Cav. based.
However, this strain is similar to the Corticium sasakii (Shirai) Matsumoto in terms of microbiological properties. <I> Example 2 </I> A strain of Corticium sasakii is inoculated with shaking for 70-80 hours on the same medium as in Example 1 and subjected to incubation.
The mycelium excreted from the culture broth is washed twice with 500 cm- 'Ringer's solution and then immediately suspended in 1 liter of Ringer's solution, a solution of 200 mg of 17-oxydesoxycorticosterone in 20 cm3 of ethanol being added at the same time. The mixture is then kept at 28 ° C. for 16 hours with stirring.
Then extract both the mycelium and Ringer's solution three times with 500 cm ethyl acetate each time. The ethyl acetate layer is washed with one fifth of its volume of a 10% sodium bicarbonate solution and twice in succession with water. The ethyl acetate is concentrated under reduced pressure in a nitrogen atmosphere to give 96 mg of a crude product. This crude product is recrystallized from chloroform, 54 mg of hydrocortisone with a melting point of 205-207 ° C. being obtained.
<I> Example 3 </I> Well water is added to a mixture consisting of 600 g of sugar cane, 10 g of potassium chloride, 10 g of magnesium sulfate, 20 g of potassium dihydrogen phosphate and 5000 cm3 of malt extract until a medium of 20 liters has formed. Then a. Corticium vagem strain was grown on this medium and incubated in a tank for 70 hours under aerobic conditions.
A solution of 15 g of 17-oxy-deoxycorticosterone in 700 cm3 of ethanol is then added and the incubation is carried out for a further 24 hours. The nutrient broth containing mycelium is extracted with 30 liters of ethyl acetate and the ethyl acetate solution is concentrated to 500 cm3.
After washing with 11% sodium bicarbonate solution, the ethyl acetate solution is concentrated under reduced pressure, 16 g of a yellow crystalline residue being obtained. The residue is washed with petroleum ether, after which 10.5 g of a crude steroid are obtained. This consists of a mixture of oxidized steroids, which contains a small amount of unchanged 17-oxy-deoxycorticosterone.
The mixture is washed with chloroform, whereupon 3.5 g of crystals are obtained, while impurities remain in the mother liquor. The crystals are recrystallized from methanol, whereupon 1.2 g of crystals A with a melting point of about 200 ° C. are obtained. The methanol is distilled off from the mother liquor which originates from the recrystallization and the residue is recrystallized from chloroform, 2.0 g of crystals B having a melting point of 190-19811 C being obtained.
The crystals A are repeatedly recrystallized from methanol, which finally results in crystals which have the following properties: mp 233-236 C, [a] D + 143 (ethanol, d.aX 243.2 mA (e, 15 500) , empirical formula C21H3o05.
Analysis calcd. C 69.58 H 8.34 found. C 69.89 H 8.11 The diacetate thereof melts at 190-191 C. The analytical value agrees with that of trioxyprogesterone. Thus, the crystals A are regarded as a steroid compound which was generated by the entry of a hydroxyl group into the 17-oxy-deoxycorticosterone.
The structure elucidation has shown that this substance is 17,19-dihydroxy-deoxycorticosterone.
The crystals B were repeatedly recrystallized from methanol and give crystals of the following properties, mp 212-216 C, [a] D + 120 (ethanol), Ama2, 242 mu (E, 14 400), empirical formers CziHso0s. Analysis. C 69.58 H 8.34 found. C 69.36 H 8.27 The diacetate thereof melts at 20l-203 C.
[a] D + 120 (chloroform), nm "1,240 ma (E, 15,000). Analysis prepared. for C24H3407: C 67.24 H 7.68 found. C 67.09 H 7.48 These properties are close same as that of epihydrocortisone, whose constants according to the literature are the following:
M.p. 209-212 C [ab + 117 (ethanol), Am ", 242 ma (±, 14 700), m.p. of the di-acetate 202-203 C, n.",. ,, 240 ma (a, 14 900). The IR spectrum of this product also largely agrees with that of epihydrocortisone.
Moreover, no depression of the melting point can be observed when the diacetate of the product melts with an authentic sample of the diacetate of epi-hydrocortisone.
From the above results, it can be seen that the crystals B are likely to be epihydrocortisone. <I> Example 4 </I> A strain of Corticium sasakii is preincubated in 1 liter of the same medium as in Example 1 for 72 hours. A solution of 200 mg deoxycorticosterone in 20 cm3 of methanol is then added and the incubation is allowed to continue for a further 48 hours with shaking.
At the end of this period, the nutrient broth is treated in the manner described in Example 1, about 280 mg of a yellow residue being obtained. The residue is subjected to chromatography in an aluminum oxide column. The fraction which shows the same behavior on the paper chromatogram as corticosterone is collected and this product is then recrystallized from a mixture of acetone and hexane. This gives 60 mg crystals with a melting point of 178-180 C,
[a] D + 216 (ethanol).
Analysis. for C21H @ n04: C 72.80 H 8.73 found. C 72.76 H 8.55 These properties largely agree with those of corticosterone according to the literature (m.p. 178-180 C, [a] D: 210.5 [ethanol]). The same is true for the IR spectrum.
<I> Example 5 </I> After preincubation of a strain of Corticium sasakii in 1 liter of the medium for 72 hours in the manner described in Example 1, a solution of 200 mg of 1-dehydro-17-oxy- desoxycorticosterone in 20 cm3 of methyl alcohol. The incubation is continued for 48 hours with shaking. After the incubation, the nutrient broth is treated further in the manner described in Example 1, 350 mg of a residue being obtained.
On the basis of the paper chromatogram, which is obtained using a mixture of propylene glycol and toluene as solvent, the residue can be regarded as a mixture which, in addition to 1-dehydrohydrocortisone, contains 3 oxidized steroids. The residue is chromatographed on a magnesium silicate column and the fraction containing 1-dehydro-hydrocortisone is collected. The crude substance obtained in this way melts at 223-226 ° C. The yield is 75 mg.
Recrystallization of the crude substance from acetone gives 40 mg of 1-dehydrohydrocortisone, mp 232-236 C (decomp.), [A] D + 100 (dioxane). Both the UV and IR spectra of the product agree pretty closely with an authentic sample of the compound.
<I> Example 6 </I> Ordinary water is added to a mixture consisting of 30 g corn starch, 0.5 g potassium chloride, 0.5 g magnesium sulfate, 1 g potassium dihydrogen phosphate and 250 cm3 20% potato juice until a medium of 1 Liters, whereupon the medium is sterilized under water vapor pressure of 1.05 kg, cm2 for 15 minutes. This medium is then mixed with 100 cm3 of a culture of a strain of Corticium microsclerotia and incubated at 28 ° C. for 48 hours.
The nutrient broth obtained in this way is added to a solution of 17-oxy-deoxycorticosterone in 20 cm3 of ethyl alcohol and the incubation is continued for a further 48 hours. Then steroids are removed from the nutrient broth by extracting them three times with 500 cm3 of ethyl acetate each time and the ethyl acetate solution is washed one after the other, first with 200 cm3 of a 1% sodium hydroxide solution and then twice with 200 cm3 of distilled water.
The ethyl acetate solution is then concentrated under reduced pressure in a nitrogen atmosphere to give 110 mg of an oily residue. This is chromatographed in a magnesium silicate column and that part which corresponds to the hydrocortisone on the paper chromatogram is collected, a crude steroid being obtained. Recrystallization of this product from acetone gives 15 mg of hydrocortisone, melting point 205-207 C, [a] D + 162 (ethanol).
<I> Example 7 </I> A medium described according to Example 1 is sterilized with steam under a pressure of 1.05 kgJcm2 for 15 minutes. 100 CM 3 of a culture of a strain of Corticium praticola are then added to the medium and the mixture is incubated at 280 C for 48 hours. This medium is set with a solution of 100 mg of 17-oxy-deoxycorticosterone in 20 cm3 of ethanol and the incubation period is continued for a further 48 hours under conditions similar to those mentioned above.
The nutrient broth is then processed further as described in Example 6, whereupon an oily residue is obtained. When working according to Example 6, 3.2 mg of hydrocortisone can be obtained from this residue.
<I> Example 8 </I> Tap water is added to a mixture of 900 g of soluble starch, 60 g of ammonium nitrate, 30 g of dibasic potassium phosphate, 15 g of ferrous chloride, 15 g of potassium chloride, 15 g of magnesium sulfate and 300 cm3 of vitamin solution to make 30 liters of one Medium.
1 liter of the vitamin solution used above contains 0.2 mg biotin, 40 mg calcium pantothenate, 0.2 mg pteroylglutamic acid, 200 mg inositol, 40 mg nicotinamide, 20 mg p-aminobenzoic acid, 40 mg pyrodoxine hydrochloride,
20 mg ribofavin mononucleotide and 40 mg thiamine hydrochloride. A portion of about 10/0 of a culture of a strain of Corticium microsclerotia is added to the medium and incubated at 28 ° C. for 48 hours with stirring and aeration. Then a solution of 20 g of 4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione-21-acetate in 600 cm3 of propylene glycol is added. The aerobic incubation is continued for 12 hours with stirring.
The nutrient broth thus obtained is treated in the same manner as in Example 3 to provide a crude steroid. Quantitative paper chromatographic analysis of the crude steroid shows that there is about 65%, based on the starting steroid, of 4-pregnen-17a, 19,21-triol-3,
20-dione and about 7 to 8%, based on the starting steroid, of 4-pregnen-11f, 17a, 21-triol-3,20-dione. Recrystallization of the crude product gives 8.4 g of 4-pregnen-17a, 19,21-triol-3,20-dione as crystals with a melting point of 235-236 ° C., [a] ri = + 121 (ethanol). The yield is 42.1 / o.
In the mother liquor from the recrystallization one observes the presence of a large amount of 4-pregnen-17a, 19,21-triol-3,20-dione and a small amount of 4-pregnen-11ss, 17a, 21-triol-3, 20-dione. <I> Example 9 </I> In the manner described in Example 8, 30 liters of the same medium as in Example 8 are prepared,
and a strain of Corticium microsclerotia is inoculated into the medium and incubated at 28 ° C. for 48 hours with aeration and stirring. A solution of 15 g of deoxycorticosterone (4-pregnen-21-ol-3,20-dione) in 300 cm3 of ethanol is then added to the culture and incubation is continued aerobically for 8 hours.
The culture broth thus obtained is extracted with ethyl acetate and the ethyl acetate is evaporated. The extract is subjected to adsorption chromatography on an aluminum oxide column and a crude product is obtained from the fraction eluted with benzene: ethanol (9: 1).
Recrystallization of the crude product from methanol-acetone-ether gives 4-pregnene-19,21-diol-3,20-dione with a melting point of 153-156 C. Acetylation of this product by means of the usual process gives the diacetate of the same (the means 19,21-diacetoxy-4-pregnen-3,20-dione) as crystals with a melting point of 122-124 ° C., [a118 = + 215 (chloro form).
The above two products show no lowering of the melting point when melted with corresponding authentic samples. Their IR spectra are in good agreement with those of the authentic samples. <I> Example 10 </I> After the incubation of Corticium microsclerotia as in Example 8, a solution of 12 g of 4-androstene-3,17-dione in 200 cm3 of ethanol is added, and the aerobic incubation is carried out with stirring . Continued for 8 hours.
The nutrient broth thus obtained is extracted with ethyl acetate and the ethyl acetate solution is concentrated. The residue is subjected to adsorption chromatography on an aluminum oxide column, and the column is eluted with benzene. A crude product with a melting point of 156 ° C. can be isolated from the eluate.
Recrystallization of the product from acetone-ether gives 4-androsten-19-ol-3,17-dione as crystals with a melting point of 165 ° C., [a] 20 = +180 (chloroform). The IR spectrum of the product is in good agreement with that of an authentic sample.
<I> Example 11 </I> In a manner similar to the method described in Example 8, a strain of Corticium microsclerotia is incubated aerobically. Then a solution of 20 g of progesterone (4-pregnen-3,20-dione) in 800 cm3 of propylene glycol is added to the culture. The aerobic incubation is continued for 12 hours with stirring.
The isolation of the resulting steroid is carried out as in Example 10, with 4-pregnen-19-ol-3,20-dione as crystals of melting point 170-171 C [a] 18 = + 175 (ethanol), <B. > A </B> mtOH 242 mA.
The product can be converted into the acetate in a known manner, and the acetate has a melting point of 125-126 C, [a] 18 = 215, # Na H 239 mu. <I> Example 12 </I> Water is added to a mixture of 600 g cane sugar, 10 g potassium chloride, 10 g magnesium sulfate, 20 g dibasic potassium phosphate and 5 liters of malt extract to obtain 20 liters of a medium.
The medium is inoculated with a strain of Corticium microsclerotia and incubated with stirring and aeration for 48 hours. A solution of 15 g of 4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione in 700 cc of propylene glycol is then added to the culture and aerobic incubation is continued for an additional 16 hours. The nutrient broth is extracted with 30 liters of ethyl acetate and the extract is concentrated to 500 cm3.
The concentrate is washed with 10% aqueous sodium bicarbonate solution. The ethyl acetate is distilled off under reduced pressure, 16 g of a yellow crystalline residue being obtained. The residue is washed with petroleum ether to give 10.5 g of crude steroid contaminated with a small amount of the unchanged starting steroid.
After washing with chloroform, the crude steroid is recrystallized from methanol to give 3.0 g of crystals melting at about 200 ° C. Further recrystallization from methanol gives a crystalline product with a melting point of 235-236 C.
Analysis: Calculated for CziH3.0: C 69.58 H 8.34 found: C 69.46 H 8.35 [a] D = + 123 (ethanol), UV spectrum: A n # oH 242, 5 mu, (E 15 500).
The product is identified as 4-pregnen-17a, 19,21-triol-3,20-dione, which was obtained in Example 3.
The diacetate of the product obtained in the usual way melts at 190 ° C., and no lowering of the melting point is observed when this diacetate together with the diacetate of 4-pregnen-17a, 19,21-triol-3,20-dione obtained in Example 3 is melted.