Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 17-Oxo-steroiden In der schweizerischen Patentschrift Nr. 485 689 wird ein Verfahren für die Herstellung von 17-Oxo- steroiden beschrieben.
Dieses Verfahren besteht darin, dass man Steroide herstellt, welche in der 17-Stellung keinen kohlenstoffhaltigen Substituenten enthalten, und zwar durch mikrobiologische Umwandlung von Steroi den, die einen gesättigten oder ungesättigten, aliphati schen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17- Stellung enthalten, unter Verwendung eines Mikroor ganismus der Gattung Mycobacterium, wobei das ge nannte Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass als Ausgangssteroide mit einem gesättigten oder ungesättig ten, aliphatischen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoff atomen in 17-Stellung solche Steroide verwendet wer den, deren Ringsystem durch die :
mikrobiologische Um wandlung mit Mikroorganismen der Gattung Mycobac- terium angegriffen wird, und dass der Angriff des Ring systems durch Durchführung :der mikrobiologischen Umwandlung in Gegenwart eines anorganischen Inhi- bitors verhindert wird. Als Inhibitoren werden insbe sondere anorganische tonen verwendet.
Es wurde nun festgestellt, dass man das besagte Verfahren nicht nur mittels Enzymen der Gattung My- cobacterium, sondern auch mittels Enzymen anderer Mikroorganismen, welche das Ringsystem dieser be stimmten Art von Steroiden anzugreifen vermögen, durchführen kann.
Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahran für die Herstellung von Steroiden mit der Grundstruktur :des 10,13-Dimethyl-cyclopentanoperhydrophen- anthrens, welche am Kohlenstoffatom in 3-Stellung eine Oxo-, Hydroxy-, Alkoxy- oder Acyloxygruppe und am Koh lenstoffatom in der 17-Stellung eine Oxogruppe auf weisen, wobei man so vorgeht, dass man Steroide der vorgenannten gleichen Grundstruktur, welche am Koh lenstoffatom in 3-Stellung ein Oxo-, Hydroxy-, Alk- oxy- oder Acyloxygruppe und am Kohlenstoffatom in der 17-Stellung eine ss-orientierte, aliphatische Kohlen wasserstoffgruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen aufweisen,
in Gegenwart eines organischen Ions als In hibitor mikrobiologisch umwandelt, und zwar mittels Enzymen von Mikroorganismen, welche das obenge nannte -Grundskelett in Abwesenheit eines Inhibitors an greifen würden, mit der Ausnahme von Enzymen der Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium.
Sämtlichen nach dem Verfahren gemäss vorliegen der :Erfindung verwendeten Mikroorganismen .ist die Eigenschaft zu eigen, dass sie, sofern kein Inhibitor vorhanden ist, das Grundskelett des Dimethyl-cyclopentanoperhydrophenanthrens anzugreifen vermögen. Zu diesem Zweck eignen sich insbesondere die Arten der Gattungen Nocardia und Arthrobacter.
Geeignete Ausgangsmaterialien sind beispielsweise Cholesterin, ss-Sitosterin, Stigmasterin, 4-Cholesten-3-on und Campesterin, welche der Klasse der 3-Keto- bzw. 3-Hydroxysteroiden mit einer aliphatischen Seitenkette von mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Stellung angehören. Derivate dieser Sterine können ebenfalls ver wendet werden, so z. B. die Ester, wie beispielsweise Cholesterylbetainat-chlorid, Cholesterylacetat, Cholesterylhemi-succinat, oder substituierte Sterine, wie z. B. 5α-Chlorcholestanol, oder -Sterine, in denen im A-Ring einer oder mehrere weitere Substituenten sind.
Dank der Anwesenheit eines Inhibitors im Reak tionsmedium, in welchem die mikrobiologische Um wandlung :der Steroide stattfindet, bleibt das Grund skelett des Steroids intakt, während lediglich die ali phatische Seitenkette in -der 17-Stellung beeinträchtigt wird. Zu diesem Zweck eignen sich insbesondere an organische Ionen, wie z. B. das Nickel-Ion, das Ko balt-Ion, das Cadium-Ion :und :das Selenit-Ion.
Von besonderem Interesse ist die mikrobiologische Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4- Androsten-3,17-dion.
Die Ketogruppe in der 17-Stellung lässt sich, wenn keine Substituenten am 16-Kohlenstoffatom vorhanden sind, leicht mittels der Zimmerman-Reaktion .feststel- len (W. Zimmerman, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chemie 233 (1935) 257).
Das Androstadien-3,17-dion ist ein wertvolles Pro dukt, das als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Verbindungen mit androgener, östrogener, anabolischer und empfängnisverhütender Wirksamkeit dienen kann.
Das neue Verfahren macht es unter anderem mög lich, natürlich vorkommendes Cholesterin, das als sol ches nur in begrenztem Umfang verwendet wird, in ein Zwischenprodukt von grossem Wert umzuwandeln.
Für die praktische Durchführung des erfindungsge mässen Verfahrens werden die genannten Mikroorganis- men zweckmässig in einem Medium gezüchtet, das eine anorganische oder :organische Stickstoffquelle, wie z. B. Aminosäuren, Ammoniumsalze, Alkalimetallnitrate und Erdalkalimetallnitrate oder Pepton, enthält. Maisquell wasser, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Sojabohnen mehl, die sogenannten distillers solubles und derglei chen sind ebenfalls sehr geeignet.
Assimilierbare Koh lenstoffquellen, wie Zucker, Stärke, mehrwertige Al koholate, können in dem Medium vorhanden sein, doch genügt in den meisten Fällen die Anwesenheit einer or ganischen Stickstoffquelle. überdies enthält ein geeigne tes Medium auch die übliche Menge von Salzen, wie z. B. Alkali- oder Erdalkalimetallphosphaten, -sulfaten oder -chloriden. Spurenelemente liegen für gewöhnlich bei Verwendung von Leitungswasser in hinreichenden Mengen vor.
Bei Verwendung von natürlichen, aus einem kom plizierten Gemisch bestehenden Stickstoffquellen, wie z. B. Maisquellwasser, kann oft der Zusatz von Mineral- salzen unterbleiben.
Die Medien werden im allgemeinen in der üblichen Weise sterilisiert; sie weisen nach dieser Behandlung normalerweise einen pH-Wert von 4 bis 8,5 und eine Azidität von etwa 7 auf.
Wenn die Zellen in dem Medium unter dauernder Belüftung hirnreichend gewachsen sind, so kann das Steroid, z. B. das Cholesterin oder das ss-Sitosterin, ent weder in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. N,N-Dimethylformamid, gelöst oder in Form einer fei nen Suspension in Wasser zugegeben werden.
Die Menge des zuzusetzenden Inhibitors hängt von den Umständen ab. Wenn die Konzentration zu ge ring ist, wird das Steroid vollständig zu Substanzen von niedrigem Molekulargewicht abgebaut. Ist die Kon zentration zu hoch, so wird die Umwandlung des Steroids weitgehend gehemmt, und der Mikroorganis mus wird sogar häufig abgetötet. Bei Verwendung von NiSO4 . 7H20 reicht eine Konzentration von 10 bis 1000 mg pro Liter aus, obwohl Umstände vorliegen können, in denen eine niedrigere oder höhere Kon zentration erwünscht ist. Wenn Kobaltchlorid, Cad miumsulfat oder Natriumselenit verwendet wird, liegt die Konzentration vorzugsweise ebenfalls in dem oben erwähnten Bereich.
Der Zeitpunkt des Zugebens der Steroide liegt etwa zwischen 0 und 72 Stunden nach der Animpfung; be friedigende Resultate werden auch bei späterem Zu setzen erhalten. Vorzugsweise geschieht das Zusetzen jedoch 24 bis 48 Stunden .nach der Animpfung der Kultur, wenn die Mikroorganismen hinreichend ge wachsen sind. Ein sehr frühes Zugeben, z. B. unmittel bar nach der Animpfung, bleibt möglich.
Der Inhibi- tor wird im allgemeinen gemeinsam mit dem Steroid zugegeben, da die Bakterien nichtgetötet werden, wenn der Inhibitor in einer geeigneten Konzentration zuge- geben wind. Dies kann leicht an Kulturen, die durch Aufstreichen der Kultur nach Zusetzen von Steroid und Inhibitor auf ein geeignetes Kulturmedium erhalten wur den, festgestellt werden.
Die Umwandlung des Steroids findet in der Re gal unter dauernder Belüftung bei einer Temperatur bei einer Temperatur zwischen 20 und 45 C statt; das Verfahren geht aber auch bei niedrigeren oder höheren Temperaturen vor sich.
Man führt die Reaktion vorzugsweise bei 30 C ,durch; es ist jedoch nicht notwendig, dass die Tempera tur während der Phasen des Kulturwachstums und des Abbauprozesses die gleiche ist. Der Mikroorganismus kann zunächst während 24 Stunden bei 26 C zum Wachsen ,gebracht werden, wonach die Temperatur nach Zusetzen von Steroid und Inhibitor auf 30 C er höht werden kann.
Die Umwandlung des zugegebenen Steroids dauert etwa 1 bis 7 Tage. In der Regel nimmt die Menge des gewünschten Endproduktes indessen nach 3 Ta gen nicht weiter zu. Ein wesentliches Hauptprodukt, das im Fall von Sterinen ohne weitere Substitution im A- Ring gebildet wird, ist 1,4-Androstadien-3,17-dion ne ben geringen Mengen 4-Androsten-3,17-dion; die Aus beuten hängen unter anderem vom Belüften ab. Die beschriebenen Umstände führen zu einem erwünsch ten Überwiegen von 1,4-Androstadien-3,17-dion gegen über 4-Androsten-3,17-dion.
Die gebildeten Steroide können aus der Kulturflüssigkeit durch Extrahieren mit einer mit Wasser nichtmischbaren Flüssigkeit, wie z. B. Methylisobutylketon, Äthylacetat, Methylenchlorid oder Chloroform, erhalten werden. Diese Extrakte werden zur Trockne eingedampft; der Rückstand wird zwecks Entfernung von nichtumgewandeltem Substrat, wie z. B. Cholesterin oder Stigmasterin, mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert.
Die zurückbleibende feste Substanz kann dann durch Chromatographie und Umkristallisation weiter gereinigt und in die Komponenten zerlegt werden.
Da geeignete Mikroorganismen zwingenderweise Enzyme bilden, welche das Ringsystem der genann ten Steroidsubstrate, welche in 17-Stellung eine ali phatische Gruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen haben, anzugreifen vermögen, ist es möglich, geeignete Mikroorganismen nach einem allgemeinen Prinzip fest zustellen, indem man diese geeigneten Organismen aus natürlichen Quellen, wie z. B. aus dem Boden, aus dem Dünger, aus an der Oberfläche liegendem Was ser usw., einengt.
Zu diesem Zweck verwendet man ein Kulturmedium, welches als einzige Kohlenstoffquelle Cholesterin neben einigen Salzen enthält.
Das Kultur- medium wird mit Gartengrund, Dünger usw. ange- impft und hierauf bei einer geeigneten Temperatur, bei- spielsweise bei einer solchen von 10 bis 40 C, ge züchtet,
obwohl auch höhere -oder niedrigere Tempera turen nicht auszuschliessen sind. Die Kultur kann auf einer vibrierenden oder rotierenden Schüttelmaschine geschüttelt werden. Gewünschtenfalls :kann man auch Restkulturen zum Konzentrieren der gewünschten Mi kroorganismen verwenden.
Auch hat :es sich als mög lich erwiesen, das Medium in halbfester Form (Agar- Agar) zu verwenden und den gewünschten Mikroor- ganismus in Petrischalen zu konzentrieren. Es kann angezeigt sein, den Boden einige Monate oder Wochen vor seiner Verwendung mit Cholesterin oder einer Koh lenwasserstoffmischung zu vermischen.
So erhält man die Art Nocardla, Stamm CBS Nr. 226.67, aus einem Boden, welcher mit einem Abfallschmieröl vermischt worden war. Das Medium, welches man für die Kon zentration verwenden kann, hat beispielsweise die fol gende Zusammensetzung:
EMI0003.0002
Ammoniumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Na2HPO4 <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Cholesterin <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser Die so konzentrierten Mikroorganismen sind be fähigt, mach der Züchtung in einem geeigneten Kultur- medium einen gesättigten oderungesättigten aliphati schen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen anzu greifen.
Wird dieser Abbau in Gegenwart eines Inhi- bitors gemäss dieser Erfindung durchgeführt, so, wird der Abbau des Ringsystems des Steroids unterdrückt, und man erhält ein Steroid mit 19 Kohlenstoffatomen, wie z. B. das 3,17 Dioxo-1,4-anidrostadien. Auf diese Weise konnte eine Anzahl von Nocardia-Arten isoliert werden, welche Cholesterin anzugreifen und abzubauen und daher das gewünschte Steroid mit 19 Kohlenstoff atomen nach der Zugabe der anorganischen Inhibito- ren der obgenannten Art zu bilden vermögen.
Ins besondere die Art Nocardia, der Stamm CBS Num mer 224.67 und Nocardia, Stamm CBS Nr. 225.67, scheinen sich für das erfindungsgemässe Verfahren be sonders zu eignen.
<I>Beispiel 1</I> Eine Impfkultur der Art Nocardia, Stamm CBS Nr. 225.67, wird durch Impfen einer Kultur dieses Mikroorganismus -auf Pepton-Glucose-Agar hergestellt und während drei Tagen bei 30 C in einem Medium bebrütet, das aus einer Lösung von 10 g Hefeextrakt ( DIFCO ) in 1 Liter Leitungswasser vom pH-Wert 6,8, das vorher während 30 Minuten -bei 110 C steri lisiert worden ist, besteht. Das Medium wird in 500- cm3-Kolben eingebracht, wobei jeder Kolben 500 cm3 des Mediums enthält.
Die Kultur wird während 48 Stunden bei<B>301C</B> auf einer rotierenden Schüttelapparatur bei einer Ge- schwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute mit einem Schüttelweg von 21/2 cm geschüttelt, wonach der Mikroorganismus hinreichend gewachsen ist, um weiter geimpft zu werden.
Das Hauptfermentationsmedium wird durch Ver dünnen von je 3 g Maisquellflüssigkeit (berechnet als Trockensubstanz) mit Leitungswasser auf 1 Liter, Lö sen von 3 g Glucose meiner Flüssigkeit und anschlie ssendes Einstellen des Mediums auf einen pH-Wert von 7 mit verdünnter Natriumhydroxydlösung herge stellt. Dieses Medium wird in 12 Kolben während 30 Minuten bei 1l0 C sterilisiert. Jeder der verwendeten Zweiliterkolben enthält 1 Liter Medium.
Die Kolben werden nun mit einer Impfkultur, wie sie oben be schrieben ist, geimpft, wobei in. jeden Kalben 50 cms eingebracht werden. Die Impfung beträgt also 5 %.
Die Kolben werden während 24 Stunden bei 30 C wie oben beschrieben geschüttelt.
Das Substrat, nämlich das Cholesterin, wird in ei nem Mörser unter Zugabe von 0,1 % Tween 80 ent haltendem Wasser pulverisiert. Diese Suspension wird den vorgenannten Kulturen in solcher Menge zugegeben, dass jeder Kolben 1 g Cholesterin enthält. Gleichzeitig wird eine sterile Lösung von 500 Mg CoCl2.6H2O in Wasser in jeden Kolben gegeben, was etwa. 125 mg Kobalt Ionen entspricht. Die Kolben werden dann wei ter unter den gleichen Bedingungen geschüttelt.
Schon nach 12 bis 24 Stunden nach dem Hinzugeben von Cholesterin kann das Vorhandensein von 3,17-Dioxo- 1,4-androstadien und 3,17-Dioxo-4-androsten durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden. Zu diesem Zwecke extrahiert man einige cm3 der Kultur flüssigkeit mit einem gleichen Volumen Äthylacetat und führt die Chromatographie des Extraktes unter Ver wendung von Silikagel mach der Methode von Stahl durch. Man kann auch DC-Fertigplatten Kieselgel F254 (Merek A. G.) verwenden.
Die Eluierungsflüssigkeit be steht aus einem Gemisch von Chloroform und Äthyl- acatat in einem Volumverhältnis von 100 : 1.
Nach 3 Tagen Schütteln werden die Inhalte der 12 Kolben vereinigt und das Gemisch dreimal mit 20 % seines Volumens Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trok- kene eingedampft und ;der Rückstand mit 80 cm3 sie dendem Methanol extrahiert. Dadurch wird das nicht umgewandelte Cholesterin entfernt. Aus dem Rückstand können 5,2 g Cholesterin gewonnen werden.
Der Me thanolextrakt enthält das gewünschte Androstadien- dion. Nach dem Eindampfen zur Trockene wird der Rückstand in 30 cm3 Benzol aufgenommen, worauf diese Lösung über eine Säule chromatographiert wird, die 150 g Aluminiumoxyd (Al2O3 nach Woelm, neutral, Aktivitätsstufe III) enthält.
Die Säule wird eluiert mit einem -Gemisch aus Benzol und Aceton (10:1). Durch Dünnschichtchro matographie wurden die das 1,4-Androstadien-dion ent haltenden Fraktionen festgestellt und diese Fraktionen vereinigt und eingedampft.
Der Rückst'an'd (710 mg) wird aus einem Gemisch von Aceton und Heptan (1:3) umkristallisiert. Auf diese Weise werden 640 mg Rohprodukt erhalten. Der Schmelzpunkt beträgt 139,5 bis 140,5 C. Eine Probe von äusserst reinem Androstadien-dion schmilzt bei 141 bis 142 C. Eine Mischung dieser beiden kristallinen Produkte zeigt keine Schmelzpunktserniedrigung. Die Infrarotspektren der beiden Proben sind identisch. Die Ausbeute an kristallinem Produkt, bezogen auf das verwendete Cholesterin, beträgt 12,9 %.
<I>Beispiel 2</I> Analog dem Verfahren .des Beispiels 1 wird eine Kultur der Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 220.67, erzeugt.
Die Umwandlung erfolgt in diesem Falle in drei 500-cm3-Kolben, von denen jeder 100 cm3 Medium enthält. Auch hier wird wiederum eine Impfkultur von 5 % verwendet, bezogen auf die Menge des Hauptfer mentationsmediums.
Die Kolben werden in der übli chen Weise bei 30 C geschüttelt. 24 Stunden nach dem Impfen werden jedem Kolben 200 mag Cholesterin und ferner 50 mg NiSO4. 7H2O zugegeben, wonach mit ,dem Schütteln fortgefahren wird. Nach 3- bis 4tägiger Inkubation enthalten die drei Kolben zusammen eine Menge @an 3,17-Dioxo-1,4-and#rostadien, die zwischen 70,2 und 117 mg variiert.
In den meisten Fällen bilden sich geringe Mengen von 3,17-Dioxo-4-androsten, je doch verschwindet der grösste Teil dieser Verbindung nach einem mehrtätigen Schütteln.
Die Ausbeute variiert zwischen 16,0 und 25;6 %, bezogen auf das zugefügte Cholesterin.
<I>Beispiel 3</I> Nach den Angaben von Beispiel 2 verwendet man eine Kultur von der Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 221.67. In jeden Kalben gibt man 400 mg Chol esterin und 50 mg CoCl2-.6H2O hinzu. Nach 4tägi- gem Schütteln. bei 30 C kann man aus jedem Kolben aus der in Beispiel 1 beschriebenen Weise 52 mag 3,17- Dioxo-1,4-androstadien isolieren.
Die Menge an 3,17 Dioxo-4-androsten ist praktisch 0. Die Menge an nicht umgesetztem Cholesterin beträgt in jedem Kolben 290 mg. Demnach werden in jedem Kolben höchstens 110 mg Cholesterin umgewandelt, so dass sich theore tisch nicht mehr als 80 mg 3,17-Dioxo-1,4-andmostadien bilden kann. Daraus lässt sich schliessen, dass die Um wandlung in einer Ausbeute von 65 %, bezogen auf umgewandeltes Cholesterin, und von 17,8<B>%,</B> -bezogen auf das zugesetzte Cholesterin, stattgefunden hat.
<I>Beispiel 4</I> Ähnlich wie in Beispiel 3 verwendet man die Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 222.67. Das Isolieren und Reinigen erfolgt nach den Angaben von Beispiel 1, wobei man ein, Ausbeute von 29 mg 3,17-Dioxo- 1,4-androstadien in jedem Kolben nach 4tägigem Schütteln erzielt. Die Ausbeute beträgt 10%, bezogen auf das zugesetzte Cholesterin.
<I>Beispiel 5</I> Man verfährt wie in Beispiel 4, .d. h. man ver wendet den Mikroorganismus der Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 222.67, mit dem Unterschied jedoch, dass man jedem Kolben 50 mg NiSO4.7H2O zusetzt. 24 Stunden nach der Zugabe von Cholesterin und In hibitor kann man durch Dünnschichtchromatographie in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise die Anwe senheit von 3,17-Dioxo-1,4-androstadien und 3,
17- Dioxo-4-androsten feststellen. <I>Beispiel 6</I> Man arbeitet wie in Beispiel 4 mit dem Unter- schiede doch, dass man einen Mikroorganismus der Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 221.67, der Art Arthro- bacter, Stamm CBS Nr. 223.67, und der Art Nocardia, Stamm CBS Nr. 225.67, verwendet.
Unter Verwendung von NiSO4.7H2O als Inhibitor erhält man, in je dem Kolben 24 bis 38 mg von 3,17-Dioxo-1,4-andro- stadien, so dass die Ausbeute, bezogen auf das zuge setzte Cholesterin, zwischen 8,2 bis 13,0% schwankt. <I>Beispiel 7</I> Eine Impfkultur der Art Nocardia, Stamm CBS Nr. 224.67, wird in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt. Das Hauptfermentationsmedium be steht aus einer Lösung von 5 g Maisquellflüssigkeit (berechnet als Trockensubstanz) pro Liter Wasser, wel cher 1 g Hefeextrakt ( DIFCO ) zugesetzt worden ist.
Das Medium wird mittels einer wässrigen Natriumhy droxydlösung auf ein pH-Wert von 7,0 eingestellt und während 30 Minuten bei 110 C sterilisiert. Jeder der 500-cm3-Kolben enthält 100 cm3 dieses Mediums. Der Prozentsatz des Animpfens beträgt 5 %.
Nach 24stündigem Schütteln versetzt .man jeden Kolben mit 200 mg Cholesterin in Formeiner wässrigen Suspension und mit einer Lösung von 50 mg CoCl2.6H2O. Nach 3tätigem Schütteln isoliert ,man aus jedem Kolben nach :der in Beispiel 1 beschriebenen Methode 32 mg 3,17-Dioxo-1,4-androstadien. Die Aus beute beträgt 22 %, bezogen auf das zugesetzte Chol esterin. <I>Beispiel 8</I> Eine Kultur von der Art Nocardia, Stamm CBS Nr. 224.67, wird nach den Angaben von Beispiel 7 hergestellt. Einem jedem Kolben werden 200 mg Chol esterin und SO mg CdSO4 zugesetzt.
Nach 24stündi- gem Schütteln lässt sich die Anwesenheit von 3,17- Dioxo-1,4-andmostadien nach der in Beispiel 1 be schriebenen Methode durch Dünnschichtchromatogra phie nachweisen.
<I>Beispiel 9</I> Eine Kultur von der Art Nocardia, Stamm CBS Nr. 224.67, oder von Nocardia, Stamm CBS Num mer 225.67, wird in der in Beispiel 7 beschriebenen Weise hergestellt. Einem jedem Kolben gibt man 200 mg Cholesterin und Natriumselenit in Mengen zwischen 3 und 10 :mg pro Kolben (30 bis 100 mg/ Liter) hinzu. Nach 24stündigem Schütteln lässt sich die Anwesenheit einer Mischung von 3,17-Dioxo-1,4-an- drostadien und 3,17-Dioxo-4-androsten in jedem der Kolben nach der gemäss Beispiel 1 durchgeführten Dünnschichtchromatographie nachweisen.
<I>Beispiel 10</I> Ähnlich wie beim Beispiel 2 stellt man eine Kul tur der Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 221.67, her. Anstelle von Cholesterin gibt man 200<I>mg</I> l3- Sitosterin hinzu. Der Inhibitor besteht aus NiSO4 . 7H.-0.
Nach 3 Tagen enthalten die Kolben 3,17-Dioxo-1,4- androstadien in einer Menge, welche zwischen 19 und 24 mg mit jedem Kolben schwankt. Die Ausbeute be trägt ungefähr 15%, bezogen auf das zugesetzte 3- Sitosterin. (Das handelsübliche zugängliche 3-Sitosterin enthält eine Anzahl von Steroiden von praktisch glei cher Struktur, so dass eine genaue Bestimmung der Ausbeute unmöglich ist).
<I>Beispiel 11</I> Dass Beispiel 10 wird wiederholt mit dem Unter schied, dass eine der folgenden Kulturen verwendet wird: Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 22.67, und Nocardia, Stamm CBS Nr. 226.67. In beiden Fällen lässt sich nach 3 Tagen die Gegenwart von 3,17-Dioxo- 1,4-androstadien nachweisen, und zwar nach der in Beispiel 1 beschriebenen Dünnschichtchromatographie- methode.
<I>Beispiel 12</I> Ähnlich wie in Beispiel 2 wird eine Kultur aus ,der Art Nocardia, Stamm CBS Nr. 225.67, in 4 Fla schen hergestellt, welche jeweils 100 cm3 des Mediums enthalten. Einem jedem Kolben gibt man 500 mg CoCl2³6H2O hinzu. Jedem der 4 Kolben wird eine wässrige Suspension zugegeben, welche aus a) 3-Oxo-4-cholesten b) Stigmasterol c) 5α-Chlorcholestanol und d) einer Lösung von Cholesterylbetainat-chlorid -besteht.
In sämtlichen Fällen beträgt die jedem Kolben zu- gesetzte Steroidmenge 100 mg. Nach 2 Tagen lässt sich durch Dünnschichtchro- matographie -die Anwesenheit von 3,17-Dioxo-1,4 -an- @drostadien nachweisen.
Process for the microbiological production of 17-oxo-steroids The Swiss patent specification No. 485 689 describes a process for the production of 17-oxo-steroids.
This process consists in producing steroids which do not contain any carbon-containing substituents in the 17-position, specifically by microbiological conversion of steroids which contain a saturated or unsaturated, aliphatic radical with at least 8 carbon atoms in the 17-position Use of a microorganism of the genus Mycobacterium, the process mentioned being characterized in that the starting steroids with a saturated or unsaturated aliphatic radical with at least 8 carbon atoms in the 17-position are those steroids whose ring system is characterized by the:
microbiological conversion is attacked with microorganisms of the genus Mycobacterium, and that the attack of the ring system is prevented by carrying out: the microbiological conversion in the presence of an inorganic inhibitor. In particular, special inorganic clays are used as inhibitors.
It has now been found that the said method can be carried out not only by means of enzymes of the genus Mycobacterium, but also by means of enzymes from other microorganisms which are able to attack the ring system of this particular type of steroid.
Thus, the present invention relates to a Verfahran for the production of steroids with the basic structure: 10,13-dimethyl-cyclopentanoperhydrophenanthene, which on the carbon atom in the 3-position is an oxo, hydroxy, alkoxy or acyloxy group and on the Koh lenstoffatom in the 17-position have an oxo group, the procedure being that one steroids of the same basic structure mentioned above, which on the carbon atom in the 3-position an oxo, hydroxy, alkoxy or acyloxy group and on the carbon atom in the 17-position have a ss-oriented, aliphatic hydrocarbon group with at least 8 carbon atoms,
microbiologically converted in the presence of an organic ion as an inhibitor, namely by means of enzymes from microorganisms which would attack the abovementioned basic skeleton in the absence of an inhibitor, with the exception of enzymes from microorganisms of the genus Mycobacterium.
All microorganisms used according to the method according to the present invention have the property that, if no inhibitor is present, they are able to attack the basic skeleton of dimethyl-cyclopentanoperhydrophenanthrene. The species of the genera Nocardia and Arthrobacter are particularly suitable for this purpose.
Suitable starting materials are, for example, cholesterol, ß-sitosterol, stigmasterol, 4-cholesten-3-one and campesterol, which belong to the class of 3-keto and 3-hydroxysteroids with an aliphatic side chain of at least 8 carbon atoms in the 17-position. Derivatives of these sterols can also be used, e.g. B. the esters, such as cholesteryl betainate chloride, cholesteryl acetate, cholesteryl hemi-succinate, or substituted sterols, such as. B. 5α-chlorocholestanol, or -sterines in which there are one or more further substituents in the A-ring.
Thanks to the presence of an inhibitor in the reaction medium in which the microbiological conversion of the steroids takes place, the basic skeleton of the steroid remains intact, while only the aliphatic side chain in the 17-position is impaired. For this purpose, organic ions, such as. B. the nickel ion, the cobalt ion, the cadium ion: and: the selenite ion.
The microbiological production of 1,4-androstadiene-3,17-dione and 4-androstene-3,17-dione is of particular interest.
If there are no substituents on the 16-carbon atom, the keto group in the 17-position can easily be determined by means of the Zimmerman reaction (W. Zimmerman, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chemie 233 (1935) 257).
Androstadien-3,17-dione is a valuable product that can be used as a starting material for the manufacture of compounds with androgenic, estrogenic, anabolic and contraceptive effectiveness.
The new process makes it possible, among other things, to convert naturally occurring cholesterol, which as such is only used to a limited extent, into an intermediate product of great value.
For the practical implementation of the method according to the invention, the microorganisms mentioned are expediently grown in a medium that contains an inorganic or organic nitrogen source, such as. B. amino acids, ammonium salts, alkali metal nitrates and alkaline earth metal nitrates or peptone. Corn steeple, yeast extract, cottonseed flour, soybean flour, so-called distillers solubles and the like are also very suitable.
Assimilable carbon sources such as sugar, starch, polyvalent alcoholates can be present in the medium, but in most cases the presence of an organic nitrogen source is sufficient. In addition, a suitable medium also contains the usual amount of salts, such as. B. alkali or alkaline earth metal phosphates, sulfates or chlorides. Trace elements are usually found in sufficient quantities when using tap water.
When using natural nitrogen sources consisting of a com plicated mixture, such as. B. Corn steeple, the addition of mineral salts can often be omitted.
The media are generally sterilized in the usual manner; they usually have a pH of 4 to 8.5 and an acidity of about 7 after this treatment.
When the cells in the medium have grown to the brain under constant ventilation, the steroid, e.g. B. the cholesterol or the ss-sitosterol, ent neither in a suitable solvent, such as. B. N, N-dimethylformamide, dissolved or added in the form of a fine suspension in water.
The amount of the inhibitor to be added depends on the circumstances. If the concentration is too low, the steroid will be completely broken down into substances of low molecular weight. If the concentration is too high, the conversion of the steroid is largely inhibited, and the microorganism is even often killed. When using NiSO4. 7H20 a concentration of 10 to 1000 mg per liter will suffice, although there may be circumstances where a lower or higher concentration is desired. When cobalt chloride, cadmium sulfate or sodium selenite is used, the concentration is preferably also in the above-mentioned range.
The time at which the steroids are added is approximately between 0 and 72 hours after inoculation; Satisfactory results are also obtained when the patient is seated later. Preferably, however, the addition takes place 24 to 48 hours after the inoculation of the culture, when the microorganisms have grown sufficiently. A very early admission, e.g. B. immediately after the inoculation remains possible.
The inhibitor is generally added together with the steroid, since the bacteria are not killed if the inhibitor is added in a suitable concentration. This can easily be ascertained in cultures obtained by streaking the culture after adding the steroid and inhibitor to a suitable culture medium.
The conversion of the steroid takes place in the shelf with constant ventilation at a temperature between 20 and 45 C; however, the process also takes place at lower or higher temperatures.
The reaction is preferably carried out at 30 C; however, it is not necessary that the temperature be the same during the phases of culture growth and the degradation process. The microorganism can first be made to grow for 24 hours at 26 ° C., after which the temperature can be increased to 30 ° C. after adding steroid and inhibitor.
The conversion of the added steroid takes about 1 to 7 days. As a rule, however, the amount of the desired end product does not increase further after 3 days. An essential main product which is formed in the case of sterols without further substitution in the A-ring is 1,4-androstadiene-3,17-dione besides small amounts of 4-androstene-3,17-dione; the yield depends, among other things, on ventilation. The circumstances described lead to a desirable preponderance of 1,4-androstadiene-3,17-dione over 4-androstene-3,17-dione.
The steroids formed can be extracted from the culture liquid by extraction with a liquid immiscible with water, such as e.g. B. methyl isobutyl ketone, ethyl acetate, methylene chloride or chloroform can be obtained. These extracts are evaporated to dryness; the residue is used for the removal of unconverted substrate, e.g. B. cholesterol or stigmasterol, extracted with an organic solvent.
The remaining solid substance can then be further purified by chromatography and recrystallization and broken down into its components.
Since suitable microorganisms inevitably form enzymes which are able to attack the ring system of the steroids substrates mentioned, which have an aliphatic group with at least 8 carbon atoms in the 17 position, it is possible to determine suitable microorganisms according to a general principle by determining these suitable Organisms from natural sources, such as B. from the soil, from the fertilizer, from what water is on the surface, etc., constricts.
For this purpose, a culture medium is used which contains cholesterol as the only source of carbon in addition to some salts.
The culture medium is inoculated with garden soil, fertilizer, etc. and then grown at a suitable temperature, for example between 10 and 40 C,
although higher or lower temperatures cannot be ruled out. The culture can be shaken on a vibrating or rotating shaker. If desired: you can also use residual cultures to concentrate the desired microorganisms.
It has also been shown to be possible to use the medium in semi-solid form (agar-agar) and to concentrate the desired microorganism in Petri dishes. It may be appropriate to mix the soil with cholesterol or a hydrocarbon mixture a few months or weeks before using it.
The species Nocardla, strain CBS No. 226.67, is thus obtained from soil which has been mixed with a waste lubricating oil. The medium that can be used for the concentration has, for example, the following composition:
EMI0003.0002
Ammonium nitrate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Na2HPO4 <SEP> 1 <SEP> g
<tb> cholesterol <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Tap water The microorganisms concentrated in this way are capable of attacking a saturated or unsaturated aliphatic residue with at least 8 carbon atoms when grown in a suitable culture medium.
If this degradation is carried out in the presence of an inhibitor according to this invention, the degradation of the ring system of the steroid is suppressed, and a steroid having 19 carbon atoms, such as e.g. B. the 3.17 dioxo-1,4-anidrostadiene. In this way it was possible to isolate a number of Nocardia species which attack and degrade cholesterol and are therefore able to form the desired steroid with 19 carbon atoms after the addition of the inorganic inhibitors of the above-mentioned type.
In particular the species Nocardia, the strain CBS number 224.67 and Nocardia, strain CBS no. 225.67, seem to be particularly suitable for the process according to the invention.
<I> Example 1 </I> An inoculation culture of the species Nocardia, strain CBS No. 225.67, is produced by inoculating a culture of this microorganism on peptone-glucose agar and incubated for three days at 30.degree. C. in a medium which a solution of 10 g of yeast extract (DIFCO) in 1 liter of tap water with a pH of 6.8, which has previously been sterilized at 110 ° C. for 30 minutes. The medium is placed in 500 cm3 flasks, each flask containing 500 cm3 of the medium.
The culture is shaken for 48 hours at <B> 301C </B> on a rotating shaker at a speed of 250 revolutions per minute with a shaking path of 21/2 cm, after which the microorganism has grown sufficiently to be vaccinated further will.
The main fermentation medium is made by diluting 3 g of corn steep liquor (calculated as dry matter) with tap water to 1 liter, dissolving 3 g of glucose and then adjusting the medium to a pH of 7 with dilute sodium hydroxide solution. This medium is sterilized in 12 flasks at 10 ° C. for 30 minutes. Each of the two-liter flasks used contains 1 liter of medium.
The flasks are then inoculated with an inoculation culture as described above, with 50 cms being introduced into each calf. So the vaccination is 5%.
The flasks are shaken for 24 hours at 30 ° C. as described above.
The substrate, namely the cholesterol, is pulverized in a mortar with the addition of 0.1% Tween 80 containing water. This suspension is added to the aforementioned cultures in such an amount that each flask contains 1 g of cholesterol. At the same time, a sterile solution of 500 mg CoCl2.6H2O in water is added to each flask, which is approximately. 125 mg of cobalt ions corresponds. The flasks are then shaken again under the same conditions.
Even after 12 to 24 hours after adding cholesterol, the presence of 3,17-dioxo-1,4-androstadiene and 3,17-dioxo-4-androstene can be detected by thin layer chromatography. For this purpose, a few cm3 of the culture liquid is extracted with an equal volume of ethyl acetate and the extract is chromatographed using silica gel using the Stahl method. Pre-fabricated silica gel TLC plates F254 (Merek A. G.) can also be used.
The elution liquid consists of a mixture of chloroform and ethyl acetate in a volume ratio of 100: 1.
After 3 days of shaking, the contents of the 12 flasks are combined and the mixture is extracted three times with 20% of its volume of methyl isobutyl ketone. The extract is evaporated to dryness under reduced pressure and the residue is extracted with 80 cm3 of methanol. This will remove the unconverted cholesterol. 5.2 g of cholesterol can be obtained from the residue.
The methanol extract contains the desired androstadiene- dione. After evaporation to dryness, the residue is taken up in 30 cm3 of benzene, whereupon this solution is chromatographed on a column containing 150 g of aluminum oxide (Al2O3 according to Woelm, neutral, activity level III).
The column is eluted with a mixture of benzene and acetone (10: 1). The fractions containing the 1,4-androstadiene-dione were determined by thin layer chromatography, and these fractions were combined and evaporated.
The Rückst'an'd (710 mg) is recrystallized from a mixture of acetone and heptane (1: 3). In this way, 640 mg of crude product are obtained. The melting point is 139.5 to 140.5 C. A sample of extremely pure androstadiene-dione melts at 141 to 142 C. A mixture of these two crystalline products shows no decrease in the melting point. The infrared spectra of the two samples are identical. The yield of crystalline product, based on the cholesterol used, is 12.9%.
<I> Example 2 </I> A culture of the Arthrobacter species, strain CBS No. 220.67, is produced analogously to the method of Example 1.
In this case, the conversion takes place in three 500 cm3 flasks, each of which contains 100 cm3 of medium. Here, too, an inoculation culture of 5% is used, based on the amount of the main fermentation medium.
The flasks are shaken at 30 C in the usual way. 24 hours after inoculation, each flask is given 200 mg of cholesterol and also 50 mg of NiSO4. 7H2O is added, after which shaking is continued. After 3 to 4 days of incubation, the three flasks together contain an amount of 3,17-dioxo-1,4-and # rostadiene, which varies between 70.2 and 117 mg.
In most cases small amounts of 3,17-dioxo-4-androstene are formed, but most of this compound disappears after several days of shaking.
The yield varies between 16.0 and 25; 6%, based on the added cholesterol.
<I> Example 3 </I> According to the information in Example 2, a culture of the Arthrobacter species, strain CBS No. 221.67 is used. In each calf, 400 mg of cholesterol and 50 mg of CoCl2-.6H2O are added. After 4 days of shaking. at 30 ° C., 52 mag 3,17-dioxo-1,4-androstadiene can be isolated from each flask in the manner described in Example 1.
The amount of 3.17 dioxo-4-androstene is practically 0. The amount of unreacted cholesterol in each flask is 290 mg. According to this, a maximum of 110 mg of cholesterol is converted in each flask, so that theoretically no more than 80 mg of 3,17-dioxo-1,4-andmostadiene can form. From this it can be concluded that the conversion took place in a yield of 65%, based on converted cholesterol, and of 17.8%, based on the added cholesterol.
<I> Example 4 </I> Similar to Example 3, the species Arthrobacter, strain CBS No. 222.67 is used. Isolation and purification are carried out as described in Example 1, a yield of 29 mg of 3,17-dioxo-1,4-androstadiene being achieved in each flask after shaking for 4 days. The yield is 10% based on the added cholesterol.
<I> Example 5 </I> Proceed as in Example 4, .d. H. the microorganism of the Arthrobacter species, strain CBS No. 222.67, is used, with the difference, however, that 50 mg NiSO4.7H2O are added to each flask. 24 hours after the addition of cholesterol and In hibitor you can by thin layer chromatography in the manner described in Example 1, the presence of 3,17-dioxo-1,4-androstadiene and 3,
17-Dioxo-4-androstening. <I> Example 6 </I> The procedure is as in Example 4 with the difference that a microorganism of the Arthrobacter species, strain CBS No. 221.67, the Arthrobacter species, strain CBS No. 223.67, and the Art Nocardia, strain CBS No. 225.67, was used.
Using NiSO4.7H2O as an inhibitor, 24 to 38 mg of 3,17-dioxo-1,4-androstadiene are obtained in each flask, so that the yield, based on the added cholesterol, is between 8.2 fluctuates up to 13.0%. <I> Example 7 </I> An inoculum of the species Nocardia, strain CBS No. 224.67, is prepared in the manner described in Example 1. The main fermentation medium consists of a solution of 5 g of corn steep liquor (calculated as dry matter) per liter of water, wel cher 1 g of yeast extract (DIFCO) has been added.
The medium is adjusted to a pH value of 7.0 using an aqueous sodium hydroxide solution and sterilized at 110 ° C. for 30 minutes. Each of the 500 cm3 flasks contains 100 cm3 of this medium. The inoculation percentage is 5%.
After shaking for 24 hours, 200 mg of cholesterol in the form of an aqueous suspension and a solution of 50 mg of CoCl2.6H2O are added to each flask. After 3 days of shaking, 32 mg of 3,17-dioxo-1,4-androstadiene are isolated from each flask according to: the method described in Example 1. The yield is 22%, based on the added cholesterol. <I> Example 8 </I> A culture of the species Nocardia, strain CBS No. 224.67, is produced as described in Example 7. 200 mg of cholesterol and 50 mg of CdSO4 are added to each flask.
After shaking for 24 hours, the presence of 3,17-dioxo-1,4-andmostadiene can be detected by thin-layer chromatography using the method described in Example 1.
<I> Example 9 </I> A culture of the species Nocardia, strain CBS No. 224.67, or of Nocardia, strain CBS No. 225.67, is prepared in the manner described in Example 7. 200 mg of cholesterol and sodium selenite are added to each flask in amounts between 3 and 10: mg per flask (30 to 100 mg / liter). After shaking for 24 hours, the presence of a mixture of 3,17-dioxo-1,4-androstadiene and 3,17-dioxo-4-androstene can be detected in each of the flasks according to the thin layer chromatography carried out according to Example 1.
<I> Example 10 </I> Similar to Example 2, a culture of the Arthrobacter species, strain CBS No. 221.67, is produced. Instead of cholesterol, you add 200 <I> mg </I> 13-sitosterol. The inhibitor consists of NiSO4. 7H.-0.
After 3 days, the flasks contain 3,17-dioxo-1,4-androstadiene in an amount which varies between 19 and 24 mg with each flask. The yield is about 15% based on the 3-sitosterol added. (The commercially available 3-sitosterol contains a number of steroids of practically the same structure, so that an exact determination of the yield is impossible).
<I> Example 11 </I> Example 10 is repeated, with the difference that one of the following cultures is used: Arthrobacter, strain CBS No. 22.67, and Nocardia, strain CBS No. 226.67. In both cases, the presence of 3,17-dioxo-1,4-androstadiene can be detected after 3 days using the thin-layer chromatography method described in Example 1.
<I> Example 12 </I> Similar to Example 2, a culture of the species Nocardia, strain CBS No. 225.67, is produced in 4 bottles, each containing 100 cm3 of the medium. 500 mg of CoCl2³6H2O are added to each flask. An aqueous suspension is added to each of the 4 flasks which consists of a) 3-oxo-4-cholesterol b) stigmasterol c) 5α-chlorocholestanol and d) a solution of cholesteryl betainate chloride.
In all cases the amount of steroid added to each flask is 100 mg. After 2 days, thin-layer chromatography -the presence of 3,17-dioxo-1,4-an @drostadiene can be detected.