Verfahren zur Herstellung von 9a- xysteroiden Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Steroiden und den so erzeugten neuartigen Verbindungen.
Insbeson dere bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Umwand lung eines 9a-Wasserstoff-1 1-oxysteraids der Pregnan- reihe oder der Allopregnanreihe zu einem 9a Hy- droxy-steroid durch die oxydierende Aktivität einer Art von Pilzen der Gattungen Cunninghamella und Helicostylum.
Vorzugsweise werden 11ss,21- Dioxy - 4,17(20)- pregnadien - 3 - an oder ein 21-Kohlenwasserstoff- carbonsäureester hiervon (USA-Patent Nr. 2 844 604) mit den oxydierende Eigenschaften besitzenden Pilz- arten der Gattungen Cunninghamella oder Helico- stylum behandelt, wobei 9a,21 Dioxy-4,17(20)- pregnadien-3,11-dion gebildet wird.
Diese Verbin dung kann in das bekannte physiologisch aktive 9a-Oxycortisonacetat umgewandelt werden (Fried et a1., J. Am. Chem. Soc. 79, 1130 [1957]), durch oxy- dative Oxylierung, nach Umwandlung in sein 21-Acetat, mit Osmiumtetroxyd und einem Oxyda tionsmittel gemäss dem Verfahren der USA-Patente Nrn. 2 769 823 und 2 769 825 und den nach stehend angeführten Beispielen.
Die oxydierenden Pilze, die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, sind Arten der Gattung Cunninghamella aus der Familie Choane- phoraceae und der Ordnung Mucorales, und Arten der Gattung Helicostylum aus der Familie Thanni- diaceae, ebenfalls aus der Ordnung Mucorales. Diese Gattungen sind gut definiert, und typische Arten können von Kultursammlungen, wie z B.
der American Type Culture Collection, bezogen werden. Pilzarten, die indem Verfahren dieser Erfindung ver wendet werden können, umfassen C. blakesleeana, C. elegans, C. verticullata, C. echinulata, C. bertholle- tia und H. piriforme.
Die Verwendung dieser Pilze bei der mikrobiolo- gischen Umwandlung gewisser Steroide ist bereits be kannt. Im USA-Patent Nr. 2 602 769 wird ein Bei spiel einer Hydroxylierung eines 11 Methylensteroids mit Cunninghamella blakesleeana angeführt. USA- Patent Nr.
2 812 286 beschreibt die 11a Hydroxy- lierung eines 11-Methylensteroids mit Cunning- hamella echinulata. Ein Beispiel einer 8- und einer 14 - Hydroxylierung eines 11- Methylensteroids mit Helicostylum piriforme wird in den USA-Patenten Nm. 2 703 806, 2 602 769 und 2 670 358 bekannt gemacht.
Die 9 Hydroxylierung eines 11-Oxysteroids mit einem Pilz, wie er im Verfahren dieser Erfindung verwendet wird, war bisher unbekannt. Diese Pilze sind innerhalb der Ordnung der Pilze, die im Ver fahren vom USA-Patent Nr 2 602 769 verwendet werden, aber ihr Gebrauch zur Bioumwandlung eines 11-Oxysteroids um 9a-Oxy-ll-ketosteroid herzustel len, ist darin nicht beschrieben.
Das vorliegende Ver fahren liefert eine Methode, um das physiologisch aktive 9a-Oxycortison und seine 21 Ester oder Zwi schenprodukte für die Herstellung derselben darzu stellen, ohne das verhältnismässig teure Hydrocortison- acetat als Zwischenprodukt zu verwenden. Statt dessen kann J 1ss,21 Dioxy-4,17(20)-pregnadien-3-on und seine Ester, die nun einfach aus Progesteron dar gestellt werden können (USA-Patent Nr. 2 844 604), verwendet werden.
Ausgangsmaterialien für das Verfahren dieser Erfindung sind: 9a-Wasserstoff-11-oxysteroide der Pregnan-oder Allopregnanreihe, vorzugsweise Steroide der llss-Oxypregnanreihe. Besonders bevorzugt sind d4-3 Ketö-9-Wasserstoff-1lss-oxysteroide der Pregnan- reihe. Die Ausgangssteroide können z. B. die in den Ecken sitzenden Methylgruppen, die für die meisten Steroide charakteristisch sind, enthalten, eine Me- thylgruppe in den 2-, 6-, 7-, 16-, 17- und 21-Stel- lungen, Halogen, z.
B. ein Fluoratom in den 2-, 4-, 6-, 16- und 21-Stellungen, eine Hydroxy- oder Acyl oxygruppe in den 1-, 3-, 5-, 6-, 7-, 8-, 12-, 14-, 15-, 16-, 17- und 21-Stellungen, eine Ketogruppe in den 3-, 6-, 7-, 12-, 16- und 20-Stellungen, eine Doppel bindung in den 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 14-, 16-, 17(20)
- und 20-Stellungen und andere Gruppen in andern Stellungen des Moleküls, wie z. B. Cyan, Alkoxy-, Maleinsäureanhydrid-Addukt, Epoxy-, Carboalkoxy-, Carboxy-, Vinyl-, Äthinyl-, aldehydische und Lakton- gruppen.
Die als Ausgangsmaterialien verwendeten Steroide der Pregnanreihe, die 9a Wasserstoff-11-oxygruppe besitzen, umfassen die Progesterone, Pregnenolone, Pregnane, Pregnene, Pregnadiene und Pregnatriene. Bevorzugt sind die 44-3-Ketopregnene. Die l lss-Oxy- steroide sind die bevorzugten Ausgangsmaterialien, die in den meisten Fällen im Verfahren dieser Er findung zu 11-Ketosteroiden oxydiert werden.
Die 9ss-Oxy-11-oxydierten Produkte des Verfahrens die ser Erfindung umfassen eine grosse Anzahl physiolo gisch aktiver Vertreter (siehe brit. Patent Nr. 777 996, USA-Patente Nrn. 2 840 572, 2 840 578, 2 840 599 und 2 840 580), z. B. 9a-Hydroxycortison, die ent zündungshemmende Wirksamkeit besitzen. Andere Verbindungen, wie sie in diesem Verfahren herge stellt werden, z.
B. solche ohne die 44-3-Ketogruppe oder 20-Ketogruppe in der Pregnanreihe, können in Verbindungen der Progesteronreihe, z. B. d4-3,20- Diketo-progesteron, durch die bekannten Reaktionen umgewandelt werden.
Bei der Ausführung des Ver fahrens dieser Erfindung wird das ausgewählte Aus- gangssteroidsubstrat, welches 9a Wasserstoff-11-oxy- steroid wie oben beschrieben umfasst und im wesent lichen frei von 11-Methylensteroid ist, der oxydieren den Aktivität einer Kultur von Pilzen der Gattung Cunninghamella oder Helicostylum, vorzugsweise unter Bedingungen einer aeroben, bewegten, unter getauchten Gärung in einem Nährmedium,
welches assimilierbaren Stickstoff, Kohlenwasserstoffe und vorzugsweise auch Phosphor enthält, ausgesetzt.
Steroidsubstrat bedeutet das zugefügte Steroid und umfasst nicht diejenigen Steroide, die von dem Pilz auf natürliche Weise erzeugt werden. Man lässt den Pilz vorzugsweise einige Zeit, z. B. 24-48 Stun den, wachsen, bevor man das Steroidsubstrat hinzu- fügt. Nach der Zugabe des Steroids werden die Gä rungsbedingungen, vorzugsweise während einiger Stunden, z. B. 24 Stunden und mehr, beibehalten, bevor die Steroidumwandlungsprodukte abgetrennt werden.
Eine vollständige Diskussion verschiedener Gärungsbedingungen findet sich im USA-Patent Nr. 2 602 769.
Die Steroidumwandlungsprodukte werden mit Vorteil durch Extraktion des Gärungspilzkörpers und des Mediums mit einem Lösungsmittel isoliert. Zum Beispiel wird das Mycel filtriert und mit Aceton ge waschen, und das Medium wird mit Methylenchlorid oder einem andern mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Gewöhnlich findet man den grössten Teil des Steroidumwandlungsproduktes im Pilzkörper.
Die extrahierten Steroide können dann durch die bekannten Verfahren, z. B. fraktionierte Kristallisa tion oder Chromatographie, gereinigt werden. <I>Beispiel 1</I> 9a,21-Dioxy-4,17(20)-(cis)-pregnadien-3,11-dion Ein Gärapparat, der 100 Liter eines sterilen Me diums bei einem pH von 4,9, das aus handelsüblicher Dextrose (10 g pro Liter) und Corn steep-Feststoffen (20 g pro Liter) hergestellt wurde, enthält, wurde mit 5 Liter einer vegetativen Kultur von Helico- stylum piriforme Bain (A. T. C. C. 8992) geimpft.
Nach 24 Stunden kräftigen Rührens und Belüftung mit einem Volumen von 2,0 Liter pro Minute wur den 20,0 g von llss,21-Dioxy-4,17(20)-(cis)-pregna- dien-3-on (USA-Patent Nr. 2 844 604) als Lösung in 500 ml Aceton hinzugefügt und die Gärung 48 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen fort gesetzt. Die Umwandlungsprodukte wurden nach der Methode von D. H. Peterson et a1., J.
Am. Chem. Soc. 74, 5933 (1952) extrahiert und ergaben etwa 42 g halbkristallinen Niederschlag, der in etwa 1 Liter trockenem Methylenchlorid aufgelöst wurde und über 2 kg Magnesiumsilikat (Florisil) chromato- graphiert wurde.
Die Kolonne wurde mit sechs 2-Liter-Portionen von jedem der folgenden Lösungs- mittelkompositionen entwickelt: Hexane (Skellysolve B) plus 180/9 Aceton, Hexane plus 20% Aceton, Hexane plus 2511/o Aceton und Hexane plus 500/a Aceton.
Die Rückstände der Fraktion 9-21, die Methy- lenfraktion mitgezählt, wurden vereinigt, in heissem Aceton aufgelöst, mit 2 g Holzkohle (Darco G-60) entfärbt, filtriert und das Filtrat konzentriert, bis reichliche Kristallisation einsetzte. Die Mischung wurde in einem Kühlschrank 2-3 Stunden lang ge kühlt und dann filtriert, wobei 10,33 g von 9a,21- Dioxy-4,17(20)-(cis)-pregnadien-3,11-dion mit einem Schmelzpunkt von 217-219 erhalten wurden.
Zu sätzliche Mengen an Kristallen wurden gesammelt, bis 12,31 g erhalten wurden, die aus Aceton um kristallisiert wurden und 9a,21-Dioxy-4,17(20)-(cis)- pregnadien-3,11-dion ergab, das bei 219,5-221 C schmolz und einen WD von + 173 C in Dioxan, einen .? mäh von 238,5 mu (a,%, 15,725), ---- vNuioi 3440, 3330, 1700, 1640 und 1605 cm-' max und die folgende Analyse aufwies:
EMI0002.0150
Berechnet <SEP> für <SEP> C21H2804: <SEP> C <SEP> 73,22 <SEP> H <SEP> 8,19
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 73,32 <SEP> H <SEP> 8,30 <I>Beispiel 2</I> 9a,21-Dioxy-4,17(20)-(cis)-pregnadien-3,11-dion 12 Liter eines sterilen Mediums, das aus 1,211/o Corn steep solids-Festkörpern und 1,011/a handels üblicher Dextrose (Cerelose) besteht und ein pH von 4,7 aufwies, wurde mit 600 ml einer 72 Stunden alten Kultur von Cunninghamella blakesleeana (A. T. C.
C. 8688a), die im gleichen Medium ge wachsen war, geimpft. Die Gärungsmischung wurde in einer Geschwindigkeit von 0,5 Liter Luft pro Minute belüftet und mit drehenden Schaufeln ener gisch gerührt. Nach 24 Stunden war das pH 4,4. Dieser Mischung wurden 3,0 g l lfl,21-Dioxy-4,17(20)- (cis)-pregnadien-3-on in 30 ml heissen Propylengly- kols zugegeben und die Belüftung und Rührung während 24 Stunden fortgesetzt. Dann wurde der Inhalt des Gärbottichs mehrmals mit Methylen- chlorid extrahiert.
Das 9a,21-Dioxy-4,17(20)-(cis)-pregnadien-3,11- dion wurde aus dem Bierextrakt auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben isoliert und seine Identität mit dem 9a,21-Dioxy-4,17(20)-(cis)- pregnadien-3,11-dion, das gemäss der Methode des Beispiels 1 erhalten worden war, bewiesen.
Gemäss dem Verfahren der Beispiele 1 und 2 wird 11/3,21-Dioxy-4,17(20)-(trans)-pregnadien-3-on in 9a,21 Dioxy-4,17(20)-(trans)-pregnadien- 3,11-dion, 11 a-Oxyprogesteron in 9a,lla-Dihydroxyprogesteron, 11f-Hydroxyprogesteron in 9a-Oxy-11-ketoprogesteron, 11,B,21 Dihydroxyprogesteron-21-acetat in 9a,21-Dioxy-11-ketoprogesteron umgewandelt.
Hydrocortisonacetat wird in 9a Hydroxycortison, 11f,17a-Dihydroxyprogesteron in 9a,17a-Dioxy-11-ketoprogesteron, 11ss-Oxypregnan-3,20-dion in 9a-Oxypregnan-3,11,20-trion, 3a,11i3,17a-Trioxypregnan-20-on in 3a,9a,17a-Trioxypregnan-11,20-dion, 3/3,11/:,17a-Trioxypregnan-20-on in 3a,9a,17a-Trioxypregnan-11,20-dion umgewandelt.
11ss,17a,21-Trioxyallopregnan-3,20-dion wird in 9a,17a,21-Trioxyallopregnan-3,11,20-trion, l lss,21-Dioxyallopregnan-3,20-dion in 9a,21-Dioxyallopregnan-3,11,20-trion, 11 ss,17a-Dioxyallopregnan-3,20-dion in 9a,17a-Dioxyallopregnan-3,11,20-trion und 3 a,11 ss,21-Trioxyallopregnan-3,20-dion in 3a,9a,21-Trioxyallopregnan-3,11,20-trion umgewandelt.
Das erhaltene 9a,21-Dioxy-4,17(20)-(cis)-pregna- dien-3,11-dion kann folgendermassen verestert werden: Zu einer Lösung von 5,0 g 9a,21-Dioxy-4,17(20)- (eis)-pregnadien-3,11-dion in 15 ml trockenem Pyri- din von 20 C wurden 15 ml Essigsäureanhydrid zu gegeben. Nach 17 Stunden bei Zimmertemperatur wurde die Lösung in 450 ml einer Eiswasser mischung gegossen. Das kristalline Produkt, das dabei ausfiel, wurde gut mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Man erhielt 5,53 g 9a,21-Dioxy-4,17(20)- (cis)-pregnadien-3,11-dion-21-acetat, das bei 172,5 bis 177 C schmolz. Die Umkristallisierung dieser Kristalle aus heissem Aceton, das filtriert und dann bis zum Einsetzen der Kristallisation auf einem Dampfbad konzentriert wurde, erhöhte den Schmelz punkt auf 188,5-190 C.
Diese Kristalle besassen
EMI0003.0073
und die folgende Analyse:
EMI0003.0074
Berechnet <SEP> für <SEP> <B>C23H3,05:</B> <SEP> C <SEP> 71,48 <SEP> H <SEP> 7,82
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 71,42 <SEP> H <SEP> 8,19 Das 21 Acetat kann folgendermassen in das 9a,17a,21-Trioxy-4 pregnen-3,11,20@-trion 21-acetat übergeführt werden:
Zu einer eiskalten Lösung von 387 mg (1 mM.) 9a,21-Dioxy-4,17(20)-(eis) pregnadien-3,11-dion-21- acetat in 18,5 ml tertiären Butylalkohols, der 0,93 ml Pyridin und 0,185 ml Wasser enthielt, wurden 370 mg N - Methylmorpholinoxyd, 800 mg Phenyljodoso- acetat und 4,0 mg Osmiumtetroxyd zugegeben.
Die Aufschlämmung wurde 2 Tage lang bei 0-5 C ge rührt, 600 mg Filtersubstanz (Magnesoi) wurde zu gefügt, gefolgt von einer Lösung von 150 mg Na triumsulfit in 10 ml Wasser.
Die sich ergebende Mi schung wurde 15 Minuten lang bei Zimmertempera tur gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert, bis die erste Spur einer Fällung einsetzte. Die Lösung wurde mit einem Minimum an tertiärem Butylalkohol geklärt und bei Zimmertemperatur 1 Stunde gerührt. Der sich ausscheidende Niederschlag wurde abfil- triert,
mit tert. Butylalkohol und Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhielt 245 mg 9a,17a,21- Trihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion 21-acetat, das bei 233-236 C schmolz. Eine polymorphe Modifika tion wurde erhalten, welche bei 212-214 C schmolz. Umkristallisation aus einer Mischung von Aceton und Hexanen erhöhte den Schmelzpunkt auf 237 bis 239 C.
EMI0003.0117