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Verfahren zur Herstellung von Estern des 4-Pregnen-11, 17a, 21-triol-3,
20-dions bzw. von 21-Estern des 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 20-trions Die Erfindung
bezieht sich auf ein verfahren zur Herstellung von Estern des 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3,11,
2o-trions durch Acylierung eines durch biologische Oxydation von 4-Pregnen-i7a,
2i-diol-3, 2o-dion mit einer Pilzart der Ordnung Mucorales, z. B. aus der Familie
der Mucoraceae, wie der Gattung Rhizopus oder der Gattung Cunninghamella, z. B.
den Arten Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus oder Cunninghamella blakesleeana
hergestellten 4-Pregnen-ii, i7a,-2i-triol-3, 2o-dions in bekannter Weise mit einem
Acylierungsmittel bzw. die im Anschluß daran durch-
geführte Oxydation des erhaltenen 4-Pregnen-ii, i7a,- |
2i-triol-3, 2o dion-2i-acylates mit Chromsäure in |
ebenfalls.bekannter Weise. |
Die nach dem erfindungsgemäßen verfahren er- |
haltenen neuen Ester des 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol- |
3, 2o-dions, nämlich die 4-Pregnen-1ia, i7a, 21-triol- |
3, 2o-dion-2i acylate, die 4-Pregnen-iia, 17a, 21-triol- |
3, 2o-dion-ii, 2i-diacylateunddie4-Pregnen-iiß, 17a, |
21-triol-3, 2o-dion-2i-acylate, sind leicht zu reinigende |
Abkömmlinge der entsprechenden Trioxysteroide; sie |
sind für die Synthese des Cortisons von Nutzen. Die |
Mono- und Di-Ester des 4-Pregnen-iia, z7a, 2i-triol-3, 2o-dions
sind auch für sich pharmakologisch wirksam.
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Die für -das erfindungsgemäße Verfahren angewandte Ausgangsverbindung
wurde durch mikrobiologische Oxydation von 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 2odion mit
einem Sauerstoff übertragenen Pilz der Ordnung Mucorales oder der daraus gewonnenen
Sauerstoff übertragenden Enzyme hergestellt, Das so erhaltene 4-Pregnen-ii, 17a,
2i-triol-3, 2o-dion wird sodann als rohes Gärungsprodukt, das frei ist von Verunreinigungen
aus der wäßrigen Phase, ohne vorhergehende Reinigung oder .in gereinigter Form mit
einem Acylierungsmittel, wie Keten, einem Keten einer Säure, einer Säure, einem
Säurechlorid, einem Säureanhydrid oder einem andern bekannten Acylierungsmittel,
zweckmäßig in einem Lösungsmittel wie Benzol, Toluol, Pyridin oder Äther bei Temperaturen
zwischen o° und dem Siedepunkt der Lösung, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in bekannter
Weise innerhalb einer halben bis ioo Stunden umgesetzt. Sowohl die Reaktionszeit
als auch die Reaktionstemperatur, das Acylierungsmittel und das Verhältnis der Reaktionspartner
können verändert werden. Das Reaktionsgemisch wird anschließend abgekühlt oder durch
Vermischen mit Eis oder kaltem Wasser verdünnt, das Produkt in einem geeigneten
Lösungsmittel aufgenommen, anschließend mehrmals mit schwach alkalischen Lösungen
und Wasser gewaschen, bis die Lösung des Acylierungsproduktes neutral reagiert.
Nach dem Trocknen dieser Lösung kann das acylierte 4-Pregnen i1, 17a, 2i-triol-3,
2o-dion durch Verdampfen des Lösungsmittels abgetrennt werden. Der- Rückstand wird
entweder direkt zum 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, =1, 2o-triOn-2i-acylat oxydiert 'oder
zunächst nach üblichen Methoden, z. B. durch Umkristallisieren oder Chromatographieren,
gereinigt.
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Nach dem vorstehend beschriebenen Acylierungsverfahren erhält man
sowohl die Mono- als auch Di-Ester in einem Mengenverhältnis, das vom Verhältnis
des Acylierungsmittels zum 4-Pregnen-ii, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion abhängig ist.
Bei Verwendung von etwa i Mol Acylierungsmittel auf i Mof des Ausgangssteroids entsteht
vorwiegend das monoacylierte Produkt, hingegen besteht größere Neigung zur Bildung
des diacylierten Produktes, wenn auf i Mol Steroid 2 oder mehr Mole Acylierungsmittel
verwendet werden.
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Unter den Estern, welche auf diese Weise hergestellt werden-können,
werden besonders genannt das 4-Pregnen-iia, 17a, 2=-triol-3, 2o-dion-2i-propionat
und das entsprechende =i a, 2i-dipropionat, das 4-Pregnen-iiß, 17a, 2i-triol-3,
2o-dion-2i-propionat, das 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-trimethylacetat
und das entsprechende na, 2i-ditrimethylacetat, das 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3,
2o-dion-2i-ß-cyclopentylpröpionat und das entsprechende ==a, 2i-di-ß-cyclopentylpropionat,
das 4-Pregneniia, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-benzoat bzw. das entsprechende iia,.2i-dibenzoat.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren - herstellbaren 4-Pregnen-=ia, =7a, 2i
triol-3, 2o-dion-2i-acylate bzw. die entsprechenden ==a, 2i-diacylate und die 4-PregnenxIß,
17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acylate enthahzn in der Acylgruppe die Reste von Säuren
mit = bis einschließlich 8 Kohlenstoffatomen, die zu den gesättigten oder ungesättigten
aliphatischen, carbocyclischen, cycloaliphatischen Carbonsäuren sowie zu den Aryl-,
Aralkyl-, MoGo-, Di- oder Polycaxbonsäuren gehören können. Die Estergruppen- enthalten
außer den vorstehend genannten Resten beispielsweise Formyloxy-, Acetoxy-, Dimethylacetoxy-,
But:iyryloxy-, Valeryloxy-, Hexanoyloxy-, Heptanoyloxy-, Octanoyloxy-, Phenylacetoxy-,
Toluoyloxy-, Naphtoyloxy-, Cyclopentylformyloxy-, Acryloxy-, Cyclohexylformoxyreste;
ebenso sind nach dem erfindungsgemäßen Verfahren z. B. die Mono- und -Diester der
Malon-, Malein-, Bernstein-, Glutar- und Adipinsäure herstellbar. Die vorstehend
genannten Säurereste können auch unter den Reaktionsbedingungen inerte Substituenten,
wie Mono- öder Polyhalogen-, Chlor-, Brom-, Oxy- oder Methoxygruppen enthalten.
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Zur Herstellung eines gemischten Esters mit zwei verschiedenen Acylgruppen
z. B. des 4-Pregneniia, =7a, 2i-triol-3, 2o-dion-iia-propionat-2i-ß-cyclopensylpropionats
kann man das 4 Pregnen-iia, =7a, 2z-triol-3, 2o-dion mit einem Acylierungsmittel
teilweise verestern und den- entstandenen Monoester mit einem Acylierungsmittel,
das eine andere Acylgruppe einführt, weiterbehandeln.
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Die q.-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acylate oder 4-Pregnen-iiß,
17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2iacylate werden als Rohprodukt -oder in gereinigter Form
mit Chromtrioxyd in essigsaurer Lösung zu den entsprechenden 2i-Estern des 4-Pregnen-i7a,
2i-diol-3, i=, 2o-trions (Cortison) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oxydiert;
dabei - bleiben die jeweiligen 2i-ständigen Acyloxygruppen unverändert.
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Für die Herstellung des Ausgangsstoffes wird im Rahmen vorliegender
Erfindung Schutz nicht begehrt. Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße
Verfahren. Beispiel i 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion Es wurde eine Nährlösung
hergestellt, die auf = 1 Wasser 2o g enzymatischen Auszug von Lactalbumin (bekanutunterdemHandelsnamennEdamine("),
3 g Maisquellwasser und 50 g technische Dextrose enthielt und deren p11-Wert
auf 4,3 bis 4,5 eingestellt wurde. 4 1 dieser sterilisierten Lösung wurden mit Rhizopus
nigricans geimpft, 24 Stunden bei einer Temperatur von 28° bebrütet und durch Rühren
und Belüftung die Sauerstoffaufnahme auf eine Geschwindigkeit eingestellt, die entsprechend
der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S.
5o4) 6,3 bis 7 Millimol Nag S03 je Liter und Stunde entsprach. Zu dieser Kulturlösung,
die eine 24 Stunden alte Kultur von Rhizopus nigricans enthielt, wurden 2 g 4-Pregnen-i7
a, 2i-diol-3, 2o-dion (Reichsteins Verbindung S) in 5o ccm Aceton suspendiert. Nach
weiterer 96stündiger Bebrütung unter denselben Temperatur- und Belüftungsverhältnissen
wurden die Würze und das Mycel extrahiert. Das Mycel wurde zweimal filtriert,
und
zwar jedesmal mit etwa dem gleichen Volumen Aceton, gewaschen und sodann zweimal,
und zwar jedesmal mit dem gleichen Volumen Methylenchlorid, extrahiert. Die Aceton-
und Methylenchloridauszüge sowie das Lösungsmittel wurden mit dem Würzefiltrat vereinigt.
Die vereinigten Auszüge des Würzefiltrates wurden nacheinander zweimal mit
0,5 Volumteilen Methylenchlorid und dann zweimal mit 0,2,5 Volumteilen Methylenchlorid
extrahiert. Die vereinigten Methylencnloridextrakte wurden zweimal mit o,i Volumteilen
2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und auf die gleiche Weise mit Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen des Methylenchlorids mit ungefähr 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat
je Liter Lösung und Filtrieren wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der halbkristalline
Rückstand wog 4,988 gg und wurde viermal mit je 6 ccm eiskaltem Methylenchlorid
verrieben. Als Rückstand wurden. 630 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt
von T94 bis 199° erhalten. Durch Umkristallisieren dieses Rückstandes aus einem
Gemisch von 3 ccm Methanol und io ccm Äther erhielt man 4o4 mg Kristalle mit einem
Schmelzpunkt von 2o5 bis 21o°. Zweimaliges Umkristallisieren aus demselben Lösungsmittelgemisch
ergab 132 g 4-Pregneniia, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion mit einem konstanten Schmelzpunkt
von 2o9 bis 212° bzw. 217 bis 2i9°, der von der Kristallform abhängig ist; (1,568
in Methanol).
Analyse Berechnet als C21 H3003:. C 69,58 0/0, H 8,35 %; gefunden: C 69,26%, H 8,34%.
4-Pregnen-iia, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acetat und -ii, 2i-diacetat Zu einer
Lösung aus 500 mg 4-Pregnen-iia, 17a,
2i-trio1-3, 2o-dion in 4 ccm
Pyridin wurden 155 mg Essigsäureanhydrid tropfenweise zugefügt. Das Reaktionsgemisch
wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, anschließend mit 70 ccm
eiskaltem Wasser verdünnt und sodann zweimal mit je 50 ccm und zweimal mit
je 25 ccm 12eth3#lencltlorid extrahiert. Der Extrakt wurde zweimal mit je 25 ccm
5%iger Salzsäure, dann mit 25 ccm io%iger Natriumbicarbonatlösung und schließlich
mit Wasser neutral gewaschen. Der Auszug wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und das Lösungsmittel verdampft. Der ölige Rückstand wurde in 125 ccm Äthylendichlorid
gelöst und an 8 g synthetischem Magnesiumsilikat (bekannt unter dem Handelsnamen
@,Florisil«) chromatographiert. Die Entwicklungsflüssigkeiten kamen in folgender
Reihenfolge zur Verwendung: i. und 2. Äthylendichlorid, 3. bis 5. Äthylendichlorid-Aceton,
Volumverhältris 25: 1, 6. und 7. Äthylendichlorid-Aceton 15: 1, B. bis ii. Äthylendichlorid-Aceton
12: 1, 12. bis 14. Äthylendichlorid-Aceton io : 1, 15. bis 18. Äthylendichlorid-Aceton
8 : 1, i9. und 2o. Äthylendichlorid-Aceton 5 : i, 21. bis 23. Äthylendichlorid-Aceton
2 : 1, 24. und 25. Aceton.
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Die chromatographischen Fraktionen 15 bis 2o wurdle-n vereint, und
nach dem Verdampfen des Lösungsmittels konnten 162 mg 4-Pregnen-iia, i7a, 21- triol
- 3, 2o - dion - 21- acetat erhalten werden. F. = 95 bis ioo°;
in CHC13 wurden-Absorptionsmaxima bei 2, = 1734, 1718, 1698, 1656 cm-' beobachtet.
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Die Extrakte der. Fraktionen 8 bis ii nach der vorstehend beschriebenen
chromatographischen Entwicklung wurden durch Verdampfen vom Lösungsmittel befreit,
vereinigt und aus Aceton unter tropfenweiser Zugabe von Petroläther umkristallisiert.
Nach dreimaligem Umkristailisieren wurden 35 mg 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-tiio1-3,
2o-dion-ii, 2i-diacetat mit einem Schmelzpunkt von 198 bis 2o2° erhalten;
(1,145 in Chloroform) ; für,1 240 ergab sich k = 33,33.
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Analvse Berechnet nach C,Ha40a: C 67,240/0, H 7,670/0; gefunden: C
67,43%, H 7,94% 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, ii, 2o-trion-2i-acetat (Cortisonacetat)
162 mg des vorstehend erhaltenen 4-Pregneni i a, 17a, 21- triol - 3, 2o -
dion - 2i - acetats wurden in io ccm Eisessig gelöst und durch tropfenweise Zugabe
einer Lösung von 30 mg Chromtrioxyd (Cr O,) in 0,5 ccm H20 und 2 ccm Essigsäure
oxydiert. Nach 6stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die grüne Lösung mit 2o
ccm Methanol verdünnt 'und unter vermindertem Druck eingedampft. Der kristalline
Rückstand wurde in 25 ccm io0/0iger Natriumbicarbonatlösung aufgeschlämmt und viermal
mit je 25 ccm einer Mischung von 4 Volumteiien Äther und i Volumteil Chloroform
extrahiert. Der Extrakt wurde dreimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet.
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Das erhaltene kristalline Oxydationsprodukt wog 166 mg. Nach dem Umkristallisieren
aus Aceton wurden 138,5 mg 4-Pregnen-17a, 2i-diol-3, ii, 2o-trion-2i-acetat (Cortisonacetat)
erhalten. Der Schmelzpunkt betrug 243 bis 245°, für A "..x = 238 ergab sich k =
36,33;
(o,3657 in Chloroform).
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Analyse Berechnet als C23Hao0s: C 68,61%, H 7,520/0; gefunden: C 68,520/0,H
7,610/0.
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Beispiel e 4-Pregnen-iiß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion Es wurde eine Nährlösung
hergestellt, die 0,5/o Pepton, 2 0/0 Dextrose, -0,5 0/0 Sojabohnenmehl, o,5 0/0
KH2P04, 0,5% NaCl und 0,3% Hefeextrakt in Wasser gelöst enthielt. .20o ccm dieser
sterilisierten Kulturflüssigkeit wurden mit Cunninghamella blakesleeana beimpft.
Die Sporen werden zuerst aus einem Sporenbehälter in eine Fleischbrühe verpflanzt,
und diese wurde sodann 24 bis
72 Stunden unter aeroben Bedingungen auf einer
Schüttelmaschine bis zum Beginn vegetativen Wachstums bebrütet. Anschließend wurde
die Kultur 48 Stunden bei 24° bebrütet, danach mit 66 mg 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3,
2o-dion (Reichsteins Verbindung S; ii-Desoxyi
7-Oxycorticosteron)
in möglichst wenig Äthanol gelöst, versetzt und die Bebrütung'weitere 7 Stunden
bei 24° fortgesetzt. Die das Steroid enthaltende Würze wurde mit 8oo ccm Aceton
verdünnt, eine Stunde auf der Schüttelmaschine geschüttelt und filtriert. Der Filterkuchen
wurde in
500 ccm Aceton aufgeschlämmt, eine weitere Stunde geschüttelt und
nochmals filtriert. Aus den vereinigten Filtraten wurde das Aceton unter vermindertem
Druck bis 50° eingeengt. Wenn notwendig, wurde dann soviel Acetoxi zugegeben, daß
eine 2o°/oige wäßrige Acetonlösung entstand, die anschließend fünfmal mit- je 1/3
Völurnteil Petroläther (bekannt unter dem Handelsnamen »Skellysolve B«) zwecks Entfernung
fettiger Bestandteile extrahiert wurde. Diese Extrakte wurden zweimal mit j@ %o
Volumteil 2o°/oigem wäßrigem Aceton ausgewaschen und die Waschflüssigkeiten mit
dem Aceton-Hauptextrakt vereint. Diese vereinten Extrakte wurden sechsmal mit 1/4
Volumteil Äthylendichlorid extrahiert, wobei nach dem Verdampfen des Äthylendichlorids
im Vakuum das Steroid als Rückstand erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde in möglichst
wenig Methylenchlorid aufgenommen und auf eine Kolonne gegeben, die mit
30 g Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagela) beschickt
war, das vorher mit 21 ccm Äthylenglykol verrieben wurde. Anschließend wurden verschiedene
mit Äthylenglykol gesättigte Entwicklungsmischungen durch die Kollone geschickt.
Die Säule wurde am automatischen Schneidgerät für chromatographische Fraktionen
nach Maßgabe der Verringerung der Lichtabsorption bei 2,40 mA, gemäß nachstehender
Tabelle in Bänder zerschnitten.
Am automatischen Schneidgerät erhaltene chromatographische
Fraktionen |
Röhren Nr. Rohe |
# Band Lösungsmittel (6o ccm) Feststoffe |
" |
in mg |
i Cyclohexan . . . . .. . . . . . . .. . . . . ... . . . .
. . . . . . . . x bis 4 11,0 |
2 Cycrohexan-Methylenchlorid 3 : _ . . . . . . . . . . . .
. . . . 5 bis 13 6,4 |
.3-- Cyclohexan-Methylenchlorid i : _ . . . . . . .
. . . . . . . . . 14 bis 16 - 3,0 |
4 Cyclohexan-Meihylenchlorid 2 : 3 : . . . . . . . . . . .
. . . . z7 bis 23 ö,o |
Cyclöhexan-Methylenchlorid i : 4 . . . . . . . . . . . . .
. . . 24 bis 38 z2,2 |
6 Methylenchiorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 39 bis 59 4,8 |
Eine Menge von 7,7 mg aus Band 5 wurde in möglichst wenig Acetoxi aufgenommen und
abgekühlt; bis sich Kristalle abschieden. Diese kalte Acetonmischung wurde zentrifugiert
und die überstehende Flüssigkeit mit einer Pipette abgezogen. Auf die abgeschiedenen
Kristalle wurden wenige Tropfen eiskalter Äther-Aceton-Mischung 3 : z zugefügt,
geschüttelt, wieder zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgehebert. Diese
Äther-Aceton-Waschung wurde- wiederholt. Die erhaltenen Kristalle wurden im Vakuum
getrocknet; sie bestanden aus 3,3 mg reinem 4-Pregnen-. 11ß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion
(KeAdallsVerbindung F; i7-Oxycorticosteron). Es werden nach vorstehend. beschriebenem
Verfahren gleichzeitig erhebliche Mengen an 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, ii, 2o-trion
(Kendalls Verbindung E; ir-Dehydro-i7-OXycorticosteron, Cortison) erhalten.
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4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 2o-trion-21-acetat (Cortisonacetät)
Eine Lösung aus 500 mg 4-Pregnen-iiß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion in 5 ccm Pyridm
wurde tropfenweise mit 150 mg Essigsäureanhydrid versetzt. Nach 24stündigem Stehen
bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 75 ccm eiskalten! Wasser 'verdünnt
und dann zweimal mit je 50 ccm kaltem Äther und zweimal mit j e 25 ccm Methylenchlorid
extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zweimal mit j e ,25 ccm kalter 5 %iger
Salzsäure, dann mit 25 ccm 2%iger Natrium- bicarbonatlösung und schließlich mit
Wasser neutral gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Durch Umkristallisieren aus
Aceton unter tropfenweiser Zugabe von Petroläther wurde das 4-Pregnen-iiß, i7a,
2i-triol-3, 2o-dion-2i-acetat erhalten, F. = 215 bis 223°;
bis 166°; Absorptionsbanden bei A, mag = 24o bis 242 mu.
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Durch Oxydation mit Chromsäure, wie im-Beispiel i beschrieben, wird
das 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 11, 2o-trion-2i-acetat mit den dort genannten Kennzahlen
erhalten.