DE1618848A1

DE1618848A1 - Verfahren zur Herstellung von 3-alpha,5-Cyclo-6ss,19-oxido-5alpha-androstan-17-on

Info

Publication number: DE1618848A1
Application number: DE19671618848
Authority: DE
Inventors: Atsushi Naito; Makoto Shirasaka; Katsumi Tanabe
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1966-02-01
Filing date: 1967-01-31
Publication date: 1971-02-18
Also published as: CH478780A; NL6701506A; GB1122600A; US3475275A; FR1509708A

Description

Dlpl.-Ιπσ, Kar! gestoben

Patentanwalt 1 6 1 8 8 A

Berlin >9, Keiserdamm 28

31. Januar 196? P.

Sankyo Company, Limited in Tokyo (Japan).

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Verfahren zur Herstellung von 30C*5-Cyclo-6ß,19-oxido-5a-androstan-17~on. g

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung einer Steroidverbindung. Sie bezieht sich insbesondere auf ein neues Verfahren zur Herstellung von 3<tf>5-Cyclo-6ß,19-oxido«5oC-androstan-17-on durch Fermentation.

Das oben genannte besondere Steroid der Androstanreihe ist eine Steroidverbindung, von der bekannt ist, daß sie nützlich ist als ein wertvolles Zwischenprodukt für die Herstellung verschiedener 19-Norsteroide, beispielsweise von 19-Nortestosteronderivaten mit anabolischen oder Schwangerschafts-Aktivitäten.

Die chemische Synthese des erwähnten besonderen Androstan® wurde früher mit Erfolg aufgezeigt (französisches Patent No. 1.353.691, erteilt für K. Tanabe et al. am 20,1„1964). Es ist jedoch sehr erwünscht, ein vorteilhafteres Verfahren zur Herstellung des genannten Androstane zu finden* ι

Als ein Ergebnis umfangreicher Forschungen nach einer Methode zur mikrobiologischen Herstellung des genannten Androstane wurde nun unerwarteterweise gefunden, daß verschiedene natürliche 3eC,5-Cyclo-6ß,19-oxido-sterole mit einer Hydrocarbyl-Seitenkette in der 17-Stellung des Steroidskeletts in befriedigender Weise umgewandelt werden können in 3o6,5-Cyclo-6ß,19-oxido-5oO-androstan-17-on mit oxydativem Abbau der Sterol-Seitenkette durch die Einwirkung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus den Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium und Arthrobacter.

Es ist daher ein Zweck der Erfindung, ein neues und vorteilhaftes Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von ^^»^-Cyclo-eßji^oxido-Sji-androstan-iy-on mit Hilfe eines Mikroorganismus der Gattungen Corynebacterium oder Arthrobacter aufzuzeigen.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung.

Sie Erfindung besteht also im Wesentlichen in einem neuen Verfahren zur Herstellung von 5e6,5-Cydo-6ß,19-ox±do-5et~androstan-17-on, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Sterol der allgemeinen Formel

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worin R eine Hydrocarbyl-Seitenkette mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, der Einwirkung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus den Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium und Arthrobacter, unter aeroben Bedingungen oder der Ein-

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wirkung von Enzymen, die durch diese Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen erzeugt werden, unterwirft.

Bei dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen mikrobiologischen Verfahren schließen typische Beispiele des als Substrat zu verwendenden Sterols (I) die folgenden Sterole ein:

6, £-Cyclo-6ß, 19-oxido-

3o6,5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5<a-sitostan und 3o£,5-Cyclo-6ß, 19-OxIdO-^oC- stigmastan.

Typische Beispiele von Mikroorganismen, die sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als nützlich erwiesen haben, schließen Mikroorganismen ein, welche zu den folgenden gehören:

Corynebacterium equi (IAM 1038), Corynebacterium xerosis,

Arthrobacter simplex (IAM 1660) und

Arthrobacter ureafaciens (IAM 1658).

Diese Mikroorganismen wurden in der Literatur beschrieben, und sie sind dem Fachmann bekannt.

Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die oben beschriebenen Mikroorganismen als solche inokuliert und kultiviert werden in einem geeigneten Kulturmedium, welches das genannte Sterol (I) als Substrat enthält, unter aeroben Bedingungen. Das Verfahren kann auch ausgeführt werden, indem man die genannten Mikroorganismen nach der Adaptation verwendet, d.h. die Kultur, in der die genannten Mikroorganismen zuvor in einem geeigneten, das genannte Sterol (I) enthaltenden Medium entwickelt wurde,

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kann in ein geeignetes Kulturmedium, welches das genannte Sterol (I) als Substrat enthält, unter aeroben Bedingungen eingebracht und kultiviert werden. Alternativ können die Mikroorganismen auch inokuliert und kultiviert werden in einem geeigneten Kulturmedium, welches kein Substrat enthält, unter aeroben Bedingungen, und sukzessiv wird die aerobe Kultur nach Hinzufügen des Substrats durchgeführt. Darüberhinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich durchgeführt werden, indem man als einen Impfstoff die Enzyme (oder die Rohflüssigkeit davon) verwendet, die aus den

ψ wachsenden Mikroorganismen durch Zerreißen der Zellen durch übliche Mittel gewonnen werden, beispielsweise durch eine "French Press", einen Schalloszillator, Lysozym, ein oberflächenaktives Mittel, und dergleichen. In jedem Fall sollten bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die aeroben Bedingungen eingehalten werden. Bas Kulturmedium kann zusammengesetzt sein aus üblichen Bestandteilen, wie sie beim Kultivieren der oben beschriebenen Mikroorganismen allgemein verwendet werden. Geeignete Kulturmedien enthalten eine Kohlenstoff-

. quelle, Stickstoff und erforderlichenfalls mineralische Stoffe (anorganische Salze). Geeignete Kohlenstoffquellen schließen ein Glucose, Sucrose, Xylose, Rohrzucker, Stärke, Glycerin und dergleichen. Geeignete Stickstoffquellen schließen ein Getreidequellflüssigkeiten, Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen. Geeignete mineralische Stoffe schließen ein Natriumchlorid, Ammoniumnitrat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Dikaliumhydrogenphosphat und dergleichen.

Bei Ausführung der Fermentation kann irgend eines der aeroben Kulturverfahren, welches dem Fachmann geläufig ist,

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befriedigend angewendet werden, jedoch werden Schüttelkulturen, stationäre Kulturen und Kulturen mit Belüftung bevorzugt angewendet. Das Kultivieren wird im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 20 ⁰G bis 4-0 ⁰C, bevorzugt bei etwa 30 ⁰C, durchgeführt.

Es ist erstrebenswert, daß der pH-Wert des Kulturmediums innerhalb des pH-Bereiches von etwa 6,0 bis 9,0, bevorzugt bei etwa 7,0 bis 8,0, liegt. Die Fermentation wird im allgemeinen während etwa 4· Tagen bis 8 Tagen, vorzugsweise etwa 5 bis 7 Tagen, durchgeführt. Das Substrat kann zu dem Kulturmedium entweder in fein verteilter Form oder als eine Lösung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Methanol, Aceton und dergleichen, hinzugefügt werden.

Es wurde auch gefunden, daß die Hinzufügung eines Inhibitors zum Kulturmedium bei einer Konzentration von etwa 10 ^ bis 10 ^y Mol die Ausbeute des gewünschten 3td,5-Cyclo-6ß,19-oxido-5oC-androstan-17-on verbessert. Obwohl die Einzelheiten dieser Verbesserung noch nicht ganz aufgeklärt sind, nimmt man mit Sicherheit an, daß ein solcher Inhibitor die Mikroorganismen wirksam an der weiteren Umwandlung des erhaltenen Androstane in andere unerwünschte Verbindungen hindert. Geeignete Beispiele von Inhibitoren, welche für diese Zwecke verwendet werden können, schließen ein 2,2'-Bipyridin, (oCoC'-Dipyridyl), Pyrogallol, Thymol, Thioharnstoff, NatriumdiäthyIdithiocarbamat, Äthylendiamintetraessigsäure und die Salze davon (Dinatrium- und Tetranatriumsalze), Pentachlorphenol, Kaliumcyanid, Natriumazid und dergleichen.

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Die Isolierung des gewünschten Produktes aus der Permentationsbrühe kann in einer für den Fachmann wohl bekannten Weise durchgeführt werden. Beispielsweise wird die Brühe mehrmals mit Äthylacetat extrahiert, die vereinigten Extrakte werden nacheinander mit wäßrigem Natriumcarbonat und mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet .und eingeengt, wobei ein öliger Rückstand verbleibt. Der Rückstand wird durch eine Aluminiumoxydsäule mit Benzoln-Hexan (1:1) chromatographyert, wobei man das gewünschte Androstan erhält, das weiterhin durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie η-Hexan, gereinigt werden kann.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium hergestellt, welches die folgenden Bestandteile enthält:

Bestandteil Gramm

Glucose 30

Peptone 30

Fleischextrakt 30

Natriumchlorid 9 Wasser bis zu 3 Liter

Das Kulturmedium wurde auf einen pH von 7»2 eingestellt und auf dreißig 500 ml-Schüttelkolben aufgeteilt, von denen ein jeder 100 ml des Mediums enthielt. Nach dem Sterilisieren bei 120 ⁰C (unter einem Druck von 15 lbs) während 15 Minuten wurde ein Substrat von 500 mg 3*6,5-0yolo-6ß,19-oxido-

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5a-cholestan, gelöst in 50 ml Dimethylformamid, in Portionen von 1 ml zu jedem dieser Kolben hinzugefügt (alternativ kann das Substrat nach feiner Verteilung in einem Mörser in Portionen zu je 10 mg den Kolben zugeteilt werden). Dann wurde Corynebacterium equi (IAM 1038) inokuliert, und die Schüttelkultur wurde 6 Tage bei 30 ⁰C und bei 120 Umdrehungen pro Minute ausgeführt. Am Ende dieser Zeit wurde der pH der Fermentationsbrühe auf einen pH von 8,2 bis Q₁A- eingestellt. Nach der Inkubation wurde die Fermentationsbrühe gesammelt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von etwa 500 ml eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wurde zweimal nacheinander mit einer 2 #igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung und mit Wasser gewaschen und nach dem Trocknen weiterhin zu einer öligen Substanz eingeengt, die dann durch eine Alumxniumoxydsäule mit Benzol-n-Hexan (1:1) chromatographiert wurde. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde die erhaltene kristalline Substanz aus η-Hexan umkristallisiert, wobei man 3^i»5-Cyclo-6ß,19-oxido-5eG-androstan-17-on erhielt, das bei 137 bis 13& °C schmilzt.

Bei Anwendung von Arthrobacter ureafaciens (IAM 1658) erhielt man in ähnlicher Weise das gewünschte Androstan.

Beispiel 2

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß ein Kulturmedium der nachstehenden Zusammensetzung angewendet wurde, wodurch in ähnlicher Weise das gewünschte Androstan erhalten wurde:

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Bestandteil Gramm

Getreidequellflüssigkeit 21

Ammoniumnitrat 6

Dikaliumhydrogenphosphat 1,5

Magnesiumsulfat 1,5

Wasser bis zu 3 Liter

Das oben beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 3^>5-Cyclo-6ß,19-oxido-5o6-ergostan (-sitöstan oder stigmastan) verwendet wurde, wobei man ähnliche Ergebnisse erhielt.

Beispiel 3

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium zusätzlich 2,2'-Bipyridin bei einer molaren Konzentration von 1,0 χ 10 bis 8 χ ΙΟ"-' enthielt, wobei man das gewünschte Androstan in einer weiter verbesserten Ausbeute erhielt.

Das oben beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die folgenden Inhibitoren anstelle von 2,2·-Bipyridin verwendet wurden, wobei in ähnlicher Weise günstige Resultate erhalten wurden: Pyrogallol, Thymol, Thioharnstoff, Natriumdiäthyldithiocarbamat, Äthylendiamintetraessigsäure (freie Säure, Dinatriumsalz oder Tetranatriumsalz), Pentachlorphenol, Kaliumcyanid oder Natriumazid.

Beispiel 4

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Arthrobacter simplex (IAM 1660)

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anstelle von G. equi verwendet wurde, wobei das gewünschte Androstan in ähnlicher Weise erhalten wurde.

Durch Verwendung von Arthrobacter ureafaciens erhält man ein ähnliches Ergebnis.

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 3üO»5-C!yclo-6ß,19-oxido-5o£-androstan-17-on, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

worin R eine Hydrocarbyl-Seitenkette mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, der Einwirkung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus den Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium und Arthrobacter, oder der Einwirkung der Enzyme, die durch diese Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen erzeugt werden, unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt ist aus einer Gruppe von Mikroorganismen, bestehend aus Gorynebact erium equi (IAM 1038), Corynebacterium xerosis, Arthrobacter simplex (IAM 1660) und Arthrobacter ureafaciens (IAM 1658).

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe von Verbindungen, bestehend aus

3<^»5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5öC-cholestan, 3o6,5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5tf6-ergostan, 3oi,5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5ö£-sitostan und 5-Cyclo-6ß t ^-

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A-. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren durchgeführt wird in Gegenwart eines Inhibitors, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2,2'-Bipyridin, Pyrogallol, Thymol, Thioharnstoff, Natriumdiäthyldithiocarbamat, Athylendiamintetraessigsäure und den Dinatrium- und Tetranatriumsalzen davon, Kaliumcyanid und Natriumazid.

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