Verfahren zur Herstellung von 16a-Alkyl-lla,17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dionen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel lung von neuen Steroid-Verbindungen, nämlich von 16a-Alkyl-Ila,17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dionen, aus gehend von 16a-Alkyl-4-pregnen-3,20-dionen.
Die erfindungsgemäss hergestellten neuen 16a- Alkyl -11 a,17a - dioxy - 4 -pregnen-3,20-dione lassen sich leicht in 16a-Alkyl-11 a,21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trione und 16a-A.lkyl-l lss,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dione überführen, welche Verbindungen äusserst starke entzündungshemmende Wirkung besitzen und insbe sondere für die Behandlung von Arthritis und ver wandten Krankheiten geeignet sind.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird als Aus gangsmaterial die bekannte Verbindung 16a-Alkyl- 4-pregnen-3,20-dion der Formel
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worin R eine Alkylgruppe bedeutet, verwendet.
Erfindungsgemäss unterwirft man dieses Aus gangsmaterial, das heisst 16a-Alkyl-4-pregnen-3,20- dion, der Einwirkung eines Oxydationsenzyms, wel ches von einem oxydierenden Stamm von Dactylium dendroides unter aeroben Bedingungen hervorgebracht wird, wobei man das entsprechende 16a-Alkyl- 11 a,17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dion erhält, eine Ver bindung der Formel
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Dieses 16a-Alkyl-lla,l7a-dioxy-4-pregnen 3,
20 dion lässt sich mittels Brom und Chloroform in 21- Stellung bromieren unter Bildung von 16a-Alkyl-21- brom-11 a,17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dion.
Durch Umsetzen der letzteren Verbindung mit Kaüumacetat erhält man 16a-Alkyl-11a,17a,21- trioxy-4-pregnen-3,20-dion-21-acetat. Die letztere Verbindung lässt sich leicht mit Natriumdichromat in Essigsäure zu 16a-Alkyl-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion oxydieren.
Das 16a-Alkyl-17a,21-dioxy-4-pregnen-3,11,20- trion kann in das Bis-semicarbazon übergeführt und mit Natriumborhydrid reduziert werden, worauf man durch Hydrolyse des Semicarbazons 16a-Alkyl- llss,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion erhält.
Es hat sich gezeigt, dass sowohl<I>16a</I> AA-lkyl- lla,17a-dioxy-4-pregnen-3,20-dione als auch 16a- Alkyl - l lss,17ay21- trioxy - 4 - pregnen - 3,20 - dione äusserst starke entzündungshemmende Wirkung be sitzen.
Die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens benötigten Stämme von Dactylium den- droides, welche die Oxydation von 16a-Alkyl-4- pregnen-3,20-dionen zu bewirken vermögen, können von den bekannten Kultursammlungen bezogen wer den.
Beispielsweise ist eine solche Kultur unter der Bezeichnung Dactylium dendroides Nummer NRRL 2574 von den Northern Regional Research Labora- tories, Peoria, Illinois, erhältlich.
Die Mikroorga- nismenkultur wird unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium in inniger Berührung mit dem zu oxydierenden 16a-Alkyl-4-pregnen-3,20-dion gezüchtet, wobei das Fermentieren oder Züchten der Mikroorganismen so lange fortgesetzt wird, bis die gewünschte Oxydation eingetreten ist.
So kann das zu oxydierende 16a-A:lkyl-4-pregnen-3,20-dion direkt in ein geeignetes Medium eingeführt werden, welches dann mit einem oxydierenden Stamm von Dactylium dendroides geimpft und unter aeroben Bedingungen bebrütet wird, wobei sich die gewünschte Oxydation vollzieht. Vorzugsweise wird das Verfahren so durch geführt, dass man den Mikroorganismus zunächst in einem geeigneten Fermentierungsmedium züchtet, dann das 16a-Alkyl-4-pregnen-3,20-dion zusetzt und die Züchtung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen so lange weitertreibt, bis die gewünschte Oxydation eingetreten ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann sowohl mit Oberflächen- als auch mit Tauchkulturen von unter aeroben Bedingungen sich entwickelndem Dactylium dendroides durchgeführt werden; praktisch bevorzugt man die Zucht des Mikroorganismus in Tauchkultur in einem geeigneten wässerigen Fermen- tierungsmedium, welches das Steroid enthält. Die Steroidmenge, welche zweckmässig oxydiert werden kann, hängt zum Teil vom angewendeten Medium ab.
Für die Zucht von oxydierenden Stämmen von Dactylium dendroides geeignete wässerige Nähr medien müssen Quellen für assimilierbaren Kohlen stoff und Stickstoff sowie auch kleine Mengen an organische Salze enthalten. Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen sich die ge bräuchlichen Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, wie Dextrose, Cerelose, Glucose, Invertmolassen und dergleichen, wie sie in Fermentierungsmedien ver wendet werden.
Gleicherweise eignen sich die bei den industriellen Fermentierungsprozessen üblicherweise benutzten komplexen Stickstoffquellen, wie Lactalbu- min-Auszug ( Edamin ) und Getreideweiche, oder anorganische Stickstoffquellen wie Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und dergleichen, zur Benutzung in den Fermentierungsmedien. Kleine Mengen anorga nischer Salze, z.
B. geeignete lösliche Salze von Ma gnesium, Kalium, Natrium und Eisen, sind gewöhn lich in komplexen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen bereits vorhanden oder können dem Fermentierungs- medium leicht in kleinen Mengen zugesetzt werden zur Erzielung einer maximalen Entwicklung des Oxy dationsmikroorganismus.
Im folgenden wird ein Beispiel für ein geeignetes wässeriges Nährmedium angegeben, welches im erfin dungsgemässen Verfahren zur Oxydation von Stero- iden benutzt werden kann:
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Mit destilliertem Wasser wird auf ein Gesamt volumen von 1 Liter Nährmedium aufgefüllt, und der pH wird mit Natriumhydroxyd auf 6,5 gestellt.
Ein Zusatz geringer Mengen Antischaumbildungs- mittel ist zwar nicht unbedingt erforderlich, jedoch bei manchen Fermentierungsmedien erwünscht, um maximale Ausbeuten am gewünschten oxydierten Produkt zu erzielen. Es wurde gefunden, dass durch Zusatz eines substituierten Oxazalins, bei welchem es sich um ein nichtflüchtiges, aminartiges, kationisches, oberflächenaktives Mittel handelt, das unter der Be zeichnung Alkaterge C käuflich ist, zu gewissen Fermentierungsmedien die Schaumbildung besonders wirksam unterdrückt werden kann.
Es können aber auch andere Antischaummittel verwendet werden, welche für solche Zwecke bekanntermassen brauchbar sind.
Beispielsweise kann 16a-Methyl-4-pregnen-3,20- dion in folgender Weise oxydiert werden: Ein steriles Kulturmedium, z. B. von der oben erwähnten Art, wird zunächst geimpft durch Ein führen einer kleinen Menge einer Sporensuspension einer vegetativen Zucht eines oxydierenden Stammes von Dactylium dendroides. Das geimpfte Nähr medium wird dann bei einer Temperatur von etwa 27-28 C unter Rühren in Gegenwart von Sauerstoff während etwa 24-48 Stunden bebrütet.
Hierauf fügt man dem Fermentierungsmedium eine Lösung von 16a-Methyl-4-pregnen-3,20-dion in Propylenglykol zu und setzt das Rühren und die Belüftung des Nähr mediums während etwa 5-30 Stunden oder bis zur Beendigung der Oxydation fort.
Nach Beendigung der Oxydation lässt sich das oxydierte Steroid aus der Fermentierungsbrühe durch Extrahieren mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für das oxy dierte Steroid gewinnen. Geeignete Lösungsmittel für diesen Zweck sind z. B. Chloroform, Methylen- chlorid, organische Säureester, aromatische Kohlen wasserstoffe und dergleichen. Die das gewünschte oxydierte Steroid enthaltende organische Lösung kann dann eingedampft werden zur Gewinnung des gewünschten Produktes, welches sich durch Um kristallisieren oder andere übliche Verfahren weiter reinigen lässt.
<I>Beispiel</I> Ungefähr 3,2 Liter des obenerwähnten Nähr mediums und die minimale Menge eines substituier ten Oxazalins (Alkaterge C), die zur Verhinderung der Schaumbildung nötig war, wurden während 1/2 Stunde bei 100 C sterilisiert. Nach dem Sterilisieren wurde das Medium mit ungefähr 250 cms einer vegetativen Zucht eines oxydierenden Stammes der Dactylium-dendroides-Kultur NRRL 2574 aus der Sammlung der Northern Regional Research Labora- tories, Peoria, Illinois, geimpft.
Das Gemisch wurde dann unter Verwendung eines Rührers mit zwei mit 560 Umdrehungen/Minute laufenden Turbinen ge rührt unter Einleiten von 3 Liter Luft/Minute und unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von 28 C.
Nach 24stündiger Behandlung gab man 1,28 g 16a-Methyl-4-pregnen-3,20-dion, gelöst in 160 cm3 Propylenglykol, zum Fermentierungsmedium und setzte das Rühren in gleicher Weise fort. Die Be lüftung wurde mit 3,0 Liter pro Minute 6 Stunden lang fortgesetzt und dann während 6 Stunden unter brochen. In dieser Weise wurde der Prozess während 36 Stunden nach Zugabe des Steroids fortgesetzt.
Aus dem Fermentierungsmedium wurde kristal lines lla,17a-Dioxy-16a-methyl-4-pregnen-3,20-dion isoliert durch Extrahieren mit Äthylacetat, Ein dampfen des organischen Auszuges im Vakuum und Umkristallisieren des Rückstandes aus Äthylacetat.