CH370778A

CH370778A - Verfahren zur Herstellung von 11a-Hydroxysteroiden

Info

Publication number: CH370778A
Application number: CH6947059A
Authority: CH
Inventors: Heinz-Juergen Dr Mannhardt; Harald Dr Metz
Original assignee: Merck Ag E
Priority date: 1958-03-19
Filing date: 1959-02-12
Publication date: 1963-07-31

Description

Verfahren zur Herstellung von 1I a-Hydroxysteroiden Die mikrobiologische Einführung einer 11a-Hy- droxylgruppe in Steroidhormone ist schon längere Zeit bekannt. Bisher wurden hierfür Pilze der Gat tungen Aspergiflus, Penicilliüm, Rhizopus, Mucor, Pestalotia, Neurospora und Heliocostylum verwendet. (S. H. Eppstein, P. D. Meister, H. C. Murray, D. H.

Peterson, Vitamines and Hormones, Band 14, Seite 359 [1956].) Es wurde nun gefunden., dass Pilze der Gattung Fusarium, und zwar der Sektionen Discolor, Gibbo- sum und Elegans-Oxysporum, mit besonderem Vor teil zur Einführung ein-er 11 a-Hydroxylgruppie ge eignet sind.

Pilze der Gattung Fusarilum sind bisher nur wenig für Reaktionen mit Steroiden benutzt wor den. So isst bekannt, dass Fusarium solani in Steroide eine 1,2-Doppelbindung einzuführen vermag (E. Vi- scher, C. Meystre, A. Wettstein, Helvetica Chimita Acta, 13d. 38, S. 835 [1955]).

Ausserdem ist die Hy- droxylierung einiger Steroide in 15a-Stellung durch Fusarium lini beschrieben (A. Gu@bler, Ch. Tamm, Helvetica Chimica Acta, Band 41, Seite 301 [l958]).

Diese für chemische Reaktionen an Steroi den bisher verwendeten Pilze gehören jedoch nicht den obengenannten drei Fusarium-Sektionen an. (Für die Nomenklatur wurde die von H. W. Wollen weber und O.

A. Reinking in ihrem Buch Die Fu- sarien, ihre Beschreibung, Schadwirkung und Be kämpfung , Verlag Paul Parey, Berlin:

1935, ver wendete Systematik der Gattung Fusarium benutzt.) Die 11 a-hydroxylierend'en Organismen der drei obengenannten Fusarium-Sektionen besitzen gegen über den bisher bekannten 11-hydroxyl'ierenden Or ganismen wesentliche Vorteile. Zunächst verläuft die 11 a-Hydroxylierung bei Verwendung der Pilze nach der Erfindung mit besonders grosser Geschwindigkeit. Während die bisher

bekannten Stämme .meist meh rere Tage für die Umsetzung benötigen, ist bei ,den Pilzen nach der Erfindung bereits nach höchstens 24 bis 25 Stunden Bebrütung kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar.

In einzelnen Fällen gelingt die Re aktion bereits innerhalb von 7 Stunden. Ausserdem verläuft die Umsetzung bei den Stämmen- der drei Fusarium-Sektionen. fast völlig in einheitlicher Rich tung; die Verluste durch Nebenreaktionen sind sehr gering, so d!ass eine gute Ausbeute erzielt wird.

Diese Tatsache ist bei Hydroxylierun gen mit Pilzen. ausser ordentlich selten. Die bisher bekannten 11-Hydroxy- lierung bewirkenden Mikroorganismen vermochten ferner 1-Dehydro-steroide, wie z. B. 1-Dehydro- Reichstei!ns-Substanz-S oder 1,6 -bis - Dehydro - ste- rold!e, wie z.

B. 1,6-bis-De!hydro-Reichsteihs-Sub- stanz-S, gar nicht oder nur spurenweise in ;die ent sprechenden 11-hydroxylierten Steroide zu überfüh- ren. Im Gegensatz hierzu gelingt es mit einer ganzen Reihe der gefundenen Fusarienistämme, die unter die obigen drei Sektionen fallen, auch 1-Dehydro- und 1,6-bis-D,

ihydro-steroide in glatter und, schneller Re aktion in die entsprechenden 11a-hydroxyl'ierien De rivate umzuwandeln. Die .neue Methode bietet gegen über allen bisher bekannten Methoden zur Einfüh- rung einer 11-Hydroxylgruppe somit wesentliche Vor teile.

Auf rein chemischem Wege. ist es bisher nur durch Anwendung viehstufiger Reaktionsfolgen mög lich gewesen, in 11-Stellung eine Hydroxyl'gruppe einzuführen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dem entsprechend ein Verfahren zur Herstefi@un.g von 11a- Hydroxy-steroiden der allgemeinen Formel I
EMI0002.0001
die in 1- undloder 6-Stellung ungesättigt seih können und worin R = H oder Acetyl ist, welches darin besteht,

dass man. Verbindungen der allgemeinen For mel II
EMI0002.0013
die in 1- und/oder 6-S.tehung ungesättigt sein könr nen und worin R die oben angegebene Richtung be- sitzt, mit Fusarium Arten aus den Sektionen Discolor und;

'od'er Gibbosum und,\oder Elegans-Oxysporum oder mit den aus diesen Pilzen erhältlichen oxydne- renden Enzymen behandelt und die so hergestellten lla-Hydroxy-steroide aus dem Reaktionsgemisch, vorzugsweisse durch Extraktion, isoliert.

Erhaltene Steroide können in bekannter Weise in die entspre chenden 21 Acetate, übergeführt werden.

Da eine Einordnung der Fusarienstämme, die über die Sek tionen hinausgeht, langwierig und mit gewissen Un sicherheiten behaftet isst, sind die einzelnen Stämme nach der Erfindung mit der internen Numerierung der Pilzsammlung der Firma E. Merck AG., Darm stadt, bezeichnet worden, die auch bei der exakten Versuchsbeschreibung verwendet worden ist.

Im einzelnen gelingt die Einführung einer lla- Hydroxylgruppe in Steroide der obigen allgemeinen Formel 11 zum Beispiel mit den folgenden Pilzen, dier Gattung Fusarium: Fusarium, Sectio Discolor: Fusarium culmorum (W.

G. Sm.) Saccardo (2092), Fusarium sambucinum Fuckel (2077), Fusarium sambucinumFuckel (2102), Fusarium reticulatum Montagne (2091), Fusarium reticulatum Möntagne f.

1 Wollen- weber (2095), Fusarium heterosporum Nees (2093), Fusarium sp. (2070), Fusarium sp. (2074).

Fusarium, Sectio Gibbo@sum: Fusarium equiseti Saccard'o var. bulilatum (Sherbakoff) Wollenweber (2083), Fusarium equiseti Saccardo var. bullatum (Sherbakoff) Wollenweber (2090).

Fusarium, Seatio Elegans-Oxysporum: Fusarium oxysporum Schlechitendhhi' (2086), Fusarium redblens Wollenweber (2087), Fusarium redolens Wollenweber (2094), Fusarium 'bulbi@genum Cke. eit Mass.

(2096), Fusarium sp. (2089), Fusarium sp. (2088).

Die Stämme körnen zum Beispiel in einer Nähr lösung aus Malzextrakt und Popton (2 /a Malzextrakt, 0,2 1/o Popton aus Casein) gezüchtet werden. Geeig net ist auch eine Nährlösung, die Glucose, Sojamehl; Hefeextrakt, Priam. Kaliumphosphat und Natriumchlo- rid enthält.

Die Umsetzung wird bei ausreichender Belüftung (im allgemeinen etwa 600 Liter Luft pro Stunde für einen Ansatz in cinlem Kl'cinfermenter mit einem Volumen von etwa 13 Liter) durchgeführt. Die Re aktionszeiten liegen zwischen 7 und 25 Stunden.

Die erhaltenen lla-Hydroxy-steroide können durch Behandlung mit einem geeigneten: Oxydations mittel in die entsprcchenden 11-Keto-steroide über führt werden, gegebenenfalls nach Schultz (Acetyl'ie- runig) der 21-Hydroxyfgruppe. Besonders geeignet für diese Oxydation ist Chromsäureanhydrid bzw.

eine Mischung von Chromsäureanhyd'ridi mit einer tert. organischen Base (z. B. Pyridin, Lutidin) oder mit EisessigiWasser.

Die Veresterung zum 21-Acetat wird zweckmässig durch Umsetzung mit Aceitylchlorid oder Essigsäure anhydrid in Gegenwart einer tert. organischen Base, wie z.

B. Pyridin, durchgeführt. Vorzugsweise wer den entweder molare Mengen an Essigsäureanhydrid und 11a-Hydrosteroid verwendet, oder man 1'ässt auf ein Gemisch, molarer Mengen des Steroids und der tert. organischen Base, z. B. Pyridin, einem über- schul3 @an Acetylchlorid einwirken.

In die so hergestellten lla-Hydroxy- oder 11- Keto-steroid'e kann man durch Behandlung mit che- mischen oder mikrobiologischen Dehyd'rieruingsmit- roelü. gk.ichzeitig oder nacheinander in 1- und! oder 6-Stellung Doppelbindungen einführen.

So gelingt es, durch Behandlung mit Chl'orani.l oder durch Bromierung (z. B. N-Bromsuccinimid) und folgende Einwirkung eines. HBr-abspal!teniden Mittels (z. B. Pyridin), eine 6-Doppelbindung einzu führen.

In die nach der Erfindung hergestellten 11 a Hyd:roxysteroide, die gegebenenfalls in, 6-Stellung noch eine Doppelbindung besitzen können, kann mit Selendioxyd oder durch aufeinanderfolgende Behand lung mit elementarem Brom und einem Halogenwas serstoff abspaltenden Mittel oder durch Behand- lung mit einem geeigneten Mikroorganismus, z. B.

Corynebacterium simplex oder Bacillus sphaericus, eine 1-Doppelbindung eingeführt werden.

Die 1- und 6-Doppelbindungen können gleich zeitig in die 11 a-Hydroxysteroide, gegebenenfalls nach Oxydation, zu den entsprechenden 11-Keto- steroiden eingeführt werden, indem man durch Be handlung mit Ortho-ameisensäureester zunächst dien 3-Enoläther herstellt und die so erhaltene Verbin dung mit Ch#lorarnil behandelt. Dabei erhält man in glatter Reaktion das entsprechende 1,4,

6-Pregnatrien.

Das Verfahren nach der Erfindung bietet somit die Möglichkeit, in glatter Reaktion und guten Aus beuten eine Sauerstoff-Funktion in lla-Stellung ein zuführen, ohne dass dabei störende Nebenprodukte durch komplizierte Aufreinigu.ngsmethoden entfernt werden müssen.

Insbesondere ist es nach der Erfindung mög lich, in zwei Stufen Reichsteins-Substanz-S in Corti- son und in drei Stufen in Prednison zu überführen. <I>Beispiele</I> 1.

Zu einer Schüttelkultur des Sbammes 2083 (Fusarium equiseti Saccardo var. bullatum [Sherba- koff] Wöllenweber), die mit 200 cm3 einer Nähr lösung aus Malzextrakt und Pe.pton (2"/0, Malzextrakt, 0,2 /o Pepton aus Casein)

in einem 1000-cms-Erlen- meyerkolben angesetzt wurde, werden nach 24stün- d'igem Wachstum 100 mg Reichsteins-Substanz-S in 4 cm3 Methanol zugegeben. Nach weiteren 24 Stun den Bebrütung bei 280 C wird die Kulturlösung mit Chloroform ausgeschüttelt, der Chloroformextrakt ge trocknet und zum. Rückstand eingedampft.

Die Pa- pierchromatographie (Lösungsmittelsysteme Bi und B4 nach 1. E. Bush, Biochemical Journal, Band 50, Seite 370 [1952]) zeigt, dass als alleiniges Steroid 11- epi-Hydrocortison als Reaktionsprodukt vorliegt. (Durch Vergleich mit authentischem 11-e@pi-Hyd!ro- cortison bewiesen.) 2.

Ein Kleinfermenter von l31 Inhalt mit 101 Nährlösung (Zusammensetzung wie im Beispiel 1) wird mit 750 cm3 einer Schüttelkur des Stammes 2083 (Fusarium cquise@ti Saccardo var. bullatum [Sherbakoff] Wollenweber) beimpft und nach 24 Stunden Anwachszeit unter kräftigem Rühren und Belüften (6001 Luft Std.)

eine Lösung von 5 g Reich steins-Substanz-S in 200 cm3 Methanol zugesetzt. Die weitere Bebrütung wird 25 Stunden lang fortgesetzt. In diesem. Zeitraum wird der Reaktionsverlauf stän dig papierehromatograph.isch verfolgt. Die Kultur- lösung wird mit Chloroform mehrfach ausgeschüttelt, der Chloroformextrakt getrocknet und auf ein Volu men von 80 cm3 eingeengt.

Nach Abkühlen kristalli sieren 3,2 g eines schwach gelb gefärbten kohpro- duktes aus, das sich nach einmaligem Umkristallisie- ren aus Aceton als völlig reines 11-e;pi#-Hydrocortison erweist. Fp. 210-130, (11)P = + 117 (Äthanol).

311) Zu: einer Schüttelkultur des Stammes 2083 (Fusarium equiseti Saccardo var. bu#llatum [Sherba- koff] Woll'enweber) in 200 em3 einer Nährlösung, ent- haltend 211/o Glucose, 0,51/o Sojamehl, 0,5111e, Hefe- extrakt, 0,

5 01o prim. Kaliumphosphat und 0,5 01o Na triumchlorid (1r. Hanson und Mitarbeiter, Journal of the American Chemical Society, Band 75, Seite 5369 [1953]), werden nach 24stündigem Wachstum 100 mg 1-Dehydro-Reichsteins-Substanz-S, gedöst in 4 cm3 Methanol,

zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden wird idie Kulturlösung wie in Beispiel 1 beschrieben auf gearbeitet.

Die Papierchromatographie zeigt einen etwa 80o/oigen Umsatz zu einer neuen Substanz, die auf Grund ihres papierchromatographischen Verhal tens als 11-epi-Predhsolon identifiziert werden kann.

3b) Ein Kl'einfermenter von 131 Inhalt, gefüllt mit 101 einer Nährlösung nach Fr. Hansen und Mit- arbeitern (Zusammensetzung siehe Beispiel 311)

wird mit 750 cm3 einer Schüttelkultur des Stammes 2082 (Fusarium equiseti Saccardo var. bullatum [Sherba- koff] Wollenweber) beimpft und nach. 24 Stundien Anwachszeit unter kräftigem Rühren und Belüften (6001 Luft;

S@td.) eine Lösung von 5 g 1-Dehyd@ro- Reichsteins-Substanz-S in 200 cm3 Methanol mge- setzt. Unter ständiger papierchromatographischer Kontrolle wird wertere 28 Stunden be:brii:

tet. Die Kul turlösung wird mehrfach mit Chloroform extrahiert, der Chloroformextrakt getrocknet und auf ein klei nes Volumen eingeengt. Beim Abkühlen kristallisiert rohes 11-epi-Pr.3dnisolon aus, das durch Um@kristalfi- sieren aus Aceton, rein erhalten wird. Fp.: 206-208 , (11)n = -I-76 C (Dioxan).

Das so erhaltene 11-epi-Pre,dinisolon kann nach an sich bekannten Methoden über das 21-Monoacetat in Pred'nison oder Prednisolon übergeführt werden.

4. Zu einer wie in Beispiel 3 vorbehandelten Schüttelkultur des Stammes 2083 (Fusarium equiseti Saccardo var. bullatum [Sherbakoff] Wollenweber) werden 100 mg 1,4,6-Pregnatrien-17a,21-diol-3,20- d'ion, gelöst in 4 em.3 Methanol, zugefügt.

Nach 24- stündiger RTI ID="0003.0233" WI="13" HE="4" LX="1218" LY="1746"> Laufzeit wird wie im Beispiel 3 aufgearbei tet. Die papierchromato@graphische Prüfung zeigt einen fast quantitativen Umsatz zu einem Produkt, das auf Grund .seines chromatographischen, Verhal- tens als 6-Dehydro-11-epi'-predaiisolon identifiziert werden kann.

5. Wie in Beispiel 1 wird ein Ansatz mit Stamm 2070 (Fusarium, Sectio Discol!or) durchgeführt. Die Papierchromatographie zeigt die alleinige Entstehung von 11-epi-Hyd'rocortison, das sich nach 24 Stunden quantitativ gebildet hat.

6. Wie in Beispiel 1 wind ein Ansatz mit Stamm 2074 (Fusarium, Sectio Discolor) durchgeführt. Nach 24 Stunden hat sich nahezu quantitativ 11-epi-Hy- drocortison gebildet.

7. Wie im Beispiel 1 angegeben, werden 100 mg Reichsteins-Substanz-S mit Fusariüm redolens Wol- lenweber (2087) behandelt. Nach etwa 24 Stunden hat sich nahezu quantitativ 11-epi-Hydrocortison ge bildet.

B. Wie in Beispiel 1 wird ein Ansatz mit Stamm Fusarium cullmorum Saccardo (2095) durchgeführt. In guter Ausbeute erhält man 11-epi-Hydrocortison nach 24stündiger Versuchsdauer (ohne Wachstums zeit der Kultur).

9. Wie in Beispiel 1 wird! eine Schüttelkultur des Stammes 2082 (Fusarium equiseti Saccardo var. bul- latum [Sherbakoff] Wol'lenweber)

bereitet und nach 24stündigem Wachstum eine Lösung von 100 mg 6- Dehydro-Reichsteins-Substanz-S in 4 cm3 Methanol zugegeben. Nach weiteren 24 Stunden zeigte das Pa- pierchromatogramm die vollständige Umwandlung zu 6-Dehyd'ro-11-epi-Hydrocortison.

10. Wie in Beispiel 1 wird ein Ansatz mit Stamm 2083 (Fusarium :equiseti Saccardo var. bullatum [Sherbakoff] Wollenweber) durchgeführt. Aus 100 mg Reichsteims-Su!bstanz-S-21-acetat erhält man nach 48 stündiger Bebrütung in: guter Ausbeute 11-epi-Hy- drocortiso:n.

Erhaltene Steroide können folgendermassen ver estert werden: 1 g 11-epi-Prednisolon werden in. 5 m1 Pyridin gelöst, 0,

29 g Essigsäureanhydrid zugegeben und die Lösung etwa 20 Stunden bei Zimmertemperatur ste- hen!gelassen. Das Gemisch wird in Wasser eingagos- sen und mit Chloroform dreimal ausgeschüttelt. Die Chloroformlösuüg wird mit verdünnter Schwefelsäure geschüttelt und mit Natriumhydra@gencarbonatlösung und Wasser neutral gewaschen.,

getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält das 21-Acetat des 11-epi-Prednisol'ons als nicht kristallisierbare Sub stanz von .glasigamorpher Beschaffenheit. Ausbeute 0,97 g.

Der Nachweis, dass es sich um die gewünschte Substanz handelt, erfolgt durch Oxydlation mit einem Chromsäure-Pyridin-Gemisch in an sich bekannter Weise. Es entsteht dann Prednisonacetrat in 701/oiger Ausbeute, das durch Vergleich mit authentischem Material einwandfrei identifiziert wurde.

1 g 6-Dehydro-11-e:pi-cortisoI wird in 250 ml Di- oxan gelöst, 0,23 ml Pyridin sowie 0,30 ml (etwa 50 o/m Überschuss) AcetylchJoriid zugefügt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehengeiassen. Die Hauptmenge Lösungsmittel wird ii-n Vakuum abb,,

zo- gen und d!er Rückstand in Chloroform aufgenommen. Die Chloroformlösung wird mit verdünnter Schwe felsäure geschüttelt und anschliessend mit Natrium- hydrogencarbonatlösung und Wasser neutral gewa schen.. Nach dem Trocknen der Lösung wird im Va kuum abgedampft, wobei das 21-Acetat als nicht- kristalIisi'erbarer Rückstand erhalten wird. Ausbeute 0,91 g.

Es lässt sich auch hier wie in Beispiel 1 durch Oxydation mit Pyridin-Chromsäure zum bekannten 6-Dehydrocortisonacetat der Nachweis führen, d!ass im amorphen Acetylierungsprodukt das gewünschte 6-Dehyd'ro-11-epi-cortisol-21-acetat vorliegt.

6-Dehydro-11-epi-predhisolon wird in 21 -Stellung analog Beispiel 1 acetyliert. Auch dieses Acetat wird nicht kristallin erhalten. Es wird nachgewiesen durch Oxydation zu dem bekannten 6-Dehydro-prednison- acetat.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von lla-Hydroxy-ste- roiden der allgemeinen Formel 1 EMI0004.0117 die in 1- und; oder 6-Stellung ungesättigt sein können und worin R = H oder Acetyl bedeutet, dadurch ge- kennzeichnet, dlass man Verbindungen der allgemei nen Formel 11 EMI0004.0124 die in 1- und;

ioder 6-Stellung unigesättigt sein können, mit Pilzen der Gattung Fusarium aus dien Sektionen Discobor und,od'er Gibbosum und;oder Elegans-Oxy- sporum oder mit den aus diesen Pilzen erhältlichen, oxydierenden Enzymen behandelt und die so her gestellten lla-Hydroxy-steroide aus dem Reaktions gemisch isoliert. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die folgenden Pilze verwendet werden.: Fusarium, Sectio Discolor: Fusarium culmorum (W. G.

Sm.) Saccardo (2092), Fusarium sambucinum Fuckel (2077), Fusarium sambucinum Fuckel (2102), Fusarium reticulatum Montagne (2091), Fusarium reticulatum Montagne f.

1 Wollen- weber (2095), Fusarium heterosporum Nees (2093), Fusarium sp. (2070), Fusarium sp. (2074).

Fusarium, Sectio Gibbosum: Fusarium equiseti Saccardo var. bullatum (Sherbakoff) Wollenweber (2083), Fusarium equiseti Saccardo var. bullatum (Sherbakoff) Wolleinweber (2090).

Fusarium, Sectio Elegans-Oxysporum: Fusarium oxysporum Schlechtendahl (2086), Fusarium redolens Woll'enweber (2087), Fusarium redolens Wollenweber (2094), Fusarium bulbigenum Cke. et Mass.

(2096), Fusarium sp. (2089), Fusarium sp. (2088). 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, @dass man erhaltene Steroide in die ent- sprechendün 21 Acetate überführt.