DE2647895C3 - Verfahren zur Herstellung von 9à -Hydroxyandrostendion auf mikrobiologische Weise - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 9à -Hydroxyandrostendion auf mikrobiologische Weise

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Description

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht Die früheste einschlägige Arbeit stamm« offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 »Berichte« 70, 470 und »Berichte« 70, 2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17j3-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet Im Jahre 1952 (vgl. US-PS 26 02 769) berichten Peterson und Murray über die 11 «-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 36 84 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,17-dion und 20«-Hydroxymethyl-pregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 37 59 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.
Erfindungsgemäß wurde dem Fachmann nun in höchst überraschender Weise erstmals die Möglichkeit an die Hand gegeben, mit Hilfe einer neuen Mikroorganismus-Mutante aus relativ preisgünstigen Ausgangsmaterialien, z. B. Sitosterin, selektiv das als Zwischenprodukt bei der Herstellung von zur Gewinnung von Corticosteroiden benötigten 11-Hydroxyverbindungen wertvolle 9«-Hydroxyandrostendione 9«-OH AD herzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von 9oc-Hydroxyandrostendion, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 752 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids oder eines Gemisches aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in den 17-Alkylseitenketten züchtet. Beispiele für geeignete Steroidsubstrate sind Sitosterine, Cholesterine, Stigmasterin, Campesterin und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen. Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum
Einsatz gelangen.
Für den Erfindungszweck wurde in der später beschriebenen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu einer neuen Labormikroorganismusmutante mutiert Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: »J.C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1 :1 (1936). Medium 90 37C«. M. Fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise CO2+H2O, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Stereoidabbau.
Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Nitrosoguanidin erhält man einen neuen Mutanten, der
is selektiv Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen zu 9<x-OHAD abzubauen vermag.
Die neue Mikroorganismus-Mutante wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH München, Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen unter der Hinterlegungsnummer DSM 752 hinterlegt
Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum DSM 752 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyons-Klassifizierung (vgl. E.H. Runyon »Med. CHn. North America«, 43, 273 [1959]) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d. h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter KoIonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.
M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum DSM 752 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum DSM 752 erfolgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum DSM 752 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar.
f5 Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum DSM 752 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umwandlungs- bzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.
bo Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum DSM 752 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsub-
b5 strats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht
zwingend erforderliche, Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/L Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukt von Kasein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.
Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens reicht von etwa 25 bis etwa 37° C und beträgt vorzugsweise 300C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.
Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handeisüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.
Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.
Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der das gewünschte umgewandelte Steroid enthaltende Destillationsrückstand kann in 10% Chloroform enthaltendem Methanol gelöst werden. Die erhaltene Lösung wird dann bis zum Auftreten von Kristallen mit Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt. Hierauf wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, um das ausgefallene Steroid abzutrennen. Das gewünschte umgewandelte Steroid erhält man ferner aus der restlichen überstehenden Flüssigkeit beim Verdampfen des in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen Lösungsmittels.
Das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Umwandlungsverfahrens angefallene Produkt stellt das bekannte Steroidzwischenprodukt 9«-OH AD dar. Die ^-Hydroxyverbindungen der Androstanreihe eignen sich als Antiandrogene und Antiestrogene und als Antifertilitätsmittel. Die 9ot-Hydroxysteroide eignen sich ferner zur Herstellung anderer therapeutisch wertvoller Steroide. So können beispielsweise die
ίο 9a-hydroxy-l 1-unsubstituierten Steroide ohne weiteres in üblicher bekannter Weise, beispielsweise mit Thionylchlorid in Gegenwart von Pyridin, zu den wertvollen 9(11)-Dehydrosteroiden dehydratisiert werden. Diese 9(11)-Dehydroverbindungen stellen bekannte Zwischenprodukte bei der Herstellung hochaktiver Verbindungen dar. So können beispielsweise die 9(11)-Dehydrosteroide ohne weiteres nach bekannten Verfahren (wie sie beispielsweise in der US-PS 28 52 511 für die Herstellung von 9ot-Halohydrocortison beschrieben sind) in die entsprechenden 9a-Ha)o-l ]ßhydroxyverbindungen überführt werden.
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben »Gewichtsprozente«. Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nichts anderes angegeben, Volumenangaben.
Beispiel 1
Herstellung der Mutante M. fortuitum DSM 752
aus M. Fortuitum ATCC 6842
(a) Nitrosoguanidin-Mutagenese
Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur vcn 28° C in einem sterilen Saatniedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen.
Nährbrühe 8 g/l
Hefeextrakt lg/1
Natriumpropionat 0,5 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf 11
Der pH-Wert des Mediums wird mit In-NaOH vor einer 20minütigem Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellt.
Die Zellen werden bis zur einer Dichte von etwa 5XlOVmI wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen
Volumen sterilen O.lm-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37° C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird
m> abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen O,lm-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:
NH4NO3
K2HPO4
MgSO4 ■ 7 H2O
1,0 g/l
0,25 g/l
0,25 g/l
NaCl 0,005 g/l
FeSO4 - 7 H2O 0,001 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf 1 1
resuspendiert Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigem Sterilisieren bei 121°C mit In-HCl auf 7,0 eingestellt Endlich werden die Zel'en zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet
(b) Auswahl und Isolierung
der Mutante M. fortuitum DSM 752
Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser und Jerrel, 1963, »J. Biol. Chem.«, 205,291 bis 295):
Glyzerin 10.0 g/l
Na2HPO4 8,4 g/l
KH2PO4 4,5 g/l
NH4Cl 2,0 g/l
MgSO4 · 7 H2O 0,3 g/l
FeCl3 · 6 H2O 0,05 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf 11
Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121CC erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28° C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. Lewis und J.R. Davis, »Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media«, J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121 ° C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann ey infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstoffliefcnnten, wodurch die Herstellung sehr homogenci, jedoch opakter Agarplatten erleichtert wird.
Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Restplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28°C werden mit Hilfe steriler
Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phänotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen ausgewertet
(c) Schüttelflaschenauswertung
Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Glyzerin 10,0 g/l
Na2HPO4 8,4 g/I
KH2PO4 4,5 g/I
NH4Cl 2,0 g/I
MgSO4 · 7 H2O 03 g/I
FeCl3 ■ 6 H2O 0,05 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefülltauf 1 1
Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt Nach 20minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121°C werden sie auf 28° C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:
Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 28° C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:
Nährbrühe 8 g/l
Hefeextrakt lg/1
Glyzerin 5 g/l
mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf 1 1
wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet.
Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20minütigen Erhitzen der Flasche auf 121°C in einem Autoklaven mit In-NaOH auf 7,0 eingestellt Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28°C inkubiert.
Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-FIaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28 bis 30° C auf einem Drehrüttler inkubiert wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d. h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von 9λ-ΟΗ AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch die neue Mutante aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.
Beispiel 2
Umwandlung von Sitosterin in 9oc-OH AD
Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen auf 121 °C sterilisiert, dann auf 30°C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur der
Mutante Mycobacterium M. fortuitum DSM 752, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30° C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockne destilliert wird. Der Rest wird mit 10% Chlorcform enthaltendem Methanol aufgenommen und dann bis zum Erscheinen von Kristallen unter Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt. Hierauf wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Entfernung ausgefallener Sitosterine filtriert. Aus der überstehenden Flüssigkeit erhält man nach dem Abdampfen des Lösungsmittels in guter Ausbeute Roh-9«-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. Durch Dünnschichtchromatographie kann auch die Anwesenheit einer Spur 9«-Hydroxy-4-androsten-3-on-17-ol nachgewiesen werden.
Beispiel 3
Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Cholesterin erhält man 9a-OH AD.
Beispiel 4
Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Stigmasterin erhält man 9<x-OH AD.
Beispiel 5
Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Campesterin erhält man 9«-OH AD.
Beispiel 6
Durch Zusatz einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiel 2 bis 5 zu dem Sitosterin in Beispiel 2 oder durch Verwendung einer beliebigen Kombination der Steroide der Beispiel 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in Beispiel 2 erhält man 9«-OH AD.
Beispiel 7
Das bei den Beispielen 2 bis 6 erhaltene Roh-9«- OH AD wird durch folgende Maßnehmen gereinigt: Die unlöslichen Bestandteile werden aus der jeweiligen Nährbrühe der Beispiele 2 bis 6 durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. Der abgetrennte Kuchen wird
ίο mit einer geeigneten Menge Wasser gewaschen, worauf die Waschflüssigkeit mit dem feststofffreien Filtrat vereinigt wird. Die Kuchenfraktion wird mit einer wäßrigen Acetonlösung (1 :4) ausgelaugt, worauf das Aceton entfernt und die restliche wäßrige Masse mit
ΐί dem feststoff freien Filtrat und der Waschflüssigkeit vereinigt wird. Reststerine können aus der ausgelaugten Kuchenfraktion durch Extrahieren mit Methylenchlorid, Entfernen des Lösungsmittels und anschließende Kristallisation rückgewonnen werden.
Die filtrierte Brühefraktion wird zweimal mit dem halben Volumen Butylacetat bei einem pH-Wert von 4,0 extrahiert, worauf die verbrauchte Brühe verworfen wird. Gesammelte Extrakte der Brühe werden mit einem Fünftel Volumen einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung zur Entfernung der bei der Fermentation bzw. Gärung gebildeten sauren Verbindungen gewaschen.
Die gesammelten neutralisierten Extrakte werden auf etwa 2% des Brühevolumens eingeengt und dann abgekühlt, worauf das gereinigte Produkt 9«-OH AD zur Kristallisation gebracht wird. Das Endprodukt erhält man in üblicher bekannter Weise durch Filtrieren und Trocknen. Es besitzt, ermittelt durch Flüssigkeitschromatographie, eine Reinheit von mehr als 95%. Weiteres 9ot-OH AD erhält man aus der Mutterlauge durch weiteres Einengen und Zusatz von Cyclohexan zur Erniedrigung der Löslichkeit

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Hers '.ellung von 9«-Hydröxyandrostendion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacerium fortuitum DSA 752 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids oder eines Gemisches aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in den 17-Alkylseitenketten züchtet
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin oder Campesterin verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroidgemisch ein Gemisch aus Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet
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