CH624143A5

CH624143A5 -

Info

Publication number: CH624143A5
Application number: CH1342976A
Authority: CH
Inventors: Merle Gene Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1975-10-24
Filing date: 1976-10-22
Publication date: 1981-07-15
Also published as: FR2328718B1; NL172763C; NL172763B; PL109912B1; JPS6029470B2; DD127455A5; DE2647895B2; DE2647895A1; FR2328718A1; DE2647895C3; JPS55148099A; MX4502E; IL50747A0; IL50747A; IE44668B1; JPS55148085A; JPS5254093A; NL7611711A; JPS5642919B2; GB1530730A

Description

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird insbeson-30 dere ein neuer Mikroorganismusmutant, nämlich Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119, zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylketten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen zu 9a-Hydroxyandrostendion (9a-OH AD) benutzt. Beispiele für geeignete Steroidsubstrate sind Sitosterine, 35 Cholesterine, Stigmasterin, Campesterin und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen. Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

Der bevorzugte neue Mikroorganismus Mycobacterium 40 fortuitum NRRL B-8119 wurde am 17. Oktober 1975 hinterlegt.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismusmutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Coryne-45 bacterium, Mycobacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, der sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von 9a-Hydroxyandrosten-50 dion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkyl-seitenkette züchtet.

Wie bereits erwähnt, erhält man durch ihre Fähigkeit 55 zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenket-ten mit 2 bis 10 Kohlenstoff atomen gekennzeichnete und 9a-ÖH AD in der Gärbrühe anhäufende Mutanten insbesondere durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, 60 Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.

Für eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungs-gemässen Verfahrens wurde in der später beschriebenen Weise die Art Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 zu 65 einem neuen Labormikroorganismusmutanten mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: «J. C. Cruz 2. Cold abscess.

Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C».

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M. Fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise C0a + H20, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 mittels Nitrosoguanidin kann man einen neuen Mutanten erhalten, der selektiv Steroide mit 17-AIkylseitenketten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen zu 9a-OH AD abzubauen vermag. Diesem Mikroorganismusmutanten von M. fortuitum wurde durch das Northern Regional Research Laboratory, US-De-partment of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, (der Mikroorganismusmutant wurde an dieser Hinterlegungsstelle in der Dauersammlung am 17. Oktober 1975 hinterlegt) die Nummer NRRL B-8119 zugeteilt. Eine Subkultur dieses Mikroorganismus ist auf Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle frei erhältlich. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die Verfügbarkeit bzw. Aushändigung der Kultur keine Lizenz am vorliegenden Patent begründet.

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum NRRL B-8119 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsart M. fortuitum ATCC 6842 nicht zu unterscheiden. Beide M. for-tuitum-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyons-KIassifi-zierung (vgl. E. H. Runyon «Med. Clin. North America», 43, 273 [1959]) handelt es sich um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pig-mentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum NRRL B-8119 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroid-moleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum NRRL B-8119 erfolgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum NRRL B-8119 stellt eine in hohem Masse wertvolle Eigenschaft dar.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 zu M. fortuitum NRRL B-8119 erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmassnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmassnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umwandlungs- bzw. Trans-formationsmassnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder äquivalente Massnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.

Die erfindungsgemässe selektive Umwandlung lässt sich vorzugsweise in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum NRRL B-8119 entweder durch zugäbe des jeweiligen Ste-roidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche, Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/1. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweissarti-gen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maisenweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukt von Kasein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpepton-flüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.

Das Umwandlungsverfahren dauert gewöhnlich etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur während des Umwandlungsverfahrens kann von etwa 25° bis etwa 37°C reichen und beträgt vorzugsweise 30°C. Der Inhalt des Um-wandlungsgefässes wird vorzugsweise mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise lässt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclohexan, kann das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert werden. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschliesslich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthy-len, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen, vorzugsweise Methylenchlorid.

Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe lässt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der das gewünschte umgewandelte Steroid enthaltende Destillationsrückstand kann in 10% Chloroform enthaltendem Methanol gelöst werden. Die erhaltene Lösung wird dann vorzugsweise bis zum Auftreten von Kristallen mit Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt. Hierauf wird die Lösung gewöhnlich auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, um das ausgefallene Steroid abzutrennen. Das gewünschte umgewandelte Steroid kann man ferner aus der restlichen überstehenden Flüssigkeit beim Verdampfen des in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen Lösungsmittels erhalten.

Das bei der Durchführung des erfindungsgemässen Umwandlungsverfahrens angefallene Produkt stellt das bekannte Steroidzwischenprodukt 9a-OH AD dar. Die 9a-Hydroxy-verbindungen der Androstanreihe eignen sich als Antiandrogene und Antioestrogene und als Antifertilitätsmittel. Die 9a-Hydroxysteroide eignen sich ferner zur Herstellung anderer therapeutisch wertvoller Steroide. So können beispiels5

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weise die 9a-hydroxy-ll-unsubstituierten Steroide ohne weiteres in üblicher bekannter Weise, beispielsweise mit Thio-nylchlorid in Gegenwart von Pyridin, zu den wertvollen 9(1 l)-Dehydrosteroiden dehydratisiert werden. Diese 9(11)--Dehydroverbindungen stellen bekannte Zwischenprodukte bei der Herstellung hochaktiver Verbindungen dar. So können beispielsweise die 9(1 l)-Dehydrosteroide ohne weiteres nach bekannten Verfahren (wie sie beispielsweise in der US-PS 2 852 511 für die Herstellung von 9a-Halohydrocor-tison beschrieben sind) in die entsprechenden 9a-Halo-l 1 ß--hydroxyverbindungen überführt werden.

Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemässe Verfahren näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben «Gewichtsprozente». Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nicht anders angegeben, Volumenangaben.

Beispiel 1

Herstellung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8119 aus M. fortuitum ATCC 6842:

(a) Nitrosoguanidin-Mutagenese:

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28°C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:

Nährbrühe (Difco) 8 g/I

Hefeextrakt 1 g/I

Natriumpropionat 0,5 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 I

Der pH-Wert des Mediums wird mit ln-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellt.

Die Zellen werden bis zur einer Dichte von etwa 5X 108/ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kü-gelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,lm-Natriumcitrats eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schliesslich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 (X g/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifu-giert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,lm-Ka-liumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schliesslich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH.,N03 1,0 g/1

K2HP0.j 0,25 g/1

MgSO,. 7HaO 0,25 g/l

NaCl 0,005 g/l

FeSO., .7H20 0,001 g/l mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1

resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigem Sterilisieren bei 121°C mit ln-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.

(b) Auswahl und Isolierung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8119:

Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fraser und Jerrel, 1963 «J. Biol. Chem.», 205, 291 bis 295):

Glyzerin

10,0 g/1

Na2HPO,

8,4 g/1

KH-jPO.,

4,5 g/1

NH4C1

2,0 g/1

MgS04. 7H20

0,3 g/I

FeCL . 6H,0

0,05 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1

Nach Zugabe von 15 g/1 Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121°C erhitzt und dann in sterile Petrischalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nähr-auxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28°C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollblatt repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. Lewis und J.R. Davis, «Préparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media», J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/1 Agar und 1,0 g/1 eines geeigneten Kohlenstoff lieferanten, wie Sitosterin oder An-drostendion (AD), wird die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121°C im Autoklaven erhitzt. Das sterile, heisse Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäss gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schliesslich in sterile Petrischalen gegossen. Bei diesen Massnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heissen Gemisches und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleich-massige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28°C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen ausgewertet.

(c) Schüttelflaschenauswertung:

Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glyzerin 10,0 g/1

Na2HPO., 8,4 g/1

KH2PO„ 4,5 g/I

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NH4C1 2,0 g/1

MgSO,.7H..O 0,3 g/1

FeCl3. 6H..O 0,05 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1

Hierauf werden in das Medium 1 g/1 Sojamehl und dann 10 g/1 Sitosterin eingemischt. Nach 20minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121°C werden sie auf 28°C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 28°C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatmediums der folgenden Zusammensetzung:

Nährbrühe (Difco) 8 g/1

Hefeextrakt 1 g/1

Glyzerin 5 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1

wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet.

Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 20minü-tigen Erhitzen der Flaschen auf 121°C in einem Autoklaven mit ln-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28°C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30°C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit 3 Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h. 2 Volumina Äthylacetat und 3 Volumina Cyclo-hexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von 9a-OH AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin in 9a-OH AD:

Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen auf 121°C sterilisiert, dann auf 30°C abgekühlt und schliesslich mit 10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten-Mycobacteriums M. fortuitum NRRL B-8119, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30°C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird durch Diatomeenerde filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockne destilliert wird. Der Rest wird mit 10% Chloroform enthaltendem Methanol aufgenommen und dann bis zum Erscheinen von Kristallen unter Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt. Hierauf wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Entfernung ausgefallener Si-tosterine filtriert. Aus der überstehenden Flüssigkeit erhält man nach dem Abdampfen des Lösungsmittels in guter Ausbeute Roh-9a-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. Durch Dünnschichtchromatographie kann auch die Anwesenheit einer

Spur 9a-Hydroxy-4-androsten-3-on-17-ol nachgewiesen werden.

Beispiel 3

s Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Cholesterin erhält man 9a-OH AD.

Beispiel 4

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Stigma-io Sterin erhält man 9a-OH AD.

Beispiel 5

Durch Ersatz des Sitosterins in Beispiel 2 durch Campesterin erhält man 9a-OH AD.

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Beispiel 6

Durch Zusatz einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 5 zu dem Sitosterin in Beispiel 2 oder durch Verwendung einer beliebigen Kombination der Steroi-2o de der Beispiele 2 bis 5 anstelle des Sitosterins in Beispiel 2 erhält man 9a-OH AD.

Beispiel 7

Das bei den Beispielen 2 bis 6 erhaltene Roh-9a-OH AD 25 wird durch folgende Massnahmen gereinigt: Die unlöslichen Bestandteile werden aus der jeweiligen Nährbrühe der Beispiele 2 bis 6 durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. Der abgetrennte Kuchen wird mit einer geeigneten Menge Wasser gewaschen, worauf die Waschflüssigkeit mit dem 30 feststofffreien Filtrat vereinigt wird. Die Kuchenfraktion wird mit einer wässrigen Acetonlösung (1:4) ausgelaugt, worauf das Aceton entfernt und die restliche wässrige Masse mit dem feststofffreien Filtrat und der Waschflüssigkeit vereinigt wird. Reststerine können aus der ausgelaugten Ku-35 chenfraktion durch Extrahieren mit Methylenchlorid, Entfernen des Lösungsmittels und anschliessende Kristallisation rückgewonnen werden.

Die filtrierte Brühefraktion wird zweimal mit dem halben Volumen Butylacetat bei einem pH-Wert von 4,0 extrahiert, 40 worauf die verbrauchte Brühe verworfen wird. Gesammelte Extrakte der Brühe werden mit einem Fünftel Volumen einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung zur Entfernung der bei der Fermentation bzw. Gärung gebildeten sauren Verbindungen gewaschen.

45 Die gesammelten neutralisierten Extrakte werden auf etwa 2% des Brühevolumens eingeengt und dann abgekühlt, worauf das gereinigte Produkt 9a-OH AD zur Kristallisation gebracht wird. Das Endprodukt erhält man in üblicher bekannter Weise durch Filtrieren und Trocknen. Es besitzt, 50 ermittelt durch Flüssigkeitschromatographie, eine Reinheit von mehr als 95%. Weiteres 9x-OH AD erhält man aus der Mutterlauge durch weiteres Einengen und Zusatz von Cyclohexan zur Erniedrigung der Löslichkeit.

55 Beispiel 8

Durch Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 durch einen Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces er-60 hält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von 9a-OH AD in der Gärbrühe auszeichnen.

65 Beispiel 9

Durch Ersatz des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8119 in Beispielen 2 bis 7 durch die gemäss Beispiel 8 erhaltenen Mutanten erhält man 9a-OH AD.

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Beispiel 10

Durch Ersatz des M. fortuitum ATCC 6842 in Beispiel 1 durch einen Mikroorganismus der Gruppe Mycobacterium phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum und M. butyricum erhält man Mikroorganismenmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17 Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung von 9a-OH AD in der Gärbrühe auszeichnen.

Beispiel 11

5 Durch Ersatz des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8119 in Beispielen 2 bis 7 durch die gemäss Beispiel 10 hergestellten Mutanten erhält man 9a-OH AD.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxyandrosten-dion, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismusmutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Micro-bacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Strepto-myces, der sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mitl7-Alkylseitenketten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von 9a-Hydroxyandrostendion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismusmutanten in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart einer Mischung aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen in den 17-Alkylseitenketten züchtet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmaste-rin oder Campesterin verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Steroidgemisch ein solches aus Sitosterin und/ oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mycobacteriummutanten, der sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit

17-AIkylseitenketten mit 2 bis 10 Kohlenstoff atomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von 9a-Hydroxyandrosten-dion in der Nährbrühe auszeichnet, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in der 17-A1-kylseitenkette züchtet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismusmutanten in einer wässrigen Nährbrühe unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemisches aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in den 17-Alkylseitenketten züchtet.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin oder Campesterin verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Steroidgemisch ein solches aus Sitosterin und/ oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemisches aus zwei oder mehreren Steroiden mit jeweils 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in den

17-AIkylseitenketten züchtet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als Steroidgemisch ein Gemisch aus Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 «Berichte» 70, 470 und «Berichte» 70, 2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im

Jahre 1952 (vgl. US-PS 2 602 769) berichten Peterson und Murray über die lla-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 3 684 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den se-5 lektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-AI-kylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoff atomen in der 17-AIkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en--3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,17-dion und 20a-Hydroxy-io methyl-pregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 3 759 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoff atomen in der 17-A1-15 kylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der Gärbrühe 9a-Hydroxyandrostendion, im folgenden 20 als 9a-OH AD bezeichnet, anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmassnahmen oder anderen Mutationsmassnahmen aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, 25 Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum.