CN107099485B - 一株去氢孕酮降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株去氢孕酮降解菌及其应用，属于环境有机污染物生物处理技术领域。该降解菌是来源于广东省佛山市某规模化养猪场冲刷水中，经人工富集培养、分离纯化得到。名称为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DGT2，于2016年11月2日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60101。本发明的菌株具有高效降解去氢孕酮的能力，可用于降解单一的去氢孕酮污染，也可用于降解多种类固醇激素混合污染物，为含去氢孕酮等类固醇激素的养殖废水生物处理提供了一种新的种质资源。

Description

一株去氢孕酮降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株去氢孕酮降解菌及其应用。

背景技术

去氢孕酮是一种人工合成孕激素，比天然孕激素具有更强的选择性和生物利用率，广泛应用于人类疾病治疗(如不孕不育、先兆流产、复发性流产、月经失调、子宫内膜异位等)以及规模化畜禽养殖(如诱导同期排卵、预防流产及促进生长等)。由于废水处理设施不完善及传统处理工艺效果有限，污水处理厂及规模化养猪场周边受纳环境、地下水中普遍检出去氢孕酮物质，浓度范围为2～2188ng/L(Liu SS,Ying GG,Liu S.Analysis of21progestagens in various matrices by ultra-high-performance liquidchromatography tandem mass spectrometry(UHPLC-MS/MS)with diverse sample pretreatment.Anal.Bioanal.Chem.2014,406(28),7299-7311.)。去氢孕酮作为一种内分泌干扰物，具有高生物活性，在ng/L的水平就可表现出对水生生物(如斑马鱼)的毒性作用，微观作用包括改变基因表达、影响类固醇生成酶的活性，宏观表现为损害生殖能力、影响性器官成熟及正常形态、改变昼夜节律(Zhao YN,Castiglioni S,Fent K.Synthetic progestinsmedroxyprogesterone acetate and dydrogesterone and their binary mixturesadversely affect reproduction and lead to histological and transcriptionalalterations in zebrafish(Danio rerio).Environ.Sci.Technol.2015,49,4636-4645.)。人类与斑马鱼的基因相似度高达87％，两者的生理学特征相似，所以去氢孕酮对人类的潜在危害不容小觑。因此，寻求高效防治去氢孕酮污染技术对人类健康和生态环境安全具有重要意义。

环境孕激素近几年才引起人们的关注，其降解去除研究还处于起步阶段，关于去氢孕酮的去除更是少见，几乎空白。尽管污水处理厂和规模化养殖场传统的污水处理设施对去氢孕酮有一定的去除效果，然而周边受纳环境及地下水中频繁检出去氢孕酮等孕激素物质，表明缺乏一种有针对性的去除这类新型有机污染物的方法。综合考虑环境和经济因素，微生物降解被认为是目前去除环境中有机物最经济绿色的方法。国内外暂未见关于菌株降解去氢孕酮的报道，亟需开展相关研究。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株去氢孕酮降解菌。该菌能高效、快速降解去氢孕酮物质。

本发明的另一目的在于提供上述去氢孕酮降解菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一株去氢孕酮降解菌，菌种命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DGT2，是来源于广东省佛山市某规模化养猪场冲刷水中，经人工富集培养、分离纯化得到。

所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)DGT2的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2016年11月2日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60101。

所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)DGT2的菌落为圆形、凸起光滑、白色，有粘性；电子显微镜下观察该菌的形态为芽孢杆菌；生物学特性为：氧化酶阴性，接触酶阳性，革兰氏染色阳性，非发酵型，专性需氧，该菌可在好氧条件下降解去氢孕酮。该菌经16S rDNA序列测序，结果在NCBI数据库中进行同源性比对，菌株与Bacillus sp.T2(2013)亲缘关系最近，同源性达99％以上。菌株DGT2的16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。

所述的去氢孕酮降解菌在养殖废水生物处理中的应用。特别是可用于降解养殖废水中的去氢孕酮等类固醇激素。

所述的类固醇激素为去氢孕酮、1,4-雄烯二酮、17β-勃地酮、雄烯二酮、诺龙、睾酮、羟孕酮、黄体酮、氢化黄体酮和甲地孕酮等中的至少一种。

本发明菌株具有高效降解去氢孕酮的能力，在Mueller Hinton(MH)肉汤培养基中，60h能完全降解5mg/L的去氢孕酮(DGT)；在实际养猪废水中，只需要24h能完全降解5mg/L的去氢孕酮；而且72h基本能完全降解实际养猪废水中的1,4-雄烯二酮(ADD)、17β-勃地酮(17β-BOL)、雄烯二酮(AED)、诺龙(19-NT)、睾酮(T)、羟孕酮(HP)、黄体酮(P)、氢化黄体酮(5α-DHP)、去氢孕酮(DGT)和甲地孕酮(MGT)等常见类固醇激素物质。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明菌株对去氢孕酮的降解速率快，可用于降解单一的去氢孕酮污染，也可用于降解多种类固醇激素混合污染物，为含去氢孕酮等类固醇激素的养殖废水生物处理提供了一种新的种质资源。

附图说明

图1是MH肉汤培养基中菌株DGT2对去氢孕酮的降解效果。

图2是实际养猪废水中菌株DGT2对去氢孕酮的降解效果。

图3是实际养猪废水中菌株DGT2对多种类固醇激素的降解效果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：去氢孕酮降解菌DGT2的驯化、分离及鉴定

菌源采自广东省佛山市某规模化养猪场的冲刷水。收集充足的冲刷水，混匀后分装于3个1L的锥形瓶中，每瓶500mL；分别添加去氢孕酮标样使废水中去氢孕酮浓度达500μg/L；多层纱布封口后于25℃、150rpm避光驯化培养；约1周之后，添加更高浓度的去氢孕酮；按照此法反复驯化多次，至60天，去氢孕酮浓度为5mg/L。

停止驯化后，取100μL驯化液于MH琼脂培养基上，三角涂布法涂平板；多次涂平板后，尽可能挑选形态、颜色、气味不同的菌进行划线；多次划线后筛选出单菌，将单菌加入仅有去氢孕酮的MH肉汤培养基中培养；根据肉汤中去氢孕酮的残留量，筛选出具有降解去氢孕酮能力的单菌；DMSO法保存菌种(取900μL菌液于1.5mL离心管中，加入100μL已灭菌的DMSO溶液，涡旋混匀，4℃放置20min后，-20℃保存菌种)，尽快送样测序，鉴定菌种。

菌种送往北京华诺时代科技有限公司，进行16S rDNA鉴定：序列的扩增采用正向引物(P690F)：5'-TGTGTAGCGGTGAAATGCG-3'(690～708bp)，反向引物(P829R)：5'-CATCGTTTACGGCGTGGAC-3'(829～811bp)，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下：95℃变性15min，95℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环；72℃10min，4℃保存。将得到的16S rDNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对，经比对发现，菌株DGT2(本实验中对去氢孕酮降解最快的菌株)与Bacillus sp.T2(2013)的同源性最高，达99％。结合形态、生理生化指标和16SrDNA基因序列分析，初步鉴定菌株DGT2为Bacillus sp.。命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)DGT2，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2016年11月2日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCCNO：60101。

所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)DGT2的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2：MH肉汤培养基中菌株DGT2对高浓度去氢孕酮的降解

配制MH肉汤培养基，灭菌后冷却至室温，无菌条件下分装至1L锥形瓶中，加入去氢孕酮使其初始浓度达5mg/L，实验分为两组：(1)有菌实验组，将菌株DGT2接种到MH肉汤培养基中，混合均匀；(2)无菌对照组，不接种DGT2菌株，且肉汤培养基中加入叠氮化钠(最终浓度为0.5％)。所有锥形瓶均用多层纱布封口，锡纸包裹避光，置于摇床中(150rpm，25℃)培养；实验组和对照组均设置3个平行，连续测定培养液中去氢孕酮的残留量，分析菌株DGT2对去氢孕酮的降解能力，结果如图1所示。由图可知，DGT2在60h内完全降解5mg/L去氢孕酮，未添加DGT2的对照组中去氢孕酮浓度基本没有变化。

本案例说明菌株DGT2在MH肉汤培养基中对高浓度的去氢孕酮具有良好的降解效果。

实施例3：养猪废水中菌株DGT2对高浓度去氢孕酮的降解

废水采自广东省佛山市某规模化养猪场的冲刷水。灭菌后的废水于无菌条件下分装于锥形瓶中，分别添加去氢孕酮标样使废水中去氢孕酮浓度达5mg/L。实验分为两组：(1)有菌实验组，将菌株DGT2接种到灭菌后的养猪废水中，混合均匀；(2)无菌对照组，不接种DGT2菌株，且废水中加入叠氮化钠(最终浓度为0.5％)。所有锥形瓶均用多层纱布封口，锡纸包裹避光，置于摇床中(150rpm，25℃)培养；实验组和对照组均设置3个平行，连续测定废水中去氢孕酮的残留量，分析菌株DGT2对去氢孕酮的降解能力，结果如图2所示。由图可知，DGT2在24h内基本完全降解5mg/L去氢孕酮，未添加DGT2的对照组中去氢孕酮浓度基本没有变化。

本案例说明菌株DGT2在高COD的实际养猪废水中仍能保持对高浓度去氢孕酮的高效降解。

实施例4：养猪废水中菌株DGT2对含有高浓度去氢孕酮等类固醇激素类物质的降解

废水采自广东省佛山市某规模化养猪场的冲刷水，其COD为2310mg/L，去氢孕酮等类固醇激素物质的总浓度为21.67μg/L。灭菌后的废水于无菌条件下分装于锥形瓶中；实验分为两组：(1)有菌实验组，将菌株DGT2接种到灭菌后的养猪废水中，混合均匀；(2)无菌对照组，不接种DGT2菌株，且废水中加入叠氮化钠(最终浓度为0.5％)。所有锥形瓶均用多层纱布封口，锡纸包裹避光，置于摇床中(150rpm，25℃)培养；实验组和对照组均设置3个平行，分别于0h，24h，48h，72h，96h测定废水中1,4-雄烯二酮(ADD)、17β-勃地酮(17β-BOL)、雄烯二酮(AED)、诺龙(19-NT)、睾酮(T)、羟孕酮(HP)、黄体酮(P)、氢化黄体酮(5α-DHP)、去氢孕酮(DGT)和甲地孕酮(MGT)等常见类固醇激素物质的残留量，计算各个时间段菌株DGT2对类固醇激素物质的降解率，结果如表1和图3所示。由图可知，DGT2在72h内基本完全降解了去氢孕酮等类固醇激素物质。实验结果显示对照组中类固醇激素物质基本没有降解。

表1不同时刻养殖废水中类固醇激素浓度(ng/L)

注：ND表示未检出。

本案例说明菌株DGT2在高COD的实际养猪废水中不仅仍能保持对去氢孕酮的高效降解，而且对其他类固醇激素物质均具有良好的降解效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州地球化学研究所

<120> 一株去氢孕酮降解菌及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物（P690F）

<400> 1

tgtgtagcgg tgaaatgcg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物（P829R）

<400> 2

catcgtttac ggcgtggac 19

<210> 3

<211> 1430

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）DGT2的16S rDNA 序列

<400> 3

cgtgctatac atgcaagtcg agcgaatgga ttaagagctt gctcttatga agttagcggc 60

ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccataagact gggataactc cgggaaaccg 120

gggctaatac cggataacat tttgaactgc atggttcgaa attgaaaggc ggcttcggct 180

gtcacttatg gatggacccg cgtcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240

caacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300

gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360

acgccgcgtg agtgatgaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag 420

tgctagttga ataagctggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag 540

cgcgcgcagg tggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca 600

ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg tagcggtgaa 660

atgcgtagag atatggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct gtaactgaca 720

ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780

acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt gctgaagtta acgcattaag 840

cactccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960

catcctctga caaccctaga gatagggctt ctccttcggg agcagagtga caggtggtgc 1020

atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

ttgatcttag ttgccatcat taagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140

aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200

acaatggacg gtacaaagag ctgcaagacc gcgaggtgga gctaatctca taaaaccgtt 1260

ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320

gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380

agagtttgta acacccgaag tcggtggggt aaccttttgg agccagccgc 1430

Claims (4)

1.一株去氢孕酮降解菌，其特征在于：名称为芽孢杆菌（Bacillus sp.）DGT2，于2016年11月2日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60101。

2.权利要求1所述的去氢孕酮降解菌在养殖废水生物处理中的应用，其特征在于：所述的去氢孕酮降解菌用于降解养殖废水中的类固醇激素。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的类固醇激素为去氢孕酮、1,4-雄烯二酮、17β-勃地酮、雄烯二酮、诺龙、睾酮、羟孕酮、黄体酮、氢化黄体酮和甲地孕酮中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述的类固醇激素为去氢孕酮。