CN107523527B - 一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌及其应用，属于环境有机污染物生物处理技术领域。该降解菌源自广东省佛山市某规模化养猪场的冲刷水中，经人工富集培养、分离纯化所得。名称为Solibacillus silvestris MPA3，于2017年06月30日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60209。本发明菌株对醋酸甲羟孕酮的降解速率快，可用于降解单一的醋酸甲羟孕酮，也可用于降解多种类固醇激素混合污染物，为含有醋酸甲羟孕酮等类固醇激素的城市污水及养殖废水处理提供了一种新的种质资源。

Description

一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌及其应用。

背景技术

醋酸甲羟孕酮又名安宫黄体酮，是一种人工合成的类固醇孕激素，由于其具有比天然孕激素更强的选择性和生物利用率，故而在医疗领域和畜禽养殖产业得到广泛应用。天然的及合成类的类固醇激素物质通过人类和畜禽代谢排放，但现有城市污水处理系统工艺对其无法有效去除，而畜禽养殖场粪污则往往采用直接排放或经简单处理后排放、畜禽粪便农用等传统的处理方式，因此导致类固醇激素物质及其代谢产物在环境中残留。如在污水处理厂进出水及规模化养猪场周边的受纳环境中均能检测到醋酸甲羟孕酮，其浓度范围为0.9-506ng/L(Liu et al.,2015；Liu et al.,2014)。醋酸甲羟孕酮作为一种内分泌干扰物，具有较高生物活性，据文献报道，其对水生生物(如斑马鱼)具有生态毒性，除了单独产生作用改变受试斑马鱼的基因表达、影响其类固醇生成酶的活性以外，还可与其他合成类孕激素(如去氢孕酮)一起产生危害更大的协同作用，损害斑马鱼的生殖能力，降低其产卵率、影响其性器官成熟及形体发育、改变其昼夜节律等(Zhao et al.,2015)。人类与斑马鱼的基因相似度高达87％，两者具有相似的生理学特征，因此，环境中残留的醋酸甲羟孕酮及其他类固醇激素物质可能对人类和水生生物构成潜在的威胁，研究环境中类固醇激素物质的消减技术是非常有必要的。

微生物降解是环境中类固醇激素物质自然消减的一种重要途径，亦是最为经济绿色的方法之一。一直以来，环境中类固醇激素物质的研究主要集中在雌激素，对于孕激素物质的研究尤其是其降解去除方面的研究较少，大多为天然孕激素黄体酮的微生物降解(Safiarian et al.,2012)，而关于其他合成类孕激素如醋酸甲羟孕酮的降解研究则未见报道。养殖场周边受纳环境及地下水中频繁检出醋酸甲羟孕酮等类固醇激素物质，表明现有污水处理工艺对该类化合物的去除能力有限，有必要研发高效的、有针对性的和高适用性的微生物降解去除方法。

发明内容

为了克服现有去除合成类孕激素醋酸甲羟孕酮所存在的技术空白，本发明的目的在于提供一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌。该菌株可快速降解合成类孕激素醋酸甲羟孕酮，并对其他多种类固醇激素物质具有降解能力。

本发明的另一目的在于提供上述醋酸甲羟孕酮高效降解菌的应用。

该菌株在醋酸甲羟孕酮及其他类固醇激素物质降解中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌，菌株命名为Solibacillussilvestris MPA3，该菌株源自广东省佛山市某规模化养猪场的冲刷水中，经人工富集培养、分离纯化所得。

所述的Solibacillus silvestris MPA3的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年06月30日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60209。

所述的Solibacillus silvestris MPA3在鉴定培养基(MH肉汤培养基)纯培养条件下，菌落呈圆形，中部凸起，边缘呈微小锯齿状，较湿润，有粘性，菌落颜色浅黄偏白，正反颜色一致。进行系列生理生化试验，结果为：硝酸盐还原反应阴性，过氧化氢酶试验阳性，明胶水解试验阴性；淀粉水解试验阳性，西蒙氏柠檬酸盐实验阴性，V-P试验阴性，葡萄糖试验阴性，甘露醇试验阴性，溶菌酶肉汤试验阴性，动力学培养基试验阳性，甲基橙试验阴性。此外，该菌株可以以醋酸甲羟孕酮为唯一碳源。

将Solibacillus silvestris MPA3的16S rDNA序列测序结果与NCBI数据库进行同源性比对，发现菌株与Solibacillus silvestris strain亲缘关系最近，同源性达99％以上。菌株MPA3的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的醋酸甲羟孕酮高效降解菌在降解类固醇激素中的应用。

所述的类固醇激素为地塞米松，雄烯二酮，1,4-雄烯二酮，17α-群勃龙，17β-群勃龙，17α-勃地酮，17β-勃地酮，19-诺龙，睾酮，表雄甾酮，甲基睾酮，雄酮，斯坦唑，5α-二氢睾酮，黄体酮，醋酸甲羟孕酮，双炔失碳酯，19-炔诺酮，异炔诺酮，屈螺酮，炔孕酮，羟孕酮，甲炔诺酮，氯地孕酮，醋酸羟孕酮，甲地孕酮，甲羟孕酮，去氢孕酮，醋酸氯地孕酮，醋酸炔诺酮，醋酸美伦孕酮，米非司酮，氢化黄体酮和已酸羟孕酮中的一种或多种。

菌株MPA3可应用于合成类孕激素醋酸甲羟孕酮的降解。

菌株MPA3可应用于其他多种类固醇激素物质的降解。

菌株MPA3应用于醋酸甲羟孕酮及其他多种类固醇激素物质降解适用的温度条件为25℃～37℃。优选温度条件为28℃～30℃。

菌株MPA3应用于醋酸甲羟孕酮及其他多种类固醇激素物质降解适用的酸碱条件为PH 6～9，优选条件为PH 7～8。

菌株MPA3应用于醋酸甲羟孕酮及其他多种类固醇激素物质降解适用的培养条件是：碳源为醋酸甲羟孕酮及其他类固醇激素物质的无机盐培养基，或碳氮源为醋酸甲羟孕酮及其他类固醇激素物质与其他共代谢底物，所述其他共代谢底物为葡萄糖，蔗糖，乳糖，酵母粉，蛋白胨，尿素中的一种或几种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的菌株MPA3能够降解合成类孕激素醋酸甲羟孕酮及其他多种类固醇激素物质；

(2)菌株MPA3在醋酸甲羟孕酮浓度为500ng/mL，28℃～30℃，PH 7～8的条件下能够快速降解醋酸甲羟孕酮，降解率达99％以上。在MH肉汤培养基中，降解半衰期为1.4h，完全降解所需时间为5h；在以醋酸甲羟孕酮为碳源的无机盐培养基中，降解半衰期为0.94h，降解完全所需时间<5h。

(3)在有碳源的MH肉汤中和无碳源的无机盐培养基中，菌株MPA3均能够同时降解几十种类固醇激素物质。

(4)本发明菌株对醋酸甲羟孕酮的降解速率快，可用于降解单一的醋酸甲羟孕酮，也可用于降解多种类固醇激素混合污染物，为含有醋酸甲羟孕酮等类固醇激素的城市污水及养殖废水处理提供了一种新的种质资源。

附图说明

图1是细菌MPA3在MH琼脂培养基上生长的菌落图(a)及其在MH肉汤培养基中，以28℃，160rpm条件培养时的生长曲线(b)。

图2是MH肉汤中菌株MPA3对醋酸甲羟孕酮的降解效果。

图3是无机盐培养基中菌株MPA3对醋酸甲羟孕酮的降解效果。

图4是MH肉汤中菌株MPA3对34种类固醇激素物质的降解效果；其中，(a)实验组，(b)对照组。

图5是无机盐培养基中菌株MPA3对34种类固醇激素物质的降解效果；其中，其中，(a)实验组，(b)对照组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：醋酸甲羟孕酮降解菌的筛选及鉴定

前期以广东省佛山市某规模化养猪场的冲刷水为菌源，经人工富集培养、有目的性地分离纯化得到29种单菌。本发明在此基础上，筛选出一株醋酸甲羟孕酮的高效降解菌，具体实施过程如下：

取32个10mL玻璃试管，分别加入5mL灭菌后的MH肉汤，其中29个作为实验组分别加入29种已培养至对数期的单菌，另取3个试管不加细菌作为对照组。向实验组和对照组中分别加入目标孕激素醋酸甲羟孕酮，使其最终浓度为5mg/L。将实验组和对照组的试管用活塞封口并用锡纸包好避光，放入摇床，于28℃，160rpm恒温培养，分别于0h，12h，24h，48h时取样上机检测，根据肉汤中醋酸甲羟孕酮的残留量，筛选出具有降解醋酸甲羟孕酮能力的单菌。29种课题组现存细菌中共有7种可以降解醋酸甲羟孕酮，其中处于对数期的菌株MPA3可以在数分钟内将5mg/L的醋酸甲羟孕酮降解完全，具有绝对的降解速率优势。

将菌株MPA3送往北京六合华大基因科技有限公司，进行16S rDNA鉴定：16S引物序列为：27f：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下：95℃变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃60s，共35个循环；72℃10min，12℃保存。将得到的16S rDNA序列登录GenBank，进行Blast同源比对，经比对发现，菌株MPA3与Solibacillus silvestris strain的同源性能够达到99％。将菌株16SrDNA基因序列结合其形态及其他生理生化指标进行分析，初步鉴定菌株MPA3为Solibacillus silvestris strain，图1为菌株MPA3的菌落形态及其在28℃，160rpm好氧条件下培养时的生长曲线。

菌株命名为Solibacillus silvestris MPA3，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年06月30日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60209。

所述的Solibacillus silvestris MPA3的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2：MH肉汤培养基中菌株MPA3对高浓度醋酸甲羟孕酮的降解

将灭菌后的MH肉汤培养基在无菌条件下分装至1L洁净锥形瓶中，加入目标孕激素醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone acetate，MPA)，使其最终浓度为5mg/L。实验包含有菌实验组及灭菌对照组：(1)实验组(未灭菌组，Nonsterile)，将菌株MPA3接种到含有目标化合物的灭菌后的MH肉汤中混合均匀；(2)对照组(灭菌组，Sterile)，不接种菌株，且在灭菌后的MH肉汤中添加适量叠氮化钠抑菌。所有锥形瓶均用可透空气的封口膜封口，外壁包裹锡纸避光，置于摇床中(28℃，160rpm)培养；实验设置3个平行，连续取样测定培养液中醋酸甲羟孕酮的残留浓度，分析菌株MPA3对醋酸甲羟孕酮的降解能力，结果如图2所示。由图可见，菌株MPA3可在5h内完全降解5mg/L醋酸甲羟孕酮，未添加细菌的对照组中醋酸甲羟孕酮浓度基本没有变化。分别采用零级动力学方程和一级动力学方程拟合MPA3在MH肉汤中对MPA的好氧降解，拟合数据均具有很好的显著性(p<0.0001)，结果如表1所示。相比之下，一级反应动力学更好地拟合了降解数据，降解半衰期为1.4h。

本实施例充分说明了菌株MPA3对MH肉汤中高浓度的醋酸甲羟孕酮具有良好的降解效果。

实施例3：无机盐培养基中菌株MPA3对高浓度醋酸甲羟孕酮的降解

配制不含碳源的无机盐培养基，灭菌后在无菌条件下分装至1L洁净锥形瓶，加入目标孕激素醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone acetate，MPA)，使其最终浓度为5mg/L。实验包含有菌实验组及灭菌对照组：(1)实验组(未灭菌组，Nonsterile)，将菌株MPA3接种到含有目标化合物醋酸甲羟孕酮的灭菌后的无机盐培养基中，混合均匀；(2)对照组(灭菌组，Sterile)，不接种菌株，且在灭菌后的无机盐培养基中添加适量叠氮化钠抑菌。所有锥形瓶均用可透空气的封口膜封口，外壁包裹锡纸避光，置于摇床中(28℃，160rpm)培养；实验设置3个平行，连续取样测定无机盐培养基中醋酸甲羟孕酮的残留浓度，分析菌株MPA3对醋酸甲羟孕酮的降解能力，结果如图3所示。由图可见，菌株MPA3可在4h左右将5mg/L醋酸甲羟孕酮完全降解，未添加细菌的对照组中醋酸甲羟孕酮浓度基本没有变化。采用一级动力学方程拟合MPA3在无机盐培养基中对MPA的好氧降解，拟合数据具有很好的显著性(p<0.0001)，结果如表1所示，降解半衰期为0.94h。

本实施例充分说明了菌株MPA3对无机盐培养基中高浓度的醋酸甲羟孕酮具有良好的降解效果，可直接以醋酸甲羟孕酮作为碳源。

表1降解过程中的动力学参数

实施例4：MH肉汤培养基中菌株MPA3对多种类固醇激素物质的降解

将灭菌后的MH肉汤培养基在无菌条件下分装至1L洁净锥形瓶中，加入34种类固醇激素，其中包含糖皮质激素地塞米松(Dexamethasone)，雄激素雄烯二酮(4-Androstene-3,17-dione)，1,4-雄烯二酮(Androsta-1,4-diene-3,17-dione)，17α-群勃龙(17α-trenbolone)，17β-群勃龙(17β-trenbolone)，17α-勃地酮(17α-boldenone)，17β-勃地酮(17β-boldenone)，19-诺龙(19-Nortestoserone)，睾酮(Testosterone)，表雄甾酮(Epi-androsterone)，甲基睾酮(Methy testosterone)，雄酮(Androsterone)，斯坦唑(stanozolol)，5α-dihydrotestosterone(5α-二氢睾酮)，孕激素黄体酮(progesterone)，醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone acetate)，双炔失碳酯(Anordrin)，19-炔诺酮(19-norethindrone)，异炔诺酮(Norethynodrel)，屈螺酮(Drospirenone)，炔孕酮(Ethynyltestosterone)，羟孕酮(Hydroxy progesterone)，甲炔诺酮(Norgestrel)，氯地孕酮(Chlormadinone)，醋酸羟孕酮(17α-Hydroxyprogesterone acetate)，甲地孕酮(Megestrol)，甲羟孕酮(Medroxyprogesterone)，去氢孕酮(Dydrogesterone)，醋酸氯地孕酮(Chlormadinone acetate)，醋酸炔诺酮(Norethisterone acetate)，醋酸美伦孕酮(Melengestrol acetate)，米非司酮(Mifepristone)，氢化黄体酮(5α-Dihydroprogesterone)和已酸羟孕酮(Hydroxyprogesterone caproate)，各物质终浓度为2mg/L。实验包含有菌实验组及灭菌对照组：(1)实验组，将菌株MPA3接种到含有目标化合物的MH肉汤中混合均匀；(2)对照组，不接种菌株，且在MH肉汤中添加适量叠氮化钠抑菌。所有锥形瓶均用可透空气的封口膜封口，外壁包裹锡纸避光，置于摇床中(28℃，160rpm)培养；实验设置3个平行，连续取样，测定培养液中各激素物质的残留浓度，计算出各激素物质在各取样点相应的降解率，结果如图4所示。由图可见，实验组中，在240h内，大部分激素物质接近完全降解，降解率均为95％以上，个别激素的降解率介于65％～90％。另外，雄烯二酮和1,4-雄烯二酮在降解初期浓度有上升现象，但随着降解时间的增加，其浓度呈现下降趋势，这可能是由于这两种雄激素物质是其他激素物质的初级降解产物(Liu et al.,2013)。对照组中，部分激素物质的浓度在240h内也有所下降，这可能是由于实验周期较长，取样次数较多，不可避免地使样品短时间暴露于阳光下，同时反应体系中pH以及氧含量等也在随着反应的进行发生变化，使得部分较易水解或光解的激素物质发生了自然降解(Young etal.,2013；

et al.,2010；Gryglik et al.,2010)。对照组中大部分物质降低的浓度介于10％～50％之间，个别激素物质浓度降低50％以上，但在实验组中，这些物质的降解率皆接近100％。

本实施例充分说明了菌株MPA3对MH肉汤中较高浓度的多种类固醇激素物质具有良好的降解效果。

实施例5：无碳源的无机盐培养基中菌株MPA3对多种类固醇激素物质的降解

配制不含碳源的无机盐培养基，灭菌后在无菌条件下分装至1L洁净锥形瓶，加入34种类固醇激素(同实施例4)，终浓度为2mg/L。实验包含有菌实验组及灭菌对照组：(1)实验组，将菌株MPA3接种到含有目标化合物的无机盐培养基中，混合均匀；(2)对照组，不接种菌株，且在无机盐培养基中添加适量叠氮化钠抑菌。所有锥形瓶均用可透空气的封口膜封口，外壁包裹锡纸避光，置于摇床中(28℃，160rpm)培养；实验设置3个平行，连续取样，测定培养液中各激素物质的残留浓度，计算出各激素物质在各取样点相应的降解率，结果如图5所示。由图可见，菌株MPA3可直接以大部分类固醇激素物质为碳源。由于无机盐培养基缺乏碳源，细菌MPA3对不同激素物质的利用情况不同，故而有些物质降解缓慢，在实验周期内(15d)降解速率较低。此外，由于实验周期较长，对照组中某些物质同样发生了自然降解且更无规律，但其降解速率明显较实验组更低。另外，某些激素物质在某些时间点浓度有所增加，这可能是由于该物质为其他激素物质某一降解阶段的产物。

本实施例充分说明了菌株MPA3可直接以大部分类固醇激素物质为碳源，对无机盐培养基中较高浓度的多种类固醇激素物质具有良好的降解效果。

参考文献：

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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院广州地球化学研究所

<120> 一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1373

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Solibacillus silvestris MPA3的16S rDNA 序列

<400> 1

cttgctgccg ttggttgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg 60

catgctgatc cgcgattact agcgattccg gcttcatgta ggcgagttgc agcctacaat 120

ccgaactgag aacggtttta tcggattagc tccccctcgc gggttggcaa ccgtttgtac 180

cgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc 240

ccaccttcct ccggtttatc accggcagtc tccttagagt gcccaactaa atgatggcaa 300

ctaagaacaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 360

cgacaaccat gcaccacctg tcaccgttgt ccccgaaggg aaaactgtat ctctacagtg 420

gtcaatggga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc 480

tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc 540

ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactgaggg gcggaaaccc cccaacactt 600

agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct 660

ttcgcgcctc agtgtcagtt acagaccaga cagtcgcctt cgccactggt gttcctccaa 720

atctctacgc atttcaccgc tacacttgga attccactat cctcttctgc actcaagttc 780

cccagtttcc aatgaccctc cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaaggaac 840

cacctgcgcg cgctttacgc ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg 900

cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctaacaagg taccgtcaag gtagcgccag 960

ttattacgct acttgttctt cccttgcaac agagttttac gaaccgaaat ccttcttcac 1020

tcacggggcg ttgctccatc agactttcgt ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc 1080

ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtgggct 1140

acgcatcgtt gccttggtga gccgttacct caccaactag ataatgcgcc gcgggtccat 1200

cctatagtga tagcaaaacc atctttcaac tttaaaccat gtggttcaaa gtattatccg 1260

gtattagctc cggtttcccg aagttatccc agtctatagg gcaggttacc cacgtgttac 1320

tccacctcgt ccgccgacta aatcctagag aaagcaacgc cttattactc tgt 1373

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 27f

<400> 2

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1492R

<400> 3

tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (6)

1.一株醋酸甲羟孕酮高效降解菌，其特征在于：名称为Solibacillus silvestrisMPA3，于2017年06月30日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60209。

2.权利要求1所述的醋酸甲羟孕酮高效降解菌在降解类固醇激素中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的类固醇激素为地塞米松，雄烯二酮，1,4-雄烯二酮，17α-群勃龙，17β-群勃龙，17α-勃地酮，17β-勃地酮，19-诺龙，睾酮，表雄甾酮，甲基睾酮，雄酮，斯坦唑，5α-二氢睾酮，黄体酮，醋酸甲羟孕酮，双炔失碳酯，19-炔诺酮，异炔诺酮，屈螺酮，炔孕酮，羟孕酮，甲炔诺酮，氯地孕酮，醋酸羟孕酮，甲地孕酮，甲羟孕酮，去氢孕酮，醋酸氯地孕酮，醋酸炔诺酮，醋酸美伦孕酮，米非司酮，氢化黄体酮和已酸羟孕酮中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述的降解适用的温度条件为25 ℃～37 ℃。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述的降解适用的酸碱条件为PH 6～9。

6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述的降解适用的培养条件是：在无机盐培养基中碳源为类固醇激素，或碳氮源为类固醇激素与其他共代谢底物，所述其他共代谢底物为葡萄糖，蔗糖，乳糖，酵母粉，蛋白胨，尿素中的一种或几种。

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