CN107988095B - 一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及应用，本发明筛选出一株屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DTC7，保藏编号为：CCTCC NO:M2017665，将该菌株与鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌有效菌进行复配后获得的微生物菌剂，可以在堆肥升温期大量生长繁殖，发挥降解抗生素的作用，达到降低畜禽粪便中四环素类抗生素的效果。此方法降解效果好、操作简单，为降解畜禽粪便中残留的四环素类抗生素提供了有效的方法。

Description

一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及应用
技术领域
本发明涉及畜禽粪便无害化技术领域，具体而言，涉及一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及应用。
背景技术
四环素类是一种广谱抗生素，包括四环素、金霉素、土霉素和强力霉素。四环素类对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及立克次氏体、支原体、衣原体等病原微生物都有很好的抑制作用。四环素以其优秀的促生长效果和低廉的价格在饲料和药物在猪的饲养环节中大量使用。四环素类抗生素在畜禽养殖业中的广泛使用使得四环素大量残留于畜禽粪便中。而抗生素不能完全被畜禽机体吸收，其30％-90％以母体化合物的形式排放至粪便中。
猪粪或有机肥中残留的抗生素可以进入土壤中，随着雨水等自然界的水循环留在土壤表面；同时四环素类抗生素可以通过垂直矩阵下降到浅层土壤，逐渐渗透进到浅层地下水，最后进入江、河等径流。甚至海洋中也发现了多种四环素类抗生素的残留。这些残留的抗生素破坏海洋的微生物平衡，导致海洋的生态系统的破坏。
四环素类抗生素对机体有一定的毒害作用。研究表明，四环素的使用虽然不会直接造成大鼠体重下降，但是会导致其性激素的合成受到抑制，睾丸、附睾、精囊的生长发育受到影响，大鼠精子数及精子成活率都显著下降。四环素类抗生素还会引起肝脏脂肪细胞病变和内质网应激，诱发病理性脂肪肝。土霉素会与体内的过氧化物酶结合，改变过氧化物酶的二级结构导致过氧化物酶失活，从而影响生物个体的发育。四环素类抗生素在低浓度下有较高的生物积累，可通过水的转运和被动运输进入植物中，其在叶片中的残留浓度最高，它对种子、植物根部以及植物茎叶的发育均有影响，最终损害蔬菜品质。目前，已在多种蔬菜中检测到了四环素的存在。这些抗生素可以通过植物、动物的富集作用进入人体中，进而危害人体的健康。因此有必要对粪便中残留的抗生素进行处理。
目前降解四环素类抗生素的主要方法有水解、氧化降解、电化学降解、植物降解以及微生物降解。但是现有的方法仍存在几处不足(1)水解等非生物方法降解不完全，会有差向异构体等中间代谢产物的残留。(2)生物降解中植物降解缓慢，而酶解对条件的要求苛刻，成本高。(3)堆肥过程中堆体温度高，耐高温的四环素类降解菌的研究目前仍未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高效降解四环素类抗生素的菌株，所述菌株已于2017年11月6日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：屎肠球菌(EnterococcusFaecium)DTC7，保藏编号：CCTCC NO: M2017665，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了一种高效降解四环素类抗生素的微生物复合菌剂，包括屎肠球菌 DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌。
本发明的最后一个目的在于提供了一种高效降解四环素类抗生素的细菌或复合菌剂在降解四环素类抗生素中的应用。
为了达到以上目的，本发明采取以下技术措施：
屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DTC7的筛选：
为申请人从华中农业大学实验猪场、天门、荆门等地的猪场猪粪中分离、筛选、鉴定得到，提取细菌 DNA，PCR扩增16SrDNA序列，提交NCBI数据库进行比对，参照《伯杰氏系统细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》该菌符合屎肠球菌的生理生化特征，确定为屎肠球菌。屎肠球菌DTC7为革兰氏阳性，白色菌落，菌落较小，呈规则的半球型，最适生长温度为37℃，在50℃PH＝9的条件下仍能生长。
所述菌株已于2017年11月6日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DTC7，保藏编号：CCTCC NO:M2017665，地址：中国武汉武汉大学。
一种高效降解四环素类抗生素的微生物复合菌剂，包括屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌。
以上所述的方案中，优选的，屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌；库特氏菌有效菌和粪肠球菌的有效菌含量均为108～109cfu/ml，四种菌按照体积比1:1:1:1进行混合。
商品化的鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌或是文献报道的，均可与屎肠球菌DTC7混合成复合菌剂完成本发明。
以上所述的方案中，优选的：
所述鹑鸡肠球菌为鹑鸡肠球菌Enterococcus ga llinarum HT34-7，参考(王怡婷,金东,杨晶,卢珊,濮吉, 孟祥莉,张桂,徐建国；喜马拉雅旱獭源鹑鸡肠球菌的分离及其耐药性检测[J]；疾病监测；2016,31(05):380-386)
所述库特氏菌Kurthia.sp.，参考(阮志勇,赵斌,王彦伟,宋金龙,赵秉强,李燕婷,孔德龙,刘艳伟,王慧敏, 陈小蓉,刘小飞；一种库特氏菌及微生物菌剂和它们的应用[P]；北京：CN103789226A,2014-05-14。保藏编号为CCTCC NO：M 2013507)
所述粪肠球菌B10MDXEF-1，参考(马德星,马春丽,葛俊伟,张丽丽,高铭扬,王芬,张跃,黄宇辰；鸡源粪肠球菌分离株及其应用[P]；黑龙江：CN104774782A,2015-07-15。保藏编号为：CCTCC NO:M2014488)。
一种高效降解四环素类抗生素的细菌或复合菌剂在降解四环素类抗生素中的应用，包括以屎肠球菌 (Enterococcus Faecium)DTC7为有效成分，制备成降解四环素类抗生素药物中的应用。
所述的四环素类抗生素包括但不限于：土霉素、四环素和金霉素。
本发明的有益效果：
本发明筛选出粪源抗生素降解菌，可以在堆肥升温期大量生长繁殖，发挥降解抗生素的作用，达到降低畜禽粪便中四环素类抗生素的效果。此方法降解效果好、操作简单，为降解畜禽粪便中残留的四环素类抗生素提供了有效的方法。
具体实施方案
本发明技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。
实施例1：
屎肠球菌DTC7的分离纯化与鉴定：
申请人从华中农业大学实验猪场、天门、荆门等地的猪场猪粪中分离、筛选、鉴定得到。具体分离纯化方法为：称取猪粪样品5g于50ml离心管中，加水至50ml摇床200r/min43℃震荡2h，取上清液1ml分别接种于抗生素浓度为20μg/ml的含有四环素、金霉素、土霉素的LB液体培养基中。24小时后吸取100μl 接种于含上述抗生素浓度为40μg/ml的LB液体培养基中。按上述方法每次接种抗生素浓度提高20μg/ml，重复接种直至培养至浓度为200μg/ml。将培养至200μg/ml的培养基吸取100μl重新接种于含抗生素 200μg/ml LB培养基中，恒温震荡培养箱200r/min 43℃震荡2h。将培养基稀释10-6-10-7倍后震荡混合均匀，吸取50μl均匀涂布于LB固体培养基中，43℃恒温培养箱培养24h，挑选出菌落大小、形状不同的菌株于 LB固体培养基划线纯化，43℃恒温培养，重复5次。
LB液体培养基：酵母浸出物5g，NaCl 5g，胰蛋白胨10g，加双蒸水至1000mL，加盐酸或NaOH调 pH值至7.0±0.05，高温灭菌，4℃保存。
LB固体培养基：酵母浸出物5g，NaCl5g，胰蛋白胨10g，琼脂粉12-18g，加双蒸水至1000mL，加盐酸或NaOH调pH值至7.0±0.05，高温灭菌，待温度降到60℃左右时，加入抗生素，混匀后倒入灭菌干燥的培养皿中，超净台内无菌凝固后封口膜封口，标注日期，4℃保存备用。
屎肠球菌为革兰氏阳性，白色菌落，菌落较小，呈规则的半球型，最适生长温度为37℃，在50℃PH＝9 的条件下仍能生长。提取细菌DNA，PCR扩增16SrDNA序列，提交NCBI数据库进行比对，参照《伯杰氏系统细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》该菌符合屎肠球菌的生理生化特征，确定为屎肠球菌。
以上所述菌株已于2017年11月6日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：屎肠球菌 (Enterococcus Faecium)DTC7，保藏编号：CCTCC NO:M2017665，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DTC7发酵培养：
将屎肠球菌复苏，吸取100μL接种于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200r/min培养12h至稳定期，通过平板菌落计数法得出有效菌浓度为2.2×108cfu/ml。
实施例3：
屎肠球菌DTC7对四环素类抗生素的降解作用：
含抗生素培养基的制备
称量胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、氯化钠10g加水至2000mL，NaOH调节pH至8±0.05，120℃高压灭菌20min。待温度冷却后向其中加入四环素、金霉素、土霉素各0.1g，制成100mg/kg的抗生素培养基。
菌液接种
将屎肠球菌DTC7复苏，吸取100μL接种于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200r/min培养12h至稳定期。吸取稳定期的培养基100μL，接种于50mL含抗生素100mg/kg的LB培养基中，43℃200r/min摇床培养。分别取1d、2d、3d、4d、5d、6d 6个时间点的培养基，样品存放于-40℃避光保存。
标准曲线绘制
准确称取一定量的土霉素、四环素、金霉素标准物质，分别用甲醇配成2mg/ml的标准储备液。再分别取5ml的标准储备液至100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，每种物质浓度为100μg/ml。
取标准溶液0.1mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL置于6个100mL的容量瓶中，用 Na2EDTA-mcllvaine-甲醇提取液稀释至刻度，配制成为：0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、 20mg/kg的标准溶液。经液相色谱检测后绘制三种抗生素的线性回归方程。
培养基中抗生素的检测
1)取各个时期的培养基5mL于10mL离心管中，以8000r/min离心10min。
2)取上清液4mL于10mL离心管中，向其中加入2mL的CHCl3和4mL的Na2-EDTA-磷酸氢二钠-柠檬酸 -甲醇提取液。
3)涡旋振荡3min使其充分混合均匀。
4)以8000r/min离心10min，吸取上清液1mL，通过0.22微孔滤膜。
5)样品存放于-40℃避光保存。
6)液相色谱条件:色谱柱：C18 250×4.6 5μm进样量20μL；
流动相：0.01草酸/乙腈/甲醇(70/15/15，v/v/v)；
流速：1.0mL/min，柱温：25℃；
检测波长：360mn，进样量:20μm。
结果计算
Figure BDA0001482649680000041
ci——从工作曲线中得到的被测组分溶液浓度的数值：
c0——空白实验值
V——试液定容体积的数值
m——试料质量的数值
k——稀释因子
降解效果
Figure BDA0001482649680000051
实施例4：
屎肠球菌DTC7的耐高温实验：
将屎肠球菌DTC7复苏，吸取100μL接种于50mL LB液体培养基中，37℃摇床200r/min培养12h至稳定期。吸取稳定期的培养基100μL，接种于50mL含土霉素100mg/kg的LB培养基中，分别在37℃、42℃和50℃下200r/min摇床培养，每小时测定吸光度OD600并记录。
培养时间/h 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
37℃ 0.00 0.01 0.03 0.11 0.36 0.51 0.55 0.54 0.55 0.54 0.54
42℃ 0.00 0.01 0.03 0.13 0.41 0.52 0.52 0.52 0.53 0.50 0.52
50℃ 0.00 0.01 0.02 0.02 0.02 0.03 0.05 0.07 0.12 0.22 0.22
根据以上数据绘制屎肠球菌DTC7的生长曲线，结果说明DTC7在42℃时生长良好，50℃下仍可生长，具有良好的耐高温特征。
实施例5：
含有屎肠球菌DTC7的复合微生物菌剂：
包括屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌。
屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌菌液的制备：接种于LB培养基中，37度培养24h。
所述的鹑鸡肠球菌，有效菌含量为1.7×108cfu/ml；库特氏菌有效菌含量为2.3×108cfu/ml；粪肠球菌有效菌含量为2.5×108cfu/ml。
所述鹑鸡肠球菌为鹑鸡肠球菌Enterococcus ga llinarum HT34-7，参考(王怡婷,金东,杨晶,卢珊,濮吉, 孟祥莉,张桂,徐建国；喜马拉雅旱獭源鹑鸡肠球菌的分离及其耐药性检测[J]；疾病监测； 2016,31(05):380-386)。
所述库特氏菌Kurthia.sp.，参考(阮志勇,赵斌,王彦伟,宋金龙,赵秉强,李燕婷,孔德龙,刘艳伟,王慧敏, 陈小蓉,刘小飞；一种库特氏菌及微生物菌剂和它们的应用[P]；北京：CN103789226A,2014-05-14。保藏编号为CCTCC NO：M 2013507)。
所述粪肠球菌B10MDXEF-1，参考(马德星,马春丽,葛俊伟,张丽丽,高铭扬,王芬,张跃,黄宇辰；鸡源粪肠球菌分离株及其应用[P]；黑龙江：CN104774782A,2015-07-15。保藏编号为：CCTCC NO:M2014488)。
将上述菌剂等体积混合，即得复合微生物菌剂，用于以下实施例。
实施例6：
含有屎肠球菌DTC7的复合微生物菌剂在降解畜禽粪便中残留四环素类抗生素中的应用：
在华中农业大学实验猪场进行堆肥实验。
新鲜猪粪取自华中农业大学实验猪场。将锯末粉碎，通过40目筛。取猪粪2.5kg、锯末0.25kg以干重 10:1混合均匀，放入高压灭菌锅内120℃20min灭菌、温度冷却至室温后加入灭菌的双蒸水，调节水分含量至65％，C/N为20。称取抗生素添加至猪粪、锯末的混合物中并混合均匀，终浓度为100mg/kg。每个堆肥装置中加入质量为20kg的混合物，以质量比1:1000接入培养至稳定的复合菌剂。堆肥装置连接鼓风机，鼓风量为5L/kg·min，每小时通风5min。分别测量4天和8天的抗生素残留，结果如下：
堆体过程中温度变化
时间 1d 2d 3 4 5 6 7 8 9
温度 43.7 47.0 55.0 54.7 49.9 43.7 34.9 27.0 16.3
金霉素含量变化
0d 4d 8d
对照 100％ 24.79 10.59
加入复合菌剂 100％ 24.81 3.81
土霉素含量变化
0d 4d 8d
对照 100％ 53.16 17.53
加入复合菌剂 100％ 49.96 8.13
四环素含量变化
0d 4d 8d
对照 100％ 50.36 40.79
加入复合菌剂 100％ 21.11 6.63
由结果可知，堆体发酵过程中，最高温度未超过56℃，屎肠球菌DTC7对该温度有较好的耐受。复合菌剂对金霉素、土霉素和四环素都有较好的降解效果，8天时效果尤为显著。
从结果可见，在畜禽粪便堆体中加入复合菌剂后对抗生素降解具有良好效果。
对本发明中所公开的实施方式的描述并非为了限制本发明的范围，而是用于描述本发明。相应地，本发明的范围不受以上实施方式的限制，而是由权利要求或其等同物进行限定。
本发明中抗生素残留量的计算方法：
Figure BDA0001482649680000071
C－对肥后样品中抗生素的含量
Ci－堆肥前样品中抗生素的含量。

Claims (6)

1.一种分离的屎肠球菌(Enterococcus Faecium) ，所述的屎肠球菌为：屎肠球菌
DTC7，保藏编号：CCTCC NO:M 2017665。
2.一种降解四环素类抗生素的微生物复合菌剂，包括屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum ) 、库特氏菌( Kurthia . sp. ) 和粪肠球菌( Enterococcus Faecalis ) ，所述的屎肠球菌DTC7的保藏编号为CCTCC NO:M 2017665。
3.根据权利要求2所述的微生物复合菌剂，所述的屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌的有效菌含量均为108～109cfu/ml，四种菌按照体积比1:1:1:1进行混合。
4.权利要求1所述的屎肠球菌在制备降解四环素类抗生素药物中的应用。
5.权利要求2所述的微生物复合菌剂在制备降解四环素类抗生素药物中的应用。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的应用，所述的四环素类抗生物为金霉素，土霉素或四环素。
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