CN113430141B - 一株水产饲用益生菌及其菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株水产饲用益生菌及其菌剂的制备方法。该水产饲用益生菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)新菌株，其菌株号为T23，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22029。实验证明，菌株T23能够促进水产动物生长、降低饲料系数、维护水产动物肠道健康及提高其抗病力作用，在水产养殖中具有广阔的应用前景。

Description

一株水产饲用益生菌及其菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株水产饲用益生菌及其菌剂的制备方法。
背景技术
益生菌是一种活的微生物，在适当的剂量下，对宿主的健康产生有益作用。芽孢杆菌是使用最广泛、研究最充分的益生菌菌株，但大多都集中在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，缺乏具有良好功效的其他物种。
目前很多都是将畜禽中益生效应良好的菌株直接运用到水产养殖中，但益生菌具有宿主特异性，畜禽来源的益生菌由于不适合水产动物的肠道环境而无法很好地定殖和存活，无法发挥出最佳益生效应，来自相同物种或其自然环境的益生菌可能是提高益生功能的最佳方法，已经有很多将水产来源的益生菌应用到水产养殖中并取得良好效应的案例。
因此，鱼类饲用微生物开发可以从土著菌入手，挖掘具有强大益生功能的新物种或菌株，并进一步推进其应用和产业开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何在水产养殖中利用益生菌促进水产动物生长、降低饲料系数、维护水产动物肠道健康和/或提高水产动物抗病力。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌株名称为T23，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22029。
上文所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株T23的16S rDNA的核苷酸序列含有序列表中序列1所示的DNA分子。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述的贝莱斯芽孢杆菌的培养物。本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌的培养物是将上文所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养得到的物质(即发酵产物，如含有贝莱斯芽孢杆菌菌株T23和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有贝莱斯芽孢杆菌菌株T23和分泌到固体培养基内的物质即固体发酵物)。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了菌剂。
所述菌剂含有上文所述的贝莱斯芽孢杆菌T23或/和上文所述的贝莱斯芽孢杆菌T23的代谢物或/和上文所述的培养物。
上文中，所述贝莱斯芽孢杆菌T23的代谢物可为贝莱斯芽孢杆菌T23的发酵液。贝莱斯芽孢杆菌T23的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养贝莱斯芽孢杆菌T23，收集发酵液(含有贝莱斯芽孢杆菌T23和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为贝莱斯芽孢杆菌T23的代谢物。
上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，包括但不限于液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂等。
上述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)提高水产动物增重率；
A2)促进水产动物生长；
A3)提高水产动物饲料利用率；
A4)提高水产动物肠道绒毛长度和/或肌层厚度；
A5)改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康；
A6)提高水产动物抗病力。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述的贝莱斯芽孢杆菌的下述至少一种应用：
B1)所述的贝莱斯芽孢杆菌在提高水产动物增重率中的应用；
B2)所述的贝莱斯芽孢杆菌在促进水产动物生长或制备促进水产动物生长产品中的应用；
B3)所述的贝莱斯芽孢杆菌在提高水产动物饲料利用率或制备提高水产动物饲料利用率产品中的应用；
B4)所述的贝莱斯芽孢杆菌在提高水产动物肠道绒毛长度和/或肌层厚度中的应用；
B5)所述的贝莱斯芽孢杆菌在改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康中的应用；
B6)所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康产品中的应用；
B7)所述的贝莱斯芽孢杆菌在提高水产动物抗病力中的应用；
B8)所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备提高水产动物抗病力产品中的应用。
上述菌剂的下述至少一种应用也属于本发明的保护范围：
B1)上述菌剂在提高水产动物增重率中的应用；
B2)上述菌剂在促进水产动物生长或制备促进水产动物生长产品中的应用；
B3)上述菌剂在提高水产动物饲料利用率或制备提高水产动物饲料利用率产品中的应用；
B4)上述菌剂在提高水产动物肠道绒毛长度和/或肌层厚度中的应用；
B5)上述菌剂在改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康中的应用；
B6)上述菌剂在制备改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康产品中的应用；
B7)上述菌剂在提高水产动物抗病力中的应用；
B8)上述菌剂在制备提高水产动物抗病力产品中的应用。
上文所述水产动物为鱼或斑马鱼。上文所述水产动物还可为其他水产动物。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上文所述的菌剂的方法。所述包括将上文所述的贝莱斯芽孢杆菌在微生物培养基中培养的步骤。
实验证明，本发明发现的发现的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株T23具有促进水产动物生长、降低饲料系数、维护水产动物肠道健康及提高其抗病力的作用，在水产养殖领域具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus velezensis
菌株编号：T23
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年3月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22029
附图说明
图1为T23对斑马鱼的存活率、增重率、饲料系数和日摄食率等的影响。
图2为T23对斑马鱼肠道健康影响。a为肠道HE染色结果。
图3为T23对斑马鱼抗病力影响。横坐标标题为小时。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明是实例中的数据均采用excel和Graphpad prism 8.3.0进行数据分析。
实施例1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)T23的分离及鉴定
本研究分离及使用鱼肠道土著菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisT23。具体为，在无菌条件下从鱼肠道后肠往前肠道缓慢挤出肠道内含物，置于含有10mLPBS缓冲液的50mL离心管中，混匀并静置1分钟后，取上清进行梯度稀释，取10-5～10-9的稀释梯度100μL涂布TSA培养基(15g/L酪蛋白胰酶消化物、5g/L大豆粉木瓜酶消化物、5g/LNaCl、15g/L琼脂)，培养24小时后，挑取菌落划线纯化，纯化后的单菌落接种到液体培养基，培养15-16小时后，取适量菌液送至测序公司进行16S rDNA测序，得到T23菌株的16S rDNA序列如序列表中序列1所示，其与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的16S rDNA的序列相似性为100％。T23菌株的形态特征为表面粗糙有凸起。通过菌株的形态特征、培养特征和Biolog微生物自动分析系统分析将T23菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)新菌株。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株T23已于2021年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.22029。下文菌株T23。
实施例2、贝莱斯芽孢杆菌T23促进斑马鱼生长、降低饲料系数
一、贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的制备
1、菌种活化：贝莱斯芽孢杆菌T23保藏于超低温冰箱，划线于LB固体平板上，30℃静置过夜培养；
2、一级种子培养：挑取单菌落于LB(Luria-Bertani)培养基，30℃、180r/min培养24h；
3、二级种子液培养：按1％接种量接种于LB培养基中，30℃、180r/min培养12h；
4、固体发酵：将二级种子液按5％接种量，接种于固体培养基中；30℃摇床震荡培养48h得到T23的培养物即T23发酵物即为贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂。贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌T23的含量为8×108cfu/g。
固体发酵培养基配制方法：以100g为例：将40g麸皮和60g豆粕混合后，加水使其含水量为60％，浸泡2h，加入葡萄糖3.6g、酵母粉2.4g和硫酸锰0.06g，混匀后，121℃灭菌30min。
二、动物实验
设置对照组和芽孢杆菌组观察贝莱斯芽孢杆菌T23对斑马鱼生长的影响。其中对照组中斑马鱼的投喂的饲料为表1的基础饲料；芽孢杆菌组中斑马鱼的投喂饲料是含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料。含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料除了添加贝莱斯芽孢杆菌T23外，其余成分与表1的基础饲料相同。含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料是向表1的基础饲料中添加步骤一的贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂得到的饲料，含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料中贝莱斯芽孢杆菌T23的含量为108cfu/g。对照组和芽孢杆菌组分别挑取体重为38±1.9mg的健康一月龄斑马鱼(购于中科院水生所)，随机分成3组，每组三个重复养殖缸，每缸20尾鱼，记录其重量，在实验室养殖系统中进行养殖，养殖温度28±1℃，第一周投喂量按体重的6％开始，之后每周在原来的基础上增加1％，每天分别在上午9:00和下午16:00投喂。养殖周期为3周。最后一次喂食结束时，将鱼禁食24h得到芽孢杆菌组处理的斑马鱼和对照组处理的斑马鱼，然后单尾鱼称重。增重率(WG)＝[100×(终末体重-初始体重)/初始体重]，饲料转化率(FCR)＝总摄食量(g)/鱼体增重(g)；存活率(SR)＝(实验结束时的鱼数量/实验开始时的鱼数量)×100，日摄食率(％/d)＝100×总摄食量/[饲喂天数×(初始体重+终末体重)/2]。
结果表明，与对照组相比，芽孢杆菌组中添加贝莱斯芽孢杆菌T23不影响斑马鱼存活率，芽孢杆菌组斑马鱼的增重率显著升高，P<0.05，饲料系数(饲料系数＝总摄食量/总增重)也有降低的趋势，同时处理组斑马鱼的日摄食率也比对照组低(图1)，说明贝莱斯芽孢杆菌T23促进了斑马鱼生长，提高了饲料利用率。
表1基础饲料原料成分及配比
Figure BDA0003168652440000051
Figure BDA0003168652440000061
实施例3、贝莱斯芽孢杆菌T23改善斑马鱼肠道形态
养殖试验结束后，将实施例2中饥饿24h的芽孢杆菌组处理的斑马鱼和对照组处理的斑马鱼在冰上解剖，取出完整肠道，放入装有4％多聚甲醛的离心管中固定，HE染色由北京中科万邦生物技术有限公司完成，拍照在本实验室(软件为ZEN)完成。肠道绒毛长度和肌层厚度由image J软件进行测量。
结果表明，与对照组相比，芽孢杆菌组中添加贝莱斯芽孢杆菌T23显著升高了斑马鱼肠道绒毛长度和肌层厚度(图2)(P<0.01)，说明贝莱斯芽孢杆菌T23可以通过改善肠道形态来改善鱼类肠道健康。
实施例4、贝莱斯芽孢杆菌T23提高斑马鱼抗病力
设置对照组和芽孢杆菌组观察贝莱斯芽孢杆菌T23对斑马鱼抗病力的影响。其中对照组中斑马鱼的投喂的饲料为表1的基础饲料；芽孢杆菌组中斑马鱼的投喂饲料是含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料。含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料除了添加贝莱斯芽孢杆菌T23外，其余成分与表1的基础饲料相同。含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料是向表1的基础饲料中添加步骤一的贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂得到的饲料，含有贝莱斯芽孢杆菌T23菌剂的饲料中贝莱斯芽孢杆菌T23的含量为108cfu/g。对照组和芽孢杆菌组分别挑取体重为38±1.9mg的健康一月龄斑马鱼，随机分成2组，每组三个重复养殖缸，每缸20尾鱼，记录其重量，在实验室养殖系统中进行养殖，养殖温度28±1℃，第一周投喂量按体重的6％开始，之后每周在原来的基础上增加1％，每天分别在上午9:00和下午16:00投喂。养殖周期为3周。最后一次喂食结束时，将鱼禁食24h得到芽孢杆菌组处理的斑马鱼和对照组处理的斑马鱼，然后将上述芽孢杆菌组处理的斑马鱼和对照组处理的斑马鱼放入攻毒缸进行攻毒实验：芽孢杆菌组处理的斑马鱼和对照组处理的斑马鱼每组各设置3个攻毒缸，每缸加入500ml干净的养殖水，同时每缸放入10尾斑马鱼，攻毒缸加入病原菌维氏气单胞菌Hm091(菌种保存于中国农业科学院饲料研究所水产动物饲料创新团队，相关文献：Ran C,Qin C B,Xie M X,Zhang J X,Li J,Xie Y D,Wang Y B,Li S N,Liu L H,Fu X Z,Lin Q,Zhou Z G,2018.Aeromonas veronii and aerolysin are important for the pathogenesis ofmotile aeromonad septicemia in cyprinid fish.Environmental Microbiology,20(9):3442-3456.)的量根据以往大量重复试验的结果估算，最终攻毒浓度为2×107cfu/mL养殖水，在96h内记录其死亡数并计算2个组在Hm091攻毒下的存活曲线。存活率＝存活的斑马鱼(条)/进行攻毒处理的斑马鱼(条)×100％。
结果表明，与对照组处理的斑马鱼(图3中的对照组)相比，芽孢杆菌组处理的斑马鱼(图3中的芽孢杆菌组)中贝莱斯芽孢杆菌T23的添加显著提高了Hm091攻毒后的存活率，P<0.01，芽孢杆菌组处理的斑马鱼在Hm091攻毒96小时的存活率为83.33％，对照组处理的斑马鱼攻毒96小时时的存活率为56.67％，说明贝莱斯芽孢杆菌T23能够提高鱼类抗病力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一株水产饲用益生菌及其菌剂的制备方法
<130> GNCSQ211314
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1356
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）
<400> 1
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 60
tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 120
tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 180
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 240
tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 300
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 360
cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 420
cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 480
ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat 540
gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg 600
cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 660
ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 720
gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 780
tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 840
gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 900
tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt 960
cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1020
gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1080
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1140
tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1200
agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt 1260
cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1320
aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgac 1356

Claims (5)

1.贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis），其菌株号为T23，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 22029。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种特性：
A1）提高水产动物增重率；
A2）促进水产动物生长；
A3) 提高水产动物饲料利用率；
A4）提高水产动物肠道绒毛长度和/或肌层厚度；
A5）改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康；
A6）提高水产动物抗病力。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的下述至少一种应用：
B1）在制备提高水产动物增重率的产品中的应用；
B2）在制备促进水产动物生长产品中的应用；
B3) 在制备提高水产动物饲料利用率产品中的应用；
B4）在制备提高水产动物肠道绒毛长度和/或肌层厚度的产品中的应用；
B5）在制备改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康产品中的应用；
B6）在制备提高水产动物抗病力产品中的应用；
所述水产动物为斑马鱼。
5.权利要求2或3所述菌剂的下述至少一种应用：
B1）在制备提高水产动物增重率的产品中的应用；
B2）在制备促进水产动物生长产品中的应用；
B3) 在制备提高水产动物饲料利用率产品中的应用；
B4）在制备提高水产动物肠道绒毛长度和/或肌层厚度的产品中的应用；
B5）在制备改善水产动物肠道形态或促进水产动物肠道健康产品中的应用；
B6）在制备提高水产动物抗病力产品中的应用；
所述水产动物为斑马鱼。
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