CN108546665B - 一种抗生素降解混合菌剂及其应用 - Google Patents

一种抗生素降解混合菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环保领域，公开了一种抗生素降解混合菌剂及其应用，混合菌剂包含：节杆菌Arthrobacter sp.和产碱菌Alcaligenes sp.。本发明中的节杆菌Arthrobacter sp.为四环素类抗生素降解节杆菌，能同时降解土霉素、四环素和金霉素；产碱菌Alcaligenes sp.为磺胺类抗生素降解菌，能降解磺胺二甲氧嘧啶，同时耐受磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺‑6‑甲氧嘧啶。以上抗生素降解菌株和菌剂可用于畜禽粪便等废弃物中残留抗生素的降解去除，减少废弃物中残留抗生素向环境的释放，同时可应用于抗生素污染土壤中抗生素污染物的降解去除，进行环境修复，具有良好的应用前景和环境效益。

Description

一种抗生素降解混合菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及环保领域，尤其涉及一种抗生素降解混合菌剂及其应用。
背景技术
环境中抗生素残留普遍，土壤、污水污泥、地表水以及动植物食品中均有抗生素检出，对人体及生态环境造成危害。众多的研究表明，环境土壤中可检出的抗生素浓度已接近于土壤中其它农药类有机污染物的含量水平。如何有效去除环境中抗生素残留已成为当下亟待解决的重要环境问题。
生物降解是解决抗生素环境残留的有效手段，已引起国内外学者的广泛关注。目前，四环素类、磺胺类抗生素降解菌均有报道。四环素类抗生素降解菌有氨基杆菌、蜡状芽孢杆菌、不动杆菌、黄孢原毛平革菌、柠檬酸杆菌等。磺胺类抗生素降解菌有类地杆菌、假单胞菌、气单胞菌等。但目前还未见节杆菌能够同时降解多种四环素类抗生素以及产碱菌降解磺胺类抗生素的报道。总体上看，筛选获得的抗生素降解菌株还较为有限，特别是能同时降解多种抗生素的菌株。
中国专利号：CN201710753603.2报道了一株能同时降解四环素、氧四环素和金霉素三种四环素类抗生素的甲基杆菌YWF1，其对金霉素的降解效果最好，其次是土霉素，最后为四环素。
此外，混合微生物群落比起单一微生物有很大的优势，对环境的适应性更强，多种微生物菌种相互配合，更能满足多种抗生素同时存在的复合污染现状，因此混菌降解抗生素的研究也很受关注。特别是实验室人工筛选构建出的混合菌剂，较成分不完全明确的天然混菌及单一菌株对污染物的生物降解优势明显。此外，由于人工构建的混合菌剂的菌种成分明确，因此更容易找到最佳、最合理的生产工艺，产品质量也更稳定，在实际应用中这类菌剂的针对性更强，也更安全合理。然而，目前关于这类菌种明确的抗生素降解混合菌剂的报道还很少。
中国专利号：CN201710753603.2公开了一种降解土壤中抗生素的混合菌剂，由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2组成，可有效降解土壤中多种抗生素，包括土霉素为代表的四环素类、以青霉素为代表的青霉素类抗生素、磺胺嘧啶等。
由上可知，为了满足日益扩大的抗生素污染的微生物修复需求，能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种，为混合菌剂配制提供更多菌种资源，筛选更多不同菌属以及针对不同抗生素的降解菌，扩大抗生素降解微生物菌种库必不可少。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗生素降解混合菌剂及其应用，其包含节杆菌Arthrobacter sp.OTC-16和产碱菌Alcaligenes sp.SMD-FA，同时作为优选添加黄孢原毛平革菌。本发明中的节杆菌Arthrobacter sp.能同时降解土霉素、四环素和金霉素；同时本发明中的产碱菌Alcaligenes sp.能降解磺胺二甲氧嘧啶，同时耐受磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶。该菌剂的应用可有效促进介质中四环素类、磺胺类或氟喹诺酮类抗生素的降解，并且可同时促进2种以上抗生素的降解。以上抗生素降解菌株和菌剂可用于畜禽粪便等废弃物中残留抗生素的降解去除，减少废弃物中残留抗生素向环境的释放，同时可应用于抗生素污染土壤中抗生素污染物的降解去除，进行环境修复，具有良好的应用前景和环境效益。
本发明的具体技术方案为：一种抗生素降解混合菌剂，包含：
节杆菌Arthrobacter sp.(节杆菌OTC-16)，已在2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 15055；节杆菌Arthrobactersp.为四环素类抗生素降解节杆菌，能同时降解土霉素、四环素和金霉素。
产碱菌Alcaligenes sp.(产碱菌SMD-FA)，已在2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 15053；产碱菌Alcaligenessp.为磺胺类抗生素降解菌，能降解磺胺二甲氧嘧啶，同时耐受磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶。
在本发明中，节杆菌OTC-16能同时有效降解多种四环素类抗生素，其中，其对土霉素的降解效果最好，其次是四环素和金霉素，OTC-16菌株的最高土霉素降解率达95％，最高四环素降解率达54％，最高金霉素降解率达68％；菌株OTC-16在pH 6.0-9.0生长良好，3％接种量下，以不接菌的空白对照为参比，发现土霉素的自然降解随pH的升高而减弱，pH 9.0时，OTC-16的土霉素降解率为74％；OTC-16在20-35℃之间可生长，最优的OTC-16降解温度为30℃。
产碱菌SMD-FA在20-30℃，pH 5-8的环境中生长良好，能耐受磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶，能有效降解磺胺二甲氧嘧啶，6天最高降解率56％。
在现有技术中，并未见节杆菌同时降解多种四环素类抗生素以及产碱菌降解磺胺类抗生素的报道。与现有技术相比，本发明公开的菌株的分类种属、降解底物类型以及抗生素降解效率均不同，为抗生素污染修复提供了重要的微生物菌种资源，为能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种提供可能。
此外，本发明公开的抗生素降解混合菌剂是一种人工筛选构建的混合菌剂，较成分不完全明确的天然混菌体系和单一菌株对污染物的生物降解优势明显。该菌剂的菌种成分明确，制备工艺简单，抗生素降解类型广泛、降解效率高，具有较好的应用前景。可应用于畜禽粪便有机肥料中的残留抗生素去除，减少伴随有机肥施用进入农田环境的抗生素，与不添加菌剂的对照相比，接种该菌剂的畜禽粪便中磺胺类、四环素类和喹诺酮类抗生素残留浓度分别下降35-77％、36-45％和20-45％的降解。可应用于抗生素污染土壤的修复，与不添加菌剂的对照相比，接种该菌剂的土壤中磺胺类和四环素类残留浓度可分别下降53％和75％。
作为优选，所述抗生素降解混合菌剂还包含黄孢原毛平革菌。
添加黄孢原毛平革菌后，所述抗生素降解菌剂可高效促进2种以上抗生素的降解，所述抗生素可以是四环素类、磺胺类或氟喹诺酮类抗生素。
进一步地，所述抗生素降解混合菌剂的制备方法如下：分别采用LB培养基培养获得节杆菌Arthrobacter sp.和产碱菌Alcaligenes sp.的种子液，将二者混合。
进一步地，所述抗生素降解混合菌剂的制备方法如下：分别采用LB培养基培养获得节杆菌Arthrobacter sp.和产碱菌Alcaligenes sp.的种子液，将二者混合，标记为菌液A；制备获得黄孢原毛平革菌的孢子、菌丝和其胞外酶，标记为菌液B；将菌液A和B混合使用。
进一步地，所述黄孢原毛平革菌的孢子、菌丝和其胞外酶的制备方法如下：将低温保存的黄孢原毛平革菌斜面放室温下过夜活化菌株；从斜面上挑取黄孢原毛平革菌，划线到PDA平板上，35℃培养一段时间，待平板上长满了白色的孢子；将孢子悬液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，35℃，60％湿度下固态发酵5-8天，直到菌丝长满固态发酵培养基；将所有固态发酵培养基上的混合物全部刮到无菌烧杯里面，用无菌玻璃杯搅拌混匀，成为黄孢原毛平革菌菌剂，室温密封干燥保存待用，保存时间不得超过1周。所述固态发酵培养基的制备方法如下：首先将小麦秸秆粉碎至20-40目，将小麦秸秆、木屑和麸皮按2∶1∶1的比例混匀；然后按照固液比(w/v)为1∶1在4g固态基质表面均匀加入营养液，营养液为Mandel’smedium(g·L-1)：NaNO32，KH2PO41.5，CaCl20.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.005，MnSO4·H2O 0.0016，ZnSO4·H2O 0.0014，CoCl20.0005，pH为6；121℃灭菌1小时，冷却后待用。
进一步地，所述节杆菌Arthrobacter sp.和产碱菌Alcaligenes sp.从制药厂污水处理曝气池中的活性污泥中驯化、筛选得到。
进一步地，所述节杆菌Arthrobacter sp.和产碱菌Alcaligenes sp.的驯化、筛选和鉴定方法，包括如下步骤：
1)取5g左右污泥分别加入含有目标抗生素(1、土霉素，50mg/L；2、磺胺二甲氧嘧啶，50mg/L)的贫营养富集培养基和富营养富集培养基中，放入恒温摇床中(30℃，150-180rpm)避光培养一周；
2)上一阶段的培养物静置后，取上清5ml，转接到相同的抗性富集培养基中，培养7天后，测定抗生素的残留浓度。共富集3个周期。
3)对比贫营养富集培养物和富营养富集培养物中的抗生素残留浓度，选择抗生素降解率较高的富集培养物，静置5-10min后，取0.2mL培养物涂布于含有目标抗生素(100mg/L)的LB平板上，培养箱中30℃恒温培养48h。
4)挑取单个菌落接种于抗性筛选试管(含有目标抗生素，100mg/L)中，恒温摇床中(30℃，150r/min)培养5天后，高效液相色谱法测抗生素浓度，选择降解率较高的抗性筛选试管，反复进行划线分离纯化，结合抗性筛选试管培养和抗生素浓度测定，获得具有抗生素降解能力的纯菌。结合抗生素测定结果发现，富营养富集液的土霉素降解率总体高于贫营养富集液，而贫营养富集液的磺胺二甲氧嘧啶降解率高于富营养富集液，因此贫营养富集培养基更适合用于分离筛选磺胺类抗生素降解菌，而富营养富集培养基更适应用于分离筛选四环素类抗生素降解菌。
5)菌株的形态学和分子生物学鉴定：OTC-16菌株在LB培养基上生长时，菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色或乳黄色、不透明的圆形凸起，显微镜下可见，杆状、小球状，单个或不规则的堆状，革兰氏阳性菌；提取细菌总DNA，用16SrDNA通用引物进行PCR扩增后，进行测序、同源性比对和进化树分析，可知16sr DNA序列与烟草节杆菌(Arthrobacte nicotianae)的同源性达到99.9％，亲缘关系最近。SMD-FA菌株在LB培养基上生长时，菌落都呈圆形，小，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色、透明的圆形凸起；显微镜下可见，杆状或短杆状，革兰氏阳性菌；16srDNA序列与水生产碱菌的同源性达到99％以上，亲缘关系最近。
进一步地，所述的贫营养富集培养基的配方为：MgSO4·7H2O 0.25g/L、Na2HPO4·12H2O 15.13g/L、KH2PO43.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.50g/L、CaCl2·2H2O 0.026g/L、微量元素液10ml/L。
所述微量元素液的配方为：氮三乙酸1.5g/L，MnSO4·2H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，H3BO30.01g/L，MgSO4·7H2O 3.0g/L，NaCl1.0g/L，CaSO40.1g/L，ZnSO40.1g/L，AlK(SO4)20.01g/L，NaMoO4·2H2O 0.01g/L。
所述的富营养富集培养基的配方为：25g LB肉汤，加1L水溶解，pH 7.0-7.2，121度灭菌20min。
进一步地，所述的抗性筛选试管的制备方法为：在玻璃试管中添加5mL的无菌LB培养基和100mg/L的目标抗生素，目标抗生素为土霉素或磺胺二甲氧嘧啶。
上述的抗生素降解混合菌剂在抗生素残留废弃物和抗生素残留环境中的应用。
进一步地，所述抗生素残留废弃物包括畜禽粪便、污泥和抗生素菌渣等；所述抗生素残留环境包括抗生素污染的水体、土壤。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1、目前未见节杆菌同时降解多种四环素类抗生素以及产碱菌降解磺胺类抗生素的报道。本发明公开的节杆菌OTC-16能同时降解多种四环素类抗生素，其对溶液中土霉素的降解效果最好，其次是金霉素和四环素。本发明公开的产碱菌SMD-FA能耐受多种磺胺类抗生素，可高效降解磺胺二甲氧嘧啶。与现有报道相比，本发明公开的菌株的分类种属、降解底物类型以及抗生素降解效率均不同，为抗生素污染修复提供了重要的微生物菌种资源，为能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种提供可能。
2、本发明公开的抗生素降解混合菌剂是一种人工筛选构建的混合菌剂，较成分不完全明确的天然混菌体系和单一菌株对污染物的生物降解优势明显。该菌剂的菌种成分明确，制备工艺简单，抗生素降解类型广泛、降解效率高，具有较好的应用前景。可应用于畜禽粪便有机肥料中的残留抗生素去除，减少伴随有机肥施用进入农田环境的抗生素，与不添加菌剂的对照相比，接种该菌剂的畜禽粪便中磺胺类、四环素类和喹诺酮类抗生素残留浓度分别下降35-77％、36-45％和20-45％的降解。可应用于抗生素污染土壤的修复，与不添加菌剂的对照相比，接种该菌剂的土壤中磺胺类和四环素类残留浓度可分别下降53％和75％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例：
一、节杆菌Arthrobacter sp.和产碱菌Alcaligenes sp.的驯化、筛选和鉴定方法，包括如下步骤：
1)取5g左右污泥分别加入含有目标抗生素(1、土霉素，50mg/L；2、磺胺二甲氧嘧啶，50mg/L)的贫营养富集培养基和富营养富集培养基中，放入恒温摇床中(30℃，150-180rpm)避光培养一周。
2)上一阶段的培养物静置后，取上清5ml，转接到相同的抗性富集培养基中，培养7天后，测定抗生素的残留浓度。共富集3个周期。
3)对比贫营养富集培养物和富营养富集培养物中的抗生素残留浓度，选择抗生素降解率较高的富集培养物，静置5-10min后，取0.2mL培养物涂布于含有目标抗生素(100mg/L)的LB平板上，培养箱中30℃恒温培养48h。
4)挑取单个菌落接种于抗性筛选试管(含有目标抗生素，100mg/L)中，恒温摇床中(30℃，150r/min)培养5天后，高效液相色谱法测抗生素浓度，选择降解率较高的抗性筛选试管，反复进行划线分离纯化，结合抗性筛选试管培养和抗生素浓度测定，获得具有抗生素降解能力的纯菌。结合抗生素测定结果发现，富营养富集液的土霉素降解率总体高于贫营养富集液，而贫营养富集液的磺胺二甲氧嘧啶降解率高于富营养富集液，因此贫营养富集培养基更适合用于分离筛选磺胺类抗生素降解菌，而富营养富集培养基更适应用于分离筛选四环素类抗生素降解菌。
5)菌株的形态学和分子生物学鉴定：OTC-16菌株在LB培养基上生长时，菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色或乳黄色、不透明的圆形凸起，显微镜下可见，杆状、小球状，单个或不规则的堆状，革兰氏阳性菌；提取细菌总DNA，用16SrDNA通用引物进行PCR扩增后，进行测序、同源性比对和进化树分析，可知16sr DNA序列与烟草节杆菌(Arthrobacte nicotianae)的同源性达到99.9％，亲缘关系最近。SMD-FA菌株在LB培养基上生长时，菌落都呈圆形，小，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色、透明的圆形凸起；显微镜下可见，杆状或短杆状，革兰氏阳性菌；16sr DNA序列与水生产碱菌的同源性达到99％以上，亲缘关系最近。
其中，所述的贫营养富集培养基的配方为：MgSO4·7H2O 0.25g/L、Na2HPO4·12H2O15.13g/L、KH2PO43.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.50g/L、CaCl2·2H2O 0.026g/L、微量元素液10ml/L。所述微量元素液的配方为：氮三乙酸1.5g/L，MnSO4·2H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，H3BO30.01g/L，MgSO4·7H2O 3.0g/L，NaCl 1.0g/L，CaSO40.1g/L，ZnSO40.1g/L，AlK(SO4)20.01g/L，NaMoO4·2H2O 0.01g/L。
所述的富营养富集培养基的配方为：25g LB肉汤，加1L水溶解，pH 7.0-7.2，121度灭菌20min。
所述抗性筛选试管的制备方法为：在玻璃试管中添加5mL的无菌LB培养基和100mg/L的目标抗生素，目标抗生素为土霉素或磺胺二甲氧嘧啶。
二、四环素类抗生素降解菌株OTC-16的降解特性研究
挑取OTC-16菌株的单菌落接种到5mL的液体LB培养基中，30℃，180rpm，培养24-36小时，获得种子液；将种子液转接到含有100mg/L目标抗生素的降解培养基中，培养一段时间后，离心去除菌体，取上清，HPLC测定抗生素浓度。
1、OTC-16菌株对不同四环素类抗生素的降解试验
配制100mg/L的不同四环素类抗生素的LB培养基(pH 7.0)为降解培养基：(1)土霉素；(2)四环素；(3)金霉素。按照3％的接种量，将OTC-16菌株的种子液分别接种到降解培养基，180rpm，30℃，培养8天，测定抗生素浓度。结果可知，以不接菌的抗生素溶液为对照，OTC-16菌株的最高土霉素降解率为95.1％，最高四环素降解率为54.7％，最高金霉素降解率为68.8％。
2、pH的影响试验
配制不同PH梯度的降解培养基：将LB液体培养基的pH值调为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0。180rpm，30℃，避光培养8天。结果表明：(1)菌株OTC-16在初始pH为5.0的培养条件下不能生长，在pH 6.0-9.0生长良好，OD600均在2.0以上。(2)在3％接种量下，以初始土霉素添加浓度为参比，100ppm土霉素的8天降解率在80-93％；以不接菌的对照为参比，pH 9.0时，OTC-16菌株的土霉素降解率为74％。
3、温度的影响试验
采用LB液体培养基(pH 7.0)中培养菌株OTC-16，在不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)，180rpm下避光培养。结果可知，OTC-16菌株在40℃下不能生长，在在20-35℃之间均可生长，但3％接种量下，最优的OTC-16菌株的降解温度为30℃。
三、磺胺类抗生素降解菌株SMD-FA的降解特性研究
挑取SMD-FA菌株的单菌落接种到5mL的LB培养基中，30℃，180rpm，培养24-36小时，获得种子液；将种子液转接到含有100mg/L目标抗生素的降解培养基(无机盐培养基)中，培养一段时间后，离心去除菌体，取上清，HPLC测定抗生素浓度。
1、SMD-FA菌株对不同磺胺类抗生素的耐受和降解试验
配制100mg/L的不同磺胺类抗生素的无机盐培养基(0.1％酵母膏)为降解培养基：磺胺二甲氧嘧啶；磺胺二甲嘧啶；磺胺嘧啶；磺胺-6-甲氧嘧啶。按照1％的接种量，将SMD-FA菌株的种子液分别接种到降解培养基，180rpm，30℃。结果可知，(1)SMD-FA菌株可耐受磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶，OD600分别为0.33、0.80、0.94和0.16；(2)SMD-FA菌株能有效降解磺胺二甲氧嘧啶，以不接菌对照为参比，抗生素6天降解率为48.1％。
2、pH的影响试验
配制不同pH梯度的降解培养基：将含有100mg/L磺胺二甲氧嘧啶的无机盐培养基(0.1％酵母膏)的pH值调为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0。180rpm，30℃，避光培养6天。结果表明：(1)菌株SMD-FA在初始pH为9.0的培养条件下不能生长，在pH 5.0-8.0生长良好。(2)在1％接种量下，以不接菌的对照为参比，pH 5.0、6.0、7.0和8.0时，SMD-FA菌株6天的磺胺二甲氧嘧啶降解率分别为25.7％、38.8％、56.6％和35.7％。
3、温度的影响试验
采用含有100mg/L磺胺二甲氧嘧啶的无机盐培养基(0.1％酵母膏，pH 7.0)中培养菌株SMD-FA，在不同温度(20℃、30℃、40℃)，180rpm下避光培养6天。结果可知，菌株SMD-FA在40℃下不能生长，在20-30℃之间生长良好，但1％接种量下，菌株SMD-FA在20℃和30℃下的磺胺二甲氧嘧啶的6天降解率分别为23.9％和56.6％。
4、初始抗生素浓度的影响试验
采用含有磺胺二甲氧嘧啶的无机盐培养基(0.1％酵母膏，pH7.0)中培养菌株SMD-FA，设置不同初始抗生素浓度处理(25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L)，30℃，180rpm下避光培养6天。结果可知，菌株SMD-FA能耐受25-150mg/L的磺胺二甲氧嘧啶，6天降解率在28.1-53.6％。
四、抗生素降解混合菌剂在土壤抗生素污染修复中的应用
抗生素降解混合菌剂1的制备：挑取节杆菌OTC-16和产碱菌SMD-FA的单菌落，分别接种于灭菌的LB液体培养基(pH 7.0)中，30℃、180rpm振荡培养48小时，然后采用离心法浓缩1倍制成种子液，将二者按1∶1混合，标记为菌液A。
降解试验：以磺胺类和四环素类抗生素残留土壤为试验对象，以磺胺嘧啶和强力霉素为主，添加混合菌剂后，25℃、65％湿度避光培养35天，测定抗生素浓度。处理组：CK，不添加任何外源物；T1：添加2％抗生素降解混合菌剂1。每个处理组三个重复。
试验结果：经过35天培养后，与对照相比，菌剂接种土壤中磺胺嘧啶和强力霉素的残留浓度分别下降了53.7％和75.8％。
五、抗生素降解混合菌剂在畜禽粪便有机肥中抗生素去除中的应用
抗生素降解混合菌剂2的制备：
(1)挑取节杆菌OTC-16和产碱菌SMD-FA的单菌落，分别接种于灭菌的LB液体培养基(pH 7.0)中，30℃、180rpm振荡培养48小时，然后采用离心法浓缩1倍制成种子液，将二者按1∶1混合，标记为菌液A。
(2)制备获得黄孢原毛平革菌的孢子、菌丝和其胞外酶，标记为菌剂B：黄孢原毛平革菌COD-1为本实验室保存菌种；将低温保存的COD-1斜面放室温下过夜活化菌株；从斜面上挑取COD-1，划线到PDA平板上，35℃培养一段时间，待平板上长满了白色的孢子；将孢子悬液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，35℃，60％湿度下固态发酵5-8天，直到菌丝长满固态发酵培养基；将所有固态发酵培养基上的混合物全部刮到无菌烧杯里面，用无菌玻璃杯搅拌混匀，成为白腐真菌菌剂，室温密封干燥保存待用，保存时间不得超过1周。其中固态发酵培养基的制备方法如下：首先将小麦秸秆粉碎至20-40目，将小麦秸秆、木屑和麸皮按2∶1∶1的比例混匀；然后按照固液比(w/v)为1∶1在4g固态基质表面均匀加入营养液，营养液为Mandel’s medium(g·L-1)：NaNO32，KH2PO41.5，CaCl20.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O 0.0016，ZnSO4·H2O 0.0014，CoCl2 0.0005，pH为6；121℃灭菌1小时，冷却后待用。
(3)使用前，将按照1∶2菌液A加入到菌剂B中，形成混合菌剂2。
降解试验：
按照5％的接种量，将混合菌剂2与猪粪混合，置于恒温培养箱中30℃静置避光培养10天，培养结束后采集样品，测定抗生素含量。以不接菌处理为对照，计算抗生素降解率。
试验结果(表1)：抗生素降解混合菌剂2可有效促进土壤、畜禽粪便等中多种残留抗生素的降解，其中四环素类抗生素去除率36-45％，磺胺类抗生素去除率35-77％，氟喹诺酮类抗生素去除率20-45％的降解。
表1抗生素降解混合菌剂2对畜禽粪便有机肥中抗生素的去除效果
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (4)

1.一种抗生素降解混合菌剂，其特征在于包含：
节杆菌(Arthrobacter sp.)，已在2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 15055，所述节杆菌(Arthrobacter sp.)为四环素类抗生素降解节杆菌，能同时降解土霉素、四环素和金霉素；
产碱菌(Alcaligenes sp.)，已在2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 15053，所述产碱菌(Alcaligenes sp.)为磺胺类抗生素降解菌，能降解磺胺二甲氧嘧啶，同时耐受磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶。
2.如权利要求1所述的一种抗生素降解混合菌剂，其特征在于，所述抗生素降解混合菌剂的制备方法如下：分别采用LB培养基培养获得所述节杆菌(Arthrobacter sp.)和所述产碱菌(Alcaligenes sp.)的种子液，将二者混合。
3.由权利要求1所述的抗生素降解混合菌剂在降解抗生素残留废弃物和抗生素残留环境中抗生素的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗生素残留废弃物包括畜禽粪便、污泥和抗生素菌渣；所述抗生素残留环境包括抗生素污染的水体、土壤。
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Assignee: Zhejiang Fengyu Ecological Technology Co.,Ltd.

Assignor: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences

Contract record no.: X2022330000475

Denomination of invention: A kind of antibiotic degrading mixed bacterial agent and its application

Granted publication date: 20190628

License type: Common License

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