CN114317514B - 一种固定化微生物小球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种固定化微生物小球及其制备方法与应用，通过从猪粪中筛选出一株专一性强、耗时短、去除效率高的四环素降解菌，然后将微生物固定在主要成分为羧甲基纤维素钠和聚多巴胺，然后通过交联剂进行交联作用得到的固定化小球中，利用羧甲基纤维素钠(羧甲基纤维素钠)和聚多巴胺(聚多巴胺)低廉的价格，良好的粘合性、亲水性和无毒性，以及微生物对四环素的降解能力合成新型四环素降解剂，利用此固定化微生物小球不仅提高了固定化微生物对环境中毒素的耐受能力和降解能力，还充分的固定住微生物防止随水的流动而流失导致的微生物浓度下降，减弱降解效果，增强该处理系统的稳定性和抗干扰性。
Description
技术领域
本发明属于固定化微生物小球对四环素的生物降解技术领域，具体涉及一种固定化微生物小球及其制备方法与应用。
背景技术
抗生素(antibiotics)是由细菌或者其他微生物所产生的一类次级代谢产物。近年来，以治疗传染病为目的，抗生素在药物治疗和农牧业生产、水产养殖中的应用越来越广泛。由于摄入的抗生素不能被完全代谢吸收，超过70％的抗生素会随尿液和粪便排出体外，并以活性形式释放到环境中，最终被释放到地下水和地表土中，其人类健康的巨大威胁也使其成为环境污染中最受关注的问题之一。因此，环境中残留的抗生素引起的污染也越来越严重，一旦释放到环境中，大多数抗生素是持久性的。
四环素(TC)作为一种广谱型抗生素，广泛用于动物感染治疗和畜牧业中，作为生长促进剂，在人们的日常生活中应用极为广泛，是世界上生产和使用第二多的抗生素。近几十年来，四环素(TC)对各种致病菌均有抗菌作用，因此被广泛应用于制药工业，用于人类、畜牧业和水产养殖业的抗感染，但摄入体内后，人和动物不能完全代谢四环素，大量摄入的四环素通过粪便和尿液排泄到各种水体中，水环境中残留的四环素会引起细菌抗性，造成生态破坏，并通过食物链中的生物积累，对人体健康和生态系统产生不利影响，由于其对生态环境和人类健康的潜在的长期不利威胁，其在环境中的存在引起了人们的高度关注，而四环素大部分通过人和动物的尿液或粪便排泄释放到环境中，四环素的滥用对生态环境，对水、大气造成负面影响，而且会抑制许多水处理的研究进展。同时四环素(TC)也是最常用的抗生素之一，具有高持久性和生物活性，会对生态系统产生毒害作用，在微生物中耐药性的传播具有持久性，可在水和土壤中积累，对环境、特别是水资源和土壤产生污染问题。因为水溶性的盐酸四环素在水环境中不稳定易降解，在浅水、饮用水和污泥中检测到大量的四环素，利用传统的污水处理方法无法将其完全去除。由于自然环境中四环素的自动生物降解非常困难，因此迫切需要开发其他方法来降低水溶液中的四环素。
微生物固化技术(Immobilized Microorganisms，IM)是指利用物理或化学方法将游离的酶或微生物，固定在特定的区域并使其维持活性的一种技术，该技术具有固液分离效果好、微生物活性高、稳定性高、环境耐受力强(如温度、pH、有机溶剂)等优点。基于这些优点，固定微生物技术应用于多种有机废水的处理中，但是在含抗生素的废水处理中的应用很少。目前处理抗生素废水大多是利用微生物的降解作用，微生物虽然能较好的除去四环素，但是耗时久，而且容易受外界因素的影响。
发明内容
为了克服现有技术中的问题，本申请提供一种固定化微生物小球及其制备方法与应用，具体方法是从猪粪中筛选出一株专一性强、耗时短、去除效率高的四环素降解菌，然后将微生物固定在固定化小球中，不仅提高了固定化微生物对环境中毒素的耐受能力和降解能力，还充分的固定住微生物防止随水的流动而流失导致的微生物浓度下降，减弱降解效果，增强该处理系统的稳定性和抗干扰性。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供一种固定化微生物小球，包含固定在小球中的四环素降解菌，所述四环素降解菌为产碱杆菌，名称为Alcaligenes sp.R3，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2020882。
作为一种可选的实施方式，本发明提供的固定化微生物小球中，所述产碱杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二方面提供一种固定化微生物小球的制备方法，包括如下步骤：
S1、从猪粪中富集、分离、纯化，得到能降解四环素的微生物菌种，然后将微生物菌种制备成菌体含量为1-9％的菌悬液；
S2、制备含有羧甲基纤维素钠和聚多巴胺的溶液，其中溶液中羧甲基纤维素钠的含量为1.5-3.5％，聚多巴胺的浓度为50-250mg/L；
S3、将步骤S1制备的菌悬液加入到步骤S2制备的溶液中，然后将浓度为1-5％的交联剂加入溶液中，交联2-10h后进行洗涤，即得到固定化微生物小球。
作为一种可选的实施方式，本发明提供的固定化微生物小球的制备方法中，微生物菌种为产碱杆菌，名称为Alcaligenes sp.R3，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2020882。
作为一种可选的实施方式，本发明提供的固定化微生物小球的制备方法中，产碱杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为一种可选的实施方式，本发明提供的固定化微生物小球的制备方法中，所述交联剂为AlCl3·6H2O。
作为一种可选的实施方式，本发明提供的固定化微生物小球的制备方法中，所述聚多巴胺的制备方法包括：将盐酸多巴胺溶于超纯水中，然后用NaOH调节pH到8.0，于60℃条件下恒温搅拌12h，在15000r/min离心15min，然后用超纯水清洗后真空冷冻干燥即得聚多巴胺。
作为一种可选的实施方式，本发明提供的固定化微生物小球的制备方法中，步骤S2中溶液的制备方法包括：将羧甲基纤维素钠和聚多巴胺溶于超纯水中，置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温备用。
本发明第三方面提供上述固定化微生物小球降解四环素的方法，将固定化微生物小球加入到含有四环素的溶液中，将反应液进行振荡处理。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的固定化微生物小球降解四环素的方法中，所述溶液中四环素的溶度为50-100mg/L。
本发明第四方面提供上述固定化微生物小球在降解四环素中的应用。
本发明第五方面提供一种用于降解四环素的水处理药剂，所述水处理药剂中含有上述固定化微生物小球。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供的固定化微生物小球的制备方法中，固定化微生物小球主要成分为羧甲基纤维素钠(CMC)和聚多巴胺(PDA)，然后通过交联剂进行交联作用，使小球固化，通过增强其机械强度达到成型的目的，使得本发明制备的微生物固定小球机械强度与力学稳定性远高于传统包埋载体。
(2)本发明通过微生物包埋技术将可降解四环素的微生物固定在纳米小球中，不仅提高了微生物对环境中有毒物质的耐受能力和对四环素的降解能力，还可以防止微生物随水体流动而浓度降低，长期保持对四环素良好的降解能力，增强降解系统的稳定性。
(3)本发明可在较少的小球投入量即可达到对四环素的高效去除，去除率最高可达到99.90％。
附图说明
图1为实施例3中为加入不同含量的羧甲基纤维素钠制备的固定化小球形态图；
图2为实施例4中不同含量的聚多巴胺对固定化微生物小球降解四环素的试验结果图；
图3为实施例5中不同交联剂浓度对固定化微生物小球降解四环素的试验结果图；
图4为实施例6中交联不同时间对固定化微生物小球降解四环素的实验结果图；
图5为实施例7中不同微生物含量对固定化微生物小球降解四环素的实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
本发明所用培养基配置方法如下：
1.基础培养基：Na2HPO4，KH2PO4，NaCl，蛋白胨，超纯水1L，起始pH为7.0，121℃灭菌25min(配固体培养基时加入2％的琼脂)。
2.LB肉汤培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，纯水1L，pH7.4～7.6，121℃灭菌15min。
3.筛选培养基：在灭完菌的基础培养基中加入盐酸四环素，根据不同的浓度需求加入经Φ0.45μm微孔滤膜过滤后的四环素母液。
盐酸四环素标准储备液：精确称取0.02g盐酸四环素，用超纯水定容于100mL的棕色容量瓶中，配制成浓度为200mg/L的四环素标准液，4℃下保存备用。
实施例1
本发明中的固定化微生物小球中的菌株为产碱杆菌Alcaligenes sp，已于2020年12月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，名称为：Alcaligenessp.R3，保藏编号为CCTCC NO：M2020882地址：中国湖北省武汉市武汉大学。
所述的产检杆菌(Alcaligenes sp.R3)从猪粪中富集，分离，纯化得到，具体步骤如下：
步骤一：固定化微生物小球中菌株的富集，分离，纯化
从某猪场取猪粪样品，用自封袋装置于–20℃冰箱中保存。取10g样品放入含玻璃珠的三角瓶中，加入90mL无菌水中，170r/min，30℃震荡20min。取处理过的样品，吸取2mL上清液接到液体培养基中培养2d；然后接到含有20mg/L四环素的筛选培养基中，培养2d，再依次接到40、80、120、160、200、240、280、320mg/L的四环素筛选培养基上，其它条件不变，培养2d，富集结束后用10倍稀释法进行稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7稀释液进行涂布，将涂布后的平板倒置于30℃的恒温培养箱中培养24h，将长出的单菌落进行平板划线筛出以四环素为唯一碳源的单菌落。
步骤二：固定化微生物小球中菌株的初筛
挑取平板上的单菌落，采用连续划线的方法接种到含100mg/L四环素的筛选固体培养基上，培养24h后挑取单菌落用斜面保存，不断进行纯化，直到在显微镜下观察为纯种为止。
步骤三：固定化微生物小球中菌株的复筛
将初步筛选的菌接到LB液体培养基中，培养24h后作为种子液接入含50mg/L四环素的基础培养基中，置于30℃，140r/min的摇床中培养2d，以不接菌的作为对照组，用高效液相(HPLC)测四环素的含量，淘汰降解能力差的菌株，四环素降解能力高的菌株用甘油管和斜面进行保存备用。
其中Alcaligenes sp.R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：CCTGCAGTCGACGGCAGCGCGAGAGAGCTTGCTCTCTTGGCGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATCGCAAGACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTACCTCCTAATACGAGGTACTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAAAGCCGAAGAGATTTGGCCGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGT
实施例2
固定化微生物小球的制备方法
S1、将微生物菌种制备成菌体含量为1-9％的菌悬液；
具体步骤如下：用接种环挑取分离纯化得到的菌株接种到LB液体培养基中，置于30℃，140r/min的恒温振荡培养箱中培养，培养12h后，取一定量的培养液于离心管中8000r/min，离心10min，将上清液倒出，用0.9％生理盐水重复洗涤1～2次后用生理盐水稀释，在紫外分光光度计600nm处，以生理盐水为参比测定其吸光度，以OD600 nm为1.0时的菌液作为菌悬液，置于4℃冰箱备用。
S2、制备含有羧甲基纤维素钠和聚多巴胺的溶液，其中溶液中羧甲基纤维素钠的含量为1.5-3.5％，聚多巴胺的浓度为50-250mg/L；
其中聚多巴胺的制备方法如下：称取1.0g盐酸多巴胺，溶于20mL的超纯水中，然后用NaOH调节pH到8.0，倒入圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于60℃的恒温油浴磁力搅拌器中反应12h，在15000r/min离心15min，然后用超纯水清洗三次，用真空冷冻干燥机干燥12h，得到聚多巴胺。
羧甲基纤维素钠和聚多巴胺的溶液的制备方法如下：称取一定量的羧甲基纤维素钠和一定浓度的聚多巴胺溶于100mL的超纯水中，置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温备用。
S3、将步骤S1制备的菌悬液加入到步骤S2制备的溶液中，然后将浓度为3-4％的交联剂加入溶液中，交联反应后进行洗涤，即得到固定化微生物小球。
实施例3
固定化微生物小球中羧甲基纤维素钠含量的确定。
固定化微生物小球制作成型的难易是以滴落成球形为标准；计算固定化微生物小球的完整率，完整率越高则固定化微生物小球的机械强度越大，完整率＝完整的固定化微生物小球的个数/固定化微生物小球总个数×100％。固定化微生物小球机械强度的评判：将制备的固定化微生物小球取25颗加入到装有50mL水的250mL的锥形瓶中，使用磁力搅拌器以1200r/min对其搅拌1min。取1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％的羧甲基纤维素钠溶于100mL的超纯水中，按照实施例2的方法制备固定化微生物小球，根据上述方法对小球机械强度进行测试，得出2.5％形成的小球完整率是98％，2％是90％，而且当羧甲基纤维素钠的含量为3％的小球出现了尾巴，结果由图1所示，表明当羧甲基纤维素钠的浓度为2.5％时制备的固定化微生物小球的机械强度和传质性最好，且小球质地均匀并没有拖尾现象出现，小球的稳定好，菌体的包埋性高。故后续实施例羧甲基纤维素钠含量设置为2.5％。
实施例4
固定化微生物小球中聚多巴胺含量的确定。
将2.5g的羧甲基纤维素钠，5mg、10mg、15mg、20mg、25mg的聚多巴胺溶于100mL的超纯水中，随后置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温，向其中加入7％的菌悬液混合均匀，用2mL的胶头滴管吸取混合液分别滴入到4.0％的AlCl3·6H2O交联剂溶液中，交联4h得到固定化的小球，然后用无菌水洗涤三次，放置于4℃的冰箱保存备用。称取4g固定微生物小球，放入100mg/L四环素的培养基中，置于140r/min、30℃的恒温振荡培养箱中振荡培养12h，计算四环素降解率，具体结果如图2所示。
当聚多巴胺含量为10mg时，四环素降解率最高，达到99.90％。而聚间苯二胺浓度过高或过低，对小球去除四环素的能力有较大影响，随着浓度的增加，固定化小球出现拖尾现象，固定化小球形状不均匀，传质性很差，强度和质地很差，对菌体的包埋固定化程度不是很好，菌体易流失，菌体易受到代谢产物毒性的侵害，代谢产物偏酸偏碱都会使酶活性将降低，可能是导致去除率低的原因。
实施例5
交联剂含量对固定化微生物小球降解四环素的影响。
将2.5g的羧甲基纤维素钠，5mg的聚多巴胺溶于100mL的超纯水中，随后置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温，向其中加入7％的菌悬液混合均匀，用2mL的胶头滴管吸取混合液分别滴入到1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％的AlCl3·6H2O交联剂溶液中，交联4h得到固定化的小球，然后用无菌水洗涤三次，放置于4℃的冰箱保存备用。称取4g固定微生物小球，放入100mg/L四环素的培养基中，置于140r/min、30℃的恒温振荡培养箱中振荡培养12h，计算四环素降解率，具体结果如图3所示。
随着浓度的升高，其四环素去除率逐渐升高，当含量为4％时，去除率可以达到93％，含量为5％，达到96％；如果交联剂浓度过高，使交联程度过高，小球的孔隙致密、机械强度大，但随着细胞的生长，对营养物质，氧气的需求增多，致密的空隙不利于物质的传输，导致菌的活性降低。交联剂浓度过高，传质性会变差，不利于小球的循环使用，因此，在安全环保节俭的原则下交联剂含量选择4％是最适合的。
实施例6
交联不同时间对固定化微生物小球降解四环素的影响。
将2.5g的羧甲基纤维素钠，5mg的聚多巴胺溶于100mL的超纯水中，随后置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温，加入7％的菌悬液混合均匀，用2mL的胶头滴管吸取混合液滴入到4％的AlCl3·6H2O交联剂溶液中，分别交联2、4、6、8、10h得到固定化的小球，然后用无菌水洗涤三次，放置于4℃的冰箱保存备用。称取4g固定微生物小球，放入100mg/L四环素的培养基中，置于140r/min、30℃的恒温振荡培养箱中振荡培养12h。计算四环素降解率。具体结果如图4所示。
随着交联时间的增加，四环素的去除率也增高了，当交联时间为4h，去除率达到99.90％，随着交联时间持续增加，去除率有所下降，固定化小球形成后，若固定化时间较长，交联化密度较高，底物扩散就会受到较大的阻力，菌的接触面积也会有影响，固定化酶活性就会相对降低。
实施例7
不同微生物含量对固定化微生物小球降解四环素的影响。
将2.5g的羧甲基纤维素钠，5mg的聚多巴胺溶于100mL的超纯水中，随后置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温，分别加入1.0％、3.0％、5.0％、7％、9％的菌液的菌悬液混合均匀，用2mL的胶头滴管吸取混合液滴入到4.0％的AlCl3·6H2O交联剂溶液中，交联4h得到固定化的小球，然后用无菌水洗涤三次，放置于4℃的冰箱保存备用。称取4g固定微生物小球，放入100mg/L四环素的培养基中，置于140r/min、30℃的恒温振荡培养箱中振荡培养12h。计算四环素降解率。具体结果如图5所示。
随着菌含量的增加，去除率呈上升趋势，当菌体量为7％时，去除率达到最高为83.2％，超过7％。菌体浓度高，导致微生物生长所需的碳源和氮源不足而导致活性菌源减少，菌体量过大，在实验过程中发现固定化小球容易破裂，形成的凝胶网络不紧密松散，导致菌体流失，小球的稳定性不高，不利于固定化微生物小球的循环使用。
通过上述实施例结果可知，当交联剂AlCl3·6H2O浓度为4％，交联时间为4h，接种量为7％时，经过12h,羧甲基纤维素钠/聚多巴胺固定化微生物小球对初始浓度为100mg/L的四环素去除率能达到99.90％。
实施例8
固定化微生物小球与固定化小球、游离菌株对四环素的降解
(1)固定化微生物小球组：将2.5g的羧甲基纤维素钠，5mg的聚多巴胺溶于100mL的超纯水中，随后置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温，向其中加入7％的菌悬液混合均匀，用2mL的胶头滴管吸取混合液滴入到4％的AlCl3·6H2O交联剂溶液中，交联4h得到固定化的小球，然后用无菌水洗涤三次，放置于4℃的冰箱保存备用。称取4g固定微生物小球，放入100mg/L四环素的培养基中，置于140r/min、30℃的恒温振荡培养箱中振荡培养12h。计算四环素降解率。
(2)将2.5g的羧甲基纤维素钠，5mg的聚多巴胺溶于100mL的超纯水中，随后置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温，用2mL的胶头滴管吸取混合液滴入到4％的AlCl3·6H2O交联剂溶液中，交联4h得到固定化的小球，然后用无菌水洗涤三次，放置于4℃的冰箱保存备用。称取4g固定微生物小球，放入100mg/L四环素的培养基中，置于140r/min、30℃的恒温振荡培养箱中振荡培养12h。计算四环素降解率。
(3)将7％的菌悬液放入100mg/L四环素的培养基中，置于140r/min、30℃的恒温振荡培养箱中振荡培养12h。计算四环素降解率。
降解效果如表1所示，由表1可知，固定化微生物小球相较空白对照和游离菌，经过24h，微生物固定化小球对四环素去除率能达到90％以上。
表1
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 一种固定化微生物小球及其制备方法与应用
<130> 20211130
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1375
<212> DNA
<213> 产碱杆菌(Alcaligenes sp.)
<400> 1
cctgcagtcg acggcagcgc gagagagctt gctctcttgg cggcgagtgg cggacgggtg 60
agtaatatat cggaacgtgc ccagtagcgg gggataacta ctcgaaagag tggctaatac 120
cgcatacgcc ctacggggga aaggggggga tcgcaagacc tctcactatt ggagcggccg 180
atatcggatt agctagttgg tggggtaaag gctcaccaag gcaacgatcc gtagctggtt 240
tgagaggacg accagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300
agtggggaat tttggacaat gggggaaacc ctgatccagc catcccgcgt gtatgatgaa 360
ggccttcggg ttgtaaagta cttttggcag agaagaaaag gtacctccta atacgaggta 420
ctgctgacgg tatctgcaga ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480
cgtagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgtgtgtagg cggttcggaa 540
agaaagatgt gaaatcccag ggctcaacct tggaactgca tttttaactg ccgagctaga 600
gtatgtcaga ggggggtaga attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagat atgtggagga 660
ataccgatgg cgaaggcagc cccctgggat aatactgacg ctcagacacg aaagcgagca 720
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat gtcaactagc tgttggggcc 780
gttaggcctt agtagcgcag ctaacgcgtg aagttgaccg cctggggagt acggtcgcaa 840
gattaaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggatgatg tggattaatt 900
cgatgcaacg cgaaaaacct tacctaccct tgacatgtct ggaaagccga agagatttgg 960
ccgtgctcgc aagagaaccg gaacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc attagttgct acgcaagagc 1080
actctaatga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat 1140
ggcccttatg ggtagggctt cacacgtcat acaatggtcg ggacagaggg tcgccaaccc 1200
gcgaggggga gccaatctca gaaacccgat cgtagtccgg atcgcagtct gcaactcgac 1260
tgcgtgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagaatg tcgcggtgaa tacgttcccg 1320
ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt tcaccagaag taggt 1375
Claims (9)
1.一种固定化微生物小球，其特征在于，包含固定在小球中的四环素降解菌，所述四环素降解菌为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)R3，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2020882。
2.如权利要求1所述的固定化微生物小球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将权利要求1中的四环素降解菌制备成菌体含量为1-9％的菌悬液；
S2、制备含有羧甲基纤维素钠和聚多巴胺的溶液，其中溶液中羧甲基纤维素钠的含量为1.5-3.5％，聚多巴胺的浓度为50-250mg/L；
S3、将步骤S1制备的菌悬液加入到步骤S2制备的溶液中，然后将浓度为1-5％的交联剂加入溶液中，交联2-10h后进行洗涤，即得到固定化微生物小球。
3.根据权利要求2所述的一种固定化微生物小球的制备方法，其特征在于，所述交联剂为AlCl3·6H2O。
4.根据权利要求2所述的一种固定化微生物小球的制备方法，其特征在于，所述聚多巴胺的制备方法包括：将盐酸多巴胺溶于超纯水中，然后用NaOH调节pH到8.0，于60℃条件下恒温搅拌12h，在15000r/min离心15min，然后用超纯水清洗后真空冷冻干燥即得聚多巴胺。
5.根据权利要求2所述的一种固定化微生物小球的制备方法，其特征在于，步骤S2中溶液的制备方法包括：将羧甲基纤维素钠和聚多巴胺溶于超纯水中，置于60℃的恒温水浴锅中，不断搅拌直至溶解完全，然后冷却至室温备用。
6.如权利要求1所述的固定化微生物小球降解四环素的方法，其特征在于，将固定化微生物小球加入到含有四环素的溶液中，将反应液进行振荡处理。
7.根据权利要求6所述的固定化微生物小球降解四环素的方法，其特征在于，所述溶液中四环素的溶度为50-100mg/L。
8.如权利要求1所述的固定化微生物小球在降解四环素中的应用。
9.一种用于降解四环素的水处理药剂，其特征在于，所述水处理药剂中含有如权利要求1所述的固定化微生物小球。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108546665A (zh) * | 2018-05-15 | 2018-09-18 | 浙江省农业科学院 | 一种抗生素降解混合菌剂及其应用 |
| AU2020103347A4 (en) * | 2020-11-10 | 2021-01-21 | Sichuan Agricultural University | Preparation Method of Sodium Alginate Composite Immobilized Microbial Inoculum Capable of Remarkably Improving Degradation Efficiency of Quinclorac |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Study on a novel immobilized microbe pellets constructed with Alcaligenes sp. R3 and its ability to remove tetracycline";Zhuangzhuang Liu 等;《Journal of Environmental Chemical Engineering》;第11卷;第1-10页 * |
| "一株土壤中苯酚降解菌的分离、鉴定及降解特性研究";崔树军 等;《河南农业科学》(第4期);第69-72页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114317514A (zh) | 2022-04-12 |
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