CN114958822B - 利用黏细菌构建生物粘附固定化菌膜的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用黏细菌构建生物粘附固定化菌膜的方法及其应用，取待成膜菌株和粘细菌分别培养后，离心制成菌悬液；将待成膜菌株和粘细菌的菌悬液共同转接至成膜培养基培养，形成菌膜；所述成膜培养基为CYE培养基、CYE稀释培养基或MSM培养基；所述CYE稀释培养基为稀释50倍的CYE培养基。发明固定化菌膜采用了一种通过结合黏细菌建立生物粘附膜结构提高外源微生物菌群的降解效率和环境稳定性的新策略。降解菌群经过生物粘附成膜后，其对环境变化的耐受性显著提高，尤其是对酸性条件和高底物浓度环境的鲁棒性更强。生物膜结构为降解体系提供的保护，有助于建立多种微生物的共存关系，并起到保护和维稳结构的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化菌膜用于强化修复化学农药的方法，具体涉及一种利用黏细菌进行生物粘附固定化微生物的方法，属于农药污染生物修复技术领域。
背景技术
当使用游离细胞降解有毒物质时，存在处理困难、细胞密度降低、与土著微生物竞争以及适应不良和渗透率降低等问题，无法有效的在所需地点的生态位稳定存在。为了减轻游离形式细胞所存在的劣势，微生物修复技术已经通过使用额外的处理来加速降解并确保微生物的存活和活力。固定化微生物技术是化学农药降解的一种潜在优化方法，其特点是将细胞限制在一个划定的区域，细胞在该区域保持其代谢、分解代谢和催化活性。
在自然界中固定微生物的一种自然方式是通过生物粘附形成微生物群落，最常见的形式就是广泛存在的生物膜。具有高细胞密度和抗压力特性的生物膜结构可以减轻生物修复过程受环境条件的影响，其生物蓄积能力还可加速有机污染物的生物修复。此外，生物粘附物质可为细胞提供粘附性，有助于建立多种微生物的共存关系，有可能为高效生物修复过程提供一个合适的微环境。
黏细菌是具有大基因组的δ组变形菌，其特征是革兰氏阴性、产粘液细菌，它在土壤中的丰度为0.4％-4.5％，是土壤细菌群落的重要组成部分，也是土壤微生物生态的调节者。黏细菌可以分泌不同种类的长链多糖，这些生物粘附物质可用于保留和组织细胞，以及在细胞外基质的范围内物理和生化地缓冲微生物群落，从而提高细菌存活率和适应性。此外，黏细菌作为微生物食物网结构中的捕食者，可通过多种模式攻击猎物以获取营养并建立竞争优势，研究发现其捕食能力具有调控性，可以在一定程度上调节微生物群落结构。因此黏细菌有望作为生物粘附辅助菌，用于通过形成生物膜对微生物多菌体系进行固定化和调节群落结构。
发明内容
本发明的目的在于提供利用黏细菌构建生物粘附固定化菌膜的方法及其应用，从而为化学农药面源污染的生物修复提供一条全新的技术路线，以解决现有技术中微生物在化学农药的实际修复应用中效率低、稳定性差、运行周期长等问题。
为实现上述技术目的，本发明采用如下方案：
一种利用黏细菌构建生物粘附固定化菌膜的方法，包括：
取待成膜菌株和粘细菌分别培养后，离心制成菌悬液；
将待成膜菌株和粘细菌的菌悬液共同转接至成膜培养基培养，形成菌膜；
所述成膜培养基为CYE培养基、CYE稀释培养基或MSM培养基；所述CYE稀释培养基为稀释50倍的CYE培养基。
作为一种优选的实施方式，所述待成膜菌株和粘细菌的菌悬液按体积比3～9:1共同转接至成膜培养基培养。
作为一种优选的实施方式，所述粘细菌选用黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DK1622。
作为一种优选的实施方式，所述成膜培养基为MSM培养基。
作为一种优选的实施方式，取待成膜菌株和粘细菌分别培养后，离心制成OD600nm＝1.0的菌悬液。
作为一种优选的实施方式，将待成膜菌株和粘细菌的菌悬液共同转接至成膜培养基震荡培养。
本发明的另一目的在于提供上述利用黏细菌构建生物粘附固定化菌膜的方法在强化修复化学农药中的应用，包括：将用于修复化学农药的微生物降解体系使用的微生物菌株作为待成膜菌株，在成膜培养基中通过生物粘附固定化制成菌膜，用于化学农药的强化修复。
所述化学农药可为乙草胺，也可以选用其他化学农药作为目标修复污染物。
以乙草胺为降解对象时，所述化学农药为草乙胺，将用于修复草乙胺的菌株和粘细菌的菌悬液按照体积比3～9：1共同转接至成膜培养基培养。
优选的案例为使用红球菌(Rhodococcus sp.)T3-1，戴尔福特菌(Delftia sp.)T3-6、鞘脂菌(Sphingobium sp.)MEA3-1组成的微生物降解多菌体系用于修复草乙胺，所述红球菌(Rhodococcus sp.)T3-1、戴尔福特菌(Delftia sp.)T3-6、鞘脂菌(Sphingobiumsp.)MEA3-1的保藏号分别为CCTCC NO：M 2012525；保藏号CCTCC NO：M 2012526和，保藏号CCTCC NO：M 2012527。使用粘细菌构建上述生物粘附固定化菌膜时，以红球菌(Rhodococcus sp.)T3-1、戴尔福特菌(Delftia sp.)T3-6、鞘脂菌(Sphingobium sp.)MEA3-1作为待成膜菌株，在成膜培养基中通过生物粘附固定化制成菌膜，用于化学农药的强化修复。将红球菌T3-1、戴尔福特菌T3-6、鞘脂菌MEA3-1和粘细菌的菌悬液按照体积比1:3-1:3-1:3-1共同转接至成膜培养基培养；优选体积比为1:2:2:1。
作为一种优选的实施方式，固定化菌膜的降解环境为：温度25～37℃、pH 4.0～8.0、乙草胺浓度50～200mg·L-1。
生物粘附固定化菌膜的制备原理如下：黏细菌Myxococcus xanthus DK1622作为生物粘附辅助菌，可分泌多种长链多糖，这些生物粘附物质可用于保留和组织细胞，以及在细胞外基质的范围内物理和生化地缓冲微生物群落，从而提高细菌存活率和适应性；黏细菌作为微生物食物网结构中的捕食者，但不会将所有的高浓度“猎物”微生物裂解，粘附的细菌还会继续生长分裂，在环境中竞争共存。这在一定程度上可以对多菌体系内成员的种群分布起到调控作用。
本发明所获得的有益技术效果：
1)本发明固定化菌膜采用了一种通过结合黏细菌建立生物粘附膜结构提高外源微生物菌群的降解效率和环境稳定性的新策略。降解菌群经过生物粘附成膜后，其对环境变化的耐受性显著提高，尤其是对酸性条件和高底物浓度环境的鲁棒性更强。生物膜结构为降解体系提供的保护，有助于建立多种微生物的共存关系，并起到保护和维稳结构的作用。
2)本发明固定化菌膜可快速降解水体中的乙草胺，50mg·L-1乙草胺的降解半衰期为4.2972h。
3)本发明固定化菌膜的稳定性良好，保存30d后的降解率仍可达到90％以上；在重复使用次数小于7次时，其对乙草胺降解率可稳定在80％以上。
4)本发明固定化菌膜在模拟污染土壤中的生物修复能力比游离态菌剂的降解效果更稳定、高效，固定化菌膜处理组7d内可基本去除土壤中20mg·kg-1的乙草胺，而游离态菌剂处理组中的乙草胺残留浓度约0.5mg·L-1。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明不同成膜营养条件所得固定化菌膜对乙草胺的降解效果图。
图2为本发明游离态多菌和固定化菌膜降解效果对比图；其中(a)为游离态多菌和固定化菌膜30d内降解效果对比；(b)为游离态多菌和固定化菌膜重复使用降解效果对比。
具体实施方式
以下将参照附图，通过实施例方式详细地描述本发明的技术方案。在此需要说明的是，对于这些实施例方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”关系。
实施例中：
粘细菌选用黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DK1622，为商业菌株。
待成膜菌株为红球菌(Rhodococcus sp.)T3-1，保藏号CCTCC NO：M 2012525；戴尔福特菌(Delftia sp.)T3-6，保藏号CCTCC NO：M 2012526和鞘脂菌(Sphingobium sp.)MEA3-1，保藏号CCTCC NO：M 2012527。
CYE固体培养基：酪胨10.0g，酵母粉5.0g，MgSO4 1.0g，琼脂15g，溶解于1L去离子水中，调节pH 7.6，121℃湿热灭菌20min。
CYE培养基：酪胨10.0g，酵母粉5.0g，MgSO4 1.0g，溶解于1L去离子水中，调节pH7.6，121℃湿热灭菌20min。
CYE稀释培养基：酪胨0.2g，酵母粉0.1g，MgSO4 0.02g，溶解于1L去离子水中，调节pH 7.6，121℃湿热灭菌20min。
MSM培养基：(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.01g，FeSO4·7H2O0.001g，NaHPO4·12H2O 1.5g，KH2PO4 1.5g，溶解于1L去离子水，121℃湿热灭菌20min。
实施例1用于降解乙草胺的生物粘附固定化菌膜的制备方法
1)从冻存管中挑取一环菌株T3-1、T3-6、MEA3-1和DK1622分别划线于CYE固体培养基中，30℃恒温培养48h；
2)挑取单菌落于5mL CYE培养基中，于30℃，摇床200rpm培养24h；
3)将四个菌株的培养液分别转接到50mL新鲜的CYE培养基中，继续培养，T3-1培养48h，T3-6培养12h，MEA3-1培养24h，DK1622培养48h，8000rpm离心收集菌体，制成OD600nm＝1.0的菌悬液；
4)将四个菌株的悬菌液按体积比1:2:2:1比例混合，转接至MSM培养基中，在30℃、200rpm下培养24h，用生理盐水清洗所产生的菌膜，并储存在4℃。
其中，固定化菌膜的成膜培养条件会影响菌株DK1622的成膜性能。选取高、中、低营养条件分别进行成膜实验进行乙草胺降解实验，确定最佳的成膜条件。
结果如图1所示，低营养条件下(MSM培养基)的生物粘附固定化菌膜对50mg·L-1乙草胺的降解率为96.62％，高营养(CYE培养基)和中营养(CYE稀释培养基)条件下的降解率76.82％和69.73％。由于在低营养环境下黏细菌启动自我保护机制，分泌更多的胞外多糖，由黏细菌调控形成的菌膜多糖含量相比其他条件更多，调控形成的降解生物膜网络含有的有效降解菌株也就更多，同等条件下对乙草胺的降解效果更好。
最优条件下构建出的固定化菌膜的降解动力学方程为lnC＝-0.1613t+3.9120，降解半衰期为t1/2＝4.2972(h)。
实施例2固定化菌膜在不同环境条件下对乙草胺的降解
将实例1最优条件下构建出的固定化菌膜按10％接种量(按固定化所需降解体系菌液体积计算)接入不同温度20、25、30、37、42℃(50mg·L-1，pH7.0)，pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0(50mg·L-1，30℃)和乙草胺浓度为50、100、200mg·L-1(30℃，pH7.0)的反应体系中，并以未添加菌株DK1622的游离态降解菌剂作为对照组做上述处理，均置于200rpm摇床，反应24h后取样检测。
表1环境因素对乙草胺降解效果的影响
结果如图1所示，制备得到的固定化菌膜的最佳降解条件为温度25～37℃、pH 4.0～8.0和50～200mg·L-1乙草胺，而游离态多菌体系为30℃、pH 6.0～8.0和50mg·L-1乙草胺，结果表明降解菌株经过生物粘附成膜后，其对环境变化的耐受性显著提高，尤其是对酸性条件和高底物浓度环境的鲁棒性更强。
实施例3固定化菌膜的使用稳定性
将实例1最优条件下构建出的固定化菌膜在4℃下储存5-30d，每隔5d测试其降解能力。按10％接种量(按固定化所需降解体系菌液体积计算)接入50mg·L-1乙草胺的10mL溶液中，在30℃的摇床中200rpm培养24h，然后离心回收菌膜，用无菌0.9％NaCl溶液冲洗后再放入含有50mg·L-1乙草胺溶液中。测定其降解效果，重复实验数次。
结果如图2所示，保存30d后，固定化菌膜的降解率仍达到90％以上，比游离态多菌体系高出约48％；在重复使用次数小于7次时，固定化菌膜的乙草胺降解率可稳定在80％以上。
实施例4固定化菌膜在模拟污染土壤中对乙草胺的降解
将实例1最优条件下构建出的固定化菌膜按10％接种量(按固定化所需降解体系菌液体积计算)加入20mg·kg-1的乙草胺污染土壤中进行模拟生物修复实验。采用乙草胺免疫胶体金快速检测试剂板用于快速检测土壤中的乙草胺残留。
表2乙草胺模拟污染土壤的生物修复
如表2所示，生物粘附固定化菌膜比游离态菌剂的降解效率高，在第2d的检测中，固定化菌膜实验组检测已成弱阴性(约2.5mg·L-1)，而游离菌实验组乙草胺的浓度仍然较高。到第7d，固定化菌膜可基本去除土壤中的乙草胺，游离态实验组的乙草胺残留浓度约0.5mg·L-1。结果表明固定化菌膜在污染土壤中表现出更好的降解效果和环境稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用黏细菌构建生物粘附固定化菌膜的方法，其特征在于，包括：
取待成膜菌株和黏细菌分别培养后，离心制成菌悬液；
将待成膜菌株和黏细菌的菌悬液共同转接至成膜培养基培养，形成菌膜；
所述成膜培养基为MSM培养基；
所述待成膜菌株为红球菌（Rhodococcus sp.）T3-1，保藏号CCTCC NO：M 2012525；戴尔福特菌（Delftia sp.）T3-6，保藏号CCTCC NO：M 2012526和鞘脂菌（Sphingobium sp.）MEA3-1，保藏号CCTCC NO：M 2012527；所述黏细菌选用黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）DK1622。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待成膜菌株和黏细菌的菌悬液按体积比3~9:1共同转接至成膜培养基培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，取待成膜菌株和黏细菌分别培养后，离心制成OD600nm=1.0的菌悬液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将待成膜菌株和黏细菌的菌悬液共同转接至成膜培养基震荡培养。
5.权利要求1~4任一项所述利用黏细菌构建生物粘附固定化菌膜的方法在强化修复化学农药中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述化学农药为乙草胺，将用于修复乙草胺的菌株和黏细菌的菌悬液按照体积比3~9：1共同转接至成膜培养基培养。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，固定化菌膜的降解环境为：温度25~37℃、pH 4.0~8.0、乙草胺浓度50~200 mg·L-1。
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