KR20140074451A - 미생물을 포함하는 수족관용 수질 개선제 - Google Patents

미생물을 포함하는 수족관용 수질 개선제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens), 니트로박터속(Nitrobactor sp), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp), 로도슈도모나스속(Rhodopseudomonas sp), 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobactor capsulatus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 및 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)으로 이루어진 미생물 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 수족관용 수질 개선제에 관한 것이다.

Description

미생물을 포함하는 수족관용 수질 개선제{MICROBIAL AGENT FOR IMPROVING WATER QUALITY OF AQUARIUM}
본 발명은 유기물 분해능을 갖는 미생물 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 수족관용 수질 개선제 및 이를 이용한 수족관의 수질 개선 방법에 관한 것이다.
일반적으로 가정이나 사무실, 음식점, 학교나 병원과 같은 공공시설 또는, 관상어 판매점 등에서는 실내환경을 자연친화적으로 조성한다거나 인테리어 효과와 함께 실내에 수분을 공급하기 위해 다양한 형태의 어항이나 수족관을 설치하여 사용하고 있다.
그러나 일정 시간이 경과하면 수족관 바닥 등에 쌓이는 미섭취 사료의 부패, 어류의 분비물 및 오염물질의 퇴적 등에 의해 고농도의 암모니아성-질소 및 아질산성-질소가 발생되고, 이에 따라 부영양화의 촉진 및 다량의 조류(적조 및 녹조) 발생하게 되어 수족관의 수질이 악화된다.
따라서, 수족관은 수중생물의 생태환경에 적합한 수중환경을 유지하기 위해 일정 주기마다 청소를 해야 하고, 이러한 청소는 매번 수조 내에 담긴 물을 완전히 갈아야 하므로 불필요한 물의 낭비를 초래할 뿐만 아니라, 여과를 위한 필터재를 분리해야 하는 등 여러가지 번거로움이 있다. 이처럼 가정용 수족관 및 상업용 활어수족관을 깨끗하고 건강하게 관리하는데 상당한 노력이 요구되며 많은 비용이 발생하고 있다. 따라서, 수족관 내 수질을 깨끗하고 편리하게 관리할 수 있는 해결방안이 절실한 실정이다.
이에 본 발명자는 화학 약품 처리보다는 생물학적 처리기능을 갖는 유용 미생물을 이용하여 오염도가 높은 상업용 활어수족관 및 가정용 관상어 수족관의 효과적인 수질 개선 방안을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 특정 미생물들이 유기물질 제거능이 뛰어난 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 의한 유용 미생물을 포함한 수족관용 수질 개선제를 사용할 경우, 수족관 내의 유기물질을 손쉽게 제거할 수 있고 화학 약품 사용으로 인한 어체 및 인체에 대한 해로운 영향을 개선할 수 있으며, 수질 관리로 인한 생활 피로도를 감소시킬 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 목적은 수질 개선능력이 우수한 미생물을 단독 또는 복합으로 포함하는 수족관용 수질 개선제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 수질 개선제를 이용하여 수족관의 수질을 개선하는 방법을 제공하는 것이다. .
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 수질 개선능력이 우수한 미생물을 단독 또는 복합으로 포함하는 수족관용 수질 개선제를 제공한다.
본 발명의 수질 개선능력이 우수한 미생물은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens), 니트로박터속(Nitrobactor sp), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp), 로도슈도모나스속(Rhodopseudomonas sp), 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobactor capsulatus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 및 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)으로 이루어진 미생물 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 수족관용 수질 개선제는 미생물 제제로서 상기 미생물 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 수족관용 수질 개선제는 유산균인 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주, 바실러스균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주, 및 효모군인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 혼합하여 복합균으로서 구성할 수 있다.
또한, 본 발명의 수족관용 수질 개선제는 바람직하게 질산화균인 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp), 및 로도슈도모나스속(Rhodopseudomonas sp) 균주가 혼합하여 구성되는 것을 특징으로 하는 복합균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 용어, "수질 개선제" 또는 "미생물 제제"는 병원성이 없는 유용미생물(Beneficial Microorganisms) 군 중에서 수족관용으로 이용 가능한 미생물을 선별한 것으로서, 유산균, 바실러스균, 질산화균, 광합성 세균, 효모균, 슈도모나스 균 등을 단독 또는 둘 이상 포함하여 수질 정화 또는 개선 기능을 갖는 것을 의미한다.
상기 언급한 본 발명의 미생물들은 유기물질 분해능이 우수하고, 생균 활성이 높고 최종 제품으로 생산시 저장 안정성이 용이한 균주이며, 수족관에서 균체 증식이 원활하게 이루어지고, 총질소(Total Nitrogen), 총인(Total Phosphorus) 제거 효과가 우수하고 악취 원인 물질 제거 효과 또한 우수한 균주들이다.
또한, 본 발명의 수질 개선제는 필요에 따라 여러 가지 첨가제, 예를 들면 광물(응집제), 안정제, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, 성형화에 사용되는 제제 등을 함유할 수 있다.
상기 수질 개선제의 안정제로서는 카라기난, 젤라틴, 글루코만난, 알긴산나트륨, 각종 검류(구아검, 잔탄검, 아라빅검, 카라야검)를 사용할 수 있다. 바람직하게, 안정제로서 잔탄검:알긴산나트륨을 또는 잔탄검:구아검을 1:1의 비율로 첨가하여 사용할 수 있다.
상기 미생물 안정제는 저장 기간 중에 pH 변화를 막으면서 사멸속도를 줄이고 균체 부유능을 개선하여 균체 침전 사멸을 방지하여 저장 안정성을 높이는 역할 을 한다.
본 발명의 수질 개선제는 분말, 과립, 펠렛 또는 액체 형태로 제조될 수 있으며, 액체 형태가 바람직하다.
본 발명에서 상기 수족관은 상업용 해수어, 활어, 담수어 또는 열대어 중 어느 하나 이상의 어류가 서식하는 수족관일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 수족관용 수질 개선제를 단독으로 또는 사료와 혼합하여 수족관에 첨가하는 것을 포함하는 수족관의 수질을 개선하는 방법을 제공한다.
상기 수질 개선제는 단독으로 또는 사료와 혼합하여 살포하는 방식으로 수족관에 투여함으로써 독성 질소를 감소시킬 수 있다. 이 경우 상기 수질 개선제를 사육수 1 L에 대하여 0.05 중량% 이상의 양으로 투여하여 독성 질소 제거 효과를 얻을 수 있다.
또는 상기 수족관 수질 개선용 미생물을 담체를 이용하여 수족관에 이용할 수 있다. 미생물 담지용 담체로서는 상기 미생물들을 담지하여 활어 수족관, 관상어 수족관에 투여할 수 있는 재료이면 어느 공지 재료도 사용할 수 있지만, 미생물의 효과적인 담지라고 하는 점에서 담체 표면에 미생물이 강하게 흡착하는 것, 미생물을 미소 공극 내에 침입시키는 것으로 보관 유지력을 높일 수 있는 것과 같은 다공성의 것, 마이크로 입자가 응집하여 실질적으로 흡착 혹은 흡착 표면적을 증대시킨 것이 바람직하다. 구체적으로는 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로스와 같은 다당류;콜라겐, 젤라틴, 알부민 등의 불활성화 단백질;이온교환 수지, 폴리비닐 클로라이드와 같은 합성 고분자 화합물;세라믹스나 다공성 유리 등의 무기물;한천, 알긴산, 카라기난 등의 천연 탄수화물;또는 셀룰로오스 아세테이트, 폴리 아크릴 아미드, 폴리비닐 알코올, 에폭시 수지, 열경화성 수지, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리우레탄 등 포괄 담체로써 얻을 수 있는 고분자 화합물 등을 들 수 있다.
본 발명에 의한 유용 미생물을 포함한 수족관용 수질 개선제를 사용할 경우, 수족관 내의 유기물질을 손쉽게 제거할 수 있고 화학 약품 사용으로 인한 어체 및 인체에 대한 해로운 영향을 개선할 수 있으며, 수질 관리로 인한 생활 피로도를 감소시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 유산균의 배양 결과를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 바실러스균의 배양 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 질산화균의 배양 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 광합성균의 배양 결과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 효모균의 배양 결과를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 슈도모나스균의 배양 결과를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 유용 미생물군의 탄소원 이용 정도를 파악한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 유용 미생물군의 질소원 이용 정도를 파악한 그래프이다.
도 9는 바실러스균에 대한 최적 증식 조건을 파악한 그래프이다.
도 10은 질산화균에 대한 최적 증식 조건을 파악한 그래프이다.
도 11은 광합성 세균에 대한 최적 증식 조건을 파악한 그래프이다.
도 12는 유산균, 효모균, 및 바실러스균을 혼합배양한 복합균에 대한 최적 증식 조건을 파악한 그래프이다.
도 13은 질산화균을 혼합배양한 복합균에 대한 최적 증식 조건을 파악한 그래프이다.
도 14는 유산균, 효모균, 및 바실러스균을 혼합배양한 복합균에 대한 scale up pilot 실험결과 그래프이다.
도 15는 질산화균을 혼합배양한 복합균에 대한 scale up pilot 실험결과 그래프이다.
도 16은 광합성 세균에 대한 scale up pilot 실험결과 그래프이다.
도 17은 유산균, 효모균, 및 바실러스균을 혼합배양한 복합균을 포함한 미생물 제제에 대한 생균 안정성 데이타이다.
도 18은 질산화균을 혼합배양한 복합균을 포함한 미생물 제제에 대한 생균 안정성 데이타이다.
도 19는 광합성 세균을 포함한 미생물 제제에 대한 생균 안정성 데이타이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 수족관용으로 이용 가능한 미생물 균주의 선별
본 발명자는 수족관용으로 보다 적합한 미생물 균주를 선별하기 위해서, 병원성이 없는 유익균 들 중에서 사료 첨가용으로 활용가능한 미생물 군과 환경 개선 효과가 우수한 미생물 군으로 구분하여 1차로 후보 미생물들을 다음과 같이 선별하였다. 또한, 본 발명의 목적을 달성하기에 가장 적합한 미생물을 선별하고자 미생물 선별 기준을 하기와 같이 정하고 각 미생물 군별로 이 조건에 가장 부합하는 미생물들을 최종적으로 선별하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
<사료 첨가용으로 활용 가능한 미생물 군>
Lactobacillus reuteri, Lactobacillus casei , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillu paracasei , Bacillus subtilis , Rhodopseudomonas capsulatus, Bifidobacterium sp.
<환경 개선 효과가 우수한 미생물 군>
Rhodobactor capsulatus , Rhodobacter sphaeroides , Saccharomyces cerevisiae, Candida sp . Bacillus thuringiensis , Bacillus amyloliqufaciens , Bacillus sp . Nitrobactor sp , Nitrosomonas sp . Pseudomonas sp .
<수족관용 미생물 균주 선별 기준>
(1) 유기물 분해능이 우수하고, 생균 활성이 높고 최종 제품으로 생산시 저장 안정성이 용이한 균주일 것.
(2) 수족관 환경에 적합한 pH 조건, 균제 증식 온도, DO 이용 정도를 파악하여 균체 증식 여부를 파악하여 정할 것.
(3) 총질소(Total Nitrogen), 총인(Total Phosphorus) 제거 효과가 우수하고, 악취 원인 물질 제거 효과가 우수한 균주일 것.
1-1. 유산균 증식 기초 실험
TEST 균주 (5종)를 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillu paracasei)로 정하였다.
이들을 MRS 배지(Difco), 50ml Bottle, 25℃, 48hr 조건으로 혐기 정치 배양하였으며 그 결과를 도 1 및 하기 표 1에 나타내었다.
L. acidophilus L. paracasei L plantarum L. casei L reuteri
pH 4.2 4.6 4.0 4.2 3.9
OD(660nm) 6.0 5.0 8.2 6.8 8.0
비 고 증식 불량 증식 불량 증식 양호 증식 양호 증식 양호
상기 결과로부터, 유산균 균종 Field 조건(수족관 환경)에서 증식이 양호하면서 저장 안정성이 높고 통성혐기성 조건에서도 증식이 잘되는 균주로서, 락토바실러스 플랜타룸, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 루테리 균주를 선택하였다.
1-2. 바실러스 증식 기초 실험
TEST 균주 (4종)를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens), 바실러스속(Bacillus sp.)로 정하고, TS 배지 (Difco), 500ml Baffle Flask, 180rpm, 25℃, 48hr 호기 교반 배양하였으며 그 결과를 도 2 및 하기 표 2에 나타내었다.
B. sp . B. thuringiensis B. amyloliqufaciens B. subtilis
pH 5.8 5.6 5.8 5.7
OD(660nm) 2.9 1.6 3.6 3.2
비 고 증식 보통 증식 불량 증식 양호 증식 양호
상기 결과로부터, 바실러스 균종 Field 조건(수족관 환경)에서 증식이 양호하면서 유기물 분해능이 우수하고 spore 형성이 잘되어 생균 저장성이 높은 균주로서, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리쿠파시엔스 균주를 선택하였다.
1-3. 질산화균 증식 기초 실험
TEST 균주 (2종)를 니트로박터속(Nitrobactor sp), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp)으로 정하고, TS 배지 (Difco), 500ml Baffle Flask, 180rpm, 25℃, 24hr 호기 교반 배양하였으며 그 결과를 도 3 및 하기 표 3에 나타내었다.
Nitrosomonas sp . Nitrobactor sp .
pH 6.0 6.2
OD(660nm) 5.6 7.0
비 고 증식 양호 증식 양호
상기 결과로부터, 두 균주 모두 질산화 반응 (Nitrification) 에 관여하면서 wild type 조건에서 생균 활성이 높은 것으로 판단되어 둘 다를 선별하였다.
1-4. 광합성균 증식 기초 실험
TEST 균주 (3종)를 로도슈도모나스속(Rhodopseudomonas sp), 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobactor capsulatus), 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로 정하고, R2A (선택배지), 500ml Baffle Flask, 120rpm, 25℃, 48hr 호기 교반 배양하였으며 그 결과를 도 4 및 하기 표 4에 나타내었다.
Rhodobacter sphaeroides Rhodopseudomonas sp . Rhodobactor capsulatus
pH 7.3 7.6 7.5
OD(660nm) 2.0 3.6 3.9
비 고 증식 보통 증식 양호 증식 양호
상기 결과로부터, 광합성 세균 균종 Field 조건(수족관 환경)에서 증식이 양호하면서 균체 대량 생산이 가능하면서 특유의 짙은 홍색 발현이 우수한 균주로서, 로도슈도모나스속 균, 로도박터 캡슐레이터스를 선별하였다.
1-5. 효모균 증식 기초 실험
TEST 균주 (2종)를 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다속(Candida sp.)으로 정하고, YM (Difco), 500ml Baffle Flask, 180rpm, 25℃, 48hr 호기 교반 배양하였으며 그 결과를 도 5 및 하기 표 5에 나타내었다.
Saccharomyces cerevisiae Candida sp .
pH 5.8 5.9
OD(660nm) 13 10
비 고 증식 양호 증식 보통
상기 결과로부터, 효모균 Field 조건(수족관 환경)에서 증식이 양호하면서 Gas 생성량이 적은 균주로서, 사카로마이세스 세레비지에 균주를 선별하였다.
1-6. 슈도모나스 증식 기초 실험
TEST 균주 (2종)을 슈도모나스속(Pseudomonas sp.), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)로 정하고, LB (Difco), 500ml Baffle Flask, 120rpm, 25℃, 24hr 호기 교반 배양하였으며 그 결과를 도 6 및 하기 표 6에 나타내었다.
Pseudomonas fluorescens Pseudomonas sp .
pH 5.7 5.6
OD(660nm) 3.2 4.5
비 고 증식 보통 증식 양호
상기 결과로부터, 슈도모나스 균주 Field 조건(수족관 환경)에서 증식이 양호하면서 wield type에서 생균 활성이 높은 균주로서 슈도모나스속 균주를 선별하였다.
상기 결과를 정리하면 최종 균주로서 선별된 미생물 군은 다음과 같다.
유산균 3종 - 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)
바실러스 2종 - 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens)
질산화균 2종 - 니트로박터속(Nitrobactor sp), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp)
광합성 세균 2종 - 로도슈도모나스속(Rhodopseudomonas sp), 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobactor capsulatus)
효모균 1종 - 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)
슈도모나스 1종 - 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)
후속하여, 상기 최종 선별 균주를 이용하여 수족관용에 적용하여 균체 증식, TN, TP, 유기물 감소 및 수조환경 변화 관찰 실험을 하기와 같이 수행하였다.
실시예 2: 수족관용 미생물 제제 대량 생산 실험
수족관용 미생물 제제 대량 생산 조건 수립을 위해 먼저, 수족관용 미생물 생산 배지의 최적화 조건에 관한 실험을 수행하였다.
2-1. 미생물 대량 배양 배지 최적화
생산용 배지를 최적화를 위해 유용 미생물들이 주로 사용하는 탄소원, 질소원, 인산염, 기타 미량원소를 파악하기 위한 실험은 수행하였다.
A. 탄소원 이용 정도 파악
Glucose, Lactose, Starch, Sucrose, 당밀, CSL, Malic acid에 대하여 탄소원 이용 정도를 파악하였으며 그 결과는 다음과 같다(도 7 참조).
유산균 종 - Glucose> Lactose> Sucrose> 당밀 이용 우수함.
바실러스 종 - Glucose > Sucrose > 당밀 > Starch 이용 우수함.
질산화균 종 - Glucose > Malic acid > 당밀 > Sucrose 이용 우수함.
광합성균 종 - Malic acid > Glucose > Sucrose > 당밀 이용 우수함.
효모균 - Glucose > Sucrose > Starch > 당밀 이용이 우수함.
슈도모나스균 - Malic acid > Glucose > Sucrose > 당밀 이용 우수함.
B. 질소원 이용 정도 파악
(NH4)2SO4, Urea, NH4NO4, KNO3, Yeast Extract, Beef Extract, peptone, MSG 에 대하여 질소원 이용 정도를 파악하였으며 그 결과는 다음과 같다(도 8 참조).
유산균 종 - Yeast Extract > peptone > Beef Extract > (NH4)2SO4 이용 우수함.
바실러스 종 - Yeast Extract > (NH4)2SO4 > KNO3 > NH4NO4 이용 우수함.
질산화균 종 - MSG > (NH4)2SO4 > Yeast Extract > KNO3 이용이 우수함.
광합성균 종 - MSG > Yeast Extract > (NH4)2SO4 > NH4NO4 이용이 우수함.
효모균 - Yeast Extract > Beef Extract> peptone > (NH4)2SO4 이용이 우수 함.
슈도모나스균 - Yeast Extract > (NH4)2SO4 > MSG > KNO3 이용이 우수함.
C. 인산염 이용 정도 파악
KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4에 대하여 인산염 이용 정도를 파악하였으나 모든 미생물군 이용 정도가 비슷하게 나타났다.
D. 기타 미량원소 이용 정도 파악
Mg, Fe, Zn, K, Ca, Citric acid, Min/vit에 대하여 이용 정도를 파악하였으나 모든 미생물 이용 정도가 비슷하게 나타났다.
Buffer로는 CaCO3, 인산 buffer, Sodium citrate를 이용하였다.
상기 실험결과를 토대로 , 각 미생물 군에 대한 최적 생산 배지 최적화(formulation)를 이룰 수 있었으며, 그 배지의 조성은 하기 표 7과 같다.
배지 조성 formulation (g/L)
유산균 Glucose 25, Yeast Extract 8, peptone 7, (NH4)2SO4 3, Sodium citrate 5, CaCO3 2, K2HPO4 2, MgSO4 0.5, Min/Vit 1ml
바실러스균 Glucose 10, Yeast Extract 7, (NH4)2SO4 3, Sodium citrate 5, KH2PO4 1, MgSO4 0.5, FeSO4 0.1, ZnSO4 0.1 Min/Vit 1ml
질산화균 Glucose 8, Malic acid 5, Yeast Extract 3, MSG 2, KH2PO4 2, MgSO4 0.5, FeSO4 0.05, CaCl2 0.1 Min/vit 1ml
광합성균 Glucose 5, Malic acid 8, Yeast Extract 4, Peptone 1, MSG 4, (NH4)2SO4 1.5 KH2PO4 2, MgSO4 0.5, FeSO4 0.05, Fe-EDTA 0.1, Min/vit 1ml
효모균 Glucose 15, sucrose 5, Yeast Extract 5, peptone 4, (NH4)2SO4 1, KH2PO4 2, K2HPO4 1, MgSO4 0.5, FeSO4 0.1, Min/vit 1ml
슈도모나스균 Glucose 10, Malic acid 5, Yeast Extract 2, (NH4)2SO4 1.5, MSG 1.5, KH2PO4 2, MgSO4 0.5, CaCl2 0.1 FeSO4 0.05, Min/vit 1ml
2-2. 미생물 배양 조건 최적화
수족관용 미생물 제제 대량 생산 조건 수립을 위해, 미생물 배양 배지 최적화 후 수족관용 미생물 최적 증식 조건을 파악하고자 다음과 같이 실험하였으며, 단일균, 복합균으로 나누어 배양 특성을 파악하였다.
A. 단일균 배양 조건
a. 바실러스균
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens)를 수족관용 최적화 배지에, 종균 접종량을 1%로 하여, 3L volume, 온도 25℃, RPM 300~400, pH 6.0~8.0, 통기량 0.5~1vvm, 압력 0.2~0.5kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
배양 실험 결과, 배양 27hr 경과 시점에 배양이 종료되었으며, 생균수 측정(QC) 결과 바실러스 균종 1.5X109cfu/ml 정도로 나타났다. 실험결과는 도 9에 나타내었다.
b. 질산화균
니트로박터속(Nitrobactor sp), 니트로소모나스속 균을 수족관용 최적화 배지에, 종균 접종량을 1%로 하여, 3L volume, 온도 25℃, RPM 300~400, pH 6.0~8.0, 통기량 0.5~1vvm, 압력 0.2~0.5kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
배양 실험 결과, 배양 27hr 경과 시점에 배양이 종료되었으며, 생균수 측정 결과 Nitrobactor sp - 2.0X109cfu/ml, Nitrosomonas sp - 8.0X109cfu/ml로 확인되었다. 실험결과는 도 10에 나타내었다.
c. 광합성 세균
로도슈도모나스속 균(Rhodopseudomonas sp), 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobactor capsulatus)를 수족관용 최적화 배지에 종균 접종량을 1%로 하여, 3L volume, 온도 25℃, RPM 300~400, pH 6.0~8.0, 통기량 0.5~1vvm, 압력 0.2~0.5kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
배양 실험 결과, 36hr 경과 시점에 배양이 완료되었으며, 생균수 측정(QC) 결과 광합성 세균 5.0X109cfu/ml로 확인되었다. 실험결과는 도 11에 나타내었다.
B. 복합균 배양 실험
유용 미생물의 혼합배양 가능성을 검토하고자, 혼합 배양시 균체 증식 정도를 파악하기 위한 실험을 수행하였다.
a. 유산균+효모균+바실러스 복합균 배양 실험
Latcobacillus + Saccharomyces + Bacillus을 수족관용 미생물 생산 배지 (g/L) 조성을 Glucose 20, Yeast Extract 7, soy peptone 7, (NH4)2SO5 1, KH2PO4 0.5, K2HPO4 1.0, Sodium citrate 2, CaCO3 2, MgSO4 0.5 (Min/vit)로 하여, 3L volume, 온도 30℃, RPM 200, pH 7.0~5.5, 통기량 1L, 압력 0kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
복합균 배양 실험 결과, 혼합 배양 상태가 비교적 양호하게 나타났으며, 36hr 경과 시점에 배양이 종료되었다. 잔류당은 고갈하였으며 생균수 측정 결과 유산균 3.0X109cfu/ml, 효모균 1.0X108cfu/ml, 바실러스균 1.5X108cfu/ml 수준으로 나타났으며, 생균 분포도가 양호하였다. 실험결과는 도 12에 나타내었다.
b. 질산화균 혼합 배양 실험
Nitrobactor + Nitrosomonas를 수족관용 미생물 생산 배지 (g/L) 조성을 Glucose 8, Malic acid 5, Yeast Extract 3, MSG 2, KH2PO4 2, MgSO4 0.5, FeSO4 0.05, CaCl2 0.1, Min/vit 1ml으로 하여, 3L volume, 온도 30℃, RPM 300, pH 6.0~8.0, 통기량 3L, 압력 0.2~0.5kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
질산화균의 혼합 배양 결과, Nitrosomonas 균체가 우점으로 증식하였으며, Nitrobactor 균체가 상대적으로 적게 증식되었으며, 질산화균 혼합 생균수 5.5X109 cfu/ml 정도로 나타났다. 실험결과는 도 13에 나타내었다.
2-3. 미생물 대량 배양 Scale up 실험
유산균+효모균+바실러스를 혼합하여 복합균 200L pilot scale up TEST로서 Jar에 수족관용 미생물 배지 조성으로, volume 150L, T 30, 30rpm, 통기량 10L, 압력 0kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
그 결과, 200L 대량 배양시 5L jar 배양 TEST 결과와 비슷한 수준의 균체 증식이 나타났으며, 생균수도 유산균 3.0X109cfu/ml, 효모균 1.5X108cfu/ml, 바실러스균 2.0X108cfu/ml 수준으로 나타났다. 실험결과는 도 14에 나타내었다.
다음으로, 질산화균(Nitrobactor, Nitrosomonas)을 혼합하여 200L pilot scale up TEST로서 진행하였다. 질산화균 혼합 배양 배지를 조성하고 volumn 150L, T30, 120rpm, 통기량 100L, 압력 0.2 kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
150L pilot TEST 결과, 균체 증식 정도가 양호하고 Lab TEST 결과와 비슷한 수준의 균체 증식이 나타났으며, 생균수도 5.5X109cfu/ml 정도로 높게 나타났다. 실험결과는 도 15에 나타내었다.
또한 광합성 미생물(Rhodobactor capsulatus)을 Jar에 100L pilot scale up 테스트로서 수족관용 광합성 미생물 배지를 조성하여 volume 80L, T30, 80rpm, 통기량 50L, 압력 0.2 kgf/cm2 조건하에 실험하였다.
100L pilot TEST 결과, 균체 증식 정도가 양호하고 색도 발현은 Lab TEST 결과 보다 우수하게 나타났으며, 생균수도 7.5X109cfu/ml 정도로 높게 나타났다. 실험결과는 도 16에 나타내었다.
실시예 3: 수족관용 미생물 제제 저장 안정화 실험
3-1. 미생물 안정제 처리
본 실험에 사용한 생물 안정제는 모두 식품첨가물로 사용 가능한 안정제, 분산제, 증점제이며, 재료 대량 구매 용이성, 제품 단가, 생균 안정성 등을 고려하여 최적 안정제를 선택하고자 카라기난, 젤라틴, 글루코만난, 알긴산나트륨, 각종 검류(구아검, 잔탄검, 아라빅검, 카라야검)를 대상으로 실험하였으며, 상기 안정제 종류 및 특징 (다당류 코팅)에 대해 하기 표 8에 정리하였다.
카라기난 젤라틴 글루코만난 알긴산나트륨 구아검 잔탄검
원 료 해산홍조류(gigartina,chondrus) 소, 돼지 등 뼈의 결합조직collagen 토란, 구약나물 감태, 다시마, 미역, 해초 Guar수(cyamopsis tetragonolobus) 잔토모나스 캄페스트리스 미생물 배양액
pH 안정범위 pH 3.5 이상 안정 pH 5.0~10.0 pH 6.0~8.0 pH 4.0~10.0 pH 6.0~10.0 pH 2.0~13.0
용해도 60℃이상
가온		 70℃이상 가온 80℃이상 가온 냉수용해 냉수용해 냉수용해
장/단점 -염류안정.
-pH안정성
우수
-무미무취
-용해성
어려움.		 -무미무취
-온도변화 민감함.
-용해성 어려움. 		-겔화용이, -보수성
우수
-pH 안정 -범위 좁음.		 -용해성우수,
-pH 안정성
우수
 -점도높음.
-용해성
우수.
-내열안정성 약함		 -pH 안정성 우수
-용해성 우수
-안정된 점도 유지.
실험결과, 균체 부유능, 안정화 처리 용이성, 최종 제품 물성 및 pH 변화 등을 고려하여 검류를 최종 안정제로서 선택하였다. 안정제 첨가량은 수족관용 미생물 배양액 물성, 제품 성상, 수족관 환경 변화 등을 고려하여 0.2~0.5% 정도가 적합한 것으로 나타났다. 미생물 배양액 pH 조절제로는 buffer Sodium citrate 0.3% 를 이용하였다 (pH 5.0~8.0).
3-2. 안정제 처리 후 Survival rate 파악
A. 복합균 군 제품(최종 제품 A)
유산균+효모균+바실러스 혼합 배양균에 대해, 상온 저장 조건으로 최소 6개월 정도 미생물 생균 안정성을 파악하고자 실험을 진행하였다. 안정제로서 잔탄검+알긴산나트륨을 1:1 비율로 첨가하였다. 복합균의 경우 유산균 + 효모균 + 바실러스 혼합 제품으로 총균수를 측정하였다. 최종 배양액은 pH 5.0 조절(buffer 처리) 하여 안정제 0.1%, 0.2%, 0.4% 처리하여 각각 비교하였다.
그 결과, 저장 2주차 정도까지는 큰 변화가 없었으나 저장 기간이 늘어날수록(8주 경과 기준) 무처리 대비 안정제 0.1% - 1.5배, 안정제 0.2% - 3.0배, 안정제 0.4% - 10배 정도의 균체 생균 활성을 유지하고 있었다. 실험결과는 도 17에 나타내었다.
B. 질산화균 군 제품
Nitrobactor + Nitrosomonas 혼합 배양균에 대해, 상온 저장 조건으로 최소 6개월 정도 미생물 생균 안정성을 파악하고자 실험을 진행하였다. 안정제로서 잔탄검+구아검을 1:1 비율로 첨가하였으며, 안정제 0.1%, 0.2%, 0.4% 첨가하여 각각 비교하였다.
그 결과, 질산화균 군(무처리 기준)의 경우 상온저장 생균 안정성이 아주 떨어지는 것으로 나타났으며, 상온 저장기간이 길어 질수록 생균 사멸속도가 빠르게 나타났다. 안정제 0.1% 처리의 경우 물성 및 생균수 변화 관찰 결과 큰 효과가 없는 것으로 나타났으며, 안정제 0.4% 처리의 경우 무처리 대비 47배(8주 경과 기준) 수준으로 안정제 처리 효과가 상당히 있는 것으로 나타났다. 실험결과는 도 18에 나타내었다.
C. 광합성 세균 군 제품
Rhodopseudomonas sp . + Rhodobactor capsulatus 광합성 미생물의 혼합 배양균에 대해, 상온 저장 조건으로 최소 6개월 정도 미생물 생균 안정성을 파악하고자 실험을 진행하였다. 안정제로서 잔탄검+구아검을 1:1 비율로 안정제 0.1%, 0.2%, 0.4% 첨가하여 각각 비교하였다.
그 결과, 안정제 무처리군의 경우 생균 활력 저하 정도가 2주 경과시부터 본격적으로 나타났으며, 안정제 0.4% 처리의 경우 4주 경과시까지 초기 생균수를 유지하고 있었으며 서서히 균체수 감소가 나타나기 시작하였다. 광합성 세균의 경우 생균 활성 유지 정도가 무처리(BK) 대비 안정제 0.4% 처리 효과가 20배 수준으로 우수한 것으로 나타났다. 실험결과는 도 19에 나타내었다.
실시예 4: 미생물 제제의 수질개선 성능 평가 시험
상기 본 발명의 실시예에 따른 결과를 통해 선별한 미생물들의 수질 개선 능력을 알아보기 위해 본 발명의 미생물을 단독으로 또는 혼합한 미생물 제품에 대하여 수질개선 성능 평가 시험을 하기와 같이 실시하였다.
인공오수를 설정하여 직경 60cm × 높이 80cm의 원형 P.V.C용기에 200Liter의 인공오수를 투입하고, 인공오수 전체 투입량의 10%인 20리터(Liter)의 단독 또는 복합미생물군을 투입하여, 배양온도인 35℃에서 폭기 및 순환을 하여 200일 동안 각기 5회에 걸쳐 시험하고, 총질소(TN)와 총인(TP)의 감소량을 측정하였다.
그 결과, 일반오수의 총질소의 감소율에 비해 본 발명의 단독 또는 복합 유용미생물을 첨가한 것의 수질 개선 능력이 현저히 우수한 것으로 나타났다.

Claims (5)

  1. 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens), 니트로박터속(Nitrobactor sp), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp), 로도슈도모나스속(Rhodopseudomonas sp), 로도박터 캡슐레이터스(Rhodobactor capsulatus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 및 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)으로 이루어진 미생물 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 수족관용 수질 개선제.
  2. 유산균인 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주,
    바실러스균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주, 및
    효모군인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 혼합하여 구성되는 것을 특징으로 하는 복합균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 수족관용 수질 개선제.
  3. 질산화균인 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp), 및 로도슈도모나스속(Rhodopseudomonas sp) 균주가 혼합하여 구성되는 것을 특징으로 하는 복합균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 수족관용 수질 개선제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 안정제로서 잔탄검:알긴산나트륨을 또는 잔탄검:구아검을 1:1의 비율로 첨가한 것을 특징으로 하는 수족관용 수질 개선제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 수족관용 수질 개선제를 단독으로 또는 사료와 혼합하여 수족관에 첨가하는 것을 포함하는 수족관의 수질을 개선하는 방법.
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