CN118126869A - 枯草芽孢杆菌bs-22株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明从猪场分离得到一株新的枯草芽孢杆菌BS‑22株，并利用该菌株制备得到方便使用的菌粉制剂，相对而言，该菌株具有较高的产纤维素酶能力，对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88和K99株均具有较强的抑制作用，在亚硝酸盐降解方面也表现优异，可以用于改善养殖环境。
Description
本申请是申请日为2023年10月17日、申请人为北京大北农科技集团股份有限公司、福建大北农华有水产科技集团有限公司和天津大北农生物科技有限公司，发明名称为“枯草芽孢杆菌BS-22株在改善养殖环境中的应用”的中国专利申请202311340921.8的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株新分离的枯草芽孢杆菌BS-22株，并具体将其用于改善养殖环境。
背景技术
我国目前已成为世界生猪养殖大国，据国家统计局数据，2014年-2018年我国生猪出栏量都在7亿头左右。随着养殖规模的扩大，也日益暴露出一些亟待改进的技术，例如，由于抗生素滥用而导致的细菌耐药性增强、药物残留、食品安全以及生态环境中的抗生素污染等问题日益严峻。同时，由于养殖规模扩大而导致养殖废弃物的处理量和处理难度也日益增大，在养殖过程中，往往不够重视养殖废水和猪粪的处理，从而导致了臭气污染，恶臭物质成分复杂，其中的多种成分都具有强烈的毒性，比如氨气和硫化氢浓度高时能使人畜中毒，作为环境公害之一，恶臭直接危害到人们的健康，同时也制约着养猪业自身的可持续发展。另外，随着养殖集约化程度的提高，养殖舍内有害细菌滋生，特别是环境中大量存在的致病菌，例如葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌和变形杆菌等有害菌破坏生态环境的平衡，引发养殖动物各种疾病，畜禽养殖舍内氨气臭味严重，场内生态环境脆弱，导致畜禽产品质量下降，甚至带来食品安全性问题。因此，在养殖过程中，为了改善养殖的环境，大量地使用消毒剂，例如消毒液、消石灰等大面积的使用，其也会消毒成分残留、环境中的有益菌群失调等问题。
枯草芽孢杆菌也称为枯草杆菌，是一类需氧型、内生抗逆孢子的杆状革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌自身没有致病性，可以分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等酶类，是我国农业部公布的课直接饲喂动物且允许使用的益生菌种之一。枯草芽孢杆菌在土壤及植物体表广泛存在，可形成孢子，且抗逆性好，在芽孢状态具有良好的稳定性，通常在120℃的高温处理下能够存活20min左右，酸性环境也可保持存活，因此，其可以在畜禽养殖生产和应用当中保持较高的活力，属于一种高效微生态制剂菌种。另外，有研究表明，枯草芽孢杆菌产生溶菌物质因而具有抑菌活性；还能够在畜禽肠道内生营养细胞，与肠道粘膜位点结合、定植，形成生物屏障后可以有效阻止病原微生物的吸附与生长；通过产生各种消化酶，例如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，能够提高饲料的转化率，促进动物的生长。近年来，也有研究表明微生态制剂可以迅速降解、吸附和转化水体中的有机污染物、氮和磷等，其中枯草芽孢杆菌能将动物排泄物、残存饲料、硝酸盐、磷酸盐等分解为小分子有机酸、氨基酸，为水体中的藻类提供营养，防止水体的富营养化，维持水体生态平衡；还可以有效降低粪便中的氨气、吲哚等有害气体的浓度，减轻粪便臭味，其代谢产物也能抑制蚊蝇的生长繁殖，改善养殖环境，有利于粪便的资源化。
目前，枯草芽孢杆菌在饲料生产中应用广泛，我公司也着力于分离获得性能更好的新菌株，并积极拓展枯草芽孢杆菌在饲料生产、养殖业中的应用范围，先后分离得到了枯草芽孢杆菌C-1株（CGMCC No：4628）、枯草芽孢杆菌1-c-7株（CGMCC No：17348），并申请了发明专利CN201110116641.X和CN20201161705.6，前者具有极强的抑菌作用和产纤维素酶的能力，可以用于畜禽的养殖，后者主要集中在水产领域应用，可以提高水产动物肝脏组织的健康水平，增强鳜鱼的抗病能力，但都未将其应用于改善养殖环境。现有技术，例如专利CN114540240A，公开了一种用于养殖场污水处理的微生态制剂及制备方法和应用，但该菌剂仅包含枯草芽孢杆菌一种，降解COD的效率不高，耐受冲击能力差，难以应对成分复杂的猪粪。目前枯草芽孢杆菌在饲料行业、养殖产业大规模应用的瓶颈问题仍然是优良菌株的分离和筛选，因此，如何筛选得到可以有效改善养殖环境的菌株是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明基于我公司分离得到的一株抗逆性强、益生功能优秀，且具有抑菌作用和较强亚硝酸盐降解能力的枯草芽孢杆菌，进一步探索其在改善养殖环境中的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌BS-22株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BS-22株于2023年05月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保存，命名为BS-22株，分类命名为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为：CGMCC No：27370，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
本发明还请求保护所述的枯草芽孢杆菌BS-22株的菌粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，枯草芽孢杆菌BS-22株的发酵：
（1）发酵培养基的配制：玉米面0.5％，黄豆饼粉1％，蔗糖0.4％，鱼粉0.6％，KH2PO40.1％，FeSO4.7H2O 0.025％，MgSO4.7H2O 0.05％，MnSO4 0.024％，CaCO3 0.1％，消泡剂0.05％，pH为7.2；
（2）发酵罐培养：121℃灭菌30min，降温至37℃，向其中接入菌龄为12h的枯草芽孢杆菌BS-22株的种子液，接种量为1%，发酵期间保持转速220rpm，通气量1:0.3vvm，罐压0.05MPa，培养至24h为发酵终点，检测枯草芽孢杆菌BS-22株的活菌数≥1.0×1011CFU/mL；
步骤二，喷雾干燥制备菌粉：在枯草芽孢杆菌BS-22株发酵菌液中加入10％w/v的玉米淀粉作为保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度160℃，出风口温度85℃，进料速度3L/h，收集得到枯草芽孢杆菌干粉制剂，经检测，菌粉中枯草芽孢杆菌BS-22株的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
本发明还请求保护一种枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉，其特征在于，所述菌粉采用以上方法制备得到。
本发明还请求保护所述的枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉在畜禽养殖环境除臭中的应用，其特征在于，使用方式为将枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉溶解于水中，对养殖环境进行喷雾处理。
本发明还请求保护所述的枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉在降解猪场废水COD中的应用，其特征在于，使用方式为在废水中加入枯草芽孢杆菌BS-22的菌粉，使得其中的活菌数达到1×107cfu/L，发酵处理从而有效降低猪场废水COD水平。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明从猪场分离得到一株新的枯草芽孢杆菌BS-22株，相对而言，该菌株具有较高的产纤维素酶能力，对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88和K99株均具有较强的抑制作用，在亚硝酸盐降解方面也表现优异，并且将该菌株用于改善养殖环境，研究表明，其可以抑制畜禽养殖环境有害微生物、减少养殖环境中的臭气，降解养殖废水中COD水平、降低水产养殖水体中的COD值，提高鱼苗的存活率，在众多方便表现出众，优于市场类似的菌剂，取得了极好的技术效果。
附图说明
图1：枯草芽孢杆菌BS-22株在降解猪场废水COD中的应用结果。
具体实施方式
实施例1：枯草芽孢杆菌的分离与筛选
1.1 菌株的初步分离：
取本集团公司旗下黑龙江地区、辽宁地区的猪场猪粪、猪粪废水暂存池、两级AO工段污水和沼液还田土壤等环境样品共30份，每个样品取样10 g，取样后分别置于100 ml猪粪模拟培养基（猪粪模拟培养基配方为：蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、乙酸钠10 g/L、柠檬酸钠10 g/L、植物油5 g/L、甘油5 g/L、羧甲基纤维素钠5 g/L、氯化铵2 g/L、硝酸钠2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸亚铁0.1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 6.8-7.3）中，在25℃、200 rpm的条件下培养5-6天，然后取10 ml培养液接种至新的猪粪模拟培养基中进行传代，连续传代3次后即得到富集培养液，而后送由北京大北农饲用微生物工程国家重点实验室进行进一步的分离、筛选与鉴定。
采用无菌PBS液将富集培养液进行10倍稀释，振荡混匀制成菌悬液，放入水浴锅中，90℃加热15分钟，之后取上清液，8000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体沉淀加入10mL人工胃液（1%胃蛋白酶，0.85%氯化钠，采用HCl溶液调节pH至2.0，过滤除菌后制备得到人工胃液）中，37℃静置2h，而后6000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体沉淀加入10mL人工胆盐（在液体肉汤培养基中添加0.3%的猪胆盐，高压灭菌后制备得到人工胆盐）中，37℃静置4h。震荡混匀后，采用无菌PBS梯度稀释后，涂布到LB培养基上，30℃培养24h后，纯化菌落。共分离获得了5株疑似枯草芽孢杆菌，而后将初步分离得到的5株菌株继续在LB培养基上进行分离纯化，分别命名为BS-05，BS-10，BS-17，BS-22，BS-28。
1.2 菌株的复筛
1.2.1 枯草芽孢杆菌的溶血性测试
将分离得到的5株枯草芽孢杆菌BS-05，BS-10，BS-17，BS-22，BS-28分别划线接种至新鲜的血液培养基上，37℃培养24h，经观察，5株菌株均未出现溶血环，表明分离得到的5株枯草芽孢杆菌没有溶血活性，对于动物而言是安全的。
1.2.2 产纤维素酶能力的筛选
采用接种环将分离纯化出来的菌株在0.5%羧甲基纤维素的LB-CMC培养基上进行点菌，30℃培养24h，用刚果红染色1小时，弃去染料后再用1M的NaCl溶液洗涤1h，根据菌落周围有无出现水解透明圈，测定透明圈与菌落直径，计算透明圈与菌落直径的比例（H/C），同时以本公司早期分离得到的枯草芽孢杆菌C-1株（CGMCC No：4628）、枯草芽孢杆菌1-c-7株（CGMCC No：17348）作为对照菌株。具体检测结果如下表1所示：
表1 枯草芽孢杆菌产纤维素酶能力测试-透明圈与菌落直径的比例（H/C）
基于以上试验结果可知，本发明所分离得到的BS-17株、BS-22株均表现出较高的产纤维素酶能力，其与本公司先前分离得到的高产纤维素酶的C-1株的产酶能力相当，其中BS-22株的产酶能力相对而言最高。
1.2.3 抑菌能力测定
以大肠杆菌K88、大肠杆菌K99和金黄色葡萄球菌为指示菌，检测分离得到的枯草芽孢杆菌的抑菌活性。具体将LB固体培养基融化后，冷却至45℃左右，加入过夜培养的指示菌培养液（每100毫升培养基加入100微升菌液），震荡混匀，倒入无菌平板，每皿倒入15-20mL。每个平板上预先放置2只经灭菌的牛津杯，琼脂凝固后将牛津杯取出，平板上形成琼脂孔。向琼脂孔中加入150μL待测菌液，设置3个重复，盖好皿盖，小心移到37℃培养箱中进行培养，平皿正放，静置培养。培养20小时后，打开皿盖，用卡尺测量抑菌圈的直径。具体抑菌效果如下表2所示：
表2 枯草芽孢杆菌的抑菌能力测定结果
基于以上抑菌性能检测结果可知，本发明分离得到的BS-17和BS-22株具有较好的抑菌能力，其中BS-22的抑菌能力最为突出，其对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88和大肠杆菌K99株均具有很强的抑菌性能，其对于大肠杆菌的抑菌能力接近C-1株的2倍。
1.2.4 枯草芽孢杆菌的降解亚硝酸盐能力测试
张峰峰（北农学报，2009，24（4）：218-221）等报道了枯草芽孢杆菌可以迅速降低养殖水体中的硝酸盐和亚硝酸盐，具有净化水体的作用。而本发明的枯草芽孢杆菌即分离自猪场猪粪、猪粪废水暂存池、两级AO工段污水和沼液还田土壤等环境样品，其分离环境中含有大量的亚硝酸盐，因此，本发明进一步对枯草芽孢杆菌BS-17和BS-22株降解亚硝酸盐的能力进行了测试。具体测试方法如下：
（1）标准曲线绘制：称取分析纯亚硝酸钠配置浓度梯度标准溶液，各取200μL至96孔板中，每孔先后加入格里斯试剂A、B各 20μL。用酶标仪测定550nm波长下的吸光值。以吸光值为横坐标，亚硝酸钠浓度为纵坐标绘制标准曲线。
（2）亚硝酸盐降解培养基配制：LB液体培养基80mL，亚硝酸钠2.5mg，加蒸馏水定容至1000mL，分装到250mL三角瓶中，每瓶100mL，表明覆盖5mL石蜡油，以隔绝空气。121℃高压灭菌 20min。
（3）菌株降解亚硝酸盐能力测定：将过夜培养的菌液按1％接种量转接到亚硝酸盐降解培养基中，在第0h、12h、24h和48h分别取发酵液1ml，离心。吸取200μL上清液至96孔板中，先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于波长550nm测定吸光值。根据标准曲线计算发酵液中亚硝酸钠的浓度。具体结果如下表3所示：
表3 枯草芽孢杆菌降解亚硝酸盐的能力测定
基于以上表3的结果可知，本发明所分离得到的枯草芽孢杆菌BS-22株降解亚硝酸盐的能力最强，其在12h内能够降解培养基95.2%的亚硝酸盐，在24h内能够降解98.4%的亚硝酸盐，在48h内降解率达到99.6%，其相比BS-17株以及现有的C-1株和1-c-7株具有相对更强的亚硝酸盐降解能力。
基于以上试验可知，本次分离得到的BS-22株相对其他分离株而言具有更强的纤维素降解能力、抑菌性能，在亚硝酸盐降解方面也表现优异，且经溶血试验表明其也安全无害，因此，将其确定为本次分离得到的最优菌株。
实施例2：枯草芽孢杆菌BS-22株的鉴定与保藏（CGMCC No：27370）
2.1形态学及生化鉴定：
经观察，枯草芽孢杆菌BS-22株细胞呈杆状，0.9-1.1μm×1.7-1.9μm，着色均匀，无荚膜，鞭毛侧生，运动，革兰氏染色呈现阳性。芽孢呈椭圆柱状，0.6-0.7μm×0.8-1.2μm。菌落为圆形，不闪光不透明，培养48h以后，菌落变厚变干，边缘出现不整齐的情况，菌落表面呈现微黄色。
根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》，对枯草芽孢杆菌BS-22株进行生理生化鉴定试验。具体生理生化特征见下表4。
表4 枯草芽孢杆菌BS-22株生理生化特征
注释：“+”表示阳性；“—”表示阴性。
2.2 16S rDNA序列测定
利用细菌16s rDNA通用引物（上游引物为5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´、下游引物：5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´）扩增细菌的16s rDNA片段，测序后得到序列片段，所得序列与Genbank 中的16s rDNA序列进行分析比对，结果显示该菌与枯草芽孢杆菌C-1株的同源性高达99.5%，结合生理生化试验结果，进一步将该分离菌鉴定为枯草芽孢杆菌。
2.3 枯草芽孢杆菌BS-22株的保藏
对于分离得到的菌株于2023年05月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保存，命名为BS-22株，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏号为：CGMCC No：27370，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
实施例3：枯草芽孢杆菌BS-22株的抗逆性检测
（1）菌种活化：将保存的枯草芽孢杆菌BS-22株划线接种到LB培养基斜面，37℃培养24h。
（2）种子液制备：挑取活化后的单菌落2环接种到LB培养基，37℃，150rpm摇床培养24h。
（3）发酵液的制备：将种子液按照2%的接种量接种到LB培养基，37℃，150rpm摇床培养24h，制备得到枯草芽孢杆菌BS-22株发酵液。
3.1温度敏感性试验：
取发酵液分别在25℃、80℃、85℃、90℃、95℃和100℃条件下保温处理10min，以25℃处理组作为对照组，对各组菌液进行梯度稀释，均匀涂布在LB固体培养基平板，37℃培养48h后进行菌落计数，测定各处理组的活菌数和存活率，各组重复3次试验。具体结果见下表5。
表5. 枯草芽孢杆菌BS-22株耐热性能的测定
基于以上表的结果可知，本发明分离得到的枯草芽孢杆菌BS-22株具有优越的耐热性能，其经过90℃的温度处理10min后，存活率仍高达97.44%，高于C-1株报道的95.4%；经过95℃的温度处理后，存活率仍高达95.51%，在100℃处理10min，其残存活菌数仍高达89.26%，以上试验结果表明，本发明分离得到的枯草芽孢杆菌BS-22株具有优越的耐热性能，能避免高温加工对于菌株活性的影响，更加适合饲料添加剂和饲料加工过程。
3.2 耐人工胃液、人工胆盐试验：
人工胃液的配制方法：1%胃蛋白酶，0.85%氯化钠，用HCl调节pH至2.0，细菌过滤器过滤除菌备用。
人工胆盐的配制方法：在LB培养基中添加0.3%或0.6%的猪胆盐（分析纯）制备得到不同浓度的人工胆盐培养基，高压灭菌后备用。
取发酵液1mL，加入9mL pH=2的人工胃液作为试验组，同时取发酵液1mL，加入9mL生理盐水作为对照组，37℃静置培养5h，对两组发酵液分布进行梯度稀释，而后均匀涂布到LB培养基，37℃厌氧培养48h后计数。
存活率（%）=人工胃液处理组的活菌数/对照组活菌数×100%。
取发酵液1mL，加入9mL含有0.3%或0.6%胆盐溶液中，同时取发酵液1mL，加入9mL生理盐水作为对照组，37℃静置培养4h，对两组发酵液分布进行梯度稀释，而后均匀涂布到MRS培养基，37℃厌氧培养48h后计数。
存活率（%）=胆盐处理组的活菌数/对照组活菌数×100%。
表6 耐人工胃、胆盐试验结果
基于以上试验可知，本次新分离得到的枯草芽孢杆菌BS-22株对于人工胃酸和胆盐都具有很好的耐受能力，人工胃肠液处理后的存活率均高达94.14%，0.3%的胆盐处理对于枯草芽孢杆菌BS-22株的活力影响不大，高达0.6%的胆盐处理后，其存活率仍高达90%以上，相比C-1株具有更好的耐受性。
实施例4：枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉的制备
4.1 枯草芽孢杆菌BS-22株的发酵：
（1）发酵培养基的配制：玉米面0.5％，黄豆饼粉1％，蔗糖0.4％，鱼粉0.6％，KH2PO40.1％，FeSO4.7H2O 0.025％，MgSO4.7H2O 0.05％，MnSO4 0.024％，CaCO3 0.1％，消泡剂0.05％，pH约7.2。
（2）发酵罐培养：121℃灭菌30min，降温至37℃，向其中接入菌龄为12h的种子液，接种量为1％，发酵期间保持转速220rpm，通气量1:0.3vvm，罐压0.05MPa，培养至24h为发酵终点，检测枯草芽孢杆菌BS-22株的活菌数≥1.0×1011CFU/mL。
4.2 喷雾干燥制备菌粉：
在枯草芽孢杆菌BS-22株发酵菌液中加入10％w/v的玉米淀粉作为保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度160℃，出风口温度85℃，进料速度3L/h。收集得到枯草芽孢杆菌干粉制剂，经检测，菌粉中枯草芽孢杆菌BS-22株的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
实施例5：枯草芽孢杆菌BS-22株在抑制畜禽养殖环境有害微生物中的应用
选取本集团黑龙江地区试验猪场的三栋猪舍为测试对象，三栋猪舍面积和空间相同，猪舍内各养殖有800头体重接近的育肥猪，饲喂的日粮均相同，管理方式（饮水、清洗）等也均相同。其中猪舍1为BS-22株试验组（将实施例4的枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉50g溶解于50L水中，对猪舍进行喷雾处理），猪舍2为C-1株对照组（按照实施例4的方法制备得到枯草芽孢杆菌C-1株菌粉，取菌粉50g溶解于50L水中，对猪舍进行喷雾处理），猪舍3为空白组（按照日常方式进行清洗和打扫，不进行喷雾处理）。
在喷雾处理前分别对猪舍采食区、休息区和粪便处理区域随机选择5cm×5cm的区域进行取样，进行大肠杆菌的检测，取样结束后采用相应的喷雾在猪舍的地面、墙壁上进行喷洒处理，每隔3天喷洒一次，在喷洒后第12天，分别在初次取样的区域取样检测总菌落数和大肠杆菌数，具体结果如下表7所示：
表7 枯草芽孢杆菌对畜禽养殖环境中大肠杆菌的抑制作用
基于以上试验结果可知，本发明的BS-22株枯草芽孢杆菌能够有效抑制养殖环境中的大肠杆菌的增殖，其对于采食区的抑制率高达89.02%，对于休息区的抑制率高达80%，对于粪便处理区的抑制率高达76.62%，高于C-1株的抑制率，且也高于现有技术（CN111826323A）中报道的抑制率。由此可以表明，本发明所得到的枯草芽孢杆菌BS-22株能够抑制养殖环境中大肠杆菌的增殖，能够避免大肠杆菌导致的腹泻等健康危害，同时有利于改善养殖环境。
实施例6. 枯草芽孢杆菌BS-22株在猪圈除臭中的应用
在黑龙江地区猪场选择3栋猪舍为测试对象，三栋猪舍面积和空间相同，猪舍内各养殖有800头体重接近的育肥猪，饲喂的日粮均相同，管理方式（饮水、清洗）等也均相同。其中猪舍1为BS-22株试验组（以活菌数为1×109CFU/mL的枯草芽孢杆菌BS-22株菌液1L，溶解于99L清水中，得到1×107CFU/mL喷雾剂，对猪舍进行均匀喷雾），猪舍2为C-1株对照组（以活菌数为1×109CFU/mL的枯草芽孢杆菌C-1株菌液1L，溶解于99L清水中，得到1×107CFU/mL喷雾剂，对猪舍进行均匀喷雾），猪舍3为空白组（按照日常方式进行清洗和打扫，采用100L清水进行喷雾处理），每天早餐喷雾一次。5天后采用氨气、硫化氢便携式检测仪器（吉顺安JK40-NH3、JK40-H2S）进行浓度检测，具体结果如下所示：
表8 枯草芽孢杆菌对于猪圈中氨气和硫化氢的影响
基于以上检测可知，本发明BS-22株试验组的氨气去除率达到65.31%，高于C-1株的37.89%；硫化氢去除率高达84.21%，远高于C-1株的39.74%。由于本发明的BS-22株具有很高的蛋白降解活性，能快速分解粪便中的蛋白质成分，减少有害菌株将其分解为氨气和硫化氢，从而避免了养殖环境中氨气浓度的上升，改善了养殖环境中的臭味情况，有利于养殖动物的健康成长。
实施例7：枯草芽孢杆菌BS-22株在降解猪场废水COD中的应用
在黑龙江地区养殖场，取养猪场废水池中的水3t，经搅拌均匀后，测定初始COD值，而后均匀分为3份，分别置于容器内进行试验，其中第一份为试验组，在废水中加入枯草芽孢杆菌BS-22的菌粉，使得其中的活菌数达到1×107cfu/L，25℃，200rpm条件下发酵处理；第二组采用市售的COD降解菌剂（本集团旗下分公司提供，由于商业原因而不便公开），工作浓度为活菌数达到1×108cfu/L，25℃，200rpm条件下发酵处理；第三组为对照组，不额外添加菌剂，在25℃，200rpm条件下发酵处理，分别在发酵的第2、4、6、8和10天采样测定水中的COD值，具体结果如图1所示。
基于图1的结果可知，本发明的枯草芽孢杆菌BS-22株具有较强的降解猪粪废水COD的能力，第4天时，其降解率即达到了75.2%，高于市售的COD降解菌剂；且在第10天时，其降解率高达92.5%，也高于市售COD降解剂的90%。由此可见，本发明的枯草芽孢杆菌BS-22株具有较强的降解猪粪废水COD的能力，且其能在4天左右降解75%左右的COD值，只需要采用单菌即可实现，不仅工艺简单，而且效率相对更高。
实施例8：枯草芽孢杆菌BS-22株在改善水产养殖环境中的应用
在福建大北农的水产养殖基地，选择10m3水体的鳜鱼鱼苗育苗池，设置对照组和试验组，其中对照组不添加任何菌剂和药品，试验组采用本发明的枯草芽孢杆菌BS-22菌剂，具体将菌剂稀释成1×109CFU/mL的枯草芽孢杆菌BS-22株菌液，每3天泼洒一次该菌剂，使得菌体最终浓度约为104CFU/mL，每组分别在增压机漩涡表面处、水深30cm处取样，每个样品取3个重复，待试验进行到第18天，即泼洒6次后水体中的COD水平。结果表明，对照组的COD水平基本较为稳定，第18天的COD/第0天的COD的比例约为1.05，鱼苗的死淘率约为4.71%；而试验组的比值约为0.57%，死淘率约为1.44%，即该实验过程中，枯草芽孢杆菌BS-22株菌液有效降低了鳜鱼鱼苗养殖水体中的COD值，提高了鱼苗的存活率。
Claims (5)
1. 一株枯草芽孢杆菌BS-22株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BS-22株于2023年05月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保存，命名为BS-22株，分类命名为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为：CGMCC No：27370，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BS-22株的菌粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，枯草芽孢杆菌BS-22株的发酵：
（1）发酵培养基的配制：玉米面0.5％，黄豆饼粉1％，蔗糖0.4％，鱼粉0.6％，KH2PO40.1％，FeSO4.7H2O 0.025％，MgSO4.7H2O 0.05％，MnSO4 0.024％，CaCO3 0.1％，消泡剂0.05％，pH为7.2；
（2）发酵罐培养：121℃灭菌30min，降温至37℃，向其中接入菌龄为12h的枯草芽孢杆菌BS-22株的种子液，接种量为1%，发酵期间保持转速220rpm，通气量1:0.3vvm，罐压0.05MPa，培养至24h为发酵终点，检测枯草芽孢杆菌BS-22株的活菌数≥1.0×1011CFU/mL；
步骤二，喷雾干燥制备菌粉：在枯草芽孢杆菌BS-22株发酵菌液中加入10％w/v的玉米淀粉作为保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度160℃，出风口温度85℃，进料速度3L/h，收集得到枯草芽孢杆菌干粉制剂，经检测，菌粉中枯草芽孢杆菌BS-22株的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
3.一种枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉，其特征在于，所述菌粉采用权利要求2的方法制备得到。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉在畜禽养殖环境除臭中的应用，其特征在于，使用方式为将枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉溶解于水中，对养殖环境进行喷雾处理。
5.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉在降解猪场废水COD中的应用，其特征在于，使用方式为在废水中加入枯草芽孢杆菌BS-22的菌粉，使得其中的活菌数达到1×107cfu/L，发酵处理从而有效降低猪场废水COD水平。
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| GR01 | Patent grant | ||
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