CN106380001A - 用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法 - Google Patents

用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，步骤为：(1)将保藏编号为CGMCC No.1.767的粪产碱杆菌培养得一级种子；将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌培养得一级种子；(2)将磺胺类化合物生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液；(3)取粪产碱杆菌的一级种子和血红密孔菌的一级种子，离心，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，发酵。本发明的方法，使用粪产碱杆菌和血红密孔菌，不需要中介物质的参与，处理成本低，环保。建立了细菌和真菌的混菌系统，实现了污水中磺胺类化合物90‑95％的降解效率，明显高于在同样的培养条件下两个单菌各自的降解率。

Description

用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法
技术领域
本发明属于环境污染治理领域，涉及一种用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法。
背景技术
以磺胺类化合物(SMX)为代表的磺胺类抗菌药物，不仅用于临床，而且大量应用于水产养殖和畜牧业。磺胺类药物通常以未转化过的形态被排放到地表水中，然而在污水处理厂，它们并不能够被有效的去除。在水体环境中的富集，导致了抗性基因的产生和传播，这种现象已经威胁到了公共健康。因此，磺胺类药物的有效降解已经引起了广泛关注。常见的非生物降解技术包括臭氧化，光解作用和光催化作用等。然而，这些技术往往都有更高的技术要求，同时也很昂贵。与之相比，生物降解技术有更高的实用价值。
最近还有一些研究使用能够产生胞外氧化酶如漆酶的真菌进行SMX的降解。真菌Pycnoporus sanguineus生产具有降解磺胺类化合物能力的漆酶，但是漆酶降解磺胺类药物中通常需要中介物质的参与，如2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)(ABTS)或者1-hydroxybenzotriazole(HBT)。然而，这些化学合成的中介物质比较昂贵，而且会对环境造成新的并且很难处理污染。Alcaligenes faecalis虽然在短期内可降解磺胺类化合物，但是降解率只有60-80％，而且后期磺胺类会出现回升。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法。
本发明的技术方案概述如下：
用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC No.1.767的粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)在种子培养基中培养，得到粪产碱杆菌的一级种子；
将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在25-30℃培养6-8天；再转入马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在25-30℃，在搅拌下，培养45-50小时，得到血红密孔菌一级种子；
(2)降解液配制：将磺胺类化合物生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中磺胺类化合物的浓度在10-50mg/L；
(3)按比例，取OD600nm＝3-4的粪产碱杆菌的一级种子30-50mL和步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子40-50mL，分别在4000-8000rpm离心8-12min，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，使总体积为500mL，在25-30℃，100-150rpm，发酵24h。
马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L，自然pH，余量是水。
马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，余量是水。
发酵培养基为：1.0g·L-1乙酸钠，1.0g·L-1葡萄糖，0.010g·L-1FeSO4·7H2O，0.25g·L-1MgSO4·7H2O，0.5g·L-1(NH4)2SO4，0.018g·L-1Na2EDTA·2H2O，0.013g·L- 1CaCl2·2H2O，7.5g·L-1Na2HPO4·12H2O，5g·L-1KH2PO4，余量是水。
磺胺类化合物为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺二甲基嘧啶或磺胺二甲氧嘧啶。
本发明的优点：
本发明的方法，使用粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)和血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)，不需要中介物质的参与，因此，处理成本低，不会对环境造成新的污染。
本发明的方法建立了细菌Alcaligenes faecalis和真菌Pycnoporus sanguineus的混菌系统，实现了污水中SMX90-95％的降解效率，这明显高于在同样的培养条件下两个单菌各自的降解率。
附图说明
图1为在发酵培养基条件下A.faecalis和P.sanguineus单菌和混菌系统分别对SMX降解的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明：
各实施例中：
马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L，自然pH，余量是水。
马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，余量是水。
发酵培养基为：1.0g·L-1乙酸钠，1.0g·L-1葡萄糖，0.010g·L-1FeSO4·7H2O，0.25g·L-1MgSO4·7H2O，0.5g·L-1(NH4)2SO4，0.018g·L-1Na2EDTA·2H2O，0.013g·L- 1CaCl2·2H2O，7.5g·L-1Na2HPO4·12H2O，5g·L-1KH2PO4，余量是水。
实施例1
用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC No.1.767的粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)在50mL Luria-Bertani种子培养基中，在35℃，200rpm条件下培养，得到OD600nm＝3的粪产碱杆菌的一级种子；
将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中在28℃培养7天；(取110cm2面积的菌丝)转入100mL马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在28℃，120rpm条件下培养48小时，得到血红密孔菌一级种子；
(2)降解液配制：将磺胺甲恶唑生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中磺胺甲恶唑的浓度在50mg/L；
(3)按比例，取OD600nm＝3的粪产碱杆菌的一级种子40mL和步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子45mL，分别在6000rpm离心10min，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，使总体积为500mL，在28℃，130rpm，发酵24h。
SMX降解率见图1。
对比例1
用粪产碱杆菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC No.1.767的粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)在50mL Luria-Bertani种子培养基中，在35℃，200rpm条件下培养，得到OD600nm＝3的粪产碱杆菌的一级种子；
(2)降解液配制：将磺胺甲恶唑生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中磺胺类化合物的浓度在50mg/L；
(3)按比例，取OD600nm＝3的粪产碱杆菌的一级种子85mL，在6000rpm离心10min，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，使总体积为500mL，在28℃，130rpm，发酵24h。
SMX降解率见图1。
对比例2
用血红密孔菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中在28℃培养7天；(取110cm2面积的菌丝)再转入100mL马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在28℃，120rpm条件下培养48小时，得到血红密孔菌一级种子；
(2)降解液配制：将磺胺甲恶唑生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中磺胺类化合物的浓度在50mg/L；
(3)取步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子85mL，在6000rpm离心10min，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，使总体积为500mL，在28℃，130rpm，发酵24h。
SMX降解率见图1。
实施例2
用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC No.1.767的粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)在50mL Luria-Bertani种子培养基中，在35℃，200rpm条件下培养，得到OD600nm＝4的粪产碱杆菌的一级种子；
将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中在25℃培养8天；(取120cm2面积的菌丝)再转入100mL马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在25℃，120rpm条件下培养50小时，得到血红密孔菌一级种子；
(2)降解液配制：将磺胺嘧啶生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中磺胺嘧啶的浓度在10mg/L；
(3)按比例，取OD600nm＝4的粪产碱杆菌的一级种子30mL和步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子40mL，分别在4000rpm离心12min，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，使总体积为500mL，在25℃，100rpm，发酵24h。
磺胺嘧啶降解率为93％
实施例3
用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC No.1.767的粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)在50mL Luria-Bertani种子培养基中，在35℃，200rpm条件下培养，得到OD600nm＝3的粪产碱杆菌的一级种子；
将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中在30℃培养6天；(取100cm2面积的菌丝)再转入100mL马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在30℃，120rpm条件下培养45小时，得到血红密孔菌一级种子；
(2)降解液配制：将磺胺异恶唑生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中磺胺异恶唑的浓度在30mg/L；
(3)按比例，取OD600nm＝3的粪产碱杆菌的一级种子50mL和步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子50mL，分别在8000rpm离心8min，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，使总体积为500mL，在30℃，150rpm，发酵24h。
磺胺异恶唑降解率为90％
实验证明，用磺胺二甲基嘧啶或磺胺二甲氧嘧啶替代本实施例的磺胺异恶唑，其它同本实施例，其降解率依次为91.2％和90.7％。
高效液相色谱所用色谱柱为C18色谱柱，所用仪器为Waters e2695Alliance HPLC和2489UV/Visible检测器，检测波长为265nm。检测条件为：色谱柱温度30℃，进样体积10μL，流速1mL·min-1。流动相组成：40％乙腈and 60％0.1％甲酸溶液。保留时间为5min左右。

Claims (5)

1.用混菌降解水体环境中的磺胺类化合物的方法，其特征包括如下步骤：
(1)种子培养：将保藏编号为CGMCC No.1.767的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)在种子培养基中培养，得到粪产碱杆菌的一级种子；
将保藏编号为CGMCC 5.815的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中，在25-30℃培养6-8天；再转入马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中在25-30℃，在搅拌下，培养45-50小时，得到血红密孔菌一级种子；
(2)降解液配制：将磺胺类化合物生产排放废水与发酵培养基混合配成降解液，使降解液中磺胺类化合物的浓度在10-50mg/L；
(3)按比例，取OD600nm＝3-4的粪产碱杆菌的一级种子30-50mL和步骤(1)获得的血红密孔菌的一级种子40-50mL，分别在4000-8000rpm离心8-12min，弃上清，用降解液将菌体重悬后，都放入降解液中，使总体积为500mL，在25-30℃，100-150rpm，发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L，自然pH，余量是水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，余量是水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵培养基为：1.0g·L-1乙酸钠，1.0g·L-1葡萄糖，0.010g·L-1FeSO4·7H2O，0.25g·L-1MgSO4·7H2O，0.5g·L-1(NH4)2SO4，0.018g·L-1Na2EDTA·2H2O，0.013g·L-1CaCl2·2H2O，7.5g·L-1Na2HPO4·12H2O，5g·L-1KH2PO4，余量是水。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述磺胺类化合物为磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺二甲基嘧啶或磺胺二甲氧嘧啶。
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