CN108823115B - 一种磺胺类抗生素降解产碱菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环保领域，公开了一种磺胺类抗生素降解产碱菌及其应用，该磺胺类抗生素降解产碱菌的分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.。本发明中产碱菌在20‑30℃，pH 5‑8的环境中生长良好，能耐受磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺‑6‑甲氧嘧啶，能有效降解磺胺二甲氧嘧啶，可应用于磺胺类抗生素污染修复。
Description
技术领域
本发明涉及环保领域，尤其涉及一种磺胺类抗生素降解产碱菌及其应用。
背景技术
环境中抗生素残留普遍，土壤、污水污泥、地表水以及动植物食品中均有抗生素检出，对人体及生态环境造成危害。众多的研究表明，环境土壤中可检出的抗生素浓度已接近于土壤中其它农药类有机污染物的含量水平。如何有效去除环境中抗生素残留已成为当下亟待解决的重要环境问题。
生物降解是解决抗生素环境残留的有效手段，已引起国内外学者的广泛关注。目前，磺胺类抗生素降解菌均有报道。磺胺类抗生素降解菌有类地杆菌、假单胞菌、气单胞菌等。但目前还未见产碱菌降解磺胺类抗生素的报道。总体上看，筛选获得的抗生素降解菌株还较为有限。
由上可知，为了满足日益扩大的抗生素污染的微生物修复需求，能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种，为混合菌剂配制提供更多菌种资源，筛选更多不同菌属以及针对不同抗生素的降解菌，扩大抗生素降解微生物菌种库必不可少。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种磺胺类抗生素降解产碱菌及其应用，本发明中的产碱菌Alcaligenes sp.能降解磺胺二甲氧嘧啶，同时耐受磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶。
本发明的具体技术方案为：一种磺胺类抗生素降解产碱菌，分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.（产碱菌SMD-FA），已在2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 15053；产碱菌Alcaligenes sp.为磺胺类抗生素降解菌，能降解磺胺二甲氧嘧啶，同时耐受磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶。
在本发明中，产碱菌SMD-FA在20-30℃，pH 5-8的环境中生长良好，能耐受磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶，能有效降解磺胺二甲氧嘧啶，6天最高降解率56%。
在现有技术中，并未见产碱菌降解磺胺类抗生素的报道。与现有技术相比，本发明公开的菌株的分类种属、降解底物类型以及抗生素降解效率均不同，为抗生素污染修复提供了重要的微生物菌种资源，为能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种提供可能。
进一步地，所述产碱菌Alcaligenes sp.从制药厂污水处理曝气池中的活性污泥中驯化、筛选得到。
进一步地，所述产碱菌Alcaligenes sp.的驯化、筛选和鉴定方法，包括如下步骤：
1）取5g左右污泥分别加入含有目标抗生素（磺胺二甲氧嘧啶，50mg/L）的贫营养富集培养基和富营养富集培养基中, 放入恒温摇床中（30℃，150-180 rpm）避光培养一周。
2）上一阶段的培养物静置后，取上清5mL，转接到相同的抗性富集培养基中，培养7天后，测定抗生素的残留浓度。共富集3个周期。
3）对比贫营养富集培养物和富营养富集培养物中的抗生素残留浓度，选择抗生素降解率较高的富集培养物，静置5-10min后，取0.2mL培养物涂布于含有目标抗生素（100mg/L）的LB平板上，培养箱中30℃恒温培养48h。
4）挑取单个菌落接种于抗性筛选试管（含有目标抗生素，100mg/L）中，恒温摇床中(30℃，150r/min)培养5天后，高效液相色谱法测抗生素浓度，选择降解率较高的抗性筛选试管，反复进行划线分离纯化，结合抗性筛选试管培养和抗生素浓度测定，获得具有抗生素降解能力的纯菌。结合抗生素测定结果发现，贫营养富集液的磺胺二甲氧嘧啶降解率高于富营养富集液，因此贫营养富集培养基更适合用于分离筛选磺胺类抗生素降解菌。
5）菌株的形态学和分子生物学鉴定：SMD-FA菌株在LB 培养基上生长时，菌落都呈圆形，小，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色、透明的圆形凸起；显微镜下可见，杆状或短杆状，革兰氏阳性菌；16sr DNA序列与水生产碱菌的同源性达到99％以上，亲缘关系最近。
进一步地，所述的贫营养富集培养基的配方为：MgSO4•7H2O 0.25 g/L、Na2HPO4•12H2O 15.13g/L、KH2PO4 3.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.50g/L、CaCl2•2H2O 0.026g/L、0.1%酵母膏、微量元素液10ml/L。
所述微量元素液的配方为：氮三乙酸1.5g/L， MnSO4•2H2O 0.5g/L，FeSO¬4•7H2O0.1 g/L，CaCl2•2H2O 0.1g/L，CuSO4•5H2O 0.01g/L，H3BO3 0.01g/L，MgSO4•7H2O 3.0 g/L，NaCl 1.0g/L，CaSO40.1g/L，ZnSO4 0.1g/L，AlK(SO4)2 0.01g/L，NaMoO4•2H2O 0.01g/L。
所述的富营养富集培养基的制备方法为：25g LB肉汤，加1L水溶解，pH 7.0-7.2，121度灭菌20min。
进一步地，所述的抗性筛选试管的制备方法为：在玻璃试管中添加5mL的无菌LB培养基和100mg/L的目标抗生素，目标抗生素为磺胺二甲氧嘧啶。
上述的磺胺类抗生素降解产碱菌在抗生素残留废弃物和抗生素残留环境中的应用。
进一步地，所述抗生素残留废弃物包括畜禽粪便、污泥和抗生素菌渣等；所述抗生素残留环境包括抗生素污染的水体、土壤。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
目前未见产碱菌降解磺胺类抗生素的报道。本发明公开的产碱菌SMD-FA能耐受多种磺胺类抗生素，可高效降解磺胺二甲氧嘧啶。与现有报道相比，本发明公开的菌株的分类种属、降解底物类型以及抗生素降解效率均不同，为抗生素污染修复提供了重要的微生物菌种资源，为能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种提供可能。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例：
一、产碱菌Alcaligenes sp.的驯化、筛选和鉴定方法，包括如下步骤：
1）取5g左右污泥分别加入含有目标抗生素（磺胺二甲氧嘧啶，50mg/L）的贫营养富集培养基和富营养富集培养基中, 放入恒温摇床中（30℃，150-180 rpm）避光培养一周。
2）上一阶段的培养物静置后，取上清5mL，转接到相同的抗性富集培养基中，培养7天后，测定抗生素的残留浓度。共富集3个周期。
3）对比贫营养富集培养物和富营养富集培养物中的抗生素残留浓度，选择抗生素降解率较高的富集培养物，静置5-10min后，取0.2mL培养物涂布于含有目标抗生素（100mg/L）的LB平板上，培养箱中30℃恒温培养48h。
4）挑取单个菌落接种于抗性筛选试管（含有目标抗生素，100mg/L）中，恒温摇床中(30℃，150r/min)培养5天后，高效液相色谱法测抗生素浓度，选择降解率较高的抗性筛选试管，反复进行划线分离纯化，结合抗性筛选试管培养和抗生素浓度测定，获得具有抗生素降解能力的纯菌。结合抗生素测定结果发现，贫营养富集液的磺胺二甲氧嘧啶降解率高于富营养富集液，因此贫营养富集培养基更适合用于分离筛选磺胺类抗生素降解菌。
5）菌株的形态学和分子生物学鉴定：SMD-FA菌株在LB 培养基上生长时，菌落都呈圆形，小，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，菌落为乳白色、透明的圆形凸起；显微镜下可见，杆状或短杆状，革兰氏阳性菌；16sr DNA序列与水生产碱菌的同源性达到99％以上，亲缘关系最近。
其中，所述的贫营养富集培养基的配方为：MgSO4•7H2O 0.25 g/L、Na2HPO4•12H2O15.13g/L、KH2PO4 3.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.50g/L、CaCl2•2H2O 0.026g/L、微量元素液10ml/L。所述微量元素液的配方为：氮三乙酸1.5g/L， MnSO4•2H2O 0.5g/L，FeSO¬4•7H2O0.1 g/L，CaCl2•2H2O 0.1g/L，CuSO4•5H2O 0.01g/L，H3BO3 0.01g/L，MgSO4•7H2O 3.0 g/L，NaCl 1.0g/L，CaSO40.1g/L，ZnSO4 0.1g/L，AlK(SO4)2 0.01g/L，NaMoO4•2H2O 0.01g/L。
所述的富营养富集培养基的制备方法为为：25g LB肉汤，加1L水溶解，pH 7.0-7.2，121度灭菌20min。
所述抗性筛选试管的制备方法为：在玻璃试管中添加5mL的无菌LB培养基和100mg/L的目标抗生素，目标抗生素为磺胺二甲氧嘧啶。
二、磺胺类抗生素降解菌株SMD-FA的降解特性研究
挑取SMD-FA菌株的单菌落接种到5mL的LB培养基中，30℃，180rpm，培养24-36小时，获得种子液；将种子液转接到含有100mg/L目标抗生素的降解培养基（无机盐培养基）中，培养一段时间后，离心去除菌体，取上清，HPLC测定抗生素浓度。
1、SMD-FA菌株对不同磺胺类抗生素的耐受和降解试验
配制100mg/L的不同磺胺类抗生素的无机盐培养基（0.1%酵母膏）为降解培养基：磺胺二甲氧嘧啶；磺胺二甲嘧啶；磺胺嘧啶；磺胺-6-甲氧嘧啶。按照1%的接种量，将SMD-FA菌株的种子液分别接种到降解培养基，180rpm，30℃。结果可知，（1）SMD-FA菌株可耐受磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶，OD600分别为0.33、0.80、0.94和0.16；（2）SMD-FA菌株能有效降解磺胺二甲氧嘧啶，以不接菌对照为参比，抗生素6天降解率为48.1%。
2、pH的影响试验
配制不同pH梯度的降解培养基：将含有100mg/L磺胺二甲氧嘧啶的无机盐培养基（0.1%酵母膏）的pH值调为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0。180rpm，30℃，避光培养6天。结果表明：（1） 菌株SMD-FA在初始pH为9.0的培养条件下不能生长，在pH 5.0-8.0生长良好。（2）在1%接种量下，以不接菌的对照为参比，pH 5.0、6.0、7.0和8.0时，SMD-FA菌株6天的磺胺二甲氧嘧啶降解率分别为25.7%、38.8%、56.6%和35.7%。
3、温度的影响试验
采用含有100mg/L磺胺二甲氧嘧啶的无机盐培养基（0.1%酵母膏，pH 7.0）中培养菌株SMD-FA，在不同温度（20℃、30℃、40℃），180rpm下避光培养6天。结果可知，菌株SMD-FA在40℃下不能生长，在20-30℃之间生长良好，但1%接种量下，菌株SMD-FA在20℃和30℃下的磺胺二甲氧嘧啶的6天降解率分别为23.9%和56.6%。
4、初始抗生素浓度的影响试验
采用含有磺胺二甲氧嘧啶的无机盐培养基（0.1%酵母膏，pH7.0）中培养菌株SMD-FA，设置不同初始抗生素浓度处理（25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L），30℃，180rpm下避光培养6天。结果可知，菌株SMD-FA能耐受25-150mg/L的磺胺二甲氧嘧啶，6天降解率在28.1-53.6%。
三、磺胺类抗生素降解菌株SMD-FA在畜禽粪便有机肥中抗生素去除中的应用
（1）菌液制备
挑取SMD-FA单菌落，接种于灭菌的LB液体培养基（pH 7.0）中，30℃、180rpm振荡培养48小时，然后采用离心法浓缩1倍制成菌液。
（2）降解试验
按照5%和10%的接种量，将菌液与猪粪混合，置于恒温培养箱中30℃静置避光培养10天，培养结束后采集样品，测定抗生素含量。
试验结果：在畜禽粪便中接种SMD-FA可有效促进磺胺类抗生素降解，与不接菌对照相比，5%接菌处理组磺胺噻唑和磺胺二甲嘧啶残留浓度降低17%和52%，10%接菌处理组磺胺噻唑和磺胺二甲嘧啶残留浓度降低4%和45%。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (3)
1.一种磺胺类抗生素降解产碱菌，其特征在于：分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.，已在2017年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 15053；产碱菌Alcaligenes sp.为磺胺类抗生素降解菌，能降解磺胺二甲氧嘧啶，同时耐受磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶。
2.由权利要求1所述的磺胺类抗生素降解产碱菌在抗生素残留废弃物和抗生素残留环境中的应用。
3.如权利要求2所述的磺胺类抗生素降解产碱菌在抗生素残留废弃物和抗生素残留环境中的应用，其特征在于，所述抗生素残留废弃物包括畜禽粪便、污泥和抗生素菌渣；所述抗生素残留环境包括抗生素污染的水体、土壤。
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