CN102747010A

CN102747010A - 一株丙烯菊酯降解菌及其土壤修复应用

Info

Publication number: CN102747010A
Application number: CN2012101418862A
Authority: CN
Inventors: 虞方伯; 单胜道; 管莉菠; 戴朝卿
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: CN102747010B

Abstract

本发明公开了一株丙烯菊酯降解菌及其土壤修复应用。本发明所提供的丙烯菊酯降解菌是产碱菌属（Alcaligenessp.）的菌株A-6，该菌可在好氧条件下，48小时内实现对6g/L丙烯菊酯的完全降解；菌株A-6对氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素呈不同程度敏感反应，对13种供试重金属呈现耐受性；具备在实际土壤环境下高效降解丙烯菊酯的能力，能够显著缩短丙烯菊酯降解时长，具备实际应用意义和价值。

Description

一株丙烯菊酯降解菌及其土壤修复应用

技术领域

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解丙烯菊酯的细菌及其在土壤污染修复中的应用。

背景技术

农药作为重要的农业生产资料，在保护农业生产、提高农业综合生产能力、促进粮食稳定增产和农民持续增收等方面发挥着极其重要的作用。中国既是农药生产大国，也是使用大国，年使用量和平均用量均位居世界第一。然而，农药的利用率却不足20%，其余部分全部进入土壤、水体和大气，形成了严重的污染和危害。统计数据显示，中国受农药残留污染的农田面积约为1500万公顷，占可耕面积的10%，近半数作物农药残留超标，每年因农残超标问题蒙受出口损失逾80亿美元。

拟除虫菊酯农药是一类人工合成的模拟天然除虫菊素的杀虫剂，其以神经钠离子通道为作用靶标，具有用量低、药效高、杀虫谱广等优点，广泛用于防治农业及家庭卫生害虫。目前，拟除虫菊酯农药品种数和使用量仅次于有机磷农药，位居杀虫剂市场的第二位，约占世界农药市场的四分之一。第二代以后的拟除虫菊酯农药具有对光和热稳定的特点，在环境中的半衰期较长，很难在自然条件下快速降解。拟除虫菌酯农药的大量使用带来了一系列环境和食品安全问题，如对部分有益昆虫的毒害，对鱼、蚌和沼虾等水生生物的高急性毒性。此外，某些拟除虫菊酯农药还具有神经毒性、生物富集毒性和生殖毒性，有致癌、致畸和致突变的“三致”危害。当前，如何有效清除环境中的拟除虫菊酯农药残留物成为了亟待解决的重大社会问题。

丙烯菊酯（Allethrin），又名烯丙菊酯，化学名称右旋-顺,反式-2,2-二甲基-3-（2-甲基-1-丙烯基）环丙烷羧酸-（R,S）-2-甲基-3-烯丙基-4-氧代-环戊-2-烯基酯。广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木和卫生害虫，用量较大；可扰乱钠离子通道，是皮肤和呼吸系统的过敏原；对ATP酶有明显抑制作用，具有抗雌激素活性，是一种环境激素；性质稳定，不易发生降解；对水生生物毒性较强，如研究显示其对虹鳟鱼和水蚤的LC₅₀值分别为19μg/L和40mg/L。此外，越来越多的研究显示，丙烯菊酯在环境中会对其它鱼类、鸟类和老鼠等动物的内分泌系统产生干扰。

近年来，随着人们对生物修复理论研究的不断深入,微生物环境修复技术以高效、廉价、安全和简便等特点，日益成为农药残留等多种有机污染物环境修复的核心技术。目前，已报道的拟除虫菊酯农药降解菌有芽孢杆菌、施氏假单胞菌、产碱杆菌、黑曲霉、酸单胞菌、克雷白色杆菌、鞘氨醇杆菌、微球菌和苍白杆菌，等等。然而，能够高效降解丙烯菊酯的菌株却极为有限。Paingankar等人报道过一株具备丙烯菊酯降解能力的酸单胞菌属（Acidomonassp.）菌株，该菌株能够在72小时降解70%左右的供试丙烯菊酯（初始浓度为5g/L）（Paingankar M.，Jain M.，Deobagkar D.Biodegradation of allethrin，a pyrethroid insecticide，by an Acidomonas sp.Biotechnology Letters，2005，27：1909-1913）。李玉清通过富集驯化培养，获得了降解丙烯菊酯的混合微生物（李玉清.丙烯菊酯农药的微生物修复作用研究.襄樊学院学报，2008，29：27-29，44）。在初始丙烯菊酯浓度为50mg/L条件下，在培养液中添加1g/L葡萄糖，72小时降解率可达76%；而以丙烯菊酯为唯一碳源、氮源和能源时，72小时丙烯菊酯降解率仅为55%。此外，上述降解菌的抗生素抗性和重金属耐受性尚未探明，也没有进行过实际应用测试，存在环境施用风险。

综上所述，筛选更为高效、对常用抗生素敏感且能够耐受多种重金属，并在实际土壤环境下具备丙烯菊酯降解能力的降解菌株成为了相关领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有丙烯菊酯微生物降解中存在的问题或不足，提供一种高效丙烯菊酯降解菌。

本发明的另一个目的是提供上述菌种在修复丙烯菊酯污染土壤中的应用。

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：

一株丙烯菊酯降解菌，该菌是产碱菌属（Alcaligenes sp.）的菌株A-6，于2012年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.6011，该菌具有降解丙烯菊酯的能力。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.。

一种所述丙烯菊酯降解菌在受丙烯菊酯污染土壤修复中的应用。

作为优选，将所述菌株CGMCC No.6011接种至含丙烯菊酯1-6g/L的基础无机盐液体培养基中，150r/min震荡培养48h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为（g/L）：MgCl₂ 0.2，NH₄NO₃ 1，KH₂PO₄ 2，K₂HPO₄ 7.5，NaCl 1，去离子水1L。

作为优选，所述的液体培养温度为25-30℃，基础无机盐液体培养基的pH为6.0-7.4。更为优选的方案是，所述的液体培养温度为30℃，基础无机盐液体培养基的pH为7.4。

作为优选，将所述菌株CGMCC No.6011接种至发酵培养基中30℃恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受丙烯菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为（g/L）：玉米粉10，豆粕粉8，(NH₄)₂SO₄ 6，玉米浆6，MgSO₄·7H₂O 1，K₂HPO₄·3H₂O 2，MnSO₄ 0.05，pH 7.4。

本发明所提供的丙烯菊酯降解菌Alcaligenes sp.A-6源自浙江省临安市污水处理厂活性污泥池的活性污泥，经人工富集培养、压力筛选和分离纯化得到。该菌属产碱菌属，其生物学特征在于：接触酶阳性，氧化酶阳性，V.P.试验阴性，吲哚试验阴性，专性好氧，菌体形态为短杆状，菌落呈乳黄色、圆形、边缘齐整、光滑湿润，具体参见表1。菌株于2012年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.6011。

表1、Alcaligenes sp.A-6的生理生化特征

注：“+”表示生长或阳性反应；“-”表示不生长或阴性反应。

该菌的最适生长条件为：pH 7.4，温度为30℃。以五分之一LB（Luria-Bertani）或工业发酵培养基（玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米浆6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L，pH 7.4）培养24小时后，菌液菌体浓度可达5×10⁹CFU/mL（CFU，菌落形成单位）。

该菌对氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素呈不同程度敏感反应，上述抗生素均为常用抗生素。可以认为：当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗（耐）药性问题而产生超级细菌。

该菌对13种测试金属离子（Li⁺、Ag⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺和Co⁴⁺）呈现不同程度的耐受性。鉴于我国土壤污染现状——持久性有机污染物污染和重金属污染并存，农残降解菌株具备重金属耐受性能十分重要。可以认为：一般土壤环境条件下，该菌株菌体施用修复效果受重金属抑制影响较小。

该菌株在摇瓶降解试验中（容积为250mL的三角瓶，装有100mL液体无机盐培养基，丙烯菊酯为唯一碳源，初始浓度6g/L，摇床转速150r/min，温度30℃），能在48小时内完全降解供试丙烯菊酯。在供试茶园土壤丙烯菊酯含量为50mg/kg情况下，施用该菌7天可使土样中92.7%的丙烯菊酯发生降解，显著提升丙烯菊酯降解速率、缩短降解时长，具备实际应用意义和价值。

综上所述，本发明和现有技术相比具有如下优点：与现有技术相比，本发明的Alcaligenes sp.A-6菌株可在好氧条件下以丙烯菊酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，同时将其快速、完全降解。在纯培养条件下，它能将浓度为6g/L的丙烯菊酯在48小时内降解完全。与已有降解菌株相比，Alcaligenes sp.A-6丙烯菊酯降解率最高，降解速率最快。此外，Alcaligenes sp.A-6对常用抗生素敏感，对13种重金属呈现耐受性，且具备在实际土壤环境条件下发挥丙烯菊酯降解作用的能力，该菌株有望在丙烯菊酯污染土壤的生物环境修复中发挥重要作用。

附图说明

图1是本发明菌株A-6的丙烯菊酯降解能力测试结果图；

图2是本发明菌株A-6土壤环境中的丙烯菊酯降解结果图，其中□：灭活土样中丙烯菊酯含量；■：喷施A-6菌体灭活土样中丙烯菊酯含量；△：新鲜土样中丙烯菊酯含量；▲：喷施A-6菌体新鲜土样中丙烯菊酯含量。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。

实施例1：Alcaligenes sp.A-6的分离与丙烯菊酯降解能力

现场采集浙江省临安市污水处理厂活性污泥池中的活性污泥，用500mL三角瓶盛装，并迅速带回实验室。将取回的样品置于丙烯菊酯选择性基础无机盐液体培养基中驯化培养。培养基成份为（g/L）：MgCl₂ 0.2，NH₄NO₃ 1，KH₂PO₄ 2，K₂HPO₄ 7.5，NaCl 1，丙烯菊酯1（预溶于丙酮），pH 7.2，去离子水1L，121℃湿热灭菌25分钟后备用。培养条件为：25℃，120r/min振荡培养，容器装液量为容器容积的1/3。此后，每隔一周将摇瓶静止片刻，弃上清液，随后补入等量的新鲜配置的选择性液体培养基并继续振荡富集培养。三周后，将上述培养物均匀涂布于固体选择性基础无机盐培养基（每升液体培养基中再加入20克的琼脂）上。将涂布好的平板倒置放入培养箱，28℃培养72小时。用无菌牙签挑选单菌落或用接种针划线直至出现单菌落再行转接至新鲜配置的固体选择性平板上，并通过气相色谱法逐一验证各菌株的丙烯菊酯降解能力，结果得到一株丙烯菊酯降解菌A-6。

将菌株A-6接入以6g/L丙烯菊酯为唯一碳源的选择性基础无机盐培养基中，以OD₆₀₀值为0.05的接种量接入A-6，30℃，150r/min振荡培养。随后，每隔12小时对培养液中丙烯菊酯的残留情况进行测试，结果如图1所示。从中可看出菌株A-6可以丙烯菊酯为唯一碳源和能源进行生长，同时实现对丙烯菊酯的完全降解。

本实施例说明分离得到的Alcaligenes sp.A-6可利用丙烯菊酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并具备高效降解丙烯菊酯的能力。

实施例2：Alcaligenes sp.A-6的抗药性实验

采用滤纸片法，选择氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素进行测试，以各抗生素滤纸片在培养降解菌A-6平板上的抑菌圈直径大小作为敏感或者耐药的判定依据。结果如表2所明，菌株A-6对上述五种抗生素均呈敏感反应。

表2、Alcaligenes sp.A-6的抗生素敏感测验

注：抑菌圈的直径大于中度敏感范围上限值的为高度敏感，小于敏感范围下限值的为抗性。

本实施例说明当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗（耐）药性问题而产生超级细菌，为其今后的实际应用提供了安全保证。

实施例3：Alcaligenes sp.A-6的重金属最小抑制浓度（MIC）测试MIC试验设计参照Filali等人的研究进行（Filali B.K.，Taoufik J.，Zeroual Y.，Dzairi F.Z.，Talbi M.，Blaghen M.Waste water bacterial isolates resistant to heavy metals and antibiotics.Current Microbiology，2000，41：151-156），挑取等大、经活化处理的A-6单菌落于培养试管中，30℃，150r/min振荡培养36小时。依菌体长势判定MIC值，每组设3个重复，分别测试该菌对13种金属离子的耐受情况。结果如表3所示，该菌株具多重耐受性，耐受性强。

表3、菌株A-6的MIC测试

实施例4：Alcaligenes sp.A-6降解茶园土壤中丙烯菊酯的试验

将菌株T-6在发酵培养基中30℃恒温培养32小时后，得到菌体发酵液。发酵培养基的成份为：玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米浆6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L，pH 7.4。

在无菌水中加入一定量的丙烯菊酯（丙烯菊酯预溶于甲醇之中），在摇床上充分振荡混匀后，浸泡待试土壤（供试土壤为pH 6.0的红壤），使土壤颗粒能够均匀的吸附丙烯菊酯，丙烯菊酯含量为50mg/kg。喷施菌体发酵液，搅拌均匀，使土样中A-6菌体浓度约为8×10⁷个/g。土壤水分含量控制在65%左右，恒温25℃。同时，参照Li Wen等人研究（Li W.，Dai Y.，Xue B.B.，Li Y.Y.，Peng X.，Zhang J.S.，Yan Y.C.Biodegradation and detoxification of endosulfan in aqueous medium and soil by Achromobacter xylosoxidans strain CS5.Journal of Hazardous Materials，2009，167：209-216），设置对照。随后，每隔1天取5 g土样测算丙烯菊酯降解率。

结果如图2所示，7天供试土样中有92.7%的丙烯菊酯发生降解，喷施A-6能够显著提升丙烯菊酯降解速率、缩短降解时长，具备实际应用意义和价值。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1. 一株丙烯菊酯降解菌，该菌是产碱菌属（Alcaligenes sp.）的菌株A-6，于2012年4月13日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No. 6011，该菌具有降解丙烯菊酯的能力。

2.权利要求1所述丙烯菊酯降解菌在受丙烯菊酯污染土壤修复中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述菌株CGMCC No. 6011 接种至含丙烯菊酯1-6 g/L的基础无机盐液体培养基中，150 r/min震荡培养48h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为（g/L）：MgCl₂ 0.2，NH₄NO₃ 1，KH₂PO₄ 2，K₂HPO₄ 7.5，NaCl 1，去离子水1 L。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的液体培养温度为25-30℃，基础无机盐液体培养基的pH为6.0-7.4。

5.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的液体培养温度为30℃，基础无机盐液体培养基的pH为7.4。

6.权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述菌株CGMCC No. 6011 接种至发酵培养基中30℃恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受丙烯菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为（g/L）：玉米粉10，豆粕粉8 ，(NH₄)₂SO₄ 6 ，玉米浆6，MgSO₄·7H₂O 1，K₂HPO₄·3H₂O 2，MnSO₄ 0.05，pH 7.4。