CN1289689C - 生物防治马铃薯晚疫病的内生细菌菌株的选择方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物防治马铃薯晚疫病内生细菌菌株的选择方法，其特征在于：取马铃薯内生细菌纯菌株，测定抑菌带宽，筛选出防效较好的菌株，取其作盆栽试验和大田试验，测定其生物防治效果后，再测定马铃薯内生细菌的定殖力、马铃薯内生细菌菌株对病原菌的直接作用和马铃薯内生细菌对马铃薯的诱导抗病作用，选择优良的内生细菌。本发明筛选出的优良菌株可以直接对病原物的产生拮抗作用和诱导马铃薯产生抗病作用，生防菌的定殖好、受环境影响小，并且受到植物的保护，有稳定的生存环境，能与植物长期共生，缓减寄主植物的防卫反应，作用稳定持久。

Description

生物防治马铃薯晚疫病的内生细菌菌株的选择方法

技术领域

本发明涉及一种内生细菌与植物长期共生，可以缓减寄主植物的防卫反应作用的，用于马铃薯生物防治的内生细菌菌株的选择方法。

背景技术

植物病害的生防菌大部份是从土壤、根际或植物体表分离的，而在室内测定具有拮抗作用的细菌，在室外施用时大多不能在寄主体表或体内正常定殖，受环境条件变化和不同生态条件下植物根围微生物种群变化等因素的影响，致使它们的生防效果不稳定，有时甚至无效。

生产上主要以化学防治为主，不仅药剂难以长期持续有效，还严重污染环境。马铃薯是重要的农作物，施用农药后，不但影响品质，而且严重危害人体健康。

马铃薯晚疫病是马铃薯上重要的毁灭性病害，往往造成严重的经济损失。目前，马铃薯晚疫病的生物防治主要是利用从叶面、根围分离的真菌、细菌。但其所处的生态环境决定，受到来自外界的紫外线、暴风雨和化学物质等恶劣环境因素的影响。受环境影响较大，因而其定殖力差，往往在实验室中有一定的防治效果，而在大田生产实际中往往会出现防效不稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物防治马铃薯晚疫病内生细菌菌株的选择方法。它筛选出的优良菌株可以直接对病原物的产生拮抗作用和诱导马铃薯产生抗病作用，生防菌的定殖好、受环境影响小，并且受到植物的保护，有稳定的生存环境，能与植物长期共生，缓减寄主植物的防卫反应，作用稳定持久。

本发明的目的是这样实现的：取马铃薯内生细菌纯菌株，测定抑菌带宽，筛选出防效较好的菌株，取其作盆栽试验和大田试验，测定其生物防治效果后，再测定马铃薯内生细菌的定殖力、马铃薯内生细菌内生细菌菌株对病原菌的直接作用和马铃薯内生细菌对马铃薯的诱导抗病作用，选择优良的内生细菌。

菌株的定殖力测定是，对马铃薯苗施用防效较好的内生细菌菌株，利用抗生素标记法测定内生细菌在生育期不同部位根、茎、叶中的定殖密度。

测定防效较好的马铃薯内生细菌菌株对马铃薯的诱导抗病作用，有以下步骤：

A.在培养液中接种活化的菌株，培养，取清液过滤膜灭菌掖，马铃薯茎基部注射此液，注射培养液为对照，挑战接种马铃薯疫霉的孢子悬浮液，黑暗保湿处理，再保持光照，相对湿度为80-90％，调查病情；

B.不同生育期的马铃薯苗施用内生细菌的菌悬液，菌悬液为在平板上涂抹接种菌株，培养，调整浓度，对照施等量蒸馏水。以一定的时间间隔测定过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，计算出每克鲜重组织中的酶活性，分析马铃薯体内诱导相关酶活性的变化情况。

本发明的优点是：

1.微生态系统中的微生物用于生物防治，由于它本身是微生态系统中的组成成份，有利于本身的定殖，而且也减小了对病原物的选择压力，还可以与病原物协同进化。选择内生细菌的优良生防菌株，由于马铃薯内生细菌的定殖力好，防效高。

2.选择优良的生物防治菌株，植物内生细菌能分布于植株体内，生长繁殖相对稳定，因此稳定性好，是很好的生防菌资源，有些内生细菌还有促生作用。

3.利用有益微生物防治植物病害，持续有效，有利于保护环境。

4.由于植物内生细菌可以系统分布于植物组织内，有足够的碳源、氮源，具有良好的生存环境，克服以往从PGPR(根围促生细菌)中筛选生防菌的定殖差、受环境影响大的缺点，受到植物的保护，比暴露于如强烈的日光、紫外光、暴风雨等恶劣环境的附生细菌更有稳定的生存环境，能够与植物长期共生，可以缓减寄主植物的防卫反应作用，作用更稳定持久。

5.在马铃薯体内分离选择优良的生物防治菌株，符合微生态学原理，因此分离自马铃薯根茎部的内生菌有较好抑菌和防病效果。

6.植物微生态系统中除病原菌外还有能起生防作用的微生物存在，它们通过对病原微生物的抑制作用，对植物的诱导抗性作用来控制病害。马铃薯体内很可能分离到对马铃薯晚疫病控制效果较好的内生细菌，而且防效优良菌株会因为内生细菌的自身特点，生防效果更能稳定持久。

7.抑菌效果较好的菌株对马铃薯还有诱导抗病作用，接种抑菌效果较好的菌株后，马铃薯的过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性明显提高，菌株可以直接对病原物产生拮抗作用和诱导马铃薯产生抗病作用。过氧化物酶广泛存在于植物细胞的各个部分，可催化木质素如松柏醇的形成，以及细胞壁碳水化合物与蛋白质形成共价键，过氧化物酶参与木质素、酚类物质机植保素的合成，细胞壁结构与抗性有关，植物抗性强的植株过氧化物酶高原弱的植株；苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶，由于该途径的中间产物酚类物质和终产物木质素、黄酮、异类黄酮等物质与植物的防御病原微生物侵染有关，因此苯丙氨酸解氨酶是植物的防御酶。

8.对马铃薯内生细菌在马铃薯内不同部位、不同时间的定殖密度的测定，为内生细菌用于马铃薯病害生物防治提供了更强有力的依据。

9、通过实验发现，具有生物防治作用的内生细菌对马铃薯还有促生作用，把植物病害生物防治和植物促生作用紧密地联系起来了。

采用本方法选择的优良内生细菌用作生防菌，能持续控制晚疫病，提高生防效果，保护环境。将优良菌株的定殖能力、温室试验、大田防效、代谢产物、诱导抗病作用以及对植物促生作用有机地接合起来，为进一步应用于生产创造条件并打下坚实的基础。

本发明在温室试验中防效可达68.23％，比以前利用根、叶围细菌防治马铃薯晚疫病的效果好。大田试验中防效可达58.53％，促生效果达15.10％。

下面以选择马铃薯生物防治内生细菌菌株防治马铃薯晚疫病为例对本发明做进一步的说明。

具体实施方式

1.将待分离的健康马铃薯根、茎、叶洗净，晾干，用75％酒精浸2-5min，0.1％升汞浸1-2min，依次用灭菌水清洗4次，加灭菌水少量研磨，静置10-15min，用曲玻棒醮取菌悬液涂于平板上，连续涂两个平板。同时用最后一次清洗分离材料的灭菌水涂平板，若以后此平板上长出菌落，舍弃所分离菌株。28℃恒温箱中培养，48小时挑取单菌落纯化，得到纯菌株转管保存待用。

2.平板拮抗试验：把马铃薯内生细菌和马铃薯疫霉相对地接种在黑麦蛋白胨培养基平板上，两天后测抑菌带宽。对有抑菌作用的菌株在黑麦蛋白胨培养基平板上再次筛选，平板中心接种马铃薯疫霉，菌块d＝0.4cm，两边对称接种待测内生细菌菌株，醮取菌悬液在距中心2.5cm处各划一条直线，每个菌株重复3次，3天后用平板拮抗试验测抑菌带宽，记录统计。

3、取平板抑菌效果较好(带越宽，说明效果越好)的菌株(以下以菌株Atpoe为例)作温室盆栽控病实验。移栽时和接种病原菌前18天分别施一次待测菌，对照施等量清水，每个处理3次重复，每个重复12株，马铃薯疫霉接种为喷雾接种，接种前用少量清水湿润叶片，每株接种10ml菌液。20℃黑暗处理24小时，再28℃保持光照(日光灯，4500LX，16h/d)，相对湿度80-90％。7天后调查病情。根据试验结果，计算防效，数值越大效果越好，筛选出防效较好的菌株进一步作盆栽试验。

4、大田放大实验：移栽，先把Atpoe菌液稀释10倍，移栽时浸根5分钟，作处理编号为A1；菌液稀释50倍移栽时穴浇500毫升/株灌根，作处理编号为A2；常规生产做3米间隔处理编号为A0；移栽时仅使用清水灌根作对照。除试验处理外，其他生产管理措施与大田管理一致。

分别在团棵、现蕾、园顶三个易发病的生育期进行调查其晚疫病发生情况，并对当时的马铃薯植株根系、生长势及发病情况进行观察。

5、内生细菌Atpoe定殖力测定：在4-6叶期马铃薯苗施用马铃薯内生细菌Atpoe，经抗生素标记(标记的作用是为了测定其作用部位)，浓度为1×10⁸cfu/ml。在5天、10天、15天分别测定其在马铃薯根、茎、叶的定殖密度。

6、内生细菌Atpoe的直接作用机理。

在灭菌载玻片上面覆盖一层约1mm厚的黑麦蛋白胨培养基，马铃薯疫霉与Atpoe菌株相距1.5cm接种，放于灭菌培养皿内曲玻棒上，加少量灭菌水保湿，对照只接种马铃薯疫霉。28℃培养48小时。

菌株Atpoe对菌丝的作用是，对峙培养，60小时后抑菌作用明显，测得抑菌带宽为8mm，镜检马铃薯疫霉菌落前沿的菌丝形态，菌丝壁消解，畸形明显，分裂加剧。

在100ml培养液中接种活化的菌株Atpoe，在28℃ 120转/min条件下振荡培养3天，10000转/min离心15min，上清液用0.22μm过滤膜灭菌待用。将过滤液按1％、3％、5％、8％、10％、20％的比例混于黑麦培养基中，对照为不加发酵液的培养基，培养基总量为10ml。平板中心接种马铃薯疫霉菌丝块(d＝0.4cm)，3次重复，2天后测菌落生长量。

发酵浓缩液对孢子囊释放的影响作用：

在100ml NA培养液中接种活化的菌株Atpoe，在28℃ 120r/min条件下振荡培养3天，4000r/min离心15min，上清液用Sephadex G-50浓缩8倍，10000r/min离心15min，过滤灭菌，存于4℃下待用，此为菌株Atpoe发酵液的浓缩液。

取浓度为1×10⁴个/ml马铃薯疫霉孢子囊悬浮液与上述浓缩液按1∶1混和，对照加肉质蛋白胨培养液，3次重复，8℃处理20min，其后在24℃下0.5小时、1.5小时、4.5小时、10小时、22小时分别测孢子囊释放率。

发酵浓缩液对孢子囊释放的影响是，Atpoe的发酵液浓缩对孢子囊释放无明显影响，处理与对照孢子囊释放率基本一致。

发酵浓缩液对游动孢子游动的影响作用：

游动孢子的获得，孢子囊悬浮液在8℃处理20min，24℃下20min后，用两层纱布过滤，调整游动孢子浓度为1×10⁴个/ml。

取浓度为1×10⁴个/ml的游动孢子悬浮液与上述浓缩液按1∶1混和，对照加肉质蛋白胨培养液，3次重复，在24℃下5min、10min、30min时分别测游动孢子的游动百分比。

发酵浓缩液对游动孢子囊游动的影响是，发酵浓缩液能明显抑制孢子的游动，5min后处理游动孢子百分比为对照的二分之一左右，10min后处理游动孢子百分比为对照的六分之一左右。

发酵浓缩液对孢子萌发的影响作用：

取浓度为1×10⁴个/ml的游动孢子悬浮液与上述浓缩液按1∶1、5∶1混和，加入2％的葡萄糖，对照加NA培养液，3次重复，24℃下4小时后分别测孢子的萌发百分比，芽管的长度超过孢子直径长度的一半就作为已经萌发的孢子。

发酵浓缩液对游动孢子萌发的影响是，4小时分别测游动孢子的萌发百分比，浓缩液1∶1时使游动孢子不能萌发，1；5时使游动孢子萌发率下降二分之一左右。

7、内生细菌Atpoe的诱导抗病作用机理。

在100ml培养液中接种活化的菌株Atpoe，在28℃ 120转/min条件下振荡培养3天，4000转/min离心15min，上清液用0.22μm过滤膜灭菌待用。

在8-10叶期马铃薯苗茎基部以上2-3cm处注射此液0.1ml/株，设注射肉质蛋白胨培养液为对照。每个处理3个重复，每个重复12株。6天后挑战接种，马铃薯疫霉接种为为喷雾接种，接种前用少量清水湿润叶片，每株接种10ml菌液，20℃黑暗保湿处理24小时，再28℃保持光照(日光灯，4500LX，16h/d)，相对湿度80-90％。7天后调查病情。菌株Atpoe代谢产物有明显的诱导抗病作用，防效为48.55％。

对4-6叶期马铃薯苗施菌株Atpoe菌液，每株10ml，对照施等量蒸馏水。菌液为NA(肉质蛋白胨培养液)平板上涂抹接种菌株AtpAtpoe，在28℃下培养3d，用蒸馏水调整浓度为1×10⁸cfu/ml。分别在1天、3天、5天、7天、9天、11天、13天测定过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性。施菌后，过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，明显比对照高，13天时，分别比对照上升32.23，29.65，24.05个酶活力单位。

结论：由于马铃薯疫霉的菌丝生长、游动孢子的游动、萌发都是马铃薯晚疫病病害的发展、流行的重要环节，若在任何环节打断，病害的发展流行都将受到抑制。马铃薯内生细菌Atpoe对马铃薯疫霉的菌丝生长、游动孢子的游动、萌发有明显的抑制作用，因而菌株Atpoe能直接抑制马铃薯疫霉。并且能诱导马铃薯产生抗病性，以防治病害。

本发明实施例是以马铃薯内生细菌Atpoe做具体说明的，用本发明的方法可以选择马铃薯内生细菌的优良生物防治菌株来防治其它马铃薯病害，同样也可以选择其它植物内生细菌的优良生物防治菌株来防治其它植物病害，能达到本发明所述效果。

Claims (3)

1.一种生物防治马铃薯晚疫病的内生细菌菌株的选择方法，其特征在于：取马铃薯内生细菌纯菌株，测定抑菌带宽，筛选出防效较好的菌株，取其作盆栽试验和大田试验，测定其生物防治效果后，再测定马铃薯内生细菌的定殖力、马铃薯内生细菌菌株对病原菌的直接作用和马铃薯内生细菌对马铃薯的诱导抗病作用，选择优良的内生细菌。

2.根据权利要求1所述的生物防治马铃薯晚疫病的内生细菌菌株的选择方法，其特征在于：菌株的定殖力测定是，对马铃薯苗施用防效较好的内生细菌菌株，利用抗生素标记法测定内生细菌在生育期不同部位根、茎、叶中的定殖密度。

3.根据权利要求1所述的生物防治马铃薯晚疫病的内生细菌菌株的选择方法，其特征在于：测定马铃薯内生细菌菌株对马铃薯的诱导抗病作用，有以下步骤：

A.在培养液中接种活化的菌株，培养，取清液过滤膜灭菌，马铃薯茎基部注射此液，注射培养液为对照，挑战接种马铃薯疫霉的孢子悬浮液，黑暗保湿处理，再保持光照，相对湿度为80-90％，调查病情；

B.不同生育期的马铃薯苗施用内生细菌的菌悬液，菌悬液为在平板上涂抹接种菌株，培养，调整浓度，对照施等量蒸馏水，以一定的时间间隔测定过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，计算出每克鲜重组织中的酶活性，分析马铃薯体内诱导相关酶活性的变化情况。