CN107493876B - 利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法及应用,属于土壤有机污染生物修复与农产品安全领域。本发明通过浸种、浸根、叶面喷施或涂抹以及灌根法等方式将植物内生菌巨大芽孢杆菌YJB3定殖于植物体内,然后将处理的植物种子播种于PAEs污染的土壤中,或将已经接种巨大芽孢杆菌YJB3的植物幼苗水培于含有PAEs的营养液中或栽培于受PAEs污染的土壤中,降低植物体内PAEs的积累。本发明操作简单、安全、经济,对环境不引入二次污染,并有效去除积累在植物体内的PAEs,能够规避农产品污染风险,对于高效利用区域性中低浓度污染土壤生产安全农产品、实现“边生产、边修复”具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于环境有机污染生物修复与农产品安全领域,具体涉及一种利用植物内生菌降低植物体内邻苯二甲酸酯(PAEs)污染的方法及应用。
背景技术
邻苯二甲酸酯(PAEs)主要作为增塑剂被广泛应用于塑料工业,也可以作为添加剂应用于室内装饰材料、建筑材料、服饰以及农药和化肥中。PAEs的消耗量每年约有60~80万吨。由于含有PAE产品的广泛应用,导致其在各种环境介质中被检出。PAEs是一类环境激素类污染物,其中某些种类具有较强的内分泌干扰、生殖发育毒性、肝毒性甚至“三致”效应。日常膳食摄入含有PAEs的农产品导致长期低剂量暴露,严重危及人类健康。邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸正二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)和邻苯二甲酸正二辛酯(DOP)等被美国环保局和中国环境监测中心列为优先控制污染物。
土壤是PAEs重要的“汇”,主要通过污水灌溉、化肥、农药以及农膜等途径进入农田土壤。每年约有22.9万吨塑料薄膜应用于农业生产,覆盖面积达198万公顷。因此,农膜使用是农田土壤PAEs的主要人为来源。污染土壤中的PAEs被农作物吸收累积,严重威胁农产品质量安全。我国塑料薄膜温室大棚生产的蔬菜中普遍检测出PAE,珠江三角洲某农业生产区中农产品中总PAEs含量最高达到79.86mg/kg,检出率为98.5%,以DBP、DEHP和DOP为主,并且叶菜类总PAEs含量超过茄果类蔬菜,在各类农产品样品中总PAEs的平均含量顺序为蔬菜>水稻>水果。植物吸收和积累PAEs是其沿着食物链富集的主要源头。PAEs进入植物体内,不易被代谢,积累在植物组织内,并表现出较强的生物富集性,通过食物链对人体健康产生威胁。日常膳食摄入含有PAEs的农产品导致长期低剂量暴露,严重危及人类健康。如何消除积累在植物体内的PAEs,降低植物体内PAEs污染,保障农产品质量安全,是当前农业生产中亟待解决的问题。
内生菌广泛存在于植物体内,与植物宿主建立了互利共生关系。有些植物内生菌对有机污染物具有较强的降解能力,其可以协同植物宿主有效去除已经积累在植物体内的有机污染物。利用内生菌控制植物中有机污染物受到广泛关注,如接种植物内生菌Pseudomonas putida strain可有效降低农药2,4-D在豌豆体内的积累;接种植物内生菌Staphylococcus sp.strain BJ06可以显著降低黑麦草根部和地上部芘的含量。因此人工接种具有降解PAEs等有机污染物功能的植物内生菌,控制和规避植物PAEs污染潜力巨大,前景广阔。然而据我们所知,目前还没有专利和文献报道植物内生菌应用于降低作物体内PAEs。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法。
本发明提供了利用具有PAEs降解功能的植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法及应用。本发明操作简单,安全、成本低,对环境不产生二次污染,并有效去除积累在植物体内的PAEs,对于在污染土壤中生产安全农产品,实现边生产边修复具有重要实用价值。
本发明的另一目的在于提供上述方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,包括如下步骤:
将植物内生菌接种于植物根际土壤或接种于植物体内,使该菌株有效定殖于植物体内,降解积累在植物体内的PAEs。
所述的植物内生菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3,其保藏信息:保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏日期:2017年06月28日,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,保藏编号:CCTCC NO:M 2017389。
所述的将植物内生菌接种于植物体内的方法可以为:将巨大芽孢杆菌YJB3接种于植物种子,其包括如下操作步骤:
(1)巨大芽孢杆菌YJB3菌剂制备:将该菌株在LB培养基上活化6~9h后,转接至LB液体培养基,摇床培养6~9h,转速100~150rpm,培养温度25~35℃,3000rpm离心收集菌体,然后用磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤2~3次后,并用含有0.5~1.8%醋酸钠的磷酸缓冲液重悬,并调整菌体浓度为106~109CFU/mL;
(2)植物种子预处理:首先将颗粒饱满的植物种子用3%H2O2漂洗3~5min,无菌水冲洗3~4次,70%酒精漂洗3~5min,无菌水冲洗3~4次,自然风干;然后浸泡于0.05~0.08mol/L的KOH溶液中10~15min,无菌蒸馏水冲洗3~4次,或浸泡于氯仿20~30s,或室温下用角质层酶(100μg/mL)处理10~30min,去除种皮腊质和角质层,无菌蒸馏水冲洗3~4次,自然风干;
(3)植物种子接种植物内生菌巨大芽孢杆菌YJB3:室温下,将预处理的植物种子浸泡于上述步骤(1)所述的菌悬液中,浸泡10~20h;
所述的将植物内生菌接种于植物体内的方法可以为:将植物幼苗根系浸没于上述步骤(1)所述的菌悬液中,浸根5~20h;
所述的将植物内生菌接种于植物体内的方法可以为:将上述步骤(1)所述的菌悬液喷施或涂抹于水培在含有PAEs的营养液中或种植在含有PAEs污染物土壤中的植物叶面,每隔3h喷施或涂抹一次,连续喷施或涂抹3~4次,并选择靠近植物顶端的幼嫩叶片。
所述的将植物内生菌接种于植物根际土壤是将浓度为106~109CFU/mL的植物内生菌菌悬液接种于生有3~4片真叶的植物幼苗根际土壤。
所述的PAEs包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)和/或邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和/或邻苯二甲酸正二丁酯(DBP)和/或邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)和/或邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和/或邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)。
所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法的应用,是将已接种巨大芽孢杆菌YJB3的植物种子播种于含有PAEs污染物的土壤中,植物内生菌通过植物种子途径定殖于植物体内,可降低PAEs在植物体内的积累。
所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法的应用,是将已经浸根接种巨大芽孢杆菌YJB3的植物幼苗水培在含有PAEs的营养液中或栽培于含有PAEs污染物的土壤中,植物内生菌通过根系定殖于植物体内,可降低植物对PAEs的积累。
所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法的应用,是在植物叶面喷施或涂抹巨大芽孢杆菌YJB3,使其通过叶片定殖于植物体内,可降低PAEs在植物体内的积累。
所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法的应用,所述的植物种类包括黑麦草、苜蓿、东南景天等用于植物修复的植物类型,以及和菜心、通菜、番茄和水稻等蔬菜和粮食作物。上述植物的种子均可从市场上购买得到。
本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:
本发明提供利用植物内生菌巨大芽孢杆菌YJB3降低植物体内PAEs污染的方法及应用。利用植物内生菌巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液通过浸种、浸根、叶面喷施或涂抹以及灌根法等方式将该菌株定殖于植物体内,降低植物体内邻苯二甲酸酯的积累。本发明操作简单、安全、经济,对环境不引入二次污染,能够规避农产品污染风险,对于高效利用区域性中低浓度污染土壤生产安全农产品并实现“边生产、边修复”具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
本发明所使用的LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl为10g,pH 7.5,水1000mL;培养基使用前先在121℃下高温灭菌20min。
磷酸缓冲液(PBS,g·L-1):K2HPO4,1.44;KH2PO4,0.24;KCl,0.2;NaCl,8.0;pH 7.2。
实施例中所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3的保藏信息:保藏单位:中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏日期:2017年06月28日,保藏地址:中国.武汉.武汉大学,保藏编号:CCTCC NO:M 2017389。
实施例1
将巨大芽孢杆菌YJB3在LB培养基上活化8h后,转接至LB液体培养基,摇床培养7h,转速100~150rpm,培养温度30℃,3000rpm离心收集菌体,然后用磷酸缓冲液洗涤3次后,并用磷酸缓冲液配置含有0.5~1.8%的醋酸钠溶液重悬,并调整菌体浓度为106~109CFU/mL。
实施例2
利用植物内生菌消除植物体内PAEs的方法,将巨大芽孢杆菌YJB3接种于植物种子,首先将颗粒饱满的植物种子用3%H2O2漂洗3min,无菌水冲洗3次,70%酒精漂洗5min,无菌水冲洗4次,自然风干;然后浸泡于0.05mol/L的KOH溶液中12min,无菌蒸馏水冲洗3次,或浸泡于氯仿20s,或室温下用角质层酶(100μg/mL)处理20min,去除种皮腊质和角质层,无菌蒸馏水冲洗4次,自然风干;然后室温下,将预处理的植物种子浸泡于107CFU/mL的菌悬液中,浸泡18h。让已经接种巨大芽孢杆菌YJB3菜心种子播种于含有DBP(初始浓度为100mg/kg)土壤中,该菌株YJB3通过植物种子途径定殖植物体内,在温室内培育45d后收获植物,分别测定植物地上部和根部DBP含量,相对于未接种植株,接种植株地上部和根部DBP含量分别降低了25.3%和37.1%。
实施例3
将浓度为108CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3的菌悬液涂抹土培植物黑麦草植株叶面,每3h涂抹一次,连续涂抹4次,并选择靠近植株顶端的幼嫩叶片。并且涂抹之前,首先用无菌水冲洗植株叶片2~3次,去除植物叶片灰尘。土壤中DEP初始浓度为100mg/kg,在温室内培育55d后收获,分别测定植物地上部和根部DEP含量,相对于未接种植株,接种植株地上部和根部DEP含量分别降低了38.3%和18.3%。
实施例4
将浓度为109CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3的菌悬液喷施水培植物番茄植株叶面,每4h喷施一次,连续喷施4次,并选择靠近植株顶端的幼嫩叶片。喷施前首先喷施无菌水冲洗植株叶片,并且待叶片水分风干后,再喷施菌液。培养液中DMP初始浓度为100mg/kg,培养容器避光处理,在温室内培育50d后收获,分别测定植物地上部和根部DMP含量,相对于未接种植株,接种植株地上部和根部DMP含量分别降低了43.6%和23.6%。
实施例5
设定土壤中DEHP浓度为100mg·kg–1,以不添加DEHP的土壤为对照,取部分土壤(约5kg)添加DEHP丙酮溶液,将其拌匀,即为污染母土,然后混入其余土壤中,搅拌均匀,待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱,缓慢滴灌加入自来水,保持田间持水量的60%,并遮光老化14d。将3~4片真叶的水稻幼苗浸入浓度为107CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中12h,然后将该水稻幼苗水培于含有DEHP污染物的营养液中(初始浓度为100mg/kg),温室内培养50d后,收获植物,分别测定植物地上部和根部DEHP含量,相对于未接种植株,接菌处理使植物地上部和根部DEHP含量分别降低了22.9%和30.5%。
实施例6
设定土壤中DnOP浓度为100mg·kg–1,以不添加DnOP的土壤为对照,取部分土壤(约5kg)添加DnOP丙酮溶液,将其拌匀,即为污染母土,然后混入其余土壤中,搅拌均匀,待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱,缓慢滴灌加入自来水,保持田间持水量的60%,并遮光老化14d。将3~4片真叶的黑麦草幼苗浸入浓度为107CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中20h,然后将该黑麦草幼苗栽培在含有DnOP污染物的土壤中(初始浓度为100mg/kg),温室内培养55d后,收获植物,分别测定植物地上部和根部DnOP含量,相对于未接种植株,接菌处理使植物地上部和根部DnOP含量分别降低了14.9%和21.3%。
实施例7
设定土壤中BBP浓度为100mg·kg–1,以不添加BBP的土壤为对照,取部分土壤(约5kg)添加BBP丙酮溶液,将其拌匀,即为污染母土,然后混入其余土壤中,搅拌均匀,待丙酮溶剂挥发完毕后装入根箱,缓慢滴灌加入自来水,保持田间持水量的60%,并遮光老化14d。采用灌根法将3浓度为108CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液接种在苜蓿幼苗(3-4片真叶)根际土壤,温室内培养50d后,收获植物,分别测定植物地上部和根部BBP含量,相对于未接种植株,接菌处理使植物地上部和根部BBP含量分别降低了10.9%和19.5%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,其特征在于包括如下步骤:
将植物内生菌接种于植物根际土壤或接种于植物体内,使该菌株有效定殖于植物体内,降解积累在植物体内的PAEs;
所述的植物内生菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3,于2017年06月28日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M 2017389。
2.根据权利要求1所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,其特征在于:
所述的将植物内生菌接种于植物体内的方法为:将巨大芽孢杆菌YJB3接种于植物种子,其包括如下操作步骤:
(1)植物种子预处理:首先将颗粒饱满的植物种子用3%H2O2漂洗3~5min,无菌水冲洗3~4次,70%酒精漂洗3~5min,无菌水冲洗3~4次,自然风干;然后浸泡于0.05~0.08mol/L的KOH溶液中10~15min,无菌蒸馏水冲洗3~4次,或浸泡于氯仿20~30s,或室温下用100μg/mL角质层酶处理10~30min,去除种皮腊质和角质层,无菌蒸馏水冲洗3~4次,自然风干;
(2)植物种子接种植物内生菌:室温下,将预处理的植物种子浸泡于浓度为106~109CFU/mL的植物内生菌菌悬液中,浸泡10~20h。
3.根据权利要求1所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,其特征在于:
所述的将植物内生菌接种于植物体内的方法为:将植物幼苗根系浸没于浓度为106~109CFU/mL的植物内生菌菌悬液中,浸根5~20h。
4.根据权利要求1所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,其特征在于:
所述的将植物内生菌接种于植物体内的方法为:将浓度为106~109CFU/mL的植物内生菌菌悬液喷施或涂抹于水培或土培的植物叶面,每隔3h喷施或涂抹一次,连续喷施或涂抹3~4次,并选择靠近植物顶端的幼嫩叶片。
5.根据权利要求1所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,其特征在于:
所述的将植物内生菌接种于植物根际土壤是将浓度为106~109CFU/mL的植物内生菌菌悬液接种于生有3~4片真叶的植物幼苗根际土壤。
6.根据权利要求1~5任一项所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,其特征在于:
所述的PAEs为邻苯二甲酸二乙酯或/和邻苯二甲酸二甲酯或/和邻苯二甲酸二丁酯和/或邻苯二甲酸二正辛酯和/或邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和/或邻苯二甲酸丁基苄基酯。
7.权利要求2所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法的应用,其特征在于:
将权利要求2中已接种巨大芽孢杆菌YJB3的植物种子播种于含有PAEs污染物的土壤中。
8.权利要求3所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法的应用,其特征在于:
将权利要求3中已经浸根接种巨大芽孢杆菌YJB3的植物幼苗水培或栽培于含有PAEs污染物的土壤中。
9.权利要求4所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法的应用,其特征在于:
权利要求4中植物叶面喷施或涂抹巨大芽孢杆菌YJB3的植物水培或种植在含有PAEs污染物土壤中。
10.根据权利要求1~5任一项所述的利用植物内生菌降低植物体内PAEs污染的方法,其特征在于:
所述的植物包括黑麦草、苜蓿、东南景天、菜心、通菜、番茄、水稻。
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