CN103275891A - 一种植物内生菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物内生菌，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，完整命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SAN1，该菌株已于2013年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7295。本发明还公开了所述的植物内生菌在修复设施土壤次生盐渍化与镉复合污染中的应用。本发明提供的巨大芽孢杆菌CGMCC 7295能够促进植物的生长，改善土壤理化性状，同时促进植物对Cd的吸收，有效的消除土壤中的Cd污染；并且能高效转化土壤的硝态氮，减轻次生盐渍化的危害；通过巨大芽孢杆菌CGMCC 7295与植物的联合作用，可实现设施土壤次生盐渍化与重金属Cd复合污染的修复。

Description

一种植物内生菌及其应用

技术领域

本发明属于土壤修复技术领域，尤其涉及一种植物内生菌及其应用。 

背景技术

设施栽培是我国蔬菜生产的重要方式之一，具有单产高、受季节影响小等优点，在蔬菜和其它经济作物的反季节和跨地区种植中发挥着重要的作用。但是在这种人工干预性强，高投入、高产出的生产模式下，由于农用化学品特别是氮肥的过量使用及不合格含镉磷肥的施用，造成了土壤中的硝酸盐、亚硝酸盐和重金属Cd污染问题突显，导致了设施土壤次生盐渍化与重金属Cd的复合污染，严重影响农作物的产量和品质，并威胁生态系统健康与食品安全。 

对于设施土壤的修复方法包括物理修复、化学修复和生物修复。由于物理和化学修复技术会影响土壤的结构和地下水所处的生态环境，而且成本高，易形成二次污染。相反，生物修复具有费用省、环境负面影响小、修复彻底有效等多种优势，已成为当前国内外设施土壤修复的主要方法。 

氮在自然界中以多种形态存在，微生物在氮的不同形态循环转化中起着重要的作用。利用好氧反硝化微生物处理硝酸盐废水的相关研究已有报道，但有关利用微生物有效降低土壤中硝酸盐含量，进而改良土壤次生盐渍化的研究还鲜见报告。设施土壤中的Cd污染对于农产品的安全产生了重要影响，但由于Cd在土壤中比较稳定，无法消解，普通修复方法很难去除，所以利用微生物-植物进行联合修复是消除Cd污染的最优选择。因此研发能够修复土壤次生盐渍化与Cd污染的修复菌剂具有重要现实意义。 

发明内容

本发明提供了一种植物内生菌及其应用，本发明从重金属镉超积累 植物东南景天中分离出特异内生菌，不仅可以促进植物的生长和对镉的吸收，而且可以高效转化硝态氮，可用于修复设施土壤次生盐渍化与镉复合污染，改善设施土壤理化性质，促进植物生长。 

一种植物内生菌，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，完整命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SAN1，该菌株已于2013年3月11日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7295。 

本发明菌株在培养基上的菌落特征为：幼龄期的菌落呈圆形、突起、表面光滑和有光泽、湿润、半透明、粘稠、易挑取。陪着培养时间的延长，菌落表面光泽变暗，颜色变为浅褐色，采用碱性复红简单染色，显微镜下观察，菌株多为两端钝圆。 

所述培养基的成分为：胰蛋白胨10g L^-1、酵母提取物5g L^-1、氯化钠10g L^-1、琼脂15g L^-1，pH值7.0。 

本发明的菌株为革兰氏染色阳性，菌体杆状，大小为2.5～3.3μm-1.3～2.1μm，产生芽孢，芽孢为近似柱状，孢囊不膨大，没有伴孢晶体，有鞭毛。过氧化氢酶阳性，葡萄糖发酵产酸，甘露醇发酵产酸，D-木糖发酵产酸，水解淀粉，水解酪素，还原硝酸盐。 

该菌株从镉超积累植物东南景天中分离得到，对植物吸收重金属镉具有促进作用，且可高效转化土壤中的硝态氮，因此，可用于修复设施土壤次生盐渍化与镉复合污染。 

本发明还提供了所述的植物内生菌在修复设施土壤次生盐渍化与镉复合污染中的应用。 

具体包括： 

(1)将植物种子消毒后放入巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液中进行第一次浸染，催芽形成幼苗； 

(2)再将所述幼苗放入巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液中进行第二次浸染； 

(3)最后将幼苗种植于土壤中进行土壤修复。 

通过对植物进行巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液浸染，可促进植物的生长和对土壤中镉的吸收，并能高效转化土壤中的硝态氮，可修复土壤中的次生盐渍化与镉复合污染。 

为了进一步增强植物的土壤修复能力，可在种植过程中每10～30d往植物上浇灌巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液，增加植物上的菌含量。 

所述巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液OD₆₀₀为0.8～1.0，该OD₆₀₀范围内的菌液具有良好的生物活性，有利于增强植物的土壤修复能力。 

植物在巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液中浸染时间过长容易造成植物内部缺氧，不利于植物的生长发育，而浸染时间过短，则不利于巨大芽孢杆菌CGMCC7295较好的负载在植物上，故优选所述第一次浸染时间为3～7h，所述第二次浸染时间为2～4h。 

所述巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌CGMCC7295活化后接入LB液体培养基，扩繁后离心去上清液，再加入磷酸缓冲液制得菌悬液。 

为了更好的增强植物对土壤中镉的吸收，可选用能够富集镉的植物品种，故优选所述植物种子采用具有富集镉能力的油菜种子、东南景天、龙葵、高粱等。 

可在植物生物量最大时收获植物，在植物生物量最大时，植物本身对土壤中的镉吸收量最大，且能转化较多的硝酸盐、亚硝酸盐。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

本发明提供的巨大芽孢杆菌CGMCC7295能够促进植物的生长，改善土壤理化性状，同时促进植物对Cd的吸收，有效的消除土壤中的Cd污染；并且能高效转化土壤的硝态氮，减轻次生盐渍化的危害；通过巨大芽孢杆菌CGMCC7295与植物的联合作用，可实现设施土壤次生盐渍化与重金属Cd复合污染的修复。 

附图说明

图1为本发明实施例2中目标菌株SNA1转化硝态氮的速率图； 

图2为本发明实施例5中巨大芽孢杆菌CGMCC7295与油菜联合修复设施土壤次生盐渍化与镉复合污染的油菜生长状况图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。 

试验中的检测方法如下： 

重金属Cd的检测方法：原子吸收光谱法； 

硝态氮的检测方法：流动分析仪； 

OD₆₀₀的检测方法：紫外分光光度法。 

实施例1东南景天内生菌的分离 

(1)培养基 

DF培养基：每升培养液中含有KH₂PO₄4g，Na₂HPO₄6g，MgSO₄·7H₂O0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸钠2g，柠檬酸2g，(NH₄)₂SO₄2g，组分1、组分2溶液各0.1mL，琼脂15g，溶剂为水，pH值7.2，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。 

其中，组分1：H₃BO₃10mg，MnSO₄·H₂O11.19mg，ZnSO₄·7H₂O124.6mg，CuSO₄·5H₂O78.22mg，MoO₃10mg溶于100mL灭菌蒸馏水中，-4℃保存； 

组分2：FeSO₄·7H₂O100mg溶于10mL灭菌蒸馏水中，-4℃保存。 

DF+ACC培养基：每升DF培养基中加入3mM的ACC。 

DF+ACC+Cd培养基：在DF+ACC培养基中加入Cd²⁺，浓度为0.5mM。 

LB液体培养基：每升培养液中含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶剂为水，pH7.0，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。 

(2)菌株的分离纯化 

整株东南景天用自来水冲洗30min，用蒸馏水洗3次，每次3min。用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。将根系和地上部分别用70％酒精浸2min，无菌水洗3次，3％NaOCl浸泡2次，每次1min，然后用无菌水冲洗3次，每次2min。称重表面灭菌后的根系和植株地上部，加入10倍体积的磷酸盐缓冲液在无菌研钵中研磨，匀浆后静置5min，取悬液进行10倍系列稀释，分别取不同稀释度的悬液100μl涂布于DF、DF+ACC、DF+ACC+Cd平板上，在30℃暗培养。 

从不同稀释倍数的平板上选择在形态、色泽和生长速率上不同的菌落在DF-ACC培养基上划线，置于37℃恒温培养箱中培养。 

多次划线，直至菌株纯化。将纯化后的单菌落接种于5ml LB液体培养基，在30℃，180rpm培养。将长好的菌液0.7mL与50％灭菌甘油0.3ml 混合分装于冻存管在-80℃保存。 

实施例2目标菌株的分离鉴定 

(1)培养基 

富集培养基：每升培养液中含有KNO₃10g，KCI1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，CaCl₂1mg，FeSO₄·7H₂O10mg，KH₂PO₄0.5g，葡萄糖7.5g，pH7.0，溶剂为水，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。 

分离培养基：每升培养液中含有KN0₃10g，KCI1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，CaCl₂1mg，FeSO₄·7H₂O10mg，KH₂PO₄0.5g，葡萄糖7.5g，琼脂15.0g，pH7.0，溶剂为水，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。 

硝态氮转化测定培养基：每升培养液中含有KNO₃1g，KCI1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，CaCl₂1mg，FeSO₄·7H₂O10mg，KH₂PO₄0.5g，葡萄糖7.5g，pH7.0，溶剂为水，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。 

LB液体培养基：每升培养液中含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶剂为水，pH7.0。高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。 

LB培养基：每升培养液中含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂15.0g，溶剂为水，pH7.0。高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。 

(2)目标菌株的筛选 

接种实施例1中得到的东南景天内生菌于100mL LB液体培养基中，置于30℃，180r/min恒温摇床上隔夜培养。取菌液10mL接入100mL富集培养基，置于30℃，180r/min恒温摇床上24小时，取10mL菌液接入到100mL新鲜富集培养基中。重复上述操作3次。将菌液稀释10⁵，涂布于分离培养基，挑取单菌落在分离培养基中划线，置于37℃恒温培养箱中培养。选取生长较快的菌株作为目标菌株，共分离纯化得到5株内生菌。 

(3)目标菌株的鉴定 

1)硝酸盐转化率测定 

将上述筛选出的5株内生菌接入硝态氮转化测定培养基，培养24h，用流动分析仪测定菌液中硝态氮浓度，之后每12h检测一次菌液硝态氮浓度，培养72h，筛选得到硝态氮转化率高的一株菌株，命名为SAN1。 

将保存的SAN1菌株接种到LB液体培养基中，置于30℃，180r/ min恒温振荡器中过夜培养。按接种量1％将菌液接入100mL硝态氮转化测定培养基，置于30℃，180r/min恒温振荡器中培养，设置5个重复，5个空白硝态氮转化测定培养基对照。培养24h后取10mL培养基，8000r/min离心5min，取上清液稀释50倍，用流动分析仪测定培养基中的硝态氮含量，之后每间隔12h测定一次硝态氮含量，绘制转化曲线，其硝态氮转化速率图见图1，可见菌株SAN1在72h后硝态氮的去除率可以达到95％以上。 

2)耐Cd测定 

在分离培养基中加入一定浓度的CdCl₂溶液，使培养基中Cd²⁺的浓度分别为0、0.5、1、2、3、4、6、8、10ppm。将上述筛选出的5株内生菌接入100mL LB液体培养基，置于30℃，180r/min恒温摇床上过夜培养，在含有不同Cd浓度的分离培养基平板中划线，置于37℃恒温培养箱中培养，选取生长良好的菌株作为目标菌株。 

经过硝酸盐转化率实验与耐Cd实验测定，SAN1菌株既可以高效转化硝态氮也能够在高Cd培养基中良好生长，故选取SAN1菌株作为我们的目标菌株。 

实施例3目标菌株SAN1的鉴定 

(1)SAN1菌株的菌落、菌体形态观察 

菌体形态学研究：对菌体进行革兰氏染色，在光学显微镜16×100油镜下进行观察。 

菌体内部结构研究：对菌体进行超薄切片，用透射电子显微镜观察菌体内部结构。 

在固体培养基上，菌株SAN1幼龄期的菌落呈圆形、突起、表面光滑和有光泽、湿润、半透明、粘稠、易挑取。陪着培养时间的延长，菌落表面光泽变暗，颜色变为浅褐色。采用碱性复红简单染色，显微镜下观察，菌株多为两端钝圆。革兰氏染色阳性，菌体杆状，大小为2.5～3.3μm-1.3～2.1μm，产生芽孢，芽孢为近似柱状，孢囊不膨大，没有伴孢晶体，有鞭毛。过氧化氢酶阳性，葡萄糖发酵产酸，甘露醇发酵产酸，D-木糖发酵产酸，水解淀粉，水解酪素，还原硝酸盐。。 

(2)SAN1菌株的分子生物学鉴定 

将保存的SAN1细菌接种到LB液体培养基中，30℃，180r/min恒温摇床上培养过夜培养，所得菌液用上海生工生物细菌DNA提取试剂盒进行提取，扩增该菌株的16S rDNA，将获得的PCR产物纯化后委托华大基因进行测序。 

PCR扩增引物为通用引物： 

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 

1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。 

PCR扩增体系采用25μl反应体系，如表1所示。 

表1PCR扩增体系 

成分	含量(uL)
		DNA模板	0.5
10×buffer	2.5
		dNTP混合物(各2.5mmol/L)	2
27F(10pmol/L)	1
		1492R(10pmol/L)	1
Taq DNA聚合酶	0.3
		超纯水	17.7
总计	25

PCR反应条件为： 

94℃预变性3min，94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃延伸5～10min。 

电泳检测：1％琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物电泳结果。 

将PCR产物送到华大基因进行测序，经测序获得到长度为1459bp的16S rDNA片段，在GenBank中的注册登记号为KC961951，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。通过Blast比对，并利用ClustalX1.83及MEGA4.0软件进行系统发育分析。结果表明，菌株SNA1与Bacillus megaterium的16S rDNA核苷酸序列的同源性在99％以上，所以鉴定该菌株为巨大芽孢杆菌，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SAN1，并将该菌株送至 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.7295，保藏日期为2013年3月11日。 

实施例4巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌剂制备 

(1)菌种活化 

将低温保存的巨大芽孢杆菌CGMCC7295原种接种于LB斜面培养基中进行活化培养，在37℃恒温培养箱中22～24h，获得菌体斜面； 

(2)扩大培养 

将活化的菌种接入LB液体培养基，进行扩繁，于30℃，180r/min恒温摇床上培养，震荡至对数期，获得菌液，将菌液离心，弃上清，用无菌水洗涤沉淀3次，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含有巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌悬液，菌悬液在应用前需将OD₆₀₀调整至0.8～1.0。 

实施例5巨大芽孢杆菌CGMCC7295的土壤修复应用 

在浙江大学农业试验站玻璃温室进行利用巨大芽孢杆菌CGMCC7295的植物-微生物联合修复土壤试验。 

植物种子选取本实验室筛选的能够富集Cd的油菜种子，微生物选用本发明的巨大芽孢杆菌CGMCC7295。 

在育苗盘中采用石英砂栽培方式，添加营养液，进行苗期试验。设置两个处理：空白对照和添加巨大芽孢杆菌CGMCC7295。 

营养液配方(单位μM)：2000KNO₃，50KCl，500Ca(NO₃)₂·4H₂O，200MgSO₄·7H₂O，100NH₄NO₃，10KH₂PO₄，12H₃BO₃，2MnSO₄·H₂O，0.5ZnSO₄·7H₂O，0.2CuSO₄·5H₂O，0.1Na₂MoO₄，0.1NiSO₄，20Fe-EDTA，5CdCl₂。 

试验步骤如下： 

(1)第一次浸染 

取适量的油菜种子利用75％酒精-HgCl₂进行表面消毒，将消毒好的种子分为两部分，一份用本发明中制备的巨大芽孢杆菌CGMCC7295菌液浸种(OD₆₀₀＝0.8～1.0)，一份用无菌水浸种，时间均为5h，然后置于湿润的石英砂上，在30℃恒温培养箱中催芽。 

(2)第二次浸染 

种子在培养箱中培养一周后，分别将巨大芽孢杆菌CGMCC7295菌液浸种的幼苗再用巨大芽孢杆菌CGMCC7295菌液浸苗3h，无菌水浸种的幼苗再用无菌水浸苗3h，再移入育苗盘的石英砂中，用巨大芽孢杆菌CGMCC7295菌液处理的幼苗每两周追加一次菌液，根据幼苗生长情况，适量浇灌营养液。 

(3)数据测定 

培养6周后收获植物，分别测定油菜的株高、地上部鲜重、干重，根部鲜重、干重，以及地上部与地下部的重金属浓度、营养液硝酸盐浓度。 

(4)结果分析 

经巨大芽孢杆菌CGMCC7295菌液处理后，植物生长状况明显改善(图2)，株高、生物量等指标明显高于对照，并且植物体内重金属含量也显著高于对照，硝酸盐含量明显低于不加菌的空白处理，表明巨大芽孢杆菌CGMCC7295对植物生长具有很好的促进作用，且能修复土壤的次生盐渍化与重金属Cd复合污染。 

Claims (10)

1.一种植物内生菌，其特征在于，命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)SAN1，保藏编号为CGMCC No.7295。

2.如权利要求1所述的植物内生菌在修复设施土壤次生盐渍化与镉复合污染中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：

(1)将植物种子消毒后放入巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液中进行第一次浸染，催芽形成幼苗；

(2)再将所述幼苗放入巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液中进行第二次浸染；

(3)最后将幼苗种植于土壤中进行土壤修复。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，还包括：在种植过程中每10～30d往植物上浇灌巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液OD₆₀₀为0.8～1.0。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的第一次浸染时间为3～7h。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的第二次浸染时间为2～4h。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌CGMCC7295的菌液的制备方法为：将巨大芽孢杆菌CGMCC7295活化后接入LB液体培养基，扩繁后离心去上清液，再加入磷酸缓冲液制得菌悬液。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物种子为具有富集镉能力的油菜种子、东南景天种子、龙葵种子或高粱种子。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，在植物生物量最大时收获植物。

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