CN110628659A - 巨大芽孢杆菌及其菌剂制备及其土壤重金属修复应用 - Google Patents

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Abstract

一种巨大芽孢杆菌及其菌剂制备及其土壤重金属修复应用，涉及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT‑5 CGMCC NO.12910，利用本发明菌株固体制剂施用可有效降低土壤硝酸盐含量以及重金属含量。本发明制备简便，操作方便，处理成本低，可广泛应用于土壤修复领域。

Description

巨大芽孢杆菌及其菌剂制备及其土壤重金属修复应用
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种巨大芽孢杆菌及其菌剂制备及其土壤重金属修复应用。
背景技术
近年来我国设施蔬菜产业快速发展，但设施栽培环境的特殊性及不科学的管理，使得设施蔬菜生产高度依赖化肥、复合肥等肥料，导致土壤养分不均衡、土壤次生盐渍化等诸多生产问题的产生。特别是土壤酸化会提高重金属在土壤中的迁移性，进而加剧重金属在土壤中的积累，其中，由农化物带来的Cd、Pb、Cu污染最为突出。在实际生产过程中，由于施肥、管理方式的差异，土壤往往存在着次生盐渍化与重金属的复合污染。不仅直接危害农作物的正常生长，导致作物减产，而且污染因子容易通过食物链方式进入人体，严重威胁人类的身体健康。因此，修复和治理设施蔬菜土壤的次生盐渍化和重金属污染对保护土壤环境，保障农产品安全具有重要的社会和生态意义。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种巨大芽孢杆菌及其菌剂制备及其土壤重金属修复应用，能够对土壤硝酸盐的降解以及对土壤有效态重金属含量的提高，并且能够促进蔬菜生长、强化超积累植物对重金属的吸收，实现土壤修复和蔬菜生产的双重功效。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种微生物菌株，即巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5，目前该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号CGMCCNO.12910，保藏日期是2016年8月26日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
本发明涉及上述巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的实现方法，以巨大芽孢杆菌CGMCC NO.4698作为出发菌，经紫外光诱变和过硝酸盐转化率及酸碱度筛选后经N+注入后得到。
所述的出发菌，即巨大芽孢杆菌(CGMCC NO.4698)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号CGMCC NO.4698，保藏日期是2011年3月21日。
所述的紫外光诱变是指：采用但不限于紫外灯对出发菌的菌悬液照射。
所述的筛选是指：将巨大芽孢杆菌(CGMCC NO.4698)作为出发菌，制备成菌悬液后涂布于含有重金属和NO3 -的平板上培养并挑取取单菌落转接至含有重金属和NO3 -的液体培养基中再次培养，挑取其中硝酸盐转化率和酸碱度符合要求的菌株。
所述的重金属是指：Cd、Pb、Cu，具体为：1.0～10.0mg/L的Cd2+、0.5～5.0g/L的Pb2 +、0.5～5.0g/L的Cu2+。
所述的N+注入是指：将符合要求的菌株制备成菌悬液，采用78～234×1013N+/cm2注入剂量进行N+注入。
所述的筛选，优选将第一次筛选得到的菌株进行再次筛选。
本发明涉及一种基于上述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的应用，将其作用于次生盐碱化土壤以实现土壤修复。
所述的应用，具体通过将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5扩大培养得到固体制剂后施用于待修复土壤后，在土壤中种植蔬菜植物，菌剂通过硝酸盐代谢途径降低土壤中过量的硝酸盐，同时通过分泌有机酸等物质活化或螯合土壤中的重金属，促进修复植物对重金属的富集，从而达到修复土壤的目的。
所述的扩大培养是指：将NCT-5菌株接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在C/N比大于或等于5，初始pH为6.0～7.5、培养温度为20～37℃的环境下培养8～24小时。
所述的无菌发酵培养基的组分含量为：碳源2～20g/L，氮源0.1～10g/L，无机盐0.01～10g/L，其余为水，pH 6.0～7.5；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、麸皮、玉米粉和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为豆饼粉、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、KNO3和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和碳酸盐中的一种或多种。
所述的固体制剂中含有巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的菌株形成的芽孢2亿个以上/克以及有机物料
所述的有机物料包括但不限于秸秆粉、风化煤、麸皮等。
所述的蔬菜植物包括：叶菜类、瓜果类、根茎类蔬菜、龙葵、茄子、辣椒。
所述的施用包括：
1)针对次生盐渍化单一污染土壤，每亩土壤施用50kg微生物固体制剂，1～3天后直接种植叶菜类、瓜果类、根茎类蔬菜；
2)针对镉、铅、铜单一或复合重金属污染土壤，每亩土壤施用45kg微生物固体制剂，2～3天后采用间作方式种植龙葵和茄子/辣椒，之后每隔30天施用15kg微生物固体制剂；
3)针对次生盐渍化与镉、铅、铜中任一种或几种重金属的复合污染土壤，每亩土壤施用50kg微生物固体制剂，2～3天后种植龙葵，30天后收割，再次施用40kg微生物固体制剂，1天后种植茄子/辣椒，之后每隔30天施用15kg微生物固体制剂，每亩土壤施用50kg微生物固体制剂，1天后种植龙葵。
所述的重金属污染土壤是指：镉、铅、铜污染土壤中的总镉含量为小于或等于3.0mg/kg、总铅含量为小于或等于1000mg/kg、总铜含量为小于或等于300mg/kg。
技术效果
与现有技术相比，本发明筛选获得的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)培养条件十分粗放，操作方便简单，能够有效修复次生盐渍化土壤，减少化肥用量，降低氮素损失，有效防止面源污染，且不会对环境造成二次污染并且该菌株具有解磷、产吲哚乙酸能力，可显著提高超积累植物对重金属的吸收，同时促进蔬菜生长，有效实现边生产边修复。
附图说明
图1为本发明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的菌落显微镜照片(100×)；
图2为实施例2不同浓度Cd2+对菌株生长的影响示意图；
图3为实施例2不同浓度Pd2+对菌株生长的影响示意图；
图4为实施例3不同浓度Cu2+对菌株生长的影响示意图。
具体实施方式
实施例1
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的筛选
本实施例包括以下步骤：
①将实验室保存的巨大芽孢杆菌CGMCC NO.4698在液体培养基(牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 0.5g/L)、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，采用血球计数板测定有效活菌数浓度，稀释制备成108CFU/mL菌悬液。
②采用30W紫外灯进行菌株诱变。照射前开启紫外灯，预热20min。用移液枪吸取5mL菌悬液于9cm的无菌培养皿中，调整紫外灯(30W)距培养皿距离为30cm(垂直距离)，开启皿盖，分别处理30s、60s、90s、120s。诱变后用移液枪吸取0.2mL菌悬液涂布平板(KNO34g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，KCl 1g/L，CaCl2 1mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，2mg/L，PdCl2 1g/L，CuSO4 2.5g/L，葡萄糖7.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)，30℃条件下避光培养48h。
③挑取单菌落转接至液体培养基(KNO3 8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，KCl 1g/L，CaCl2 1mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，CdCl2 4mg/L，PdCl2 2g/L，CuSO4 5g/L，葡萄糖7.5g/L，pH 7.0)、30℃、180rpm培养48h，取发酵液体离心后检测硝酸盐含量和pH。，硝酸盐转化率其中：Vs为硝酸盐转化率，单位为％，m1为培养基初始硝酸盐含量，单位为mg/L，m2为发酵结束后硝酸盐含量，单位为毫克(mg)，100％为换算为％。
④挑取硝酸盐转化率较高、pH偏酸的单菌落，接入液体培养基(牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 0.5g/L)，30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，采用血球计数板测定有效活菌数浓度，稀释制备成108CFU/mL菌悬液。菌株制备成108CFU/mL菌悬液，进行N+注入，采用78、92、138、184、234×1013N+/cm2注入剂量处理。诱变后用移液枪吸取0.2mL菌悬液涂布平板(KNO3 4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，KCl 1g/L，CaCl2 1mg/L，FeSO4·7H2O10mg/L，CdCl2 2mg/L，PdCl2 1g/L，CuSO4 2.5g/L，葡萄糖7.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)，30℃条件下避光培养48h。
⑤挑取单菌落转接至液体培养基(KNO3 8g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，KCl 1g/L，CaCl2 1mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，CdCl2 4mg/L，PdCl2 2g/L，CuSO4 5g/L，葡萄糖7.5g/L，pH 7.0)、30℃、180rpm培养48h，取发酵液体离心后检测硝酸盐含量和pH，选择硝酸盐转化率较高、pH偏酸的菌株，进行传代培养，培养10代后检测各个菌株的硝酸盐转化率和pH，选择功能稳定、良好的菌株命名为NCT-5。
本实施例通过上述方法筛选得到的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5，在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为1.2-1.5μm×3.5-5μm大小的杆菌，37℃培养1～3天形成芽孢，芽孢为长圆形或圆柱状。在上述培养基中30℃培养8h菌体可以大量生长。菌落呈白色，表面光滑，不透明。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的培养温度：20～37℃，最适温度为30℃；培养酸碱度为pH 5.8～7.5，革兰氏染色为阳性，甲基红实验为阳性，硝酸盐还原为阳性，吲哚生产为阳性，乙酰甲基甲醇试验为阳性，脲酶生产为阴性。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5经测得菌株16S rDNA大部分序列1476bp，如SEQ ID No.1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与巨大芽孢杆菌达到99.9％同源。认定本实施例使用的是巨大芽孢杆菌，具体为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5。
实施例2
本实施例涉及将实施例1得到的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5制成固体菌剂，具体包括：
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，利用NaOH溶液调pH 6.5。
产芽胞培养基：麸皮15g/L，硝酸钾10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.1g/L，碳酸钙0.1g/L，利用NaOH溶液调pH 7.0。
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5(CGMCC NO.12910)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有600L灭菌后的发酵培养基的1000L发酵罐中进行培养，培养条件：37℃，100r/min，通气量1.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵10h，产芽胞数达到70×108cfu/mL。将培养液用秸秆粉吸附，培养液：秸秆粉之比为1:30(L：kg)，搅拌混合，即得到含有巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCCNO.12910)的固体菌剂。经检测，该固体制剂中含有CGMCC NO.12910菌株形成的芽孢2亿个以上/克。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的促生特性检测，具体包括：
i.产吲哚乙酸(IAA)能力的鉴定
TSB培养基：每升培养基中含大豆胨3g/L、胰蛋白胨17g/L、NaCl 5g/L、葡萄糖2.5g/L、K2HPO4 2.5g/L，色氨酸100mg/L(过滤灭菌)，pH 7.1～7.5。
Salkowski试剂：1mL 0.5mol/L FeCl3溶液与50mL体积分数35％的高氯酸溶液混合。
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5(CGMCC NO.12910)接种于TSB培养基，28℃、200r/min条件下振荡培养48h，8000r/min离心10min。取上清液2ml，加入50μl体积分数83％的正磷酸和4ml Salkowski试剂，避光条件下25℃度显色30min，观察颜色变化。结果显示产生粉红色反应，表明菌株具有产IAA能力。菌株产生IAA的浓度采用Salkowski比色法测定，以空白TSB培养基为对照，测定菌株反应液在530nm下的吸光值。结果显示菌株分泌IAA的浓度为12.3mg/L。
ii.解磷能力的鉴定
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，利用NaOH溶液调pH 6.5。
无机磷培养基：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，NaCl 0.3g/L，KCl 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，MnSO4·7H2O 0.03g/L，Ca3(PO4)3 5.0g/L，pH 7.0。
有机磷培养基：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，NaCl 0.3g/L，KCl 0.3g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，MnSO4·7H2O 0.03g/L，卵磷脂2.0g/L(灭菌时不添加)，CaCO35.0g/L，酵母粉0.5g/L，pH 7.0。
蛋黄培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.4-7.6，10mL蛋黄卵磷脂/L。
将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5(CGMCC NO.12910)接种于种子培养基，30℃，200r/min培养24h，吸取1mL接种于无机磷、有机磷、蛋黄液体培养基。28℃，200r/min培养7d，用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量。结果显示，菌株溶解无机磷含量为28.4mg/L，溶解有机磷含量为34.6mg/L，表明该菌株具有溶解有机磷、无机磷能力。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的耐受重金属特性检测，具体包括：
LB培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，pH 7.0。
1)分别配制氯化镉、氯化铅、硫酸铜溶液，加入LB培养基中，分别制备成Cd2+终浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/L，Pb2+终浓度为0、200、400、600、800、1000、1200、1400mg/L，Cu2+终浓度为0、50、100、150、200、250、300、350、400mg/L。
2)将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5(CGMCC NO.12910)在LB培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于含有不同浓度Cd2+、Pb2+、Cu2+的培养基中培养48h后，在酶标仪的600nm处检测发酵液OD值。结果显示，较低浓度的Cd2+、Pb2+、Cu2+可以促进CGMCC NO.12910菌株的生长，但到达一定的浓度后菌株生长受到显著抑制，由图2～图4可见，菌株可以耐受的Cd2+、Pb2+、Cu2+浓度分别为3.5mg/L、1200mg/L、350mg/L。
实施例3
本实施例涉及将实施例1得到的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5进行次生盐渍化土壤的修复，具体包括：
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，利用NaOH溶液调pH 6.5。
产芽胞培养基：玉米粉5g/L，糖蜜10g/L，尿素10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.1g/L，碳酸钙0.1g/L，利用NaOH溶液调pH 7.0。
步骤①将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5(CGMCC NO.12910)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有7L灭菌后的发酵培养基的10L发酵罐中进行培养，培养条件：37℃，300r/min，通气量2.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵12h，产芽胞数达到50×108cfu/mL。将培养液用腐殖酸吸附，培养液：秸秆粉之比为1:25(L：kg)，搅拌混合，即得到含有巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的固体菌剂。经检测，该固体制剂中含有CGMCC NO.12910菌株形成的芽孢2亿个以上/克。
步骤②将含有巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的固体菌剂、腐殖酸均匀抛洒于大棚次生盐渍化土壤(土壤硝酸盐含量为634mg/kg)表面，用量为50kg/亩，浅耕使其与土壤混匀，采用喷灌灌溉，使土壤湿润，1天后种植生菜(Lactuca sativa Linn.var.ramosaHort.)。40d后收获生菜，收集土壤和植物样品进行检测。同时设置空白对照，即不施用秸秆粉或菌剂的处理。由表1可知，施用菌剂不仅能显著降低土壤硝酸盐含量(去除率36.12％)、提高土壤有机质含量(提高率15.50％)，也能有效促进青菜生长，对青菜平均单株鲜重的促生率达到52.59％。
表1菌剂对次生盐渍化土壤的修复效果
表2菌剂对青菜株高鲜重的影响
实施例4
本实施例涉及将实施例1得到的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5进行重金属污染土壤修复，具体包括：
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，利用NaOH溶液调pH 6.5。
产芽胞培养基：麸皮10g/L，玉米粉5g/L，硝酸钾10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.1g/L，碳酸钙0.1g/L，利用NaOH溶液调pH 7.0。
步骤①将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5(CGMCC NO.12910)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有7L灭菌后的发酵培养基的10L发酵罐中进行培养，培养条件：37℃，300r/min，通气量2.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵12h，产芽胞数达到50×108cfu/mL。将培养液用秸秆粉吸附，培养液：秸秆粉之比为1:25(L：kg)，搅拌混合，即得到含有巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的固体菌剂。经检测，该固体制剂中含有CGMCC NO.12910菌株形成的芽孢2亿个以上/克。
步骤②将含有巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的固体菌剂均匀抛洒于大棚重金属污染土壤(Cd 0.96mg/kg、Pb 337mg/kg、Cu 34mg/kg)表面，施用量45kg/亩，浅耕使其与土壤混匀，采用喷灌灌溉，使土壤湿润，2天后采用间作方式种植龙葵和茄子，龙葵和茄子的行距50cm，株距60cm。之后每隔30天施用15kg/亩固体菌剂。设置对照组，即采用相同的方式种植龙葵和茄子，不施用菌剂。成熟后分别收获进行检测。由表3可知，施用菌剂能够有效提高龙葵和茄子的生物量，对茄子果实单株鲜重的促生率达到15.5％。此外，施用菌剂条件下显著促进了龙葵对重金属的吸收，因而提高了其对污染土壤的修复效率(表4)。
表3施用菌剂对龙葵和茄子生物量的影响
表4施用菌剂对土壤/龙葵重金属含量的影响
实施例5
本实施例涉及将实施例1得到的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5进行次生盐渍化和重金属复合污染土壤修复，具体包括：
种子培养基：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，利用NaOH溶液调pH 6.5。
产芽胞培养基：麸皮10g/L，玉米粉5g/L，硝酸钾10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.1g/L，碳酸钙0.1g/L，利用NaOH溶液调pH 7.0。
步骤①将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5(CGMCC NO.12910)在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有7L灭菌后的发酵培养基的10L发酵罐中进行培养，培养条件：37℃，300r/min，通气量2.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵12h，产芽胞数达到50×108cfu/mL。将培养液用秸秆粉吸附，培养液：秸秆粉之比为1:25(L：kg)，搅拌混合，即得到含有巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的固体菌剂。经检测，该固体制剂中含有CGMCC NO.12910菌株形成的芽孢2亿个以上/克。
步骤②将含有巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的固体菌剂均匀抛洒于大棚重金属污染土壤(硝酸盐含量2180mg/kg、Cd 0.68mg/kg、Pb 89mg/kg、Cu 46mg/kg)表面，施用量50kg/亩，浅耕使其与土壤混匀，采用喷灌灌溉，使土壤湿润，2天后种植龙葵，行距50cm，株距40cm，30天后收割；再以40kg/亩施用菌剂，1天后种植辣椒，行距50cm，株距50cm，之后每隔30天按照15kg/亩施用菌剂，成熟后收获；再以50kg/亩施用菌剂，1天后种植龙葵，行距50cm，株距40cm，60天后收割。设置对照组，即采用相同的方式种植龙葵和辣椒，不施用菌剂。成熟后分别对土壤进行检测。结果显示，施用菌剂不仅能显著降低土壤硝酸盐含量，还能有效降低土壤Cd、Pb、Cu含量，实现对复合污染土壤的修复。
表5施用菌剂对次生盐渍化和重金属复合污染土壤的修复效果
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 巨大芽孢杆菌及其菌剂制备及其土壤重金属修复应用
<130> f-b261e
<141> 2018-06-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> NCT-5(巨大芽孢杆菌)
<400> 1
cacttaggcg gctagctcct tacggttact ccaccgactt cgggtgttac aaactctcgt 60
ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc 120
gattactagc gattccagct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaat 180
ggttttatgg gattggcttg acctcgcggt cttgcagccc tttgtaccat ccattgtagc 240
acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg 300
gtttgtcacc ggcagtcacc ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg 360
ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca 420
ccacctgtca ctctgtcccc cgaaggggaa cgctctatct ctagagttgt cagaggatgt 480
caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg 540
cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc 600
ttaatgcgtt agctgcagca ctaaagggcg gaaaccctct aacacttagc actcatcgtt 660
tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcgcctcagc 720
gtcagttaca gaccaaaaag ccgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt 780
tcaccgctac acgtggaatt ccgcttttct cttctgcact caagttcccc agtttccaat 840
gaccctccac ggttgagccg tgggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgcgcgc 900
tttacgccca ataattccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac 960
gtagttagcc gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggta caagcagtta ctcttgtact 1020
tgttcttccc taacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcatcactca cgcggcgttg 1080
ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg 1140
ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctatg catcgttgcc 1200
ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcaccgcg ggcccatctg taagtgatag 1260
ccgaaaccat ctttcaatca tctcccatga aggagaagat cctatccggt attagcttcg 1320
gtttcccgaa gttatcccag tcttacaggc aggttgccca cgtgttactc acccgtccgc 1380
cgctaacgtc atagaagcaa gcttctaatc agttcgctcg acttgcatgt attaggcacg 1440
ccgccagcgt tcatcctgag ccaggattca aactat 1476

Claims (12)

1.一种微生物菌株，其特征在于，具体为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5，目前该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏编号CGMCCNO.12910，保藏日期是2016年8月26日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
2.一种根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌NCT-5(CGMCC NO.12910)的实现方法，其特征在于，以巨大芽孢杆菌CGMCC NO.4698作为出发菌，经紫外光诱变和过硝酸盐转化率及酸碱度筛选后经N+注入后得到。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的筛选是指：将巨大芽孢杆菌(CGMCCNO.4698)作为出发菌，制备成菌悬液后涂布于含有重金属和NO3 -的平板上培养并挑取取单菌落转接至含有重金属和NO3 -的液体培养基中再次培养，挑取其中硝酸盐转化率和酸碱度符合要求的菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的重金属是指：Cd、Pb、Cu，具体为：1.0～10.0mg/L的Cd2+、0.5～5.0g/L的Pb2+、0.5～5.0g/L的Cu2+。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的N+注入是指：将符合要求的菌株制备成菌悬液，采用78～234×1013N+/cm2注入剂量进行N+注入。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征是，所述的筛选，优选将第一次筛选得到的菌株进行再次筛选。
7.一种基于上述任一权利要求所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的应用，其特征在于，将其作用于次生盐碱化土壤以实现土壤修复；
所述的重金属污染土壤是指：镉、铅、铜污染土壤中的总镉含量为小于或等于3.0mg/kg、总铅含量为小于或等于1000mg/kg、总铜含量为小于或等于300mg/kg。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，具体通过将巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)NCT-5扩大培养得到固体制剂后施用于待修复土壤后，在土壤中种植蔬菜植物，菌剂通过硝酸盐代谢途径降低土壤中过量的硝酸盐，同时通过分泌有机酸等物质活化或螯合土壤中的重金属，促进修复植物对重金属的富集，从而达到修复土壤的目的。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的扩大培养是指：将NCT-5菌株接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在C/N比大于或等于5，初始pH为6.0～7.5、培养温度为20～37℃的环境下培养8～24小时。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的无菌发酵培养基的组分含量为：碳源2～20g/L，氮源0.1～10g/L，无机盐0.01～10g/L，其余为水，pH 6.0～7.5；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、麸皮、玉米粉和糖蜜中的任意一种或几种的组合；氮源为豆饼粉、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、KNO3和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和碳酸盐中的一种或多种。
11.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的固体制剂中含有巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-5的菌株形成的芽孢2亿个以上/克以及有机物料。
12.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述的施用包括：
1)针对次生盐渍化单一污染土壤，每亩土壤施用50kg微生物固体制剂，1～3天后直接种植叶菜类、瓜果类、根茎类蔬菜；
2)针对镉、铅、铜单一或复合重金属污染土壤，每亩土壤施用45kg微生物固体制剂，2～3天后采用间作方式种植龙葵和茄子/辣椒，之后每隔30天施用15kg微生物固体制剂；
3)针对次生盐渍化与镉、铅、铜中任一种或几种重金属的复合污染土壤，每亩土壤施用50kg微生物固体制剂，2～3天后种植龙葵，30天后收割，再次施用40kg微生物固体制剂，1天后种植茄子/辣椒，之后每隔30天施用15kg微生物固体制剂，每亩土壤施用50kg微生物固体制剂，1天后种植龙葵。
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