CN112725234B - 一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌8‑32，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC：NO.20824，保藏日期为2020年9月25日，分类学命名为：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。该芽孢杆菌可以同时产吲哚乙酸和细胞分裂素，因此可应用于制备微生物肥料中，促进植物的生长发育。

Description

一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物及其应用技术领域，更具体地说是涉及一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
植物促生菌是一类广泛存在于土壤等环境和植物组织中，能够促进植物生长或拮抗病原菌的有益微生物。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)中的一种，是目前应用最为广泛的植物促生菌之一。枯草芽孢杆菌具有微生物肥料和微生物农药双重作用，可以产生多种脂肽类抑菌物质和植物生长素(吲哚乙酸，IAA)、细胞分裂素、赤霉素等多种促进植物生长的物质。
目前已有枯草芽孢杆菌产吲哚乙酸的相关专利，如CN103275895中公开了一种耐盐碱产吲哚乙酸的枯草芽孢杆菌，但目前并没有关于可以同时产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌的相关报道。
因此，如何提供一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，可以同时产吲哚乙酸和细胞分裂素，因此可应用于制备微生物肥料中，促进植物的生长发育，同时降低病虫害的发生率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌8-32，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC：NO.20824，保藏日期为2020年9月25日，分类学命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌在制备促进植物生长的肥料中的应用。
一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌在制备防治番茄青枯病肥料中的应用。
一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌在制备防治黄瓜枯萎病肥料中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一株产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌，能同时高产吲哚乙酸和细胞分裂素，盆栽实验和大田实验均证实枯草芽孢杆菌8-32对蔬菜作物具有促生作用且同时防治蔬菜根腐病和枯萎病；而且，本发明中枯草芽孢杆菌8-32来源于土壤，安全环保、易培养，使用后无污染、无残留、对人畜无害，符合绿色农药的发展要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为吲哚乙酸含量、吸光度的标准曲线图；
图2附图为HPLC法测定玉米素含量与吸收峰面积的标准曲线图；
图3附图为HPLC法测定玉米素核甘含量与相对峰面积的标准曲线图；
图4附图为HPLC法测定异戊烯基腺嘌呤浓度与相对峰面积的标准曲线图；
图5附图为枯草芽孢杆菌8-32菌株的菌落图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用实验材料：
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，琼脂20g，添加蒸馏水定容至1L，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。
本发明所用枯草芽孢杆菌8-32保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC：NO.20824，保藏日期为2020年9月25日，分类学命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；本发明所用病原菌及其它原料、试剂均购自市场。
实施例1菌株8-32的分离、筛选
菌株8-32分离土壤采集自河北省保定市莲池区农田土，具体过程为：
取10g土壤置于装有90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分震荡后，将三角瓶置于80℃加热10min得到土壤悬液，采用梯度稀释方法将土壤悬液稀释102、103、104或105，取0.1ml涂布于LB固体培养基上，将平板置于30℃恒温培养箱中，培养48h后，挑取不同大小、颜色、形态不同的典型单个群落，采用划线纯化培养，将获得的单菌落保存于LB斜面，待用；
将纯化得到的菌株接种于LB培养基中，30℃、180r/min培养48小时后得到发酵液，将发酵液于8000r/min离心10min得到发酵液上清。通过定性和定量方法获得产吲哚乙酸的细菌，再通过高效液相色谱法(HPLC)获得产细胞分裂素和吲哚乙酸的细菌。
吲哚乙酸产生菌的获得：
首先采用定性方法对分离得到的菌株进行初筛，取发酵液上清1ml加入Salkowski比色液2ml，静止25min，颜色变红者表明能够分泌吲哚乙酸。然后再用定量筛选方式做进一步的筛选，使用分析纯的吲哚乙酸做标准曲线，如图1所示；取1ml发酵上清液加入2mlSalkowski比色液，静止25min，使用分光光度计测定其在530nm下的吸光度值。
细胞分裂素产生菌的获得：
将得到的产吲哚乙酸的菌株进行产细胞分裂素情况测定。细胞分裂素种类较多，本筛选方法主要对菌株产生玉米素、玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤的能力进行测定。使用高效液相色谱法(HPLC)对分析纯的玉米素、玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤分别做标准曲线，如图2-图4所示。
将上述发酵液上清过0.45um的微孔滤膜，滤液直接进样进行HPLC分析。
通过以上测定筛选出一株高产吲哚乙酸和细胞分裂素的菌株，命名为8-32。该菌株在实验室摇瓶条件下，发酵液上清中吲哚乙酸含量达50.32mg/L，细胞分裂素含量达到37.2mg/L。
将上述方法筛选分离出的菌株，经北京六合华大基因科技有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果，如SEQ ID NO.1所示，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，根据该菌株的生理生化特征(糖、醇类发酵实验、甲基红实验、V-P测定实验、淀粉水解实验、产氨实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验、卵磷脂酶、接触酶、明胶液化实验、丙二酸利用实验均为阳性；荧光色素、柠檬酸利用为阴性；耐受7％浓度氯化钠，如表1)，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌株的菌落图如图5所示；将该菌株于2020年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CG MCC No.20824。
表18-32菌株生理生化特征
Figure BDA0002907482950000041
对比例：
选取与实施例1公开的菌株8-32同属的解淀粉芽孢杆菌L-H15，对其进行发酵培养，测得其发酵液中IAA量为6.698×10-11mol/L(合计1.173×10-5mg/L),细胞分裂素含量为2.1577×10-10mol/L(合计5.879×10-5mg/L)。可知，本发明的公开的枯草芽孢杆菌8-32具有更优越的产IAA和细胞分裂素的能力。
实施例2枯草芽孢杆菌8-32发酵液在西红柿上的应用
西红柿(品种：农博粉3号)种子表面消毒后，将种子种植在土壤中。实验设置2个处理，每个处理30个重复，分别为：不接菌处理(对照组)和接菌处理(实验组)，接菌处理的接种量为5ml/株(发酵液稀释50倍，含菌量为40亿/ml)。7天后测定出苗率，21天后测量株高、鲜物质量和干物质量，如表2所示；
表2枯草芽孢杆菌8-32对西红柿幼苗生长的影响
Figure BDA0002907482950000051
结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌8-32能明显促进了西红柿幼苗的生长，增加了幼苗的生物量。
将病原菌番茄青枯菌Ralstonia solanacearum在PDA培养基上培养7天，用无菌水将孢子洗脱下来，用无菌水配制成2×106cfu/mL的孢子悬浮液，按照50mL/kg将其接种在健康土壤中。将在正常土壤中培养到2叶的西红柿幼苗移栽到病原菌土壤中。将实验分为2个处理，对照组不再做进一步处理，实验组再接种5ml/株(发酵液稀释100倍，含菌量为40亿/ml)的发酵液。培养30天后统计发病率，结果发现对照组发病率为86.7％，实验组发病率为8.6％。表明菌株8-32可以防止番茄青枯菌引起的青枯病。
实施例3枯草芽孢杆菌8-32发酵液在黄瓜上的应用
黄瓜(品种：博耐526)种子表面消毒后，将种子种植在土壤中，土壤基本理化性质为有机质6.05％，碱解氮141.20mg/kg，速效磷102.17mg/kg，速效钾287.32mg/kg，pH 7.45。实验设置2个处理，30个重复，分别为：不接菌处理(对照组)和接菌处理(实验组)，接菌处理的接种量为5ml/株(发酵液稀释50倍，含菌量为40亿/ml)。播种1周后调查出苗率，30天后测量株高、茎粗、根长、单株总叶面积、根干物质和地上干物质，如表3所示；
表3枯草芽孢杆菌8-32对黄瓜幼苗生长的影响
Figure BDA0002907482950000061
结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌8-32能明显促进了黄瓜幼苗的生长，增加了幼苗的生物量。
将病原菌尖孢镰刀菌在培养基上培养7天，用无菌水将孢子洗脱下来，用无菌水配制成4×106cfu/mL的孢子悬浮液，按照50mL/kg将其接种在健康土壤中。将在正常土壤中培养到2叶1心的黄瓜幼苗移栽到病原菌土壤中。将实验分为2个处理，对照组不再做进一步处理，实验组再接种5ml/株(发酵液稀释50倍，含菌量为40亿/ml)的发酵液。培养30天后统计发病率，结果发现对照组发病率为68.4％，实验组发病率为28.3％。表明菌株8-32可以防止尖孢镰刀菌引起的枯萎病。
实施例4枯草芽孢杆菌8-32发酵液在辣椒上的应用
辣椒(品种：卓椒12号)播种在土壤中，土壤基本理化性质为有机质30.05g/kg，碱解氮136.10mg/kg，速效磷98.60mg/kg，速效钾228.86mg/kg，pH 6.52。于播种60天后移栽，移栽时实验组使用发酵液蘸根处理，实验设置2个处理，分别为：使用无菌水蘸根(对照组)和使用发酵液蘸根处理(实验组，发酵液稀释50倍，含菌量为40亿/ml)。移栽后4个月测定株高、开展度、主茎直径、有效分枝。果实成熟后，对单株果实数、单果鲜重、单株产量进行测定，如表4所示；
表4枯草芽孢杆菌8-32对辣椒生长和产量的影响
Figure BDA0002907482950000062
结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌8-32能明显促进了辣椒的生长，增加了辣椒的产量。
实施例5枯草芽孢杆菌8-32发酵液在茄子上的应用
茄子(品种：京茄黑霸)播种在土壤中，于栽培35天后进行移植。移植后分为2个处理，对照组正常种植，实验组在移栽时和30天分别用稀释100倍的发酵液进行滴灌，每株5ml。于移栽后7天测定株高、根长、茎粗和干物质重生长指标。果实成熟后，对茄子产量进行统计，如表5所示；
表5枯草芽孢杆菌8-32对辣椒生长和产量的影响
Figure BDA0002907482950000071
结果表明，与未接菌的对照组相比，枯草芽孢杆菌8-32能明显促进茄子的生长，增加了茄子的产量。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河北冀微生物技术有限公司
河北农业大学
<120> 一种产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
ggggcgggcg tgctatacat gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260
ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gccgccgaag 1440
gtggaccaga ag 1452

Claims (4)

1.枯草芽孢杆菌8-32在产细胞分裂素和吲哚乙酸中的应用，其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌8-32，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC：NO.20824，保藏日期为2020年9月25日，分类学命名为：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌8-32在产细胞分裂素和吲哚乙酸中的应用，其特征在于，枯草芽孢杆菌在制备促进植物生长的肥料中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌8-32在产细胞分裂素和吲哚乙酸中的应用，其特征在于，产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌在制备防治番茄青枯病肥料中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌8-32在产细胞分裂素和吲哚乙酸中的应用，其特征在于，产吲哚乙酸和细胞分裂素的枯草芽孢杆菌在制备防治黄瓜枯萎病肥料中的应用。
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