CN101955925A

CN101955925A - 一种通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法

Info

Publication number: CN101955925A
Application number: CN2009100697166A
Authority: CN
Inventors: 姜春晓; 孙红文; 张彦峰; 王婷; 张清敏
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明涉及微生物育种方法，具体说涉及建立一种基于基因组改组技术进行真核和原核微生物原生质体多亲本融合的方法。为实现本发明的目的采用的技术方案是：首先对微生物进行人工诱变，经筛选获得对镉具有高效抗镉性能的突变微生物；接下来以具有高效抗镉性能的突变微生物为出发菌株，采用细胞原生质体多亲本融合方法，经培养斜面孢子、菌株诱变、基因组改组、筛选、递推式多次融合，获得具有较好性状抗镉的菌株。采用本发明建立的细胞原生质体多亲本融合方法，对抗镉的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)和热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)进行改造，获得2株抗镉性能比Bacillus subtillis和Candida tropicalis大幅度提高的优良融合菌株。

Description

一种通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法

技术领域

本发明涉及一种通过微生物诱变手段提高微生物对镉的耐受性的方法。

背景技术

镉(Cd)是生物毒性极强的重金属元素，与Pb、Cr、As和Hg合称为“五毒”，位列第二。近年来，现代工业的发展以及镉在冶炼、化工、造纸和电子工业等方面的广泛应用，使得Cd污染日趋严重。因此，如何修复环境中的镉污染，成为国内外研究的热点。目前，关于微生物修复镉污染的研究主要集中于对耐镉微生物的选择策略上。传统的耐镉微生物的筛选主要是采用“驯化”的方法，许多研究表明，在起始阶段经过“驯化”的微生物对镉能表现出较好的耐性，而在后期这种耐性却几乎消失。利用紫外诱变对微生物进行诱变处理，是简单有效的诱变育种技术。国内外主要是利用紫外线诱变育种技术来获得大量高产的工业微生物菌株，但是利用诱变技术来选育高效耐镉微生物的研究较少。

本发明的目的旨在提供一种通过微生物诱变手段提高微生物对镉的耐受性，以修复环境中镉污染的新方法。

发明内容

针对目前选择高效耐镉微生物技术中存在的问题，本发明提供一种通过诱变手段提高枯草芽孢杆菌对镉的耐受性，从而修复环境中镉污染的方法。

本发明的一种通过紫外诱变提高枯草芽孢杆菌对镉的耐受性的方法，其包括以下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌进行预培养，在牛肉膏蛋白胨培养基上，经200转/分钟振荡培养10h后，离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液。加入玻璃球振荡分散，以脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90-95％。

(2)对步骤(1)中所制备的菌悬液3mL(1×10⁶个/mL)置于直径7cm的平底培养皿中，进行紫外线诱变：用15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下照射5min后，对诱变后的活菌落进行筛选，获得对镉具耐受性的突变芽孢杆菌。

(3)对步骤(2)诱变后的突变菌株进行筛选的方法为浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛相结合的两步筛选法。

步骤(1)中出发菌枯草芽孢杆菌对镉的耐性浓度为0.25mmol/L。

步骤(1)的每升培养基以及步骤(3)的摇瓶发酵培养基成分为，蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏5g、pH 7.2。步骤(3)的浓度梯度平板培养基成分为，每升含有蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏5g、琼脂20g、pH 7.2。

步骤(2)的15W功率的紫外灯管需预热20min，以稳定光波(254nm)；平底培养皿应在磁力搅拌器上，控制温度为37℃。

步骤(3)的浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛的培养基中含镉浓度0.36mmol/L。

本发明的优点：

本发明通过紫外诱变和两次筛选，得到对高浓度镉充分耐受的突变芽孢杆菌B38，其对镉的耐受浓度达到3mmol/L，是出发菌枯草芽孢杆菌的耐镉浓度的12倍。通过本方法，提高了芽孢杆菌对镉的耐受性。

具体实施方式

出发菌枯草芽孢杆菌难以耐受高浓度的镉。将出发菌紫外诱变后会形成耐镉能力不同的芽孢杆菌突变库，其中很可能含有少量对镉的耐受者，关键是将这部分在突变库中占极少比例的镉的耐受型突变芽孢杆菌从大量无义突变中筛选出来，如果镉耐受型突变芽孢杆菌确实在突变库中存在，将突变库接入高浓度镉的培养基后，镉耐受型突变芽孢杆菌就会生长，而大量无义突变芽孢杆菌则死亡，从而诱变并筛选得到镉耐受型突变芽孢杆菌。

以下通过实施例进一步对本发明进行描述：

实施例1：

紫外诱变与第一次筛选：将菌落数为1×10⁶个/mL的枯草芽孢杆菌杆菌1mL接种于100mL液体牛肉膏蛋白胨中，放入250mL带硅胶塞的三角瓶中，200r/min振荡培养10h后。离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液。加入玻璃球振荡分散，以脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90-95％。将所制备的菌悬液3mL(1×10⁶个/mL)置于直径7cm的平底培养皿中，放在37℃的磁力搅拌器上进行紫外线诱变。诱变开始前，须将15W功率的紫外灯管预热20min，以稳定光波(254nm)。调节培养皿与灯管的距离为30cm，打开培养皿盖，在暗室进行诱变，诱变时间为5min。取诱变后的芽孢杆菌0.1mL，将菌液涂在含镉0.36mmol/L的浓度梯度平板上，培养基平板成分为：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏5g、琼脂20g，在平板上生长的菌落即为初次诱变成功的能耐受镉的突变芽孢杆菌。

第二次筛选：对第一次诱变成功的能耐受镉的初次突变芽孢杆菌和出发菌枯草芽孢杆菌进行预培养。将菌落数为1×10⁶个/mL的初次突变芽孢杆菌1mL接种于100mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种两份，一份含0.36mmol/L的镉，另一份不含镉。分别放入250mL三角瓶中，200r/min振荡培养10h。在分光光度计上测定两份摇瓶中微生物的OD₆₀₀值，计算镉对突变耐受微生物的致死率，其中致死率＝(ODck-ODcd)/ODck，ODck代表菌株在不含镉培养基中的OD₆₀₀值，ODcd代表菌株在含镉培养基中的OD₆₀₀值。按照上述步骤将出发菌接种后，也进行摇瓶培养10h后，计算镉对出发菌的致死率。比较初次突变芽孢杆菌和出发菌的致死率大小，挑选致死率小于出发菌的突变芽孢杆菌，即为高效耐镉突变杆菌。将第二次筛选出的耐镉突变杆菌进行遗传稳定性试验，共转接10代，证明其是否是遗传稳定的耐镉突变杆菌。

实例2：

将菌落数为1×10⁶个/mL的耐镉突变杆菌B38和出发菌，接种于100mL的含镉3mmol/L的牛肉膏蛋白胨培养基中，在200r/min振荡培养10h后，B38突变杆菌可以生长，而出发菌无法生长。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法，其特征依次包括以下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌进行预培养，在牛肉膏蛋白胨培养基上，经200r/min振荡培养10h后，离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液。加入玻璃球振荡分散，以脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90-95％。

(2)对步骤(1)中所制备的菌悬液3mL(10⁶个/mL)置于直径7cm的平底培养皿中，进行紫外线诱变：用15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下照射5min后，对诱变后的活菌落进行筛选，获得对镉具耐受性的突变芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法，其特征在于：步骤(1)中出发菌枯草芽孢杆菌对镉的耐性为0.25mmol/L。

3.根据权利要求1所述的通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法，其特征在于：步骤(1)的每升液体培养基以及步骤(3)的摇瓶发酵培养基成分为，蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏5g、pH 7.2。步骤(3)的浓度梯度平板固体培养基成分为，每升含有蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏5g、琼脂20g、pH 7.2。

4.根据权利要求1所述的通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法，其特征在于：步骤(2)的15W功率的紫外灯管需预热20min，以稳定光波(254nn)；平底培养皿应在磁力搅拌器上，控制温度为37℃。

5.根据权利要求1所述的通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法，其特征在于：步骤(3)的浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛的培养基中含镉浓度为0.36mmol/L。